DE2938377C2

DE2938377C2 - Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q ↓1↓↓0↓

Info

Publication number: DE2938377C2
Application number: DE2938377A
Authority: DE
Inventors: Kunio Soka Saitama Hata; Isao Tokio/Tokyo Kano; Motoi Tokio Matsui; Kihachiro Ohshima
Original assignee: Jujo Paper Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 1978-09-25
Filing date: 1979-09-22
Publication date: 1985-05-02
Also published as: US4245048A; DE2938377A1; JPS593197B2; JPS5548397A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q_!0 durch Kultivieren des Mikroorganismus Trichosporon ATCC 20 566 in einem Kulturmedium, das Sulfitablauge (nachfolgend als »SWL« bezeichnet) als Kohlenstoffquelle enthält und Gewinnen des erzeugten Coenzyms Qi₀- Dieser Mikroorganismus JY-155 = ATCC 20 566 gehört zu den Hefen und kann Coenzym Qi₀ in seiner Zelle erzeugen und anreichern. Darüber hinaus kann dieser Stamm In einem SWL enthaltenden Kulturmedium gezogen werden.

Coenzym Qi₀ ist eine Verbindung, die durch die folgende Formel dargestellt wird und eine wichtige Rolle als ein Element des Elektronenübertragungssystems in einem Organismus spielt.

(CH₂CH=C-CH₂)IoH

Es ist bekannt, daß diese Verbindung eine ausgezeichnete pharmazeutische Wirkung bei verschiedenen Erkrankungen aufweist. In den letzten Jahren wurde sie klinisch zur Heilung von Herzinsuffizienzen durch orale

Verabreichung verwendet.

Plese Verbindung wird industriell entweder über ein halbsynthetisches Verfahren hergestellt, bei dem ein Material verwendet wird, das In Pflanzen vorkommt, oder durch ein Fermentationsverfahren, bei dem die Verbindung aus Mikroben-Zellen extrahiert wird. Im Falle des Fermentationsverfahrens liegt eine der Bedingungen zur Verwirklichung einer vorteilhaften industriellen Produktion darin, Mikrobenzeilen, die Coenzym Q,o enthalten, mit niedrigen Kosten herzustellen, da die Menge des In den Mikrobenzellen angehäuften Coenzyms Qio gering ist.

Was die Extraktionsmethode des Coenzyms Q₁₀ aus Mikroorganismen betrifft, Insbesondere aus Hefe und dgl., wird auf die japanische Palentveröffentlichung Nr. 8 836/1973, auf die japanische Patentveröffentllchung Nr. 19 034/1976 und auf die offengelegte japanische Patentveroffentllchung Nr. 105 288/1977 hingewiesen. Ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Qio, das durch die Verwendung höherer Fettsäuren als ein Substrat bei der Kultivierung von Hefe charakterisiert Ist, wird In der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 4 758/1975 beschrieben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auf SWL als ein kostengünstiges Material zur Herstellung von Mikrobenzellen, die Coenzym Qio enthalten, zurückgegriffen.

Bekanntlich Ist SWL eine Ablauge, die beim Verkochen von Holz erhalten wird, wobei diese Ablauge bei dem Verfahren zur Herstellung von Sulfitzellstoff bzw. Sulfitpulpe als Abstrom erhalten wird. Historisch wurde sie zur Herstellung von Hefe verwendet, die für Nahrungs- und Futtermittel ausgenutzt wurde, und s<e wird kürzlich als ein Ausgangsmaterlal zur Herstellung von Hefe der Gattung Torula verwendet, aus der wirksame Bestandteile, wie Nuklelnsäure und Glutathlon extrahiert werden. In der SWL Hegen Saccharose, Essigsäure und Alkohole vor, die zur Kultivierung von Hefe geeignet sind. Andererseits liegen auch viele Substanzen vor, die d?s Wachstum der Hefe inhibieren, wie schweflige Säure, Zersetzungsprodukte von Lignin, Furfural, Ameisensäure und lose gebundenes Sulfit. Daher Ist Im allgemeinen die Eignung von SWL als Kulturmedium für Hefe gering, und die Hefearten, die In einem Kulturmedium wachsen können, das SWL als eine Haupt-Kohlenstoffquelle enthalt, sind begrenzt. D. h. lediglich die Gattung Torula u. dgl. werden In dem Medium In Industrlellem Maßstab kultiviert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nunmehr ein Mikroorganismus gefunden, der Coenzym Qi₀ enthalten und SWL assimilieren kann. Es hat sich gezeigt, daß In der Natur der Hefestamm JY-155 erhalten werden kann, der In dem Kulturmedium, das SWL enthält, eine wesentlich höhere Wachstumsgeschwlndlgkeli als Kulturen bekannten Typs aufweist, für eine langzeitige kontinuierliche Kultivierung geeignet sein kann und

