JPS5824119B2 - 微生物によるユビキノン−１０の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オオスポリデイウム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉ−
ｕｍ ）属またはスポリデイオオラス（５ｐｏｒｉｄｉ
−ｏｂｏｌｕｓ ）属に属するユビキノン−１０生産菌
を培養し、その菌体からユビキノン−１０を製造する方
法に関する。

ユビキノンは、その一般式が で示される一連の化合物の総称で、ユビキノン−１０は
マルチプレニル側鎖のイソプレン単位数が１０個、すな
わち上記一般式におけるｎが１０のものである。

ユビキノン−１０は広く動植物界に分布し、生体の末端
電子伝達系に関与する生理的に重要なキノン誘導体であ
る。

また、最近、本物質が他のユビキノン同族体とともに人
、犬、ラットを含んだ哺乳動物に対したとえば心不全の
緩解などの薬理作用や心筋ミトコンドリアの酸化還元活
性の賦活などの生理作用を示すことが報告されており（
例、生化学実験講座１３巻、６８１〜６８２頁、東京化
学同人、１９７５年）、臨床的にはたとえば心不全に対
し、成人１日あたり通常０．５〜１ｒＩＴ９／ユが経口
投与で用いられている。

ユビキノン−１０の製造法としては、従来、たとえば動
物組織からの抽出法か一般に知られているが、原料資源
が限られていること、また含量が（ｆｋイとトモあって
、この方法でユビキノン−１０を工業的に生産すること
は極めて困難である。

まり、シュードモナス、アグロバクテリウム属等の細菌
、ノイロスポラ、アスペルギルス、オオレオバシデイウ
ム属等の糸状菌、ロドトルラ、クリプトコツカス、カン
デイダ、トルロプシス、トリコスポロン、スポロボロミ
セス、フレラ、ロドスポリデイウム、シゾサツカロミセ
ス属等の酵母、トレメラ属等の担子菌のなかには、その
菌体中にユビキノン−１０を蓄積する株のあることは知
られている。

しかしながら、これらの菌を使用するユビキノン−１０
の製造法は、たとえば、菌体中のユビキノン−１０の蓄
積量が不十分であるなど、いまだ工業的な製造法として
は十分確立されているとは言い難い。

この様な背景のもとに、本発明者らは、工業的に有利な
ユビキノン−１０の製造法を確立するために、鋭意検討
を重ねた結果、従来、ユビキノン−１０を生産すること
が全く知られていなかったオオスポリデイウム（Ｏｏｓ
ｐｏｒｉｄｉｕｍ ）属およびスポリデイオボラス（Ｓ
ｐ ｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属菌が、その菌体中に著
量のユビキノン−１０を蓄積することを見出し、その知
見に基づいてさらに種々研究を重ね、本発明を完成する
に至った。

すなわち、本発明はオオスポリデイウム（Ｏｏ−ｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍ ） 属またはスポリデイオボラス（５
ｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ）属に属し、ユビキノン−
１０を生産する能力を有する微生物を、栄養培地に培養
してユビキノン−１０を生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする微生物によるユビキノン−１０の製造法
である。

本発明においては、オオスポリデイウム属またはスポリ
デイオボラス属に属し、ユビキノン−１０生産能を持っ
た株であれば、いずれも適宜使用しうるが、たとえば、
オオスポリデイウム・マーガリイテイフエシム（Ｏｏｓ
ｐｏｒｉｄｉｕｍ ｍａｒｇａ−ｒｉｔｉｆｅｒｕｍ
） ＣＢ Ｓ −２５３１および同ＣＢ５−６１７７、
スポリデイオボラス・ジョンソニー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏ
ｂｏｌｕｓ” １）ＩＦＯ−６９０３、ＪＯｎＳＯｎｌ スポリディオボシス・ルイネニー（５ｐｏｒｉｄｉｏｂ
ｏｌ −ｕｓ ｒｕｉｎｅｎｉｉ ） ＣＢＳ −
５００１などは、有利に使用される菌株の例である。

これらの菌株は、オランダのＣＢ Ｓ （Ｃｅｎｔｒａ
ａｌ ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃｈｉｒｒｍｅｌｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ）または財団法人発酵研究所（Ｉ Ｆ
Ｏ） （Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ ＋０ｓａｋａ）に標準株として上記ＣＢ
ＳまたはＩＦＯ番号で保存されており、必要に応じ容易
に入手出莱る菌株である。

