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Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren auf biotechnischem Wege
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure und
gewisser anderer Aminosäuren durch Gärung, insbesondere aber auf ein Verfahren zur
Herstellung dieser Aminosäuren durch Züchtung gewisser Stämme von Mikroorganismen
unter submersen, aeroben Bedingungen, Bei den hier in Betracht stehenden Stämmen
von Mikroorganismen handelt es sich um solche der Art Aspergillus terreus. Dies
ist eine bekannte Art, deren Kulturen, die in allgemein zugänglichen Samenlungen
erhältlich sind, aus natürlichem Material, z.B. Erde oder Wasser, isoliert werden
könnet. Sie sind in Publikationen eindeutig beschrieben.
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Die Erfindung betrifft die Gärung, d. h. die Züchtung des Mikroorganismus
in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und unter Verwendung eines Stammes
des Aspergillus terreus. Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann der
Mikroorganismus auf Agar-Schrägnährböden oder auf anderen geeigneten, den Mykologen
bekannten Nährböden kultiviert werden. Sporen oder auch die gesamte Kultur kann
von diesen Schrägnährböden auf geeignete Nährmedien zur Züchtung des Organismus
in Kolben übergeführt werden. Die Dauer des Wachstums im Kolben beträgt am Zweckmäßigsten
etwa 24 bis 90 Stunden. Das auf diese Weise erhaltene Material kann zur Gewinnung
des Produkts oder zum Impfen von Nährböden in größeren Gefäßen, die für submerse
aerobe Gärung eingerichtet sind, verwendet werden. Diese Nährböden können zur Herstellung
größerer Produktmengen dienen.
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Die für die Durchführung des Gärungsverfahrens verwendeten Medien
können sehr verschieden sein. Es ist wichtig, daß sie eine Stickstoffquelle enthalten,
die aus anorganischen oder organischem Material oder einer Mischung aus beiden bestehen
kann. Geeignet hierfür sind Aminosäuren, Proteine, Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff
u. dgl., die jedoch dem verwendeten Organismus gegenüber keine giftige Wirkung besitzen
sollen. Es empfiehlt sich auch, Kohlehydrate, mineralische Bestandteile (die aber
auch in den anderen Materialien in ausreichender Menge vorhanden sein können) und
wachstuznsförderade Mittel zuzusetzen. Das Verfahren wird bei etwa neutralem p11-Wert,
d. h. von etwa 5,5 bis 8,0, durchgeführt. Wenn in der Gärlösung als Nährböden Stoffe
verwendet werden, die dazu neigen, den pn-Wert zu verändern, kann es erforderlich
sein, Pufferstoffe einzusetzen oder den p$-Wert während der Gärung zu berichtigen.
Das Verfahren ist im allgemeinen innerhalb von 48 bis 90 Stunden beendet. Hierbei
wird eine Tempezatur von etwa 25 bis 32° C verwendet. Danach kann das Produkt abgetrennt
werden. Es wurde beobachtet, daß die Zugabe gewisser hochkonzentrierter Stickstoffquellen
zu Beginn oder während der Gärung für die Erzielung hoher Ausbeuten an Glutaminsäure
besonders wirksam ist. So ist beispielsweise Harnstoff für diesen Zweck äußerst
wirksam. Ammoniak und Ammoniumsalze, z. B. Sulfate oder Nitrate, sind ebenfalls
gut brauchbar, obwohl sie nicht so wirksam sind wie Harnstoff. Es können auch andere
Stickstoffquellen verwendet werden, wenn sie auch etwas weniger wirksam sind. Wenn
Ammoniak oder Ammoniumsalze als Stickstoffquellen verwendet werden, muß sorgfältig
auf die Aufrechterhaltung eines geeigneten pg-Wertes geachtet werden. Es können
weiterhin Gemische von zwei oder mehreren dieser Stoffe verwendet werden.
