DE1517827A1

DE1517827A1 - Verfahren zur Herstellung von Diaminopimelinsaeure

Info

Publication number: DE1517827A1
Application number: DE19661517827
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hagino; Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-07-23
Filing date: 1966-07-20
Publication date: 1969-05-14
Also published as: US3531372A; GB1085588A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD ^Ig ' DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 14.7.1966 Pu/Ax

Kyowa Hakko Kogyo Company Limited (Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha), No. 4, 1-chome, Ohte-machi, Chiyoda-ku, Tokyo-to (Japan)

Verfahren zur Herstellung von Diaminopimelinsäure

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Diaminopimelinsäure durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen.

Diaminopimelinsäure ist in den Zellwänden verschiedener Mikroorgansimen vorhanden und dient als Vorstufe für die Biosynthese von Lysin sowie ferner für die medizinische und biologische Forschung.

Seit langem wurde nach einem Mikroorganismus gesucht, der eine große Menge Diaminopimelinsäure in der Gärbrühe aus billigeren Materialien, die Kohlehydrate enthalten, zu bilden vermag. Es wurde nun gefunden, daß Diaminopimelinsäure nach einem verbesserten Verfahren mit niedrigeren Prodiuktionskosten in wirtschaftlicher Weise durch Fermentation hergestellt werden kann, wenn zur Fermentation Mutanten von Bacillus subtilis verwendet werden, wobei große Mengen Diaminopimelinsäure angereichert werden.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Diaminopimelinsäure durch Fermentation, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Fermentationsmedium, das ein Kohlehydrat enthält, mit einem Diaminopimelinsäure bildenden Mikroorganismus, der zu den Mutanten von

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Bacillus subtilis gehört, beimpft, das beimpfte Medium unter aeroben Bedingungen etwa 3-5 Tage bei einer Temperatur von etwa 25-35⁰C so behandelt, daß eine Gärbrühe gebildet wird, die Diaminopimelinsäure enthält, und die Diaminopimelinsäure von der Gärbrühe gewinnt.

Die Gewinnung der Säure aus der Fermentationsbrühe kann nach beliebigen üblichen Trennverfahren erfolgen, z.B. durch Abfiltrieren des Feststoffs und Zellmateriäls aus der Kulturflüsaigkeit, Konzentrieren der Kulturflüssigkeit und Äirchleitung der konzentrierten Kulturflüssigkeit durch einen üblichen Ionenaustauscher, der ein kationisches Ionenaustauschharz enthält, wodurch die Säure von der Brühe abgetrennt wird. Die Säure kann mit beliebigen üblichen Mitteln, z.B. unter Verwendung von wässrigem Ammoniak, aus dem Ionenaustauschharz ausgespült werden» Die Säure kann durch Pällung mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Äthanol, in gereinigter Form aus der eluierten lösung entfernt werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Diaminopimelinsäure durch Fermentation in einfacher und wirtschaftlicher Weise.

Für das Verfahren gemäß der Erfindung können auxotrophe Mutantenstämme verwendet werden, die aus Bacillus subtilis erhältlich sind und Diaminopimelinsäure zu bilden vermögen. Geeignet ist beispielsweise der Stamm, der durch Behandlung von Baaillus subtilis mit radioaktiven Strahlen, z.B. Röntgenstrahlen oder Ultraviolettstrahlen, erhalten wird. Bs hat sich gezeigt, daß die erhaltenen Mutanten Diaminopimelinsäure in einem Fermentationsmedium zu bilden vermögen, das Kohlehydrat und Stickstoffverbindungen enthält. Typische Mutantenstamme von Bacillus subtilis, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind KY 7525 (ATCC Nr. 19550) und KY 7526 (ATCC Nr. 19549).

Die Mutantenstämme, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, werden vor dem Beimpfen des Fermentationsmediums in beliebigen Nährmedien gezüchtet, die sioh

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zur ZUohtung von Baoillue subtilis eignen und als Zusatz eine Aminosäure und eine NuoleinsÄure enthalten. Ss hat eich gezeigt, daß diese Mutanten ohne Zusatz sowohl einer Aminosäure als auoh einer Nuoleinsäure nioht in einem Nährmedium zu waohsen vermögen« das βion zur Züchtung des ELt β met amme s eignet. Beliebige übliche lährmedimn für die Züchtung von Bacillus eubtilis können naoh Zugabe einer Aminosäure und einer Nuoleinsäurekomponente für die Züchtung der Mutantenstämme verwendet werden. Diese Nährmedien enthalten im allgemeinen neben der Nuoleinsäurekomponente und der Aminosäure ein Kohlehydrat, z.B. Glucose, Stärkehydrolysat usw., beliebige assimilierbare Stickstoff-Quellen, z.B. Harnstoff, Ammoniumohlorid und andere anorganische Verbindungen oder Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, beliebige anorganische Salze oder Salzgemische, z.B. Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(Il)-sulfat, Kaliumionen, Natriumionen usw. sowie beliebige übliohe organische Nährstoffe, z.B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Natiiumsalz von HNA., Oaseinhydrolysat, PoIypepton, fleischextrakt usw. Ferner kann Oalciumoarbonat zur Neutralisation und zur Einstellung des pg-Wertes verwendet werden·

