DE2330426C2

DE2330426C2 - Verfahren zur Herstellung von D-Ribose

Info

Publication number: DE2330426C2
Application number: DE19732330426
Authority: DE
Inventors: Ken-ichi Kawani Hyogo Sasajima; Masahiko Kobe Yoneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-06-17
Filing date: 1973-06-15
Publication date: 1985-07-18
Also published as: GB1406182A; FR2189513B1; NL7308369A; NL175735C; DK134569B; JPS4920388A; JPS5016878B2; CA996483A; FR2189513A1; CH585790A5; DE2330426A1; IT986911B; NL175735B; DK134569C

Description

20 μ-Mol D-Rlbose-5-phosphat, 0,5 μ-ΜοΙ NADH₁ D-Rlbose-5-phosphatlsomerase, D-Rlbose-5-phosphateplmerase, 0,66 Einheiten a-Glycerophosphatdehydrogenase, die Trlosephcsphatlsomerase enthält, und 60 μ-ΜοΙ Tris(hydroxymethyl)amlnomethan-HC!-PufferIösung (pH 7,5).

Reaktionslösung B:

20 μ-Mol MgCIj, 0,43 μ-Mol Thlamlnpyrophosphat, 40 μ-Mol Trls(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-PufTerlösung (pH 7,5) und eine gegebene Menge der Enzymlösung.

III. Bestimmung der Transketolaseaktivität
Jede Reaktionslösung wird 10 Minuten bei 30° C bebrütet. Die Reaktionslösungen werden dann gemischt

(Gesamtvolumen 2 ml), worauf ihre Extinktion bei 340 ΐημ im Laufe der Zelt gemessen wird. Die Transketoiaseaktivität (μ-Mol/Mln./mg Protein) in der Enzymlösung wird durch die folgende Formel ausgedrückt:

UX

Hierin Ist -4E₃₄₀ZM_1n. ^dIe Geschwindigkeit der Abnahme der reinen Absorption der gemischten Reaktionslösung bei 340 ηιμ für 1 Minute, V das Gesamtvolumen des Gemisches der Reaktlonsiösungen (2 ml), Σ der molare Extlnklonskoefflzient von NADH bei 340 ΐημ (6,22 οπι²/μ-Μο1), d der Lichtweg (1 cm), E das Volumen der Enzymlösung (0,1 ml) und ρ das Gewicht des Proteins in der Enzymlösung (mg/ml).

Als Testmikroorganismen wurden bekannte Stamme von Aminosäuren benötigende Mikroorganismen, nämlich Bacillus pumllus Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtllis Nr. 429 (britische Patentschrift 12 55 254) sowie Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktlvltat, nämlich die Bacillus species Shi 5 und Shi 7 [Agricultural and Biological Chemistry, Band 35, Nr. 4, SeIM 509 (1971)], verwendet. Zum Vergleich wurden Wildstämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis verwendet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

	Prnl^in (mg/ml)	optische Dichte (-ΔΕΜΟ/Mm.)	Transketolaseaktiyität (μ-Mol/ (%) Min./mg, Protein)	100
Bacillus pumilus (Wildstamm)	2a	0,165	0,24	0
Bacillus pumilus No. 503	1,9	< 0,005	0,00	0
Bacillus pumilus No. 537	1,8	< 0,005	0,00	100
Bacillus subtilis (Wildstamm)	2,0	0,080	0,13	0
Bacillus subtilis 1"ο. 429	1,7	< 0,005	0,00	0
Bacillus species Shi 5	1,8	< 0,005	0,00	0
Bacillus species Shi 7	1,9	< 0,005	0,00

25 30 35

Bel der vorstehend beschriebenen Bestimmung der Transketolaseaktlvität wurde als Enzymlösung die klare Lösung als solche verwendet, und die Aktivität wurde zumindest bis hinab zur zweiten Dezimalstelle mit Null ermittelt. Bei dieser Methode wurde jedoch keine wesentliche Zahl an der dritten Dezimalstelle gefunden.

