CH665220A5 - METHOD FOR PRODUCING D-RIBOSE. - Google Patents
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Description
BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose. DESCRIPTION The present invention relates to a fermentative process for producing D-ribose.
D-Ribosé in sämtlicher lebender Materie als Bestandteil der Ribonucleinsäuren enthalten, und ihr Derivat in reduzier-60 ter Form, Ribit, kommt als Komponente des Vitamins B2 und als Ribitteichonat vor, das eine Komponente der Zellwand ist. Dementsprechend sind beide Substanzen von grosser Bedeutung, sei es bereits allein unter physiologischen ist. Gesichtspunkten. D-ribose is present in all living matter as a component of ribonucleic acids, and its derivative in reduced form, ribit, occurs as a component of vitamin B2 and as a ribite tichonate, which is a component of the cell wall. Accordingly, both substances are of great importance, even if it is already under physiological ones. Points of view.
65 D-Ribose wird auch als Ausgangsstoff für die Synthese von Vitamin B2 eingesetzt, und in neuerer Zeit erregt seine Verwendung als Rohstoff für Nucleotid-Würzmittel grosse Aufmerksamkeit. Unter diesen Umständen ist es industriell 65 D-Ribose is also used as a raw material for the synthesis of vitamin B2, and more recently its use as a raw material for nucleotide seasonings has attracted a lot of attention. In these circumstances, it is industrial
3 3rd
665 220 665 220
von hoher Bedeutung, die Substanz zu niedrigem Preis und in grossem Produktionsmassstab zu erzeugen. of great importance to produce the substance at a low price and on a large production scale.
Die bisher bekannten Verfahren zur Erzeugung von D-Ri-bose umfassen das Verfahren, bei dem D-Ribose aus Naturstoffen extrahiert wird, das Verfahren, bei dem sie aus Furan, Glucose usw. synthetisiert wird, und das Fermentationsverfahren unter Einsatz von Mikroorganismen. The previously known methods for producing D-Ri-bose include the method in which D-ribose is extracted from natural products, the method in which it is synthesized from furan, glucose, etc., and the fermentation method using microorganisms.
Die vorgenannten Verfahren haben Nachteile dahingehend, dass sie eine komplizierte Serie von Produktionsschritten oder die Verwendung teurer Materialien erfordern oder aber nur geringe Ausbeuten an D-Ribose liefern, was zur Folge hat, dass keines von ihnen als wirtschaftlich-technisches Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose voll befriedigend ist. The aforementioned processes have disadvantages in that they require a complicated series of production steps or the use of expensive materials or only provide low yields of D-ribose, with the result that none of them is an economical and technical process for the production of D- Ribose is fully satisfactory.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eingehende Untersuchungen mit dem Ziel durch, ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose in guter Ausbeute mit Hilfe eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus zu entwik-keln. Dabei wurde gefunden, dass sich D-Ribose in grossen Mengen durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Bacillus in einem zuckerhaltigen Fermentationsmedium erzeugen lässt, das durch eine Substanz ergänzt ist, die die Bildung von Gluconsäure hemmt, das Wachstum des Stammes jedoch nicht beeinflusst. Dieser Befund zog weitere Forschungen nach sich, aus denen die Entwicklung der vorliegenden Erfindung resultiert. The inventors of the present invention carried out extensive studies with the aim of developing a fermentative process for producing D-ribose in good yield with the aid of a microorganism of the genus Bacillus. It was found that D-ribose can be produced in large quantities by cultivating a strain of the genus Bacillus in a sugar-containing fermentation medium which is supplemented by a substance which inhibits the formation of gluconic acid but does not influence the growth of the strain. This finding prompted further research, which resulted in the development of the present invention.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose durch Kultivieren eines zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium befähigt ist, das durch eine Verbindung der Formel The present invention relates to a method for producing D-ribose by cultivating a microorganism belonging to the genus Bacillus, which is capable of producing D-ribose in a medium which is produced by a compound of the formula
R-X-COOH [I], R-X-COOH [I],
in der in the
R H- oder eine Ci-C4-Alkyl-Gruppe ist, die durch 1 oder 2 Gruppen der Formel HO-, HS-, CH3S- R is H or a Ci-C4-alkyl group which is formed by 1 or 2 groups of the formula HO-, HS-, CH3S-
?H2 r' ? H2 r '
I ' I '
HOOC-CH-CH2-S-S- oder HOOC-CH-CH2-S-S- or
(R'ist H-oder NH2-) (R'is H- or NH2-)
substituiert sein kann, und X eine Gruppe der Formel may be substituted, and X is a group of the formula
1 2 1 2
-C- oder -CH- -C- or -CH-
ist, oder ein Salz derselben ergänzt ist, und Ernten der dadurch erzeugten und angereicherten D-Ribose aus der Kulturbrühe. or a salt thereof is added, and harvesting the D-ribose thus produced and enriched from the culture broth.
