DE1900492C

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Publication number: DE1900492C
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu. biochemischen Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in assimilierbare Kohlen- und StickstofTquellen, anorganische Salze und Wuc'.isstoffe enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt an Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten.The invention relates to a method. biochemical production of L-leucine by aerobic breeding of microorganisms in assimilable sources of carbon and nitrogen, inorganic salts and substances nutrient media containing isoleucine, methionine, phenylalanine and / or valine at the usual temperature and pH values.

!.-'..euciii ist eine Aminosäure, die Lebensmitteln für Menschen und Futtermitteln für Tiere als Nährstoff zugesetzt werden kann.! .- '.. euciii is an amino acid that is food for humans and feed for animals can be added as a nutrient.

Es ist bekannt (vgl. japanische Patentschrift 14395/ 63), daß L-Leucin durch Züchten eines Mutanten-Stammes von Micrococcus glutamicus in einem Valin enthaltenden Nährmedium gebildet werden kann; über die erreichbare Ausbeute wurden keine Angaben gemacht. Auch ist bekannt (vgl. Zeitschrift »Amino Acids and Nucleic Acids«, 8 [1964], S. 53), daß die Vermehrungsgeschwindigkeit von Mutantenstämmen von Corynebacterium glutamicum (Synonym für Micrococcus glutamicus) durch Gegenwart von I.·*?- leucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin beachtlich gesteigert werden kann. Schließlich ist bekannt (vgl. britische Patentschrift 1 071 935, französische Patentschrift 1 367 815), daß man Aminosäuren im allgemeinen, insbesondere auch L-Leucin, durch Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium herstellen kann; dabei wird mit Brevibacterium flavum ATCC 14067 eine Ausbeute an L-Leucin von 24,4 mg/Liter erreicht.It is known (see Japanese Patent Specification 14395/63) that L-leucine can be produced by cultivating a mutant strain can be produced by Micrococcus glutamicus in a nutrient medium containing valine; No information was given about the achievable yield. It is also known (cf. magazine »Amino Acids and Nucleic Acids «, 8 [1964], p. 53) that the rate of propagation of mutant strains of Corynebacterium glutamicum (synonym for Micrococcus glutamicus) by the presence of I. *? - leucine, methionine, phenylalanine and / or valine can be increased considerably. After all, it is known (See British patent specification 1,071,935, French patent specification 1,367,815) that amino acids in general, including L-leucine, by growing microorganisms in a hydrocarbon as a nutrient medium containing carbon sources; this is done with Brevibacterium flavum ATCC 14067 achieved an L-leucine yield of 24.4 mg / liter.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von L-Leuein mit hoher Ausbeute zu schaffen.The invention is based on the object of an economical process for the production of L-Leuein to create with high yield.

Ausgehend von der biochemische!.; Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wuchsstoffe enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt an Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Cornyebacterium glutamicum ATCC21301 oder ATCC 21335 einsetzt. — Kulturen dieser Mikroorganismen sind für die öffentiichkeit in der »American Type Culture Collection« hinterlegt.Starting from the biochemical!.; Production of L-leucine by aerobic cultivation of microorganisms in nutrient media containing assimilable carbon and nitrogen sources, inorganic salts and growth substances, which contain isoleucine, methionine, phenylalanine and / or valine, with this usual temperature and pH values, the invention is characterized in that the microorganisms Cornyebacterium glutamicum ATCC21301 or ATCC 21335 is used. - Cultures of these microorganisms are for the public in the »American Type Culture Collection «.