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Bei dem vorliegenden Verfahren kann eine Quelle wachstumsfördernder
Stoffe in einer Konzentration von etwa 1 bis 60/, verwendet werden. Mittel,
wie z. B. lösliche Rückstände der Alkoholdestillation, Hefeextrakt und andere, den
Gärungsspezialisten bekannte Stoffe dieser Art, sind in dieser Hinsicht besonders
wirksam. Zusätzlich zu den genannten wachstumsfördernden Stoffen wird eine organische
Stickstoffquelle in einer Konzentration von etwa 2 bis 6 °/o zugegeben. Für diesen
Zweck ist Maisklebermehl besonders wirksam. Man kann auch Sojabohnenmehl, Erdnußmehl
oder Baumwollsamenmehl verwenden, doch sind diese nicht so wirksam wie das erstgenannte
Mehl. Schließlich sollte das Nährmedium noch eine Kohlehydratquelle enthalten. Diese
kann in Form von Stärke, Glukose, Saccharose oder anderer Zucker oder Zuckersirups
zugegeben werden. Es wurde gefunden, daß Glukose besonders wirksam ist. Man kann
die Kohlehydrate in einer Konzentration von
etwa 3 bis 10 °/o verwenden.
Gewisse organische Stickstoffquellen (z. B. Maisklebermehl) vermögen ebenfalls eine
beträchtliche Menge an Kohlehydraten beizusteuern.
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Nachdem das Gärmedium hergestellt ist, kann es auf einen pH-Wert von
etwa 5;5 bis 8,0, wie oben angegeben, eingestellt werden. Wenn -das Gemisch sauer
ist, kann die Einstellung mit Alkali, z. B. Natrium- oder Kaliumhydroxyd oder -karbonat,
_erfolgen. Danach wird der Nährboden sterilisiert und unter sterilen Bedingungen
mit einem ausgewählten Stamm des Aspergillus terreus geimpft. Mehrere Stämme=- dieses
Organismus wurden untersucht und zur Herstellung von Glutaminsäure in beträchtlichen
Ausbeuten unter den hierin beschriebenen Bedingungen als wirksam befunden. Es ist
verhältnismäßig einfach, Stämme dieses Organismus aus Erdproben oder Kulturensammlungen
zu gewinnen, indem man dabei die bekannten - Merkmale des Organismus berücksichtigt.
Die Stämme können in der Weise bewertet werden, daß man_ die Fermentation unter
den hierin beschriebenen Bedingungen durchführt. Im allgemeinen ist es zweckmäßig,
einen Stamm zu wählen, der mindestens etwa 5 g pro Liter Gärlösung erzeugt. Einige
Stämme, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen und in öffentlichen Kulturensammlungen
zugänglich sind, sind im folgenden aufgeführt:
| Bezeichnung Bezeichnung |
| in der öffentlichen in der Pfizer |
| Kulturensammlung Kulturensammlung |
| 0M1013 3465 |
| QM 441 3470 |
| QM 151 A 3468 |
| QM 449 3466 |
| ATCC 1012 1109 |
| NRRL 32 A S16 1110 |
| NRRL 32E S1-4 1112 |
0M ist das Kennzeichen der Kulturensammlung des Ouartermaster Corps Depot in Philadelphia,
Pennsylvanien. ATCC ist die Bezeichnung für die American Type Kulturensammlung in
Washington; D.C. NRRL ist die Bezeichnung für die Kulturensammlung des Northern
Regional Research Laboratory des Ackerbauamtes in Peoria, Illinois.
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Das Medium wird unter sterilen Bedingungen etwa 48 bis 90 Stunden
lang gerührt und belüftet. Wie oben bereits erwähnt wurde, ist es zweckmäßig, entweder
zu Beginn oder während des Gärungsverfahrens eine konzentrierteSticlz:stoffquelle,
z. B. Ammoniak, einArnmoniumsalz oder Harnstoff, in einer Konzentration von etwa
0,1 bis 1 Gewichtsprozent, bezogen auf das Nährmedium, zuzugeben. Die Zugabe im
Verlaufe des Gärungsverfahrens kann nach und nach in zeitlichen Abständen oder auch
auf einmal erfolgen. Es ist manchmal zweckmäßig, diese oder andere Stickstoffquellen
nach dem Wachstumsbeginn des Organismus, z. B. nach etwa 20 bis 30 Stunden, zuzugeben.
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Während das vorliegende Verfahren sich besonders für die Herstellung
von Glutaminsäure eignet, kann es jedoch auch zur Herstellung gewisser anderer Aminosäuren
verwendet werden, die für die Ernährung sowie für therapeutische Zwecke von großer
Bedeutung sind. Zu diesen Verbindungen gehören Trypotophan, Lysin und andere wertvolle
Aminosäuren. Die Glutaminsäure bildet sich vorwiegend oder ausschließlich in Form
der >,natürlichen« Verbindung, d. h. als L(-E-)-Glutaminsäure.