Zu den zur Gattung Bacillus gehörenden und zur Bildung von D-Ribose befähigten Mikroorganismen gehören beispielsweise Stämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis. Speziell seien die folgenden Stämme genannt: The microorganisms belonging to the genus Bacillus and capable of forming D-ribose include, for example, strains of Bacillus pumilus and Bacillus subtilis. The following strains are specifically mentioned:
Bacillus pumilus Bacillus pumilus
Nr. 503 (IFO 12600, ATCC 21356) No. 503 (IFO 12600, ATCC 21356)
Nr. 537 (IFO 12601, ATCC 21357) No. 537 (IFO 12601, ATCC 21357)
Nr. 558 (IFO 12602, ATCC 21358) No. 558 (IFO 12602, ATCC 21358)
Nr. 716 [IFO 13322 (eingereicht am 3. Juni 1972), FERM No. 716 [IFO 13322 (filed June 3, 1972), FERM
BP-812, ATCC 21951 (eingereicht am 4. Juni 1973)] Nr. 911 (IFO 13566, FERM-P 2260, ATCC 31095) BP-812, ATCC 21951 (filed June 4, 1973)] No. 911 (IFO 13566, FERM-P 2260, ATCC 31095)
Nr. 1027 (IFO 13585, FERM-P 2466, ATCC 31098) No. 1027 (IFO 13585, FERM-P 2466, ATCC 31098)
Nr. 1083 (IFO 13620, FERM-P 2832, ATCC 31093) No. 1083 (IFO 13620, FERM-P 2832, ATCC 31093)
Bacillus subtilis Bacillus subtilis
Nr. 429 (IFO 12603, ATCC 21359) No. 429 (IFO 12603, ATCC 21359)
Nr. 483 (IFO 12604, ATCC 21360) No. 483 (IFO 12604, ATCC 21360)
Nr. 608 (IFO 13323, FERM-P 1490, ATCC 21952) Nr. 957 (IFO 13565, FERM-P 2259, ATCC 31096) Nr. 941 (IFO 13573, FERM-P 2360, ATCC 31097) No. 608 (IFO 13323, FERM-P 1490, ATCC 21952) No. 957 (IFO 13565, FERM-P 2259, ATCC 31096) No. 941 (IFO 13573, FERM-P 2360, ATCC 31097)
Nr. 1054 (IFO 13586, FERM-P 2467, ATCC 31091) No. 1054 (IFO 13586, FERM-P 2467, ATCC 31091)
Nr. 1067 (IFO 13588, FERM-P 2468, ATCC 31092) No. 1067 (IFO 13588, FERM-P 2468, ATCC 31092)
Nr. 1097 (IFO 13621, FERM-P 2833, ATCC 31094) No. 1097 (IFO 13621, FERM-P 2833, ATCC 31094)
Die oben angegebenen IFO-Nummern sind Hinterlegungsbezeichnungen des «Institute for Fermentation, Osaka» (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, The IFO numbers given above are the depository names of the "Institute for Fermentation, Osaka" (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku,
Osaka 532, Japan, die FERM-Nummern sind diejenigen des «Fermentation Research Institute» (FRI), Agency of Industriai Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-Ken 305, Japan, und die ATCC-Nummern sind diejenigen von «The American Type Culture Collection» (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA. Osaka 532, Japan, the FERM numbers are those of the Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industriai Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-Ken 305, Japan , and the ATCC numbers are those of The American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.