In dem Nährmedium können als Kohlenstoffquellen Fruktose. Mannose, Galaktose, Maltose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Melasse, Glycerin, Essigsäure od. dgl. verwendet werden; vorzuziehen ist jedoch die Verwendung von Glukose. Als Stickstoffquellen kommen im wesentlichen Ammoniak, Harnstoff, Ammonsulfat, Ammonchlorid, Ammonacetat oder Ammonsalze von anderen organischen Säuren in Frage. Als anorganische Salze für sind das Nährmedium Eisen-, Mangan-, Magnesium-, Kobalt-, Zink-, Nickel-, Chromsalze u. dgl. ebenso verwendbar wie Phosphorsäureverbindungen. Als Wuchsstoffe können Aminosäuren (Cystin, Cystein, Glutaminsäure), Vitamine (Biotin, Thiamin), Hefeextrakt, handelsübliche Sojabohnenmehl-HydroIysatlösung, Maisquellwasser, Pepton, Eiweißhydrolysat, Fleischextrakt, Hydrolysate mikrobieller Zellen u. dgl. verwendet werden. Die M~nge des zusetzenden Isoleucins, Methionins, Phen\lalanins und/oder Valins hängt von den Zuchtbedingungen und der Art der verwendeten Aminosäuren ab; ah Richtwert wird 50 bis 1000y/ml angegeben.Fructose can be used as a carbon source in the nutrient medium. Mannose, galactose, maltose, sucrose, Starch hydrolyzate, molasses, glycerine, acetic acid or the like can be used; however, this is preferable Use of glucose. The main nitrogen sources are ammonia, urea, ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium acetate or ammonium salts other organic acids in question. As inorganic salts for the nutrient medium iron, Manganese, magnesium, cobalt, zinc, nickel, chromium salts and the like can be used as well as phosphoric acid compounds. Amino acids (cystine, cysteine, glutamic acid), vitamins (biotin, thiamine), yeast extract, commercially available soybean flour hydrolyzate solution, Corn steep liquor, peptone, protein hydrolyzate, meat extract, microbial cell hydrolyzate and the like can be used. the Amount of isoleucine, methionine, phenalanine to be added and / or valine depends on the cultivation conditions and the type of amino acids used away; The guideline value is given as 50 to 1000 y / ml.

Die L-Leucin-Fermentation ist unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Züchtungstemperatur liegt bei 25 bis 40 "C, vorzugsweise zwischen 27 und 37 C. Der pH-We-t wird während des Züchtens zweckmäßigerweise mit Hilfe eines geeigneten Neutralisierungsmittels, wie z. B. Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Harnstoff u. dgl., auf 5,5 bis 8,5 eingestellt. Nach 3- bis otägigem Züchten hat sich das L-Leucin angesammelt. Nach dem Züchten werden die Mikroorganismenzellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Das Filtrat wird beispielsweise durch Behandlung mit einem stark sauren Kationen-Austauscherharz gereinigt, wonach das dabei absorbierte L-Leucin zur Gewinnung von Rohkristallen eluiert, konzentriert und in üblicher Weise gekühlt wird.The L-leucine fermentation is under aerobic conditions perform. The growth temperature is 25 to 40 "C, preferably between 27 and 37 C. The pH-We-t is expediently adjusted during cultivation with the help of a suitable neutralizing agent, such as Ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, urea and the like are adjusted to 5.5 to 8.5. After 3- to L-leucine has accumulated every day of cultivation. After cultivation, the microorganism cells become separated by filtration or centrifugation. The filtrate is, for example, treated with Purified a strongly acidic cation exchange resin, after which the absorbed L-leucine to Obtaining crude crystals is eluted, concentrated and cooled in the usual way.

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren erreichte technische Fortschritt besteht darin, daß das L-Leucin in einer Menge von mehr als 10 mg/ml, also in wesentlich höherer Ausbeute als bei den bekannten Verfahren gewonnen wird.The technical progress achieved by the process according to the invention is that the L-leucine in an amount of more than 10 mg / ml, so in a much higher yield than the known Procedure is won.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert.The invention is explained in more detail below with reference to a few exemplary embodiments.

example 1

Ein Nährmedium wurde mit Corynebacterium glutamicum ATCC 21301 beimpft; das Nährmedium enthielt Pepton (lg/dl). Fleischextrakt (lg/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und Glukose (2 g/dl); es hatte ein pH von 7,0. Die Züchtung wurde zur Bildung einer Impfkultur 24 Stunden fortgesetzt.A nutrient medium was inoculated with Corynebacterium glutamicum ATCC 21301; contained the nutrient medium Peptone (lg / dl). Meat extract (lg / dl), yeast extract (0.5 g / dl), sodium chloride (0.3 g / dl) and Glucose (2 g / dl); it had a pH of 7.0. The cultivation was allowed to form an inoculum for 24 hours continued.