Weitere Untersuchungen über die Bestimmung der Transketolaseaktlvität führten zur Entwicklung einer Methode, bei der die Berechnung der Transketolaseaktlvität richtig bis hinab zur dritten Dezimalstelle an einer konzentrierten Lösung, die durch Ultrafiltration der Enzymlösung bei der vorstehend beschriebenen Bestimmungsmethode erhalten wird, vorgenommen werden kann. Hierbei wird die Enzymlösung durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, z. B. der DIAFLO-Membran PM 10 konzentriert, bis sie etwa Vio Ihres ursprünglichen Volumens hat. Von der Anmelderin wurde die In dieser Weise konzentrierte Lösung als Enzymlösung verwendet.

Bei dieser Methode zeigte es sich, daß die Transketolaseaktivität der Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen und der Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktlvität an der dritten Dezimalstelle nicht Null betrug. Weitere Untersuchungen der Stämme und Kultivierungsmethoden fühlten zu der Feststellung, daß Stämme, deren Transketolaseaktlvltat wenigstens bis zur fritten Dezimalstelle Null Ist, D-Rlbose in größerer Menge als die Aminosäuren benötigenden Mikroorganismen und die Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität anzuhäufen vermögen, und daß die angehäufte Menge etwa 40 bis 50 mg/ml Kulturmedium, das nach den bekannten Verfahren erhalten wird, betragen kann. Es wurde ferner gefunden, daß die Stämme, deren Transketolaseaktivität bis wenigstens zur dritten Dezimalstelle Null beträgt (nachstehend einfach als »die Mikroorganismen« bezeichnet), eine wesentlich größere D-Rlbosemenge anhäufen, wenn sie In Gegenwart einer zweibasischen organischen Säure kultiviert werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind die Stämme Bacillus pumilus Nr. 716 (=IFO 13322) und Bacillus subtilis Nr. 608 (=IFO 13323). In Tabelle 2 1st die Transketolaseaktivität dieser Stämme Im Vergleich zu Bacillus pumilus Nr. 503 und Nr. 537 und Bacillus subtilis Nr. 429, Bacillus species ShI 5 und ShI 7 angegeben. Diese Werte wurden unter Verwendung der Enzymlösung als solche (Methode I) und der konzentrierten Enzymlösung (Methode II) ermittelt.

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Tabelle 2

Relative Transketolaseaktivitäten

	Methode 1	Extinktion	Transketolaseaküvjtül	%	Methode 11	Extinktion	Transkctolaseaktivitiit	%	U)
Mikroorganismus	Protein mg/ml	-ΔΕμο/Μιλ.	μ-Mol/Min./mg		Protein mg/ml	-uEuatMln.	μ-Mol/Min./mg		U) O
			Protein	0			Protein	2	-P» io
		< 0,005	0,00 (< 0,01)	0		0,030	0,005	3
Bacillus pumilus No. 503	1,9	< 0,005	0,00 (< 0,01)	0	19,1	0,045	0,008	0
Bacillus pumilus No. 537	3,8	< 0,005	0,00 (< 0,01)	0	19,0	< 0,005	0,00 (< 0,001)	3
Bacillus pumilus No. 716	2,0	< 0,005	0,00 (< 0,01)	0	20,3	0,025	0,004	0
Bacillus subtilis No. 429	1,7	< 0,005	0,00 (< 0,01)	0	20,0	< 0,005	0,000 (< 0,001)	3
Bacillus subtilis No. 60S	2,2	< 0,005	0,00 (< 0,01)	0	22,4	0,040	0,007	3
Bacillus species Shi 5	1,8	< 0,005	0,00 (< 0,01)	19,5	0,045	0,007
Bacillus species Shi 7	1,9			19,8

In Tabelle 3 Ist die Fähigkeit der vorstehend genannten Stämme zur Bildung von Rlbose nach der nachstehend genannten Methode angegeben:

Eine Impfnadelmenge der Schrägkultur des Testmikroorganismus wurde In 20 ml eines Mediums geimpft, das 2% Sorbit, 2% Malsquellwasser, 0,3% Dlkallumhydrogenphosphat, 0,1% Kallumdlhydrogenphosphat, 100 y/ml L-Tryptophan, 100 y/ml L-Phenylalanln und 100 y/ml L-Tyrosln enthielt und In einem 200-ml-Kolben enthalten ^s war. Eine Impfkultur wurde hergestellt. Indem 16 Stunden bei 37° C auf einer rotierenden SchUttelmaschine bei 200 Upm bebrütet wurde.