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Bei der Gärung bildet sich eine verhältnismäßig große Menge der Aminosäuren
in dem Myzel, während sich eine geringere :Menge der Aminosäuren in der Flüssigkeit
befindet. Wenn das Myzel der Säurehydrolyse unterworfen wird, werden die Aminosäuren
daraus befreit. Da aber das Myzel selbst eine Eiweißsubstanz ist, wird bei Säurehydrolyse
auch das Myzel unter Bildung von Aminosäuren abgebaut.
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Die Glutäniinsäure und andere Verbindungen, die nach dem vorliegenden
Verfahren hergestellt werden, können durch eine Reihe in der chemischen Technik
bekannter Verfahren abgetrennt werden. Beispielsweise kann das Myzel, das nachweislich
einen hohen Gehalt an Glutaminsäure, wahrscheinlich in gebundener Form als Polypeptid
(oder Protein) enthält, oder die gesamte Gärlösung mit der entsprechenden Menge
einer starken Säure, vorzugsweise einer Mineralsäure, z. B. konzentrierter Salzsäure
oder 8- bis 50°/oiger Schwefelsäure, behandelt werden. Nach mehrstündigem Erhitzen
auf vorzugsweise 100° C oder darüber, beispielsweise im Autoklav unter einem Druck
von 1,4 kg/cm2, kann die aus dem Myzel ausgelaugte Aminosäure auf mit Säure gewaschener
Tonerde adsorbiert werden. Dieses Material kann man diskontinuierlich oder, vorzugsweise,
in einer Säule anwenden. Danach kann man die Tonerde mit verdünntem Alkali eluieren,
wobei die Aminosäure in einer gereinigten Lösung erhalten wird. Die Lösung, die
die Natriumsalze enthält, kann auf bekannte Weise zur Trockne eingeengt werden.
Man kann die Glutaminsäure auch dadurch gewinnen, daß man eine Lösung des sauren
Myzelhydrolysats mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz zusammenbringt. Ein weiteres
Verfahren besteht darin, daß man das Myzel mit heißer Salzsäure extrahiert, filtriert
und anschließend die salzsaure Lösung konzentriert, bis sich die feste Glutaminsäure
abscheidet. Wenn man wasserfreien Chlorwasserstoff in die hochkonzentrierte Lösung
einleitet und dann abkühlt, so scheidet sich das kristalline Chlorhydrat ab.
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Es können auch andere Verfahren zur Aufarbeitung des Produkts angewandt
werden. Man filtriert z. B. das Schwefelsäurehydrolysat und neutralisiert es mit
Kalk. Das ausgefällte Calciumsulfat wird abfiltriert und die Lösung mit einem synthetischen
Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlit IR120 (Hersteller Rohm & Haas Comp.),
welches das Lysin entfernt, behandelt. Das Lysin läßt sich durch Eluieren mit verdünnter
Säure gewinnen, Durch weitere Behandlung der Lösung mit einem Anionenaustauscherharz,
z. B. Amberlit IR4B, können die anorganischen Salze entfernt werden. Weiterer Kontakt
mit einem Harz der gleichen Art führt zur Gewinnung der Glutaminsäure, die man mit
verdünntem Alkali entfernt. Durch Konzentrierung des Eluats bei einem geeigneten
p11-Wert wird Mononatriumglutamat in fester Form abgeschieden. Glutaminsäure in
Form des Calciumglutamats gewinnt man dadurch, daß man dem hydrolysierten Gärungsprodukt
Kalk zusetzt (wobei man zuerst, falls Schwefelsäure zum Hydrolysieren verwendet
wird, das Calciumsulfat abtrennt) und anschließend etwa 10 Volumen Methanol zu der
Lösung gibt. Das Produkt wird abfiltriert und getrocknet. Es kann in die Säure oder
das Natriumsalz umgewandelt werden.
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Im allgemeinen wird nach dem vorliegenden Gärungsverfahren Glutaminsäure
in einer. Ausbeute von etwa 5 bis 20 g pro Liter des Gesamtgärungsproduktes gewonnen.
Wie oben erwähnt, befindet sich der größte Teil der Glutaminsäure in dem Myzel,
d. h. den festen Bestandteilen der Gärbrühe, und muß nach den oben beschriebenen
Verfahren aus diesem gewonnen werden.