Die Fermentation wurde unter Verwendung eines Nährmediums ausgeführt, das Glukose (10 g/dl), Ammonsulfat (2 g/dl), KH₂PO₁ (0,15 g/dl), K,HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄-7 HjO (0,05 g/dl), Phenylalanin (150 y/ml), Isoleucin (lOOy/ml), Methionin (100 y/ml), Valin (100 y/ml), Biotin (100 y/ml) und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt. Jeweils 20 ml dieses Nährmediums wurden in 250-ml-ErlenmeyerkoIben gefüllt und jeweils sterilisiert. Das sterile Nährmedium in jedem dieser Kolben wurde mit 1 ml der Impfkultur beimpft, deren Herstellung oben beschrieben wurde. Die Fermentation wurde unter 5tägigem Schütteln bei 28°C durchgeführt. Es sammelte sich in dem Fermenta-The fermentation was carried out using a nutrient medium containing glucose (10 g / dl), ammonium sulfate (2 g / dl), KH ₂ PO ₁ (0.15 g / dl), K, HPO ₄ (0.05 g / dl ), MgSO ₄ -7 HjO (0.05 g / dl), phenylalanine (150 y / ml), isoleucine (100 y / ml), methionine (100 y / ml), valine (100 y / ml), biotin (100 y / ml) and CaCO ₃ (2 g / dl). In each case 20 ml of this nutrient medium were filled into 250 ml Erlenmeyer flasks and each sterilized. The sterile nutrient medium in each of these flasks was inoculated with 1 ml of the inoculum culture, the preparation of which was described above. The fermentation was carried out with shaking for 5 days at 28 ° C. It collected in the fermentation

tionsmedium jedes Kolbens durchschnittlich eine Menge von 9,5 mg/ml L-Leucin an.tion medium of each flask an average of 9.5 mg / ml L-leucine.

1 Liter Fermentationsmedium wurde gesammelt und zur Entfernung der Mikroorganismenzellen zentrifugiert. Das Filtrat wurde durch eine Harzkolonne, die mit einem handelsüblichen, stark sauren Kationen-Austauscherharz in seiner Η-Form gefüllt war, geschickt. Dann wurde das Harz mit wäßriger 0,2n-Ammoniaklösung gewascüen, um das L-Leucin zu eluieren. Die Fraktionen, die das eluierte L-Leucin enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Nach Stehenlassen erhielt man Rohkristalle (6,5 g) von L-Leucin, welchen man Methanol zusetzte (700 ml, 70gewichtsprozentig). Man erhitzte und ließ dann die Lösung abkühlen. Der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und mit Methanol (70gewichtsprozentig) gewaschen, um gereinigtes L-Leucin zu erhalten.1 liter of fermentation medium was collected and centrifuged to remove the microorganism cells. The filtrate was passed through a resin column, the was filled with a commercially available, strongly acidic cation exchange resin in its Η form, sent. Then, the resin was washed with 0.2N aqueous ammonia solution to add L-leucine elute. The fractions containing the eluted L-leucine were pooled and concentrated. To Left to stand, crude crystals (6.5 g) of L-leucine were obtained, to which methanol (700 ml, 70 percent by weight). The solution was heated and then allowed to cool. The obtained precipitate became separated and washed with methanol (70% by weight) to obtain purified L-leucine.