2 ml der Impfkultur wurden In 20 ml eines Hauptkulturmedlums (nachstehend als Medium A bezeichnet) überführt, das 15% D-Glukose, 1,5% Trockenhefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 2% Calclumcarbonat, 100 y/ml L-Tryptophan, 100 y/ml L-Phenylalanln und 100 y/ml L-Tyrosln enthielt und In einem 200-ml-Kolben enthalten '" war. Die Bebrütung wurde 6 Tage bei 37° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 Upm vorgenommen.

Die In den Kulturmedien angehäufte Menge der D-Rlbose wurde nach der Methode bestimmt, die In »Agricultural and Biological Chemistry«, Band 35, Seite 509 (1971), beschrieben Ist.

Tabelle 3 Fähigkeit zur Ribose-Bildung Mikroorganismus angehäufte Ü-Kibose ^₁

mg/ml

Bacillus pumilus Nr. 503 29 Bacillus pumilus Nr. 537 28 Bacillus pumilus Nr. 716 45 Bacillus subtilis Nr. 429 26 Bacillus subtilis Nr. 608 -55 Bacillus species Shi 5 31 _J() Bacillus species Shi 7 27

Die Mikroorganismen haben die genetischen Merkmale, daß sie nicht auf Kohlehydraten, wie D-Glukonsäure, L-Aralblnose und D-Rlbose als ausschließliche Kohlenstoffquellen wachsen können und daß sie zum Wachstum Shikimisäure oder gleichwertige Substanzen, wie L-Tyrosln, L-Tryptophan oder L-Phenylalanln benötigen.

Weitere genetische und biochemische Merkmale, In denen diese Stämme sich von den bekannten Stämmen unterscheiden, bestehen darin, daß Ihre Transketolaseaktlvität unter der zur Zelt bekannten Grenze der Nachweisbarkeit liegt und Ihre Entwicklung und die Anhäufung von D-Rlbose sehr hoch sind.

Zur Kultivierung der Mikroorganismen können als Kohlenstoffquellen D-Glukose, D-Fruktose, D-Mannose, Sorbit., D-Mannlt, Saccharose, Maltose, Dextrin, lösliche Stärke, ausgebrauchte Melasse usw. und als Stickstoffquellen verschiedene anorganische und organische Stickstoffverbindungen und diese enthaltende Substanzen, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff, Malsquellwasser, Tr^kenhefe, Fleischextrakt, Pepton und Kaseinhydrolysat, verwendet werden. Außer diesen Bestandteilen müssen als zum Wachstum notwendige Faktoren Shikimisäure oder ihre Derivate (z. B. der Methylester und Äthylester) dem Medium zugesetzt werden.

Natürlich können als Ersatz für Shikimisäure oder ihre Derivate auch aromatische Säuren, z. B. L-Tyrosln, L-Tryptophan, L-Phenylalanln und deren Derivate (z. B. die Methylester, Äthylester, Acetylate und Benzoylate) verwendet werden.

Die vorstehend genannten aromatischen Aminosäuren müssen nicht unbedingt reine Produkte sein. Beispielsweise können ebensogut Trockenhefe, Polypepton, Fleischextrakt, Kaseinhydrolysate usw., die aromatische Aminosäuren entfalten, verwendet werden. Bei Verwendung der vorstehend genannten aromatischen Aminosäuren als Stickstoffquelle können sie daher In einem leichten Überschuß Ober den Bedarf als StickstofTquelle verwendet werden. Die Anhäufung von D-Ribose kann welter gesteigert werfen, Indem dem Nahrmedlum eine zweibasische organische Säure mit 2 bis 5 C-Atomen, z. B. Apfelsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure oder Glutarsäure oder ein Alkalisalz dieser Säuren, zugesetzt wirf. Im allgemeinen liegt der Anteil dieser Säure Im Bereich von 0,002 bis 0,2 Mol, Insbesondere etwa 0,003 bis 0,05 Mol.