Die oben genannten Stämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis sind bereits bekannt und der Öffentlichkeit zugänglich. The above strains of Bacillus pumilus and Bacillus subtilis are already known and are available to the public.
Der Stamm Bacillus pumilus Nr. 716 wurde am 17. Juni 1972 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japan, unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM P-1491 hinterlegt und wird nach der Umwandlung der Hinterlegung in eine solche nach dem Budapester Vertrag beim FRI unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM BP-812 aufbewahrt. The strain Bacillus pumilus No. 716 was deposited on June 17, 1972 with the Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japan, under the depository name FERM P-1491 and is after the conversion of the deposit in such under the Budapest Treaty with the FRI under the deposit name FERM BP-812.
Für die im vorstehenden angeführten Mikroorganismen sind die bakteriologischen kennzeichnenden Eigenschaften des Bacillus pumilus und des Bacillus subtilis die gleichen wie diejenigen, die in Bergey's «Manual of Determinative Bacteriology», 8. Auflage, Seite 529-534, beschrieben sind, mit der Massgabe, dass Stämme, bei denen durch mutagene Behandlung Defekte in bezug auf die Fähigkeit zur Sporenbildung (Sporulation) erzeugt wurden, eingeschlossen sind. For the microorganisms mentioned above, the bacteriological characteristics of Bacillus pumilus and Bacillus subtilis are the same as those described in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 8th edition, pages 529-534, with the proviso that Strains in which defects in sporulation ability have been generated by mutagenic treatment.
Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismen sind Stämme der Gattung Bacillus, die zum Wachstum aromatische Aminosäuren (L-Tyrosin, L-Tryopto-phan und Phenylalanin) benötigen, Stämme der Gattung Bacillus, die in bezug auf wenigstens entweder Transketolase oder D-Ribulose-5-phosphatase-3-epimerase fehlerhaft sind, Stämme der genannten Bacillus-Organismen, die in bezug auf die Fähigkeit zur Sporulation fehlerhaft sind, sowie diejenigen Stämme der genannten Bacillus-Stämme oder Organismen, die eine Aktivität zur Oxidation von 2-Desoxy-D-glu-cose besitzen. Wenn diese Mikroorganismen in einem die für ihr Wachstum notwendigen Nährstoffe enthaltenden Medium kultiviert werden, erzeugen sie D-Ribose und reichern sie in den Brühen in grossen Mengen an, jedoch liefern sie gleichzeitig Gluconsäure als Nebenprodukt. Bei der Durchführung der Kultur hemmt der Zusatz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) die Erzeugung von Gluconsäure und ergibt eine höhere Ausbeute an D-Ribose. The microorganisms used in the practice of the present invention are strains of the genus Bacillus which require aromatic amino acids (L-tyrosine, L-tryoptophan and phenylalanine) to grow, strains of the genus Bacillus which, with respect to at least either Transketolase or D- Ribulose-5-phosphatase-3-epimerase are defective, strains of said Bacillus organisms which are defective in the ability to sporulate, and those strains of said Bacillus strains or organisms which have an activity for oxidizing 2-deoxy -D-own glu-cose. If these microorganisms are cultivated in a medium containing the nutrients necessary for their growth, they produce D-ribose and accumulate them in large quantities in the broths, but at the same time they supply gluconic acid as a by-product. When carrying out the culture, the addition of a compound of the general formula (I) inhibits the production of gluconic acid and gives a higher yield of D-ribose.
Beispiele für die Ci-C4-Alkyl-Gruppe in der Verbindung (I) umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, N-Butyl, Iso-butyl, sec-Butyl und tert-Butyl. Examples of the Ci-C4-alkyl group in the compound (I) include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, N-butyl, iso-butyl, sec-butyl and tert-butyl.