SLn typisches Nährmedium für Baeillus subtilis, das für die Zwecke der Erfindung verändert werden kann, ist eine Modifikation des Mediums von Gray und Tatum. Dieses Medium wird hergestellt, indem die folgenden Substanzen zu 1 1 destilliertem Wasser gegeben werdeni

Glucose 1 g K₂HPO₄ 3 g NH₄Ol 5 g KH₂PO₊ 1 g Na₂SO₊ 1 g CaOl₂.2H₂O 0,001 g

* Diese lösung wird hergestellt durch Zusatz von 200 mg Zn, 200 mg Pe, 100 mg Ou, 20 mg Mn und 10 mg B zu 1 1 destilliertem Wasser. Das Nährmedium wird auf p„ 7,0 eingestellt.

Dieses Nährmedium kann modifiziert werden, indem ihm 100 mg wenigstens einer der folgenden Aminosäuren pro Liter Nähr-

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NH₄NO₃	1	β
MgSO₄^H₂O	O,	1 β
Lösung*	1	ml

medium zugesetzt werden»

L-Giutaminsäure, !-Asparaginsäure, Histidin, Arginin, Lyβin, Glyoin, Alanin, Leucin, Valin, Ieöleuοin, Prolin, Serin, threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Cystin, Methionin,· Tryptophan·

Stattdessen können auch 100 g rltaminfreie Oasamlnosäure in Pulverform (Handelsbezeichnung des gereinigten Produkts, das aus hydrolysiertem Oasein hergestellt wird und Ton nutritional Biochemical Corporation, U.S.A. erhältlich ist) verwendet werden·

Das endgültige Hährmedium kann hergestellt werden, indem 10 mg wenigstens einer der folgenden Nuolelnsäurekomponenten pro Liter des die Aminosäure enthaltenden Nähmediums zugesetzt wirdt Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoianthin, üraoil, Cytosin, Shymln·

Ss ist möglich, außer den genannten speziellen Stämmen beliebige andere Mutantenstämme iu verwenden, die von den genannten auxothrophen Mutanten abgeleitet sind, sowaVt diese abgeleiteten Mutanten eine große Menge Diaminopimelinsäure in einer fermentationsflüssigkeit zu bilden vermögen·

Mit der 2mpfkultur des Mutantenstamms, die mit dem lährmedium gebildet wurde, die die Aminosäure und luoleinsäure enthält, wird das Jermentationsmedium beimpft, um die Diaminopimelinsäure gemäß der Erfindung zu bilden· Dieses Termentationsmedlum kann beliebige Kohlehydrate enthalten· Typisοhe Kohlehydrate, die für die Zweoke der Erfindung geeignet sind, sind die Monosaccharide, z.B. Arablnose, Xylose, Dextrose, Mannose, läruloee usw., Disaooharide, z.B. Maltose, Saccharose usw., Polysaccharide, z.B. Dextrine, Stärkehydrolysate usw.

Das Permentationsmedium muß ferner eine Stickstoffverbindung enthalten· Pur die Zweoke der Erfindung eignen sich übliche Stickstoffverbindungen, z.B. Harnstoff, Ammoniumchlorld sowie beliebige andere anorganische Ammoniumsalze·

909820/0606 ^{BAD ofi;ciNAL}

Bas Nährmedium muß außerdem ein anorganisches Metallsal* enthalten! das zum Waohstum des Mikroorganismus erforderlioh ist. Im fermentationsmedium können beliebige Metallsalze, z.B. das oben genannte SaIs, verwendet werden· Vorzugsweise wird ein Gemisch solcher Salze in der Fermentationsbrühe verwendet· Den Fermentationsmedien werden beliebige übliche organische Nährstoffe zugesetzt, z.B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Natriumsalz von BNA, Caseinhydrolysat, Polypepton, Fleischextrakt usw. oder Gemische dieser Nährstoffe· Zur Einstellung dee p„-Wertes wird Oaloiumoarbonat dem Fermentationsmedium zugesetzt.

Ein typisches Fermentationsmedium für das Verfahren gemäß der Erfindung wird beispielsweise aus den folgenden Bestandteilen gebildet:

Glucose 5 g/dl Magnesiumsulfat 0,02 g/dl Harnstoff 0,4 g/dl Manganion 2 ppm Hefeextrakt 0,2 g/dl Natriumsalz von KNA 10 mg/dl Polypepton 0,1 g/dl Ammoniumchlorid 0,4 g/dl Zweibasisches Kaliumphosphat 0,1 g/dl

Fe-Ion . 2 ppm

Oaseinhydrolysat 0,2 g/dl Maisquellwasser 0,2 ml/dl Fleischextrakt 0,1 g/dl Oalciumoarbonat 2 g/dl

Das Medium wird vorzugsweise sterilisiert, indem es etwa 10 Minuten bei einem p^Wert von etwa 7,0 und bei 115⁰O autoklaviert wird« Der pg-Wert wird vorzugsweise auf 7,0 eingestellt. Bei diesem Wert wird günstiges Waohstum und die Bildung der höchsten Ausbeute an Mikroorganismen in den frühen Phasen erzielt.

