DE2429068A1 - Fermentatives verfahren zur herstellung von l-histidin - Google Patents

Description

DR. MÜLLER-BORE CIPL. ING. G30ENI NG DIPL.-CHEM. DR. DEUFEL DIPL.-CHEnÄ. DR. SCHÖN DIPL.-PHVS. HERTEL

PATENTANWÄLTE

tM/th - T 1294

Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 21, Doshomachi 3-chome, Higashi-ku Osaka / Japan

Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin

Unionspriorität: 18. Juni 1973

Japan Nr. 68573/73

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Die Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin.

L-Histidin, eine der Aminosäuren, wird als wirksamer Bestandteil von Arzneimittelpräparaten und Nahrungsmittelzusätzen verwendet.

Es ist bekannt, daß L-Histidin durch Extraktion von Proteinhydrolisaten gewonnen werden kann. Dieses Verfahren ist wegen des komplizierten Extraktionsverfahrens von Nachteil. Es ist ferner bekannt, daß man L-Histidin durch Züchten einer Hutante von Brevibacterium flavum, Corynebacterium acetoacidthilum, Arthrobacter citreus, Micrococcus luteus und Bacillus subtilis herstellen kann (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Ur. 7353/1972). Weiterhin ist es bekannt, daß man L-Histidin durch Züchten einer gegen histidinanaloge Verbindungen resistente Mutante von Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter citreus, Brevibacterium flavum, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Nocardia globerula bereiten kann (vgl. Amino acid und Nucleic Acid, 24, 79-86 (1971)). Es ist jedoch kein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Histidin unter Verwendung eines Stammes des Genus Serratia bekannt geworden.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß eine Mutante von Serratia marcescens, die keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweist und gegen 2-Methylhistidin resistent ist, in einem Siährmedium für die Bildung von L-Histidin hervorragend geeignet ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisende, gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante von Serratia marcescens unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium unter Bildung einer FerFientationsbrühe züchtet und das angesammelte L-Hystidin aus der Fermentationsbrühe isoliert.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte L-Histidin-Ainmoniak-Lyase-freie und gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante

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kann man dadurch erhalten, daß man einen wilden Stamm von Serratia raarcescens mit einem Mutagen oder Ultraviolettstrahlen behandelt, um dadurch eine keii,e L-Histidin-Änmoniak-Lyase aufweisende Mutante von Serratia marcescens oder eine gegen 2-Methylhistidin resistente Mut ante von Serratia raarcescens zu bilden und die keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisende Mutante oder die gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante mit einem Mutagen oder Ultraviolettstrahlen weiter behandelt. Zum Beispiel behandelt nan einen wilden Stamm von Serratia marcescens mit N-Methyl-N¹ -nitro-li-nitrosoguanidin und züchtet den Organismus während 2 bis 3 Tagen bei 3O°C auf Agar-Platten, die die folgenden Bestandteile enthalten: 0,2% (Gewicht/Volumen) Glucose, 0,3% (Gewicht/Volumen) K₂HPO₄, 0,7% (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄, 0,01% (Gewicht/Volumen) MgSO₄-TH₃O, 0,0005% (Gewicht/Volumen) (NH₄J₂SO₄, 0,2% (Gewicht/Volumen)L^Histidin-Hydrochlorid-monohydrat und 0,05% (Gewicht/Volumen) iJatrium-citrat-trihydrat. Die von L-Histidin-Ammoniak-Lyase freie Mutante von Serratia marcescens kann in Form kleiner Kolonien isoliert werden. Die keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase enthaltende Mutante von Serratia marcescens wird mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und dann während 3 bis 4 Tagen bei 30 C auf Agar-Platten gezüchtet, die die folgenden Bestandteile enthalten: 0,2% (Gewicht/Volumen) Glucose,- 0,3% (Gewicht/Volumen) K₂HPO₄, 0,7% (Gewicht/Volumen) KH₂PO₄, 0,01% (Gewicht/Volumen) MgSO₄-7H₂O, 0,1% (Gewicht/Volumen) (WH₄J₂SO₄, 0,05% (Gewicht/Volumen) Natrium-citrat-trihydrat und 0,1% bis 1% (Gewicht/Volumen) 2-Methylhistidin. Die L-Histidin-Ammoniak-Lyase-freie und gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante wird in Form großer Kolonien isoliert. Eine lebensfähige Kultur dieser Mutante ist bei der American Type Culture Collection unter der Mummer 31026 hinterlegt worden.

Die Fermentation einer keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisenden, und gegen 2-Methylhistidin resistenten Mutante von Serratia marcescens kann dadurch erfolgen, daß man den Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen entweder unter Schütteln oder unter submersen Bedingungen züchtet. Die Fermentation kann vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt werden. Zur Einstellung

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des pH-Wertes des Mediums können Calciumcarbonat und Ammoniak verwendet werden. Der für die Fermentation bevorzugte Temperaturbereich erstreckt sich von 25°C bis 37°C. Das Fermentationsmedium erhält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere Elemente. Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentation umfassen Saccharide (zum Beispiel Glucose, Stärkehydrolysate), organische Säuren (zum Beispiel Fumarsäure, Zitronensäure), Polyalkohole (zum Beispiel Glycerin) und Kohlenwasserstoffe. Geeignete Stickstoffquellen umfassen Harnstoff, organische Ammoniumsalze (zum Beispiel Ammonium-acetat) und anorganische Ammoniumsalze (zum Beispiel Ammonium-sulfat oder Ammonium-nitrat). Die bevorzugten Mengen für die Kohlenstoffquelle und die Stickstoffquelle in dem Medium liegen in einem Bereich von 2% bis 15% (Gewicht/Volumen) bzw. 0,5% bis 3% (Gewicht/Volumen). Weiterhin können zu dem Medium organische Nährstoffe (zum Beispiel Maiswasser, Pepton oder Hefeextrakte) und/oder anorganische Elemente (zum Beispiel Kalium-phosphat oder Magnesium-sulfat) zugesetzt werden. Die erfindungsgemäße Fermentation oder Gärung kann im Verläufe' von etwa 24 bis 96 Stunden durchgeführt werden. In der Fermentationsbrühe sammelt sich L-Histidin an.

Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen und andere feste Kulturbestandteile in üblicher Weise von der Fermentationsbrühe abgetrennt, indem man das Material erhitzt und dann filtriert oder zentrifugiert. Zur Gewinnung und/oder Reinigung von L-Histidin aus dem Filtrat oder der überstehenden Lösung können bekannte Verfahrensweisen angewandt v/erden. Zum Beispiel wird die abfiltrierte Fermentationsbrühe durch ein starkes Kationenaustauscherharz geführt oder damit behandelt. Dann wird das Harz mit einer verdünnten alkalischen Lösung, wie wässrigem Ammoniak, eluiert. Die L-Histidin enthaltenden Eluate werden vereinigt und aufkonzentriert. Dann wird zu der konzentrierten Lösung ein Alkanol wie Methanol oder Äthanol zugesetzt. Die ausgefällten Kristalle werden aus einem wässrigen Alkanol, wie wässrigem Methanol oder wässrigem Äthanol, umkristallisiert, wobei man die reinen Kristalle von L-Histidin erhält.

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Eine praktische und bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in dem folgenden Beispiel zur weiteren Erläuterung angegeben. In dem folgenden Beispiel erfolgt die Identifizierung des L-Histidins in der Fermentationsbrühe mit Hilfe der Ninhydrin-Reaktion und der Pauly¹sehen Diazo-Reaktion auf einem Papierchromatogramm. Weiterhin wird die L-Histidin-Menge in der Fermentationsbrühe unter Verwendung von Leuconostoc raesenteroides P-60 biologisch bestimmt.

Beispiel

Man bereitet ein wässriges Nährmedium (pH 7/0) unter Verwendung der folgenden Bestandteile:

Glucose 3 % (Gedicht/Volumen)

Dextrin 10 % (Gewicht/Volumen)

Harnstoff 2 % (Gewicht/Volumen)

Ämmoniurn-phosphat 1 % (Gev/icht/Vo lumen)

Zweibasisches 0,1 % (Gewicht/Volumen) I'alium-phosphat

Magnesium-sulfat- 0,05% (Gev/icht/Volumen) hepta-hydrat

Calcium-carbonat 2 % (Gewicht/Volumen)

Man beschickt einen 500 ml Schüttelkolben mit 15 ml des llecliums und sterilisiert den Inhalt durch Erhitzen im Autoklaven. Glucose und Dextrin werden getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen zu dem Medium zugesetzt. Dann wird das Medium mit einer mit einer Platinschlinge übertragenen Menge der L-Histiäin-Ammoniak-Lyase-freien und gegen 2-Methylhistidin resistenten "utante (Hd-IiHr), ATCC Nr. 31026, von Serratia marcescens angeimpft. Anschließend wird das Medium während 72 Stunden bei 30°C unter Schütteln (140 UpH, Hub 3 cm) gezüchtet. Das in dieser Weise erhaltene Fermentationsmedium enthält 5 mg L-Histidin pro Milliliter. Dann werden 100 ml des Fermentationsmediums während 20 Minuten auf 1OO°C erhitzt und filtriert. Das Filtrat wird durch eine mit einem starken Kationenaustauscherharz (in der U-Form), das von der Firma Röhm & Haas Company unter der Bezeichnung

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"Aaiberlite IR-120" erhältlich ist, gefüllte Säule (1 cm χ 10 cm)
geführt. Nach dein Waschen mit Wasser wird die Säule mit 5%igem
wässrigem Ammoniak eluiert. Die L-Histiäin enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Zu der
konzentrierten Lösung gibt man wässriges Methanol. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag wird aus wässrigem !!ethanol umkristallisiert. Man erhält 350 mg L-Histidin.
⁵ = -37,38° (C = 2 in H₃O) .

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Claims (8)

1. Patentansprüche

   A V Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisende, gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante von ^erratia marcescens unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium unter Bildung einer Fermentationsbrühe züchtet und das angesammelte L-Histidin aus der Fermentationsbrühe isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante eine keine L-Histidin-Ammoniak-Lyase aufweisende, gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante von Serratia marcescens, mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 31026 verwendet. -
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 erfolgt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von 25⁰C bis 37°C durchgeführt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer Temperatur von 25°C bis 37°C durchführt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichn e t, daß das verwendete wässrige Nährstoffmedium 2% bis 15% (Gewicht/Volumen) einer assimilisierbaren Kohlenstoffquelle und 0,5% bis 3% (Gewicht/Volumen) einer assimilierbaren Stickstoffquelle enthält und die Züchtung bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und bei einer Temperatur von 25°C bis 37°C erfolgt.
7. 7. Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, dadurch ge kennzeichnet, daß man die L-Histidin-Ammoniak-Lyasefreie und gegen 2-Methylhistidin resistente Mutante

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   ATCC Nr. 31026 von Serratia marcescens in einem wässrigen Medium, das 2% bis 15% (Gewicht/Volumen) einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und 0,5% bis 3% (Gewicht/Volumen) einer assimilierbaren Stickstoffquelle enthält, bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und bei einer Temperatur von 25 C bis 37 C unter aeroben Bedingungen unter Bildung einer Fermentationsbrühe züchtet und das angesammelte L-Histidin aus der Fermentationsbrühe isoliert.
8. 8. L-Histidin, erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 1 oder 7.

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