因みに、ＣＢ５−２５３１およびＣＢ５−６１７７は、
ＣＢＳ ；リスト・オブ・カルチャーズ（Ｌｉ５ｔ
ｏｆ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ ）第２８版（１９７２年）
第３０５頁に、ＩＦＯ−６９０３は、ＩＦＯ；リスト・
オプ・カルチャーズ（Ｌｉ−５ｔ ｏｆ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ ）第５版（１９７２年）第１８１頁に、また、Ｃ
Ｂ５−５００１株は、ロダー編、ザ・イースト（Ｊ、
Ｌｏｄｄｅｒ ｒ Ｔｈｅ Ｙｅ−ａｓｔｓ）第
２版８２７〜８３０頁にそれぞれ記載されている。

本発明で用いられる菌の培養に際しては、菌が同化しう
る炭素源、資化しうる窒素源その他の無機塩類、ビタミ
ン類などを含有する培地が適宜用いられる。

炭素源としては、同化し５るものであればいかなるもの
でもよく、たとえば、糖類（例、グルコース、シューク
ロース、マルトース、テキストリン、可溶性殿粉、殿粉
、糖蜜など）、グリセリン、油脂類（例、オリーブ油、
大豆油、米ぬか油）、有機酸類（例、酢酸、乳酸、フマ
ール酸、コハク酸、クエン酸など）、アルコール類（例
、メタノール、エタノール、プロパツールなト）、ガス
状乃至液状の炭化水素類（例、ｎ−パラフィン、メタン
など）などが用いられる。

また窒素源としては、たとえば、麦芽エキス、ペプトン
、大豆抽出物、肉エキス、酵母エキス、コーン、ステイ
ープ・リカー、尿素、アンモニア塩類（例、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウムなど）、硝酸塩類（例、硝酸
アンモニウム、硝酸ナトリウムなど）、その他の有機ま
たは無機の窒素含有物が用いられる。

さらに必要に応じて、無機塩類（例、食塩、リン酸塩類
など）、金属塩類（カルシウム、マグネシウム、マンガ
ン、鉄などの硫酸、塩酸、硝酸などとの塩類）、微量栄
養物質（例、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基）等も必要
に応じて適宜添加される。

培養方法は、静置あるいは振盪培養のいずれでもよいが
、好気的条件下に深部培養するのが一般に有利である。

又培養温度は一般に、１５〜４０℃の範囲が望ましく、
液性をｐＨ２〜１０、より好ましくは３〜８の範囲に保
持し、１０時間ないし１０日程度培養するのがよい。

菌体は、培養終了液から遠心分離、沢過などの方法によ
り分離取得される。

かくして得られる菌体中にはユビキノン−１０が豊富に
含有されているので、適当に菌体を処理後（例、乾燥、
粉砕）、菌体をそのまま栄養剤、医薬に供することがで
きる。

また必要に応じ菌体からユビキノン−１０のみを単離し
てもよい。

菌体からのユビキノン−１０の単離は、常法にしたがっ
て行うことができる。

たとえば、エタノールに菌体を加え５０℃〜９０℃で１
〜数時間加混抽出する。

あるいは、１ずメタノール、水酸化ナトリウムおよびピ
ロガロールの混合物を用いて菌体中のリン脂質などのけ
ん化性物質をけん化し、本けん化液からｎ−ヘキサンの
如き水と混合しない有機溶媒を加えて、ユビキノン−１
０を抽出スる。

ついで抽出物をシリカゲル、フロリジルなどを用いて分
別精製を行って単離することもできる。

菌体から得られるユビキノン−１０の同定には、１紙ク
ロマトグラフィー、薄層クロマトグラフイ−、元素分析
、融点測定、赤外および紫外部吸収スペクトル、核磁気
共鳴スペクトル、質量分析などの手段が用いられる。

また、定量法としては、例えばレツドファーンの方法（
メンズ・イン・エンザイモロジー第１０巻、３８１頁、
１９６７年）。

（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ −
ｖｏｌ １０゜ｐ、３８１（１９６７））が用いられ
る。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明の詳細な説明
するが、これらによって本発明が限定されるものではな
い。

ｊ実施例 １ グルコース３チ、ポリペプトン１チ、酵母エキス０．５
％、麦芽エキス０．５％からなる培地（ｐＨ６，０）３
／を５１容小型醗酵槽に仕込み、常法により加熱滅菌後
冷却した。