Der typische Einfluß der Zugabe dieser zweibasischen organischen Säuren bei Verwendung von Bacillus pumilus Nr. 716 und Bacillus subtilis Nr. 608 ergibt sich aus Tabelle 4.

Tabelle 4 Einfluß der Zugabe von zweibasischen organischen Säuren auf die Anhäufung von D-Ribose

Zweibasische	Menge mg/1
organische Säuren	O
V,.r4indung	500
Oxalsäure	100
(C₂O₄H₂)	500
Malonsäure	100
(C₃H₄O₄)	500
Maleinsäure	500
(C₄H₄O₄)	-
Fumarsäure	100
(C₄O₄H₄)	500
Bernsteinsäure	100
(C₄H₄O₁)	500
Glutarsäure	500
(C₅H₈O₄)	-
Adipinsäure	500
(C₆O₄H₁₀)	-
Korksäure	500
(C₈O₄H₁₄)	-
Sebacinsäure
(CoO₄Hi₈)

Anhäufung von D-Ribose, mg/ml Bacillus Bacillus

pumilus subtilis

Nr. 716

Nr. 608

Bacillus subtilis

Nr. 632

58

46
55

27

45
55

45
53

46

57

55

4?
52

46

55
44

35
21

48 56 47 55 48 55 54

49 53

45 54

37 39 29

Die Ergebnisse In Tabelle 4 wurden nach der gleichen Kultivierungsmethode und der gleichen Bestimmungsmethode wie bei dem Versuch In Tabelle 3 erhalten mit dem Unterschied, daß die genannten Mengen der zwelbasischen organischen Säuren dem Medium A zugesetzt wurden.

Wie die vorstehenden typischen Ergebnisse zeigen, bewirken zweibasische organische Sauren eine Steigerung der Ausbeuten an D-Rlbose, wobei Maleinsäure besonders wirksam Ist. Außer den vorstehend genannten Bestandteilen können Magnesiumsulfat, Calciumphosphat, Calclumcarbonat usw. zugesetzt werden.

Die Mikroorganismen können nach Verfahren, die für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein üblich sind, kultiviert werden, jedoch Ist die Submerskultur am zweckmäßigsten. Die Kultivierungstemperatur, der pH-Wert und die Kultivierungsdauer sind weltgehend freigestellt, jedoch wird eine genügend große Menge D-Rlbose gebildet und angehäuft, wenn der Stamm 24 bis 120 Stunden bei 25 bis 45° C und einem pH-Wert von 4,5 bis 8,5 kultiviert wird.

Für die In dieser Welse angehäufte D-Rlbose aus dem Kulturmedium wird ein Verfahren empfohlen, bei dem die Zellen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt werden, das erhaltene Flltrat oder der Überstand mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharzen zur Entfärbung bzw. Entsalzung behandelt, eingeengt und anschließend ein organisches Lösungsmittel, z. B. Äthanol, zum Konzentrat gegeben und hierdurch die Kristallisation der gewünschten Verbindung bewirkt wird. Wenn das Fermentationsprodukt durch andere Kohlenhydrate als die gewünschte D-Rlbose verunreinigt Ist, können diese Kohlenhydrate durch Behandlung des Produkts mit Glukoseoxydase oder mit einem Stamm eines Mikroorganismus, der D-Rlbose nicht verwertet, aber die jeweiligen Kohlenhydrate verwertet, entfernt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele welter erläutert. Hierbei bedeutet die Abkürzung IFO »Institute for Fermentation Osaka«. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen (g/100 ml), falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Bacillus pumilus Nr. 716 (IFO 13322) wurde In 10 1 eines Mediums geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellwasser, 0,3% Dlkaliumphosphat und 0,1% Monokallumphosphat enthielt. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 36° C bebrütet, wobei eine Impfkultur erhalten wurde. Mit dieser Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15% D-Glukose, 1,0% Trockenhefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 2,0% CaCO₃ und 100 mg L-Tryptophan pro Liter enthielt, worauf 72 Stunden bei 36° C unter Belüftung und Bewegung kultiviert wurde. Hierbei wurde D-Ribose in einer Menge von 45 g/l im Medium angehäuft. Diese D-Rlbose-Fermentationsbrühe wurde zur Entfernung der Zellen filtriert. Das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt und dann mit Äthr.r- i In einer Menge von etwa V₄ seines Volumens versetzt. Die Fällung wurde verworfen und die Lösung mil einem Kationenaustauscherharz und einem Anionenaustauscherharz entsalzt und dann an einer Aktivkohlesäule entfärbt. Die entfärbte Lösung wurde eingeengt und dann mit etwa dem 4fachen Volumen Äthanol versetzt. Hierbei wurden 3,5 kg kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 2