Die analytischen Ergebnisse durch Papierchromatographie uno lutomatische Aminosäure-Analysen bewiesen, daß das L-Leucin, das nach dem obengenannten Verfahren erhalten wurde, ähnliche Eigenschaften aufwies wie L-Leucin, welches man nach bekannten Verfahren erhalten hatte. Das nach dem obengenannten Verfahren erhaltene Produkt war biologisch aktiv und für das Wachstum von Stämmen verwendbar, die für die biologische Prüfung von L-Leucin brauchbar waren. Der Schmelzpunkt lag bei 298° C (zersetzt).The analytical results by paper chromatography uno lutomatic amino acid analyzes proved that the L-leucine, which after the above Method was obtained, had similar properties as L-leucine, which is known according to Procedure had received. The product obtained by the above process was biologically active and useful for growing strains useful for biological testing of L-leucine was. The melting point was 298 ° C (decomposed).

Example 2

Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wieA fermentation was carried out in a similar way - like

im Beispiel 1 beschrieben — ausgeführt, nur mit dem Unterschied, daß ein Medium verwendet wurde, welches Glukose (12 g/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Ammonsulfat (2g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05g/dl), MgSo₄-7H₂O (0.05g/dl), IeSO₄-7H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ - 4H_aO (0,002 g/dl), Biotin (50 y/ϊ)described in Example 1 - carried out, with the only difference that a medium was used, which glucose (12 g / dl), yeast extract (0.5 g / dl), ammonium sulfate (2g / dl), KH ₂ PO ₄ (0 , 15 g / dl), K ₂ HPO ₄ (0.05g / dl), MgSo ₄ -7H ₂ O (0.05g / dl), IeSO ₄ -7H ₂ O (0.002 g / dl), MnSO ₄ - 4H _a O (0.002 g / dl), biotin (50 y / ϊ)

ίο und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt.ίο and CaCO ₃ (2 g / dl) contained.

Die Fermentation wurde 4 Tage lang bei 29 ⁰C durchgeführt. Im Fermentationsmedium eines jeden Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,0 mg/ml L-Leucin an.The fermentation was carried out ^{at 29 ° C. for 4 days.} An average of 11.0 mg / ml L-leucine accumulated in the fermentation medium of each flask.

B e i s ρ ι e I 3B e i s ρ ι e I 3

Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wie im Beispiel 1 beschrieben — mit dem Unterschied durchgeführt, daß Corynebacterium glutamicumA fermentation was carried out in a similar manner - as described in Example 1 - with the difference carried out that Corynebacterium glutamicum

ao ATCC 21335 und ein Medium verwendet wurden, das FeSo₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), MnSo₄ · 4H₂O (0,002 g/dl), Glukose (12 g/dl), Pepton (1 g/dl), Ammonsulfat (2 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), Biotin (50y/l) und Cat. J₃ (2 g/dl) enthielt. Im Fermentationsmedium eines jeden Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,4 mg/ml L-Leucin an.ao ATCC 21335 and a medium containing FeSo ₄ · 7H ₂ O (0.002 g / dl), MnSo ₄ · 4H ₂ O (0.002 g / dl), glucose (12 g / dl), peptone (1 g / dl ), Ammonium sulfate (2 g / dl), KH ₂ PO ₄ (0.15 g / dl), K ₂ HPO ₄ (0.05 g / dl), MgSO ₄ · 7H ₂ O (0.002 g / dl), biotin (50y / l) and Cat. J contained ₃ (2 g / dl). An average of 11.4 mg / ml L-leucine accumulated in the fermentation medium of each flask.

Claims

Claim:

Process for the biochemical production of L-leucine by aerobic cultivation of microorganisms in assimilable sources of carbon and nitrogen, inorganic salts and growth substances containing nutrient media which contain isoleucine, methionine, phenylalanine and / or valine _xo , at the temperature and pH customary for this Values, characterized in that Corynebacterium glutamicum ATCC 21301 or ATCC 21335 are used as microorganisms.