これに予め同一の組成ノを有する培地に、２８℃１日前
培養したスポリデイオボシス・ルイネニーＣＢ５−５０
０１を接種し、２８℃にて、攪拌毎分８００回転、通気
毎分３１の条件で２４時間培養した。

培養中、アンモニアおよび硫酸を用いて、ｐＨを６．０
に保持した一環養液を遠心分離して菌体を採取し、水で
洗滌した後再度遠心分離して、生菌体ペーストを得た（
乾燥菌体５＝ｌ相当の菌体が得られ、この菌体にｄ乾物
１．ｇ当り９２０ ｕｇのユビキノン−１０が含まれて
いた。

）。 ２得られた湿菌体をエ
タノール７５０ ｍ ｌに懸濁し６０℃、１時間加温抽
出する。

同様に合計３回抽出し、抽出液を合わせ水でうすめたＩ
ｎ−へキサ７１０００ｍｌずつで３回抽出する。

ｎ−ヘキサン層を減圧下蒸発乾固すると黄色油状物４．
１２゜ｇが得られた。

これをベンゼン６ｍｌに酸カシ、フロリジル（１００〜
２００メツシユ）をつめたカラム（５００ｍｌ容）に流
し、ついでベンゼンを流し、溶出液を１０ｍ１ずつ分取
する。

各溶出液を薄層クロマトグラフィーおよび呈色反応でし
。

らべ、ユビキノン−１０の標品に相当する両分を集め減
圧下、蒸発乾固すると黄色油状物５６２■が得られた。

水晶をクロロホルム５ｍｌに溶かし、シリカゲルＧＦ２
５４ （硫酸カルシウム含有シリカゲルの薄層上に塗
布し、ベンゼンで展開しユビキ・ノン−１０の標品に相
当する部分を抽出すると、黄色油状物５４ｍ９が得られ
た。

水晶をエタノール１０ｍ１に溶かし放冷しユビキノン−
１０黄色晶２９ＷＩ９かえられた。

水晶は融点４８〜５０℃を示およびマススペクトル（ｍ
／ｅ１分子イオンピーク８６２、ヒドロキノンピーク８
６４、ピリリウムイオンピーク２３５、ペンシリウムイ
オンピーク１９７）から水晶をユビキノン−１０と同定
した。

実施例 ２ スボリデイオボラス・ジョンソニーＩＦＯ−６９０３を
実施例１の方法と同様の方法で培養し、生菌体ペースト
（乾燥菌体量４５ｇ相当）を得た。

この菌体１ｄ乾物１ ｇ当り５２０μｇのユビキノン−
１０を含有していた。

この菌体を実施例１の方法と同様に処理して、ユビキノ
ン−１０の黄色晶１３．６Ｗ１９をえた。

なお、このユビキノン−１０の同定は、実施例１の方法
と同様の方法で行った。

実施例 ３ 実施例１と同じ組成の培地を３０ ｍ ｌ宛２００ｍ１
容フラスコに分注後、滅菌した。

これにオオスポリデイウム・マーガリテイフエラムＣＢ
５−２５３１を接種し２４℃で１週間培養した。

これを集菌してユビキノン−１０を乾物１ｇ当り４５０
μｇを含む湿菌体１６９ｇ（乾燥菌体４１，９相当）を
えた。

実施例１と同様に処理すると黄色油状物質４．４７９が
得られ、これをさらに実施例１の方法と同様の方法で処
理して、ユビキノン−１０の黄色晶１１ヤをえた。

このユビキノン−１０の同定は、実施例１の方法と同様
の方法で行った。

実施例 ４ オオスポリデイウム・マーガリテイフエラムＣＢ５−６
１７７を実施例３の方法と同様の方法で培養し、湿菌体
１２０１をえた。

この菌体な実施例１の方法と同様の方法で処理してユビ
キノン−１０の黄色晶５．６■をえた。

このユビキノン−１０の同定は、実施例１の方法と同様
の方法で行った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ オオスポリデイウム（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ）
   属またはスポリデイオボラス（５ｐｏｒｉｄｉｏｂ
   ｏｌｕｓ ）属に属し、ユビキノン−１０を生産する能
   力を有する微生物を、栄養培地に培養してユビキノン−
   １０を生成せしめ、これを採取することを特徴とする微
   生物によるユビキノン−１０の製造法。