m> eine beträchtliche Menge an Coenzym Q₁₀ In seinen Zellen akkumuliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird Im folgenden genauer beschrieben.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus Ist der Stamm JY-155, der der Gattung Trichosporon angehört, der aus Erdboden gewonnen wurde. Dieser Stamm kann In dem SWL als eine Hauptkohlenstoffquellc enthaltenden Kulturmedium kräftig wachsen und akkumuliert Coenzym Q_i0 In seinen Zellen. Der Stamm weist

<>> folgende mikrobiologische Eigenschaften auf.

a) Wachstum In Kulturmedium

I. Malzextraktmedium (flüssig) -,,-

Die Sprossung Ist polypolar. Es bildet sich ein Film. Die Form stellt ein längliches Ellipsoid von 2,2-6,5 μπι (Mikron) auf 6,7-16,2 \im (Mikron) dar.

Das Wachstum Ist kräftig. Der Rand der Kolonie ist wellenförmig. Die Elevation der Kolonie ist kegeiförmig oder konvex. Im Zentrum der Kolonie Hegt eine Höhlung vor. Die Oberfläche der Kolonie ist rauh und der Oberzug bzw. Gianz der Kolonie ist kreldearUg. Die Beschaffenheit der Kolonie 1st zäh.

3. Streichkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedlum Mycelium und Pseudomycellum werfen gebildet, und Keimspore und Oidium werfen gebildet.

4. Streichkultur und MY-Agarmedium Endosporenbildung.

b) Ascosporenbildung

Keine Ascosporenbildung.

c) Bildung projektiver Sporen

Projektlve Sporen werfen nicht gebildet.

d) Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Bedingung ^a pH: 5-7

Temperatun 27-35° C

2. Wachstumsbereich pH: 3-11,5
Temperatun 15-45° C

3. Assimilation vcn Nitrat: njin

4. Zersetzung von Fett: nein

5. Zersetzung von Harnstoff: ja

6. Verflüssigung von Gelatine: nein

7. Toleranz gegen osmotischen Druck mit Salz: Der Stamm kann bei einer Salzkonzentration bis zu 12« » wachsen.

8. Bildung amyloldaler Substanz: nein

9. Bildung organischer Säure: nein

10. Bildung von Carotlnolden: nein

11. Vitaminerfordernis: Thlamln Ist erforderlich.

12. Zersetzung von Arbutln: nein

13. Esterbildung: nein

14. Reaktivität von Lackmusmilch: nein

15. Cyclohexlmld-Toleranz: ja

16. Extinktionstemperatur: 50'C

e) Saccharoidfermentatlon: nein

0 Assimilation von Kohlenstoffquellen:

D-Glucose +

D-Galactose +

L-Sorbose +

Saccharose +

Maltose +

Cellobiose +

Trehalose +

.

Lactose +

Mellblose +

Rafflnose +

Melezltose + Inulin

lösliche Stärke +

D-Xylose +

L-Arablose + D-Arablnose

D-Rlbose +

L-Rhamnose +

Äthanol +

Glycerin +

Erythrit +

Adonlt +

Garactlt +

D-Mannlt +

D-GIucit +

a-Methyl-D-glucosld +

Salicin +

Arbutln +

DL-Lactat +

Citrat +

Succinat Inosit

D-Mannose +

D-Fructose + Kaliumgluconat
a-Calciumketogluconat +

Acetat +

Dextrin +

Werden die vorstehend beschriebenen Eigenschaften im Vergleich mit den in »The Yeast. A Taxonomic Study« (1970) von J. Lodder et al. beschriebenen bewertet, so gehört dieser Stamm zur Gattung Trlchosporon. In dieser Gattung Hegt jedoch keine Spezies vor, die sich mit diesem Stamm identifizieren laßt. Beispielsweise ist dieser Stamm ähnlich Trlchosporon cutaneum, einem bekannten Stamm, unterscheidet sich jedoch deutlich von diesem Stamm Im Hinblick auf die Assimilation von Inosit, sowie auch Im Hinblick auf die Sulfittoleranz, Furfuraltoleranz und die Assimilation von SWL, wie in den folgenden Tabellen I und II gezeigt.

Daher wurde dieser Stamm als neue Spezies bezeichnet und mit dem Namen Trlchosporon JY-155 versehen. Diesem Stamm wurde die Nummer ATCC-20 566 zugeordnet bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.

Tabelle I *)	Wachstum beim Sulfitzusatz	Wachstum beim Zusatz von lose gebundenem Sulfit	Wachstum beim Furfural- zusatz
Stamm
Trichosporon	ja	ja	ja
JY-155, ATCC 20 566
Trichosporon cutaneum	nein	nein	nein
IFO-173	nein	nc.'ii	nein
lFO-598	nein	nein	nein
IFO-1200	nein	nein	nein
IFO-1489

*) Untersuchungsmeihode

Die Untersuchung wurde nach der Untersuchungsmethöde für die Assimilation einer Kohlenstoffque.'le, einer der mikrobiologischen Eigenschaften durchgeführt. Zu einem Kulturmedium, das 1% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, wurden 0,5% (Gew./Vol.) Na₂SOj als Sulfit oder 2% (Vol./Vol.) einer gemischten Lösung von Mol Natrlumblsulflt als lose gebundenes Sulfit und 0,3 Mol Formaldehyd und 0,3 Mol Acetaldehyd oder 0,1% (Gew./Vol.) Furfural gefügt. Die Trübung wurde mit dem bloßen Auge bewertet, um festzustellen, ob der Stamm eewachsen war oder nicht.

Tabelle II *)

Stamm	Assimilation	von SWL
	Zucker	Konzentration
	verbrauch	der gebildeten
		Zellen
	%	g/l
Trichosporon
JY-155, ATCC 20 566	77.3	9.7
Trichosporon cutaneum
IFO-173	4,2	0,6
IFO-598	6,3	0,7
!FQ-1200	2,1	0.3
IFO-1489	5,0	0.9

") Untersuchungsmethode

In einen 500-ml-Sakagui.hl-Kolben wurden 50 ml eines Kulturmediums gefügt, das 1% Glucose, 0,15% Harnstoff, 0,15% KH₂PO₁, 0,02% MgSOi ■ 7H₂O, 0,01% CaCl, · 2H₂O, 0,01% NaCl und 0,2% pulverisierten Hefeextrakt enthielt. Das Kulturmedium wurde mit jedem der vorstehenden Stämtne inokuliert, und es wurde eine einleitende Kultur unter 24stündlgem Schütteln bei 30° C durchgeführt. Anschließend wurde SWL zur Erzielung einer Zuckerausgangskonzentration von 1,4% verdünnt. Die so verdünnte SWL wurde zu einer Substanz gefügt, die die gleiche Zusammensetzung hatte, wie das einleitende Kulturmedium, mit Ausnahme von Glucose, wodurch ein SWL enthaltendes Kulturmedium hergestellt wurde. Zu diesem Kulturmedium wurden 5 ml der einleitenden Kulturbrühe gefügt, und die Kultivierung erfolgte unter den gleichen Bedingungen, wie die einleitende Kultivierung.

Die Kultivierungsbedingungen, unter denen SWL als Ausgangsmaterial zur Kultivierung von Trichosporon JY-155 verwendet wird, wurden eingehend untersucht. Erflndungsgemaß wird SWL als solches oder nach geeigneter Verdünnung auf eine Zuckerkonzentration von 0,5-4% (berechnet als Glucose) verwendet. Es können jegliche Kulturmedien verwendet werden, die hergestellt werden durch Zusatz einer assimilierbaren Stickstoffquelle, anderer anorganischer Salze und Vitamine zu der vorstehenden SWL. Beispiele für StickstofTqueüen sind wäßriges Ammoniak, Ammonium-Salze (Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.), Harnstoff, Pepion, Fleischextrakt und andere anorganische oder organische, Stickstoff enthaltende Substanzen. Andere anorganische Salze schließen Phosphat, Magneslumsaize, Calclumsalze, Elsensalze, Mangansalze, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und gegebenenfalls Salze von Spurenmetallen ein. Wachstumspromotoren umfassen Vitamine, Aminosäuren, Hefeextrakt, Maisquellwasser usw.

Die Kultivierung erfolgt durch aerobes Schütteln oder durch Rühren unter Luftzufuhr. Die Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise Im Bereich von 25-37° C. Der pH-Wert für die Kultivierung wird Im Bereich von 4-8 gehalten. Bei der Kultivierung kann es sich entweder um den ansatzweisen Typ (10 Stunden bis 5 Tage Kultivierungszeitraum) oder um den kontinuierlichen Typ handeln. Letzterer Ist für die Kultivierung in Industriellem Maßstab bevorzugt.

Mikroorganismenzeilen werden aus der Kulturbrühe durch eine Methode wie Zentrifugleren, Filtrieren usw. abgetrennt. In den so erhaltenen Zellen ist das Coenzym Qi₀ enthalten und angehäuft.

Die Zellen, aus denen Coenzym Qio abgetrennt werden soll, können lebende Zellen, trockene Zellen oder behandelte Zellen sein. Die Abtrennung des Coenzyms Q₁₀ aus den Zellen kann nach jeglicher üblicher Verfahrensweise erfolgen. Beispielsweise wird zur Extraktion des Coenzym Q₁₀ die in den Zellen enthaltene verseifbare Substanz unter Anwendung von Methanol-Alkall oder Äthanol-Alkali in Anwesenheit von Pyrogallol verseift. Das Coenzym Qio aus der so verselften Flüssigkeit wird In einem Lösungsmittel, wie η-Hexan oder Petroläther gelöst. Anschließend führt man eine fraktionierte Raffination unter Verwendung von Aluminiumoxid, Slllclumdloxldgel, Florizil oder dgl. durch, und anschließend wird mehrfach umkristallisiert, um reine Kristalle von Coenzym Qi₀ zu erhalten.

Im folgenden wird die Erfindung durch ein Beispiel erläutert. Beispiel

Ein 500-mI-Sakaguchi-Kolben, in dem 50 ml eines Kulturmediums enthalten waren, das 1% Glucose, 0,15% Harnstoff, 0,15% KH₂PO₄, 0,02% MgSO, · 7H₂O, 0,01% CaCl₂ - 2H₂O, 0,01% NaCl und 0,2% pulverisierten Hefeextrakt enthielt (pH 5.5), wurde mit Trichosporon JY-155 (ATCC 20 566) inokuliert. Eine einleitende Kultivierung wurde unter Schütteln während 24 Stunden bei 30° C vorgenommen, und die so erhaltene KuiturbrOhe wurde in ein Kulturmedium in einen 30-1-Fermentationsbehälter in einer Menge von 5% gefügt. SWL wurde verdünnt zur Einstellung der Zuckerkonzentration auf 10 g pro 1, und die ursprüngliche Zusammensetzung des SWL-Mediums für die ansatzweise Kultur wurde durch Zusatz von 0,15% Ammoniumsulfat, 0,1596 KH2PO4, 0.02% MgSO₄ ■ 7H₂O, 0,01% NaCl und 0,05% pulverisierten Hefeextrakt bereitet. Die Kultur wurde unter folgen-