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Die Herstellung und Bebrütung des Fermentationsmediurne mit dem Mutantenetamm wird wie folgt vorgenommen) Der von Bacillus eubtille erhaltene Mutantenstamm, der Gärbrühen zu bilden vermag» die Diaminopimelinsäure enthalten, und der durch Bebrüten des Nährmediums unter Rühren bei 30⁰O für eine Dauer von 16-24 Stunden erhalten wird, wird in 30 ml des Fermentationsmediums in einem Erlenmeyer-Kolben geimpft· Das beimpfte Medium wird dann etwa 3-5 Tage bei 25-35⁰C unter aeroben Bedingungen geschüttelt, wobei Diaminopimelinsäure in der Gärbrühe gebildet und angereichert wird· Nach beendeter Fermentatian werden die Zellen durch Filtration von der Kulturbrühe entfernt, wobei eine geklärte lösung erhalten wird, die eingeengt wird. Aus der eingeengten lösung, die rohe Diaminopimelinsäure enthält, kann eine verhältnismäßig reine lösung von Diaminopimelinsäure erhalten werden. Dies wird erreicht, indem die eingeengte lösung in einen Ionenaustauscher gegeben wird, der ein kationischee Ionenaustauschharz enthält, das die Säure von der lösung abtrennt. Pur die Zwecke der Erfindung können beliebige übliche kationische Ionenaustauschharze verwendet werden. Das Säureprodukt kann durch Spülen mit einer wässrigen lösung vom Ionenaustauschharz gewonnen werden« Das Produkt kann durch Fällung in reiner Form aus der wässrigen lösung abgetrennt werden.

Beispiel 1

Mit einem von Bacillus subtilis abgeleiteten Mutantenetamm der Bezeichnung KY 7526 (ATOO Nr. 19549) wurden 30 ml eines Mediums, das 5# Glucose, 1£ (NH^)₂SO₊, 0,05^ K₂HPO₊,

^ MgSO₊.7 H₂O, Q,3# Hefeextrakt und 1# OaCO₃ enthielt 7,0) und in einem Erlenmeyer-Kolben enthalten war, beimpft. Die Bebrütung wurde 4 Tage bei 30⁰C vorgenommen, wobei eine Gärbrühe erhalten wurde, die 4,2 mg Diaminopimelinsäure pro ml enthielt»

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Sie FermentationsbrUhe wurde duroh Zentrifugieren von den Zellen abgetrennt und dann duroh Säulen geleitet, die mit dem Kationenaustauschharz Dowex (50 χ 2) vom Cl-Typ (stark saures Polystyrol-Kationenaustauschharz, Hersteller Dow Chemical Co., Nidland, Mich., U.S.A.) gefüllt waren, wobei die Diaminopimelinsäure adsorbiert wurde. Die Säure wurde vom Ionenaustauschharz mit 0,Obigem wäßrigem Ammoniak eluiert, aufgefangen, eingeengt und in Äthanol gegeben, wobei die Diaminopimelinsäure ausgefällt wurde. Ausbeute 28 g.

Beispiel 2

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Welse wurde eine Fermentation mit einem von Bacillus subtllis abgeleiteten Mutantenstamm der Bezeichnung KY 7525 (ATCC Nr. 19550) durchgeführt, wobei eine Fermentationsbrühe erhalten wurde, die pro ml 4,5 mg Diaminopimelinsäure enthielt. Die Aufarbeitung auf die beschriebene Welse ergab ein gefälltes Produkt.

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Claims

- 8 Patentansprüche

1)Verfahren zur Herstellung von Diaminopimelinsäure duroh Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daB man ein Fermentationsmedium, das ein Kohlehydrat enthält, mit einem Diaminopimelinsäure bildenden Mikroorganismus von den Mutanten des Bacillus subtilis beimpft, das beimpfte Medium unter aeroben Bedingungen etwa J bis 5 Tage bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 35°C unter Bildung einer Fermentationsbrühe behandelt und die Diaminopimelinsäure aus der Brühe gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB man als Mikroorganismen solche der Stämme KY 7525 (ATCC Nr. 19550) oder KY 7526 (ATCC Nr. 19549) einsetzt.

5) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daft das Fermentationsmedium anorganische Salze enthält und einen pH-We|*t von etwa ¹J ,0 aufweist.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daB man die Diaminopimelinsäure aus der Fermentationsbrühe folgendermaßen gewinnt: Abfiltrieren des Zellmaterials unter Bildung einer klaren Lösung, Aufkonzentrieren dieser klaren Lösung unter anschließender Behandlung mit einem Kationenaustauschharz unter Absorption der Säure und schließlich Auswaschen der Säure vom Ionenaustauschharz.

5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fermentationsmedium auch noch eine Stickstoffquelle, vorzugsweise Harnstoff oder Ammoniumchlorid enthält.

":!::■-MAL INSPECTED

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