Zu Beispielen für die Gruppe Examples for the group
R' R '
fV fV
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
665 220 665 220
4 4th
(in der R' die im vorstehenden angegebenen Bedeutungen hat), die gegebenenfalls die Ci-Gi-Alkyl-Gruppe substituieren kann, zählen Phenyl und p-Aminophenyl. (in which R 'has the meanings given above), which may optionally substitute the Ci-Gi-alkyl group, include phenyl and p-aminophenyl.
Zu Beispielen für die Verbindung (I) zählen L-Valin, L-, D- oder DL-Leucin, L-Isoleucin, L-Methionin, L-Cystein, L-Cystin, Phenylalanin, DL-a-Amino-n-buttersäure, p-Amino-DL-phenylalanin, DL-3-Phenylserin, Glyoxylsäure und a-Ketoisocapronsäure. Examples of the compound (I) include L-valine, L-, D- or DL-leucine, L-isoleucine, L-methionine, L-cysteine, L-cystine, phenylalanine, DL-a-amino-n-butyric acid , p-Amino-DL-phenylalanine, DL-3-phenylserine, glyoxylic acid and a-ketoisocaproic acid.
Zu Beispielen für das Salz der Verbindung (I) zählen Natrium-, Kalium-, Lysin-hydrochlorid- oder andere Salze der DL-a-Aminobuttersäure, Glyoxylsäure und a-Ketoisocapronsäure. Examples of the salt of the compound (I) include sodium, potassium, lysine hydrochloride or other salts of DL-a-aminobutyric acid, glyoxylic acid and a-ketoisocaproic acid.
Die Werte der Zusätze der Verbindung (I), bezogen auf das verwendete Medium, betragen allgemein etwa 0,2 g/1, vorzugsweise etwa 0,2 bis 2 g/1, und besonders bevorzugt etwa 0,2 bis 0,6 g/1. Der genannte Wert des Zusatzes bezeichnet die pro Kultur zugegebene Gesamtmenge. The values of the additions of the compound (I), based on the medium used, are generally about 0.2 g / 1, preferably about 0.2 to 2 g / 1, and particularly preferably about 0.2 to 0.6 g / 1. The stated value of the additive denotes the total amount added per culture.
Hinsichtlich des Zeitplans der Zugabe der Verbindung (I) kann die Verbindung dem Ausgangsmedium oder dem Medium in einem frühen Zwischenstadium der Kultur zugesetzt werden. Regarding the schedule of adding the compound (I), the compound can be added to the starting medium or the medium at an early intermediate stage of the culture.
Als Kulturmethoden kommen verschiedene routinemässig eingesetzte Kulturmethoden für Mikroorganismen in Betracht, von denen die aerobe Submerskultur die vorteilhafteste ist. Various routinely used culture methods for microorganisms come into consideration as culture methods, of which the aerobic submerged culture is the most advantageous.
Das Medium besteht aus verschiedenen Nährstoffen, darunter Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen. Kohlenstoff-Quellen sind beispielsweise D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Sucrose, Melasse, Stärke-Hydrolysat, Stärke, Essigsäure, Ethanol usw. Zu den Stickstoff-Quellen zählen verschiedene stickstoffhaltige organische Quellen wie Maisquellflüssigkeit, Baumwollsamenöl, Hefeextrakt, Trok-kenhefe, Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure usw., anorganische Stickstoff-Verbindungen wie wässriges Ammoniak, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat usw. und organische Stickstoff-Verbindungen wie Harnstoff, Aminosäuren usw. Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen kann das Medium geeignete Mengen verschiedener Metalle, Vitamine, Aminosäuren usw. enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sein können. The medium consists of various nutrients, including carbon and nitrogen sources. Carbon sources are, for example, D-glucose, D-fructose, D-mannose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, molasses, starch hydrolyzate, starch, acetic acid, ethanol, etc. The nitrogen sources include various nitrogenous organic sources such as corn steep liquor , Cottonseed oil, yeast extract, dry yeast, fish meal, meat extract, peptone, casamino acid etc., inorganic nitrogen compounds such as aqueous ammonia, gaseous ammonia, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium carbonate, ammonium phosphate, sodium nitrate etc. and organic nitrogen compounds such as urea , Amino acids, etc. In addition to these carbon and nitrogen sources, the medium may contain suitable amounts of various metals, vitamins, amino acids, etc., which may be necessary for the growth of the microorganisms.
