DE2429068C3 - Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin.

L-Histidin, eine der Aminosäuren, wird als wirksamer Bestandteil von Arzneimittelpräparaten und Nahrungsmittelzusätzen verwendet.

Es ist bekannt, daß L-Histidin durch Extraktion von Proteinhydrolisaten gewonnen werden kann. Dieses Verfahren ist wegen des komplizierten Extraktionsverfahrens von Nachteil. Es ist ferner bekannt, daß man L-Histidin durch Züchten einer Mutante von Brevibacterium flavum, Corynebacterium acetoacidthilum, Arthrobacter citreus, Micrococcus iuteus und Bacillus subtilis herstellen kann (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 7353/1972). Weiterhin ist es bekannt, daß man L-Histidin durch Züchten einer gegen histidinanaloge Verbindungen resistente Mutante von Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter citreus, Brevibacterium flavum, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Nocardia globerula bereiten kann (vgl. Amino acid und Nucleic Acid, 24, 79-86 [1971 J;. Es ist jedoch kein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin unter Verwendung eines Stammes des Genus Serratia bekanntgeworden.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß eine Mutante von Serratia marcescens, die keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweist und gegen 2-Methylhistidin resistent ist, in einem Nährmedium für die Bildung von L-Histidin hervorragend geeignet ist.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte L-Histidin-Ammoniak-Lyase-freie und gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante wurde dadurch erhalten, daß man einen wilden Stamm von Serratia marcescens mit einem Mutagen oder Ultraviolettstrahlen behandelte. Man behandelte einen wilden Stamm von Serratia marcescens mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und züchtete den Organismus während 2 bis 3 Tagen bei 30° C auf Agar-Platten, die die folgenden Bestandteile enthielten: 0,2% (Gewicht/Volumen) Glucose. 03% (Gewicht/Volumen) K₂HPO₄, 0,7% (Gewicht/Volumen) KH2PO4, 0.01% (Gewicht/Volumen) MgSOWH₂0,0,0005% (Gewicht/Volumen) (NH₄J₂SO₄, 0,2% (Gewicht/Volumen) L-Histidin-Hydrochlorid-monohydrat und 0,05% (Gewicht/Volumen) Natrium-citrat-trihydraL Die von L-Histidin-Ammoniak-Lyase freie Mutante von Serratia marcescens wurde in Form kleiner Kolonien isoliert Die keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase enthaltende Mutante von Serratia marcescens wurde sodann mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und dann während 3 bis 4 Tagen bei 30⁰C auf Agar-Platten gezüchtet, die die folgenden Bestandteile enthielten: 0,2% (Gewicht/Volumen) Glucose, 03% (Gewicht/Volumen) K₂HPO₄, 0,7% (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄, 0,01% (Gewicht/Volumen) MgSO₄-7H₂O, 0,1% (Gewicht/Volumen) (NH₄)₂SO₄, 0,05% (Gewicht/Volumen) Natrium-citrat-trihydrat und 0,1% bis 1% (Gewicht/Volumen) 2-Methylhistidin. Die L-Histidin-Ammoniak-Lyase-freie und gegen 2-MethyI-histidin resistente Mutante wurde in Form großer Kolonien isoliert. Eine lebensfähige Kultur dieser Mutante ist bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 31026 hinterlegt worden.

Die Fermentation der keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisenden und gegen 2-Methylhistidin resistenten Mutante von Serratia marcescens kann dadurch erfolgen, daß man den Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen entweder unter Schütteln oder unter submersen Bedingungen züchtet. Die Fermentation kann vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt werden. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums können Calciumcarbonat und Ammoniak verwendet weiden. Der für die Fermentation bevorzugte Temperaturbereich erstreckt sich von 25° C bis 37° C.

Das Fermentationsmedium erhält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere Elemente. Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentation umfassen Saccharide (zum Beispiel Glucose, Stärkehydrolysate), organische Säuren (zum Beispiel Fumarsäure, Zitronensäure), Polyalkohole (zum Beispiel Glycerin) und Kohlenwasserstoffe. Geeignete Stickstoffquellen umfassen Harnstoff, organische Ammoniumsalze (zum Beispiel Ammonium-acetat) und anorganische Ammoniumsalze (zum Beispiel Ammonium-sulfat oder Ammonium-nitrat). Die bevorzugten Mengen für die Kohlenstoffquelle und die Stickstoffquelle in dem Medium liegen in einem Bereich von 2% bis 15% (Gewicht/Volumen) bzw. 0,5% bis 3% (Gewicht/Volumen). Weiterhin können zu dem Medium organische Nährstoffe (zum Beispiel Maisquellwasser, Pepton oder Hefeextrakte) und/oder anorganische Elemente (zum Beispiel Kaliumphosphat oder Magnesium-sulfat) zugesetzt werden. Die erfindungsgemäße Fermentation oder Gärung kann im Verlaufe von etwa 24 bis 96 Stunden durchgeführt werden. In der Fermentationsbrühe sammelt sich L-Histidin an.

Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen und andere feste Kulturbestandteile in üblicher Weise von der Fermentationsbrühe abgetrennt, indem man das Material erhitzt und dann filtriert oder zentrifugiert. Zur Gewinnung und/oder Reinigung von L-Histidin aus dem Filtrat oder der überstehenden Lösung können bekannte Verfahrensweisen angewandt

werden. Zum Beispiel wird die abfiltrierte Fermentationsbrühe durch ein starkes Kationenaustauscherharz geführt oder damit behandelt Dann wird das Harz mit einer verdünnten alkalischen Lösung, wie wäßrigem Ammoniak, eluieit Die L-Histidin enthaltenden Eluate werden vereinigt und aufkonzentriert Dann wird zu der konzentrierten Lösung ein Alkanol wie Methanol oder Äthanol zugesetzt Die ausgefällten Kristalle werden aus einem wäßrigen Alkanol, wie wäßrigem Methanol oder wäßrigem Äthanol, umkristallisiert, wobei man die _]0 reinen Kristalle von L-Histidin erhält

Eine praktische Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in dem folgenden Beispiel zur weiteren Erläuterung angegeben. In dem folgenden Beispiel erfolgt die Identifizierung des L-Histidins in der Fermentationsbrühe mit Hilfe der Ninhydrin-Reaktion und der Paulyschen Diazo-Reaktion auf einem Papierchromatogramm. Weiterhin wird die L-Histidin-Menge in der Fermentationsbrühe unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides P-60 biologisch bestimmt

Beispiel

Man bereitet ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0) unter Verwendung der folgenden Bestandteile:

Glucose 3% (Gewicht/Volumen),
Dextrin 10% (Gewicht/Volumen),
Harnstoff 2% (Gewicht/Volumen),
Ammonium-phosphat 1% (Gewicht/Volumen),
Zweibasisches

Kalium-phosphat 0,1 % (Gewicht/Volumen),

Magnesium-sulfat-

hepta-hydrat 0,05% (Gewicht/Volumen),
Calcium-carbonat 2% (Gewicht/Volumen).
Man beschickt einen 500-ml-Schüttelkolben mit 15 ml des Mediums und sterilisiert den Inhalt durch Erhitzen im Autoklav. Glucose und Dextrin werden getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen zu dem Medium zugesetzt. Dann wird das Medium mit einer mit einer Platinschlinge übertragenen Menge der L-Histidin-Ammoniak-Lyase-freien und gegen 2-Methylhistidin resistenten Mutante Serratia marcescens ATCC Nr. 31026 angeimpft Anschließend wird das Medium während 72 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln (140 UpM, Hub 8 cm) gezüchtet Das in dieser Weise erhaltene Fermentationsmedium enthält 5 mg L-Histidin pro Milliliter. Dann werden 100 ml des Fermentationsmediums während 20 Minuten auf 100⁰C erhitzt und filtriert Das Filtrat wird durch eine mit einem starken Kationenaustauscherharz (in der H-Form) gefüllte Säule (lern χ 10cm) geführt Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert Die L-Histidin enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Zu der konzentrierten Lösung gibt man wäßriges Methanol. Der kristalline Niederschlag wird abfiltiert Der Niederschlag wird aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Man erhält 350 mg L-Histidin.

[λ] £> - -37,38° (C = 2 in H₂O).

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Histidin-Ammoniak-Lyase-freie und 2-Methyl-Histidinrestitente Mutante ATCC Nr. 31026 von Serratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen zur Gewinnung einer Fermentationsbrühe gezüchtet und angereichertes L-Histidin daraus abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten bei einer Temperatur von 25 bis 37° C durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchten bei einem pH-Wert von 6 bis 9 sowie bei einer Temperatur von 25 bis 37° C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte wäßrige Nährmedium 2 bis 15% (Gewicht/Volumen) einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und 0,5 bis 3% (Gewicht/Volumen) einer assimilierbaren Stickstoffquelle enthält und das Züchten bei einem pH-Wert von 6 bis 9 sowie bei einer Temperatur von 25 bis 37⁰C durchgeführt wird.