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Die nachstehend gegebenen Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung
und schränken die Erfindung in keiner Weise ein. Da das vorliegende Verfahren ohne
Abweichen aus dem Rahmen der Erfindung eine- ganze Reihe von Ausführungsformen zuläßt,
ist _zu beachten, daß eine
Begrenzung des Erfindungsgegenstandes
lediglich durch den Wortlaut der beigefügten Ansprüche erfolgt.
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Beispiel 1 Ein Gärungsmedium wurde hergestellt, das 40/, lösliche
Alkoholdestillationsrückstände, 7 Gewichtsprozent Glukosemonohydrat und o;2 Gewichtsprozent
Maisquellwasser enthielt. Dieses Gemisch wurde verteilt, zu je 100 ccm in 300-ccm-Kolben,
mit Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,o eingestellt, im Autoklav sterilisiert
und anschließend unter aseptischen Bedingungen mit Sporen des in einem Agar-Schrägnährboden
kultivierten Aspergillus terreus geimpft. Das Gemisch wurde 48 Stunden lang unter
Rühren bei 28° C bebrütet. Dieses Impfmaterial wurde zum Impfen eines aus 4 Gewichtsprozent
Maisklebermehl, 4 Gewichtsprozent löslichen Alkoholdestillationsrückständen und
7Gewichtsprozent Glukosehydrat hergestellten Gärungsmediums verwendet. Das Medium
wurde mit verdünnter Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt
und vor dem Impfen im Autoklav behandelt. Es wurden etwa 100 ccm Impfmaterial je
2 1 Gärungsmedium verwendet. Das Gemisch wurde in sterile, 41 fassende Metallgefäße
gebracht, die für das Wachstum von Mikroorganismen unter Belüftung und Rühren bei
sterilen Bedingungen geeignet waren. Die Gärung wurde bei 28° C durchgeführt, und
nach Ablauf von 24 Stunden wurden 0,5 Gewichtsprozent Harnstoff unter sterilen Bedingungen
zu dem Gärungsgemisch gegeben. Nach weiteren 48 Stunden wurde das Gemisch filtriert.
Das Myzel wurde mit einer gleichen Menge konzentrierter Salzsäure 6 Stunden lang
im Autoklav behandelt. Aus der hierbei erhaltenen, wäßrigen Lösung wurde Glutaminsäure
in einer Ausbeute von etwa 15 g pro Liter des ursprünglichen Gärungsgemischs gewonnen.
Beispiel 2 Ein Gärungsmedium wurde hergestellt, das 140/, handelsübliche Melasse
(bekannt als »crude B«), 40/0 Maisklebermehl, 20/, lösliche Alkoholdestillationsrückstände,
20/, Maisstärke und 1/,0/0 Ammoniumsulfat enthielt. Das Gemisch wurde mit Leitungswasser
verdünnt und vor dem Sterilisieren mit K O H auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.
Anschließend wurde das Medium unter sterilen Bedingungen mit einem Stamm des »Aspergillus
terreus« geimpft. Die Gärung wurde 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 27°
C durchgeführt. Dann wurden 0,50/, Harnstoff unter sterilen Bedingungen zugegeben,
und das Verfahren wurde weitere 48 Stunden fortgesetzt. Eine Probe ergab einen Gehalt
von insgesamt 15 g Glutaminsäure pro Liter Gärbrühe. Das Myzel wurde abgetrennt
und bei 115'C
unter Anwendung von Druck mit 12°/oiger Schwefelsäure behandelt.
Das entstandene Gemisch wurde filtriert, mit Kalk neutralisiert, 1/2 Stunde lang
gerührt und vom Calciumsulfat abfiltriert. Das Filtrat wurde durch eine mit Amberlit-IR-120-Harz
gepackte Säule geführt. Das aus der Säule abfließende Material wurde dann durch
eine mit Amberlit-IR-4B gepackte Säule geleitet, bis der Aschegehalt wesentlich
verringert war. Danach wurde die Lösung durch eine weitere Säule mit Amberlit-IR-4B
geleitet, in welcher die Glutaminsäure adsorbiert wurde. Die Aminosäure wurde aus
dieser Säule mit der Menge an verdünnter Natriumhydroxydlösung, die zur Bildung
des Mononatriumsalzes ausreichte, eluiert. Die Lösung wurde konzentriert und mit
Methanol versetzt, um das feste Mononatriumglutamat auszufällen, das hiernach abfiltriert
und getrocknet wurde.