Wenngleich die Kulturbedingungen, d.h. Inkubationstemperatur, pH des Mediums, Inkubationszeit usw. nicht besonders kritisch sind, betragen die Inkubationstemperatur im allgemeinen etwa 18 °C bis 45 °C, vorzugsweise etwa 25 °C bis 40 °C, der pH des Mediums allgemein etwa 4,5 bis 9, vorzugsweise etwa 5,5 bis 8 und die Inkubationszeit allgemein etwa 18 bis 180 h, vorzugsweise etwa 36 bis 120 h. Although the cultural conditions, i.e. Incubation temperature, pH of the medium, incubation time etc. are not particularly critical, the incubation temperature is generally about 18 ° C to 45 ° C, preferably about 25 ° C to 40 ° C, the pH of the medium generally about 4.5 to 9, preferably about 5.5 to 8 and the incubation time generally about 18 to 180 h, preferably about 36 to 120 h.
Die D-Ribose kann aus der Kulturbrühe mittels der herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von D-Ribose geerntet werden, d.h. durch die Schritte des Entfernens der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation, des Behandeins des Filtrats oder des Überstands mit Aktivkohle und Ionenaustausch-Harzen zur Entfärbung und Entsalzung, des Einengens desselben und schliesslich des Zugebens eines organischen Lösungsmittels wie Ethylalkohol zu dem Konzentrat zum Zwecke der Kristallisation. Falls irgendein anderes Kohlenhydrat als D-Ribose ebenfalls in der Brühe enthalten ist, lässt es sich durch Behandeln mit Glucose-oxidase oder mit einer Hefe oder einem Bakterienstamm, der D-Ribose nicht verwertet, das spezielle Kohlenhydrat jedoch verwertet, entfernen. The D-ribose can be harvested from the culture broth by the conventional methods for obtaining D-ribose, i.e. by the steps of removing the cells by filtration or centrifugation, treating the filtrate or the supernatant with activated carbon and ion exchange resins for decolorization and desalting, concentrating the same, and finally adding an organic solvent such as ethyl alcohol to the concentrate for the purpose of crystallization. If any carbohydrate other than D-ribose is also present in the broth, it can be removed by treating with glucose oxidase or with a yeast or bacterial strain that does not utilize D-ribose but does utilize the particular carbohydrate.
Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure, die in den mit Verbindungen der Formel (I) ergänzten Kulturen gewonnen wurden, sind im folgenden angegeben. In diesen Kulturen waren der Stamm und das Medium die gleichen, die auch in dem nachfolgenden Beispiel 1 verwendet wurden, und die The yields of D-ribose and gluconic acid obtained in the cultures supplemented with compounds of the formula (I) are given below. In these cultures, the strain and medium were the same as that used in Example 1 below and that
Kulturbedingungen sowie die anderen Arbeitsweisen waren ebenfalls die gleichen wie in Beispiel 1. Culture conditions as well as the other working methods were also the same as in example 1.
Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure in den Brühen sind in Tabelle 1 aufgeführt. The yields of D-ribose and gluconic acid in the broth are shown in Table 1.
Tabelle 1 Table 1
Zusatzstoff Additive
Menge amount
(g/1) (g / 1)
D-Ribose-Gluconsäure-Ausbeute Menge (mg/ml) (mg/ml) D-Ribose Gluconic Acid Yield Amount (mg / ml) (mg / ml)
Kontrolle control
65,1 65.1
40,5 40.5
L-Valin L-valine
0,25 0.25
80,5 80.5
5,1 5.1
L-, D-, DL-Leucin L, D, DL leucine
0,25 0.25
82,3 82.3
4,8 4.8
L-Isoleucin L-isoleucine
0,25 0.25
74,4 74.4
8,3 8.3
L-Methonin L-methonine
0,25 0.25
73,4 73.4
15,5 15.5
Cystin Cystine
0,25 0.25
71,3 71.3
4,8 4.8
Cystein Cysteine
0,25 0.25
70,2 70.2
6,2 6.2
Phenylalanin Phenylalanine
0,25 0.25
74,5 74.5
6,0 6.0
DL-a-Amino-n-buttersäure DL-a-amino-n-butyric acid
0,25 0.25
77,1 77.1
9,1 9.1
p-Amino-DL-phenylalanin p-Amino-DL-phenylalanine
0,25 0.25
78,3 78.3
4,8 4.8
DL-3-Phenylserin DL-3-phenylserine
0,25 0.25
79,0 79.0
4,6 4.6
Glyoxylsäure Glyoxylic acid
0,25 0.25
75,4 75.4
20,5 20.5
a-Ketoisocapronsäure a-ketoisocaproic acid
0,25 0.25
76,3 76.3
10,1 10.1
Es ist zu erkennen, dass die Kultur mit dem Zusatzstoff der Formel (I) Gluconsäure nur in einer Menge von 4 bis 20 mg/ ml erzeugt, während die herkömmliche Kultivierung 30 bis 50 mg/ml Gluconsäure liefert. Dementsprechend unterdrückt die vorliegende Erfindung die Nebenproduktion von Gluconsäure und steigert die Ausbeute an D-Ribose. It can be seen that the culture with the additive of the formula (I) produces gluconic acid only in an amount of 4 to 20 mg / ml, while conventional cultivation provides 30 to 50 mg / ml of gluconic acid. Accordingly, the present invention suppresses the by-production of gluconic acid and increases the yield of D-ribose.
Die Kultivierung eines zu der Gattung Bacillus gehörenden und zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium, das durch eine Verbindung (I), einschliesslich eines Salzes derselben, gemäss der vorliegenden Erfindung ergänzt ist, befähigten Mikroorganismus ergibt eine unterdrückte Bildung des Nebenprodukts Gluconsäure und eine erhöhte Ausbeute an D-Ribose. Da die Menge des Nebenprodukts Gluconsäure klein ist, wird der Arbeitsgang des Abtrennens und Entfernens der Gluconsäure erleichtert. The cultivation of a microorganism belonging to the genus Bacillus and capable of producing D-ribose in a medium which is supplemented by a compound (I), including a salt thereof, according to the present invention results in suppressed formation of the by-product gluconic acid and a increased yield of D-ribose. Since the amount of the by-product gluconic acid is small, the operation of separating and removing the gluconic acid is facilitated.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. The present invention is explained in more detail by the following examples, but is not restricted to these.
Beispiel 1 example 1
Der Mutanten-Stamm Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951) von Bacillus pumilus, die von dem Ursprungsstamm durch wiederholte Ultraviolett-Bestrahlung abgeleitet ist, wurde in ein Medium (101) geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikaliumphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 36 °C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 18% D-Glucose, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, 0,005% L-Tryptophan und 0,025% L-Valin enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 38 °C. Als Ergebnis wurde D-Ribose erzeugt und angereichert in einer Menge von 80,1 mg/ ml. Der Ertrag an D-Ribose wurde nach der Orcin-Methode bestimmt. Diese Methode ist beschrieben in «Methods in Carbohydrate Chemistry», Vol. 1, Seite 484 (1962). Mutant strain No. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951) from Bacillus pumilus, which is derived from the original strain by repeated ultraviolet radiation, was inoculated into a medium (101) containing 2% sorbitol, 2 % Corn steep liquor, 0.3% dipotassium phosphate and 0.1% monopotassium phosphate, and incubated at 36 ° C for 24 h. The culture obtained was inoculated with a medium (1001) which contained 18% D-glucose, 2% corn steep liquor, 0.5% ammonium sulfate, 1.6% calcium carbonate, 0.005% L-tryptophan and 0.025% L-valine; the incubation was carried out by means of aerobic submerged culture at 38 ° C. for 72 h. As a result, D-ribose was produced and enriched in an amount of 80.1 mg / ml. The yield of D-ribose was determined by the orcin method. This method is described in “Methods in Carbohydrate Chemistry”, Vol. 1, page 484 (1962).
Aus dieser D-Ribose-Fermentationsbrühe wurden die Zellen abfiltiert, und das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte seines Volumens eingeengt, und anschliessend wurde etwa ein Viertel seines Volumens Ethanol zugesetzt. Nach dem Abfiltireren des erhaltenen Niederschlags wurde das Filtrat an einem Kationenaustausch-Harz und einem Anionenaustausch-Harz entsalzt und an einer Aktivkohle-Säule entfärbt. Die entfärbte Flüssigkeit wurde konzentriert und etwa mit dem 4fachen Volumen Ethanol versetzt, wonach 7,4 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden. The cells were filtered from this D-ribose fermentation broth, the filtrate was concentrated to about half its volume, and then about a quarter of its volume was added to ethanol. After the precipitate obtained had been filtered off, the filtrate was desalted on a cation exchange resin and an anion exchange resin and decolorized on an activated carbon column. The decolorized liquid was concentrated and about 4 times the volume of ethanol was added, after which 7.4 kg of crystalline D-ribose were obtained.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
5 5
665 220 665 220
Beispiel 2 Example 2
Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde in ein Medium (101) geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikali-umphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 37 °C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 20% D-Glucose, 2,2% Maisquell-flüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, 0,05% Mangansulfat, 0,05% Leucin und 0,005% L-Tryptophan enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 37 °C. Am Ende der Inkubationszeit waren 90,6 mg/ml D-Ribose angereichert worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch 8,3 kg kristalline D-Ribose isoliert wurden. The same mutant strain of Bacillus pumilus as used in Example 1, i.e. No. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951) was inoculated into medium (101) containing 2% sorbitol, 2% corn steep liquor, 0.3% dipotassium phosphate and 0.1% monopotassium phosphate, and Incubated for 24 h at 37 ° C. A medium (1001) was inoculated with the culture obtained, which was 20% D-glucose, 2.2% corn steep liquor, 0.5% ammonium sulfate, 1.6% calcium carbonate, 0.05% manganese sulfate, 0.05% leucine and contained 0.005% L-tryptophan; the incubation was carried out using aerobic submerged culture at 37 ° C. for 72 h. At the end of the incubation period, 90.6 mg / ml D-ribose had been enriched. The broth was treated in the same manner as in Example 1, thereby isolating 8.3 kg of crystalline D-ribose.
Beispiel 3 Example 3
Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde in ein Medium (101) 5 geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikali-umphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 37 ° C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 18% D-Glucose, 2,2% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, io 0,005% L-Tryptophan und 0,025% a-Aminobuttersäure enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 37 °C. Am Ende der Inkubationszeit waren 78,2 mg/ ml D-Ribose angereichert worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch 7,2 kg 15 kristalline D-Ribose isoliert wurden. The same mutant strain of Bacillus pumilus as used in Example 1, i.e. No. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951) was inoculated into a medium (101) 5 which contained 2% sorbitol, 2% corn steep liquor, 0.3% dipotassium phosphate and 0.1% monopotassium phosphate, and incubated for 24 h at 37 ° C. The culture obtained was inoculated with a medium (1001) which contained 18% D-glucose, 2.2% corn steep liquor, 0.5% ammonium sulfate, 1.6% calcium carbonate, 0.005% L-tryptophan and 0.025% α-aminobutyric acid ; the incubation was carried out using aerobic submerged culture at 37 ° C. for 72 h. At the end of the incubation period, 78.2 mg / ml D-ribose had been enriched. The broth was treated in the same manner as in Example 1, isolating 7.2 kg of 15 crystalline D-ribose.
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