Bacillus subtills Nr. 608 (IFO 13323) wurde In 10 1 eines Impfmediums der In Beispiel 1 genannten Zusammensetzung geimpft. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 36° C unter Belüftung und Bewegung bebrütet. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15% D-Glukose, 1,2% Trockenhefe, > 0,3% Ammoniumsulfat, 2,0% CaCOj und pro Liter 100 mg L-Phcnylalanln, 50 mg L-Tyrosln, 50 mg L-Tryptophan und 10 mg Shikimisäure enthielt. Das geimpfte Medium wurde 84 Stunden bei 37° C unter Belüftung und Rühren bebrütet, wobei 45,5 g D-Rlbose pro Liter Im Medium angehäuft wurden.

Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium entfernt und das Flltrat auf die In Beispiel 1 beschriebene Welse aufgearbeitet. Hierbei wurden 3,5 kg kristalline D-Rlbose erhalten. ^lü

Beispiel 3

Mit dem in Beispiel 1 verwendeten Stamm Bacillus pumllus Nr. 716 (IFO 13322) wurden 10 I eines Mediums geimpft, das 2% Sorbit, 2% Malsquel!wasser, 0,3% Dikaliumphosphat und 0,1% Monokallumphosphat enthielt. Das geimpfte Medium wurde 24 Stunden bei 37⁰C kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 I eines Mediums geimpft, das 15% D-Glukose, 1,0% Trockenhefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 2,0% CaCOj und pro Liter 50 mg L-Tryptophan, 50 mg L-Tyrosln, 50 mg L-Phenylalanln und 500 mg Maleinsäure enthielt. Das gelmpOe Medium wurde unter Belüftung und Bewegung 90 Stunden bei 37° C bebrütet. Nach dieser Zelt betrug die angehäufte Menge D-PJbcse 60 mg/m!. Das KuUurmedium wurde auf die Ir, Beispiel 1 beschriebene Weise aufgear- -" beltet, wobei 4,5 kg kristalline D-Rlbose erhalten wurden.

Beispiel 4

Der In Beispiel 2 verwendete Bacillus subtills Nr. 608 (IFO 13323) wurde In 10 I eines Mediums geimpft, das -⁵ 2% Sorbit, 2% Malsquellwasser, 0,3% Dikaliumphosphat und 0,1% Monokaüumphosphat enthielt, und 24 Stunden bei 36° C kultiviert. Mit der erhaltenen Impfkultur wurden 100 1 eines Mediums geimpft, das 15% D-Glukose, 2,0% Trockenhefe, 0,5% Ammoniumsulfat, 2,0% CaCOj und 750 mg Maleinsäure/1 enthielt. Das geimpfte Medium wurde 72 Stunden bei 37° C unter Belüftung und Bewegung bebrütet, wobei D-Rlbose In einer Menge von 55,5 g/l Im Medium angehäuft wurde. ^Jn

Das Kulturmedium wurde auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Hierbei wurden 4,3 kg kristalline D-Rlbose erhalten.

Claims

Patentanspruch:

Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von D-Ribose durch Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus und Isolieren der gebildeten D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus pumilus IFO 13322 oder Bacillus subtills IFO 13323 züchtet.