den Bedingungen durchgeführt. Kultivierungstemperatur 32° C; Luftbeschlckungsgeschwlndigkcli 18 1 pro Minute; Rotationsgeschwindigkeit 410 Umdrehungen pro Minute; Menge des flüssigen Mediums Im Behälter 18 1; pH-Wert 5,1. Wenn das Wachstum der Hefe In die logarithmische Phase eintrat, wurde eine kontinuierliche Kultur durchgeführt, unter kontinuierlicher Beschickung des SWL-Medlums. Der Vorrat des SWL-Medlums wies den gleichen Gehalt an anorganischen Salzen auf, wie das Medium zur ansatzweisen Kultur, hatte eln^ Zuckerkonzentration von 30 g pro I In der SWL und 2 ppm Thlamln-Hydrochlorld wurden anstelle des pulverisierten Hefeextrakts zugesetzt. Die Kultur wurde durch Aufrechterhaltung eines 70*lgen Zuckerverbrauchs gesteuert, und so wurde der stabile Zustand erreicht. Zu diesem Zeltpunkt betrug die Hefekonzentration In dem Behälter etwa 1,3%. Durch Zentrifugieren von 301 der aus dem Fermentationsbehälter überströmenden

ίο Brühe wurden 1820 g nasse Zellen erhalten (entsprechen 337 g trockene Zellen). In diesen Zellen waren 840 mg Coenzym Q₁₀ pro I g trockene Zellen enthalten. Diese Zellen wurden mit 3,61 Methanol, 180 g Pyrogallol und 900 ml 60%lgem Kaliumhydroxid vermischt, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Erwärmen auf 80° C unter Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen des Gemlschs wurde die Coenzym Q_to enthaltende Fraktion zweimal mit 3 I n-Hcxan extrahiert und In einer Schicht von η-Hexan gelost. Das η-Hexan, In dem die das Coenzym Qi₀ enthaltende Fraktion gelöst war, wurde mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und wurde anschließend mit Glauber-Salz getrocknet, worauf konzentriert und verdampft wurde. Der Rückstand wurde In Aceton gelöst, das Aceton wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in n-Hexars gelöst. Diese Lösung wurde in einer Slllctumdloxidgelsäule entwickelt, unter Verwendung eines Gemlschs von Äther und η-Hexan, und das Coenzym Qio enthaltende Eluat wurde durch Fraktionleren gesammelt. Das Lösungsmittel dieses Eluats wurde durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde In einer geringen Menge Äthanol gelöst und an einem kühlen Ort stehengelassen.

Es fielen rohe Kristalle von Coenzym Qio aus. Durch dreimalige Wiederholung der Umkristallisatlon aus Äthanol erhielt man 106 mg Kristalle des Coenzyms Q_)o. Diese Verbindung zeigte einen Schmelzpunkt von 48-50° C und wurde durch Dünnschichtchromatographie, Flüssigkeitschromatographie, UV-Absorptlonsspektrum und Massenspektrum als Coenzym Qio bestätigt.

Claims

Patentansprache:

1. Verfahren zur Herstellung von Coenzym Qi₀ durch Züchten einer Hefe und Extrahieren des Coenzyms aus der Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe den Stamm Trichosporon ATCC 20S66 züchtet, und zwar in einem Kulturmedium, das Sulfitablauge als Kohlenstoffquelle enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sulfitablauge eine solche einsetzt, die 0,5 bis 4 Gew.-96 Zucker, berechnet als Glucose, enthält