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch genannte Verfahren zur Herstellung von D-Ribose.
Als Bestandteil von Nucleinsäuren kommt D-Rlbcse in allen Organismen vor. Rlbltol, ein Reduktionsprodukt von D-Ribose, ist in Vitamin B₂ und Ribltol-Teichonsäure, einem Bestandteil der Zellmembranen, vorhanden. Sie ist somit eine physiologisch sehr wichtige Substanz. Femer haben D-Rlbose und Ihre Derivate bisher starke Aufmerksamkeit als AusgangsmateriaUen far die Synthese von Vitamin B₂ und die sogenannten Nuclelnsäurewürzen auf sich gezogen, so daß die Entwicklung eines großtechnischen Verfahrens zur Herstellung von 'S D-Rlbose sehr erwünscht ist.

Zu den üblichen Verfahren zur Herstellung von D-Rlbose gehören Methoden, bei denen die D-Rlbose aus

Naturprodukten extrahiert wird, und Syntheseverfahren unter Verwendung von Furan, D-Glukose usw. als

Ausgangsmaterialien. Es wurde ferner über die fermentative Erzeugung von D-Ribose berichtet, aber die

Ausbeuten der Fermentation sind äußerst niedrig. Diese Verfahren sind somit nicht völlig befriedigend für die

²⁰ Großherstellung von D-Ribose.

Von der Anmelderin wurden bereits Verfahren zur Herstellung von D-Ribose unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus vorgeschlagen. Bei diesen Verfahren wird ein D-Ribose bildender Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der L-Tyrosin, L-Tryptophan und L-Phenylalanin zum Wachstum benötigt, (diese Mikroorganismen werden nachstehend als »Aminosäuren benötigende Mikroorganismen« bezeichnet) oder dem Transketolaseaktivität fehlt (nachstehend werden diese Mikroorganismen als »Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktlvität« bezeichnet), verwendet.

Das erstgenannte Verfahren, bei dem Aminosäuren benötigende Organismen verwendet werden, wird in der britischen Patentschrift 12 55 254 und das letztgenannte Verfahren, bei dem Mikroorganismen mit fehlender Transketolaseaktivität verwendet werden, in »Agricultural and B. logical Chemistry«, Band 35, Nr. 4, Seite 509 » (1971), beschrieben.

Die bei diesen Verfahren erhaltene Ausbeute an D-Ribose Hegt zwischen etwa 20 und 30 mg/ml Kulturmedium.

Sowohl die Mikroorganismen, die Aminosäuren benötigen, als auch die Mikroorganismen, denen Transketo- <3se fehlt, haben eine äußerst geringe Transketolaseaktivität. Insbesondere wurde bei den letztgenannten Mikrons Organismen aufgrund von Versuchen, in denen die Aktivität nach der nachstehend beschriebenen Methode von B. L. Horecker und Mitarbeitern [Journal of Biological Chemistry, Band 223, Seite 1009 (1956)1 gemessen wurde, angenommen, daß sie keine Transketolase enthalten.

I. Herstellung der rohen Enzymlösung

Die Schrägkultur eines Stammes, dessen Transketolaseaktivität bestimmt werden soll, wird in 200 ml eines modifizierten Spizlzen-Medlums [Agricultural and Biological Chemistry, Band 34, Nr. 3. Seite 381 (1970)] Oberführt, das 0,496 (NH₄)JSO*, 1,4* KjHPO₄, 0,6% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄ · 7H₃O, 0,0004% Biotin, 0,0068% Adenin, 0,014% Guanosln, 0,5% Sorbit und 0,5% Natrium-L-glutamat als Kohlenstoffquellen enthält und In einem 1-1-Kolben enthalten ist, und bei 37° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. Nach einer Kultivierungsdauer von 16 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugleren Isoliert, mit einer 0,01-molaren Trls-(hydroxyrnethyl)amlnomethan-HCI-Pufferlösung (pH 7,5), die 0,001 Mol Mercaptoäthanol enthält, gewaschen und In der gleichen Pufferlösung so suspendiert, daß die Extinktion der Zellsuspension bei 650 Γημ 10 beträgt. Dann wird Lysozym der Zellsuspension in einer Konzentration von 50 Mg/ml zugesetzt. Die Suspension wird 90 Minuten

5·> bei 37° C bebrütet. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (1,2 χ 10⁴ g) entfernt. Die klare Lösung wird als Enzymlösung verwendet.

II. Herstellung von Reaktionslösungen 55 Reaktionslösung A: