DE2708149A1 - Verfahren zur herstellung von ubichinon-10 - Google Patents
Verfahren zur herstellung von ubichinon-10Info
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Description
2708U9
VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE
Dr.-Ing. von Kreisler f 1973
Dr.-Ing. von Kreisler f 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
S KÖLN 1
24. Februar 1977 AvK/IM
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Osaka, Japan
Osaka, Japan
Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-1o
709837/0673
<'i't-· i'l -IS 41 ■ .1 TvI. . -. ?';')? J1, ,,-ι j V. !'!..in: Ij.,..,t, iit-i t ;,lii
2708U9 '*- 4
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass man einen Ubichinon-10 erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Sporidiobolus oder der Gattung
Oosporidium züchtet und Ubichinon-10 von den Mikrobenzellen
abtrennt.
Ubichinon ist eine allgemeine Bezeichnung für eine Reihe von Verbindungen der allgemeinen Formel:
CH3
CH=C-CH,
Ubichinon-10 ist eine Verbindung der obigen allgemeinen Formel, worin η = 10 ist, d.h. eine Verbindung, die 10
Isopreneinheiten in der Multiprenylseitenkette enthält.
Ubichinon-10 ist ein physiologisch wichtiges Derivat von Ubichinon, das im Tierreich und im Pflanzenreich
weit verbreitet ist und in die Endstufe des Elektronentransportsystems
von Lebewesen einbezogen ist.
Es wurde kürzlich berichtet, dass diese spezielle Verbindung wie andere Ubichinon-Homologe bestimmte pharmakologische
Aktivitäten aufweist, wie eine lindernde Wirkung auf die Herzinsuffizienz, und bestimmte physiologische
Aktivitäten aufweist, wie eine stimulierende V/irkung auf die Oxydations-Reduktions-Aktivität von Myocard-Mitochondrien
bei Menschen und Säugetieren, wie Hunden und Ratten
709837/0673
* „ 2708H9
(z.B. Seikagaku Zikken Koza, Bd. 13, S. 681-682, Tokyo
Kagaku Dozin, 1975). Ubichinon-10 v;urde klinisch per os an
Patienten mit Herzinsuffizienz verabreicht, normalerweise in rogelmässigen Dosen von 0,5 bis 1 mg pro kg und Tag bei
erwachsenen Menschen.
Ein Verfahren zur Erzeugung von Ubichinon-10 durch Extrahieren desselben aus tierischem Gewebe ist allgemein
bekannt. Jedoch ist es ausserordentlich schwierig, Ubichinon-10 in technisch signifikanten Mengen in industriellem
Massstab herzustellen, teils wegen der beschränkten Zugänglichkeit derartiger Quellen und teils, weil die Verbindung
nur in geringen Prozentsätzen vorkonmt. Es ist bekannt, dass bestimmte Bakterienstämme von Gattungen, wie Pseudomonas,
Agrobacterium usw., Pilzstämme von Gattungen, wie Neurospora, Aspergillus, Aureobasidium usw., Hefestämme von
Gattungen, wie Rhodotorula, Cryptococcus, Candida, Torulopsis,
Trichosporon, Sporobolomyces, Bullera, Rhodosporidium, Schizosaccharomyces, usw., und Basidiornycetenstämme von Gattungen,
v/ie Tremella, Ubichinon-10 in ihren Zellen anzureiehern
vermögen. Nichtsdestoweniger wurde noch kein technisches Verfahren entwickelt, das sich dieser Organismen bedient,
unter anderem wegen der ungeeigneten Menge an Ubichinon-10, die in den Zellen angereichert wird.
Im Falle von Bakterien haben die Zellen erstens eine Neigung, durch Bakteriophagen infiziert zu werden und
ihre Zellaktivitäten im Verlauf der Fermentierung zu verlieren, und zweitens ist das Isolieren der Zellen durch Zen-
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2708U9 -r- &
trifugieren oder Filtrieren schwierig und dauert lange, weil
die Zellen sehr klein sind.
Andererseits ist im Falle von Hefen, Pilzen und
Basidiomyceten die Ausbeute an Ubichinon-10 nicht befriedigend.
Vor diesem Hintergrund wurden umfangreiche Untersuchungen über die Möglichkeit, ein technisch vorteilhaftes
Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10- zu entwickeln, ausgeführt. Die Untersuchungen führten zu der
Feststellung, dass bestimmte Mikroorganismen, die. zu der Gattung Sporidiobolus oder der Gattung Oosporidium gehören,
Ubichinon-10 intrazellulär in grosser Menge anzureichern vermochten; von keinem dieser Mikroorganismen war bekannt
gewesen, dass sie Ubichincn-10 erzeugten. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus
der Gattung Sporidiobolus oder der Gattung Oosporidium, der Ubichinon-10 zu erzeugen vermag, züchtet und das genannte
Produkt erntet.
Im erfindungsgemässen Verfahren können beliebige Stämme der Gattung Sporidiobolus oder der Gattung Oosporidium,
die Ubichinon-10 zu erzeugen vermögen, mit Vorteil in geeigneter Weise verwendet werden. Zu den Stämmen, die
vorteilhafterweise verwendet werden können, gehören Sporidiobolus johnsonii IFO-69O3 (ATCC-2O'I9O) und Sporidiobolus
ruinenii CBS-5001 (IFO-I689, ATCC-20^89), Oosporidium mar-
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. 2708U9
—Β— "4
garitiferum CßS-2531 (ATCC-10676, IFO--12O8) und Oosporidium
margaritiferum CBS-6177 (IFO-I688), um nur einige wenige
zu nennen. Diese Mikroorganismenstämme wurden bei Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Niederlande;
The Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan; bzw. The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland,"
U.S.A. unter den oben genannten Nummern hinterlegt.
Es sei darauf hingewiesen, dass sachdienliche Beschreibungen von CBS-2531 und CBS-6177 in der CBS List
of Cultures, 28. Auflage (1972) auf Seite 305 enthalten sind; IFO-69O3 ist in IFO List of Cultures, 5. Auflage
(1972) auf Seite I8I beschrieben; und eine Beschreibung
von CBS-5001 findet sich in Lodder, The Yeasts, 2. Auflage, auf den Seiten 827 bis 83Ο.
Die Züchtung derartiger Mikroorganismen, die erfindungsgemäss
verwendet werden, kann unter Verwendung eines geeigneten Nährbodens erfolgen, der Quellen von assimilierbarem
Kohlenstoff, Quellen von assimilierbarem Stickstoff, anorganische Salze, Vitamine usw. enthält.
Die Kohlenstoffquellen können beliebige Materialien sein,
vjelche die verwendeten Mikroorganismen zu assimilieren vermögen, einschliesslich von Kohlehydraten (z.B. Glucose,
Saccharose, Maltose, Dextrin, lösliche Stärke, Stärke, Melasse usw.), Glycerin, Oelen und Fetten (z.B. Olivenöl,
Reiskleienöl usw.), organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure usw.),
Alkoholen (z.B. Aethanol, Propanol usw.) und anderen Quel-
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len. Als Stickstoffquellen können unter anderem genannt
werden: Malzextrakt, Pepton, Sojabohnenextrakt, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Harnstoff,
Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw.), Nitrate (z.B. Ammoniumnitrat, Natriumnitrat usw.) und andere
organische und anorganische stickstoffhaltige Materialien.
Erforderlichenfalls können auch geeignete Mengen von anorganischen Salzen (z.B. Natriumchlorid, Phosphate usw.),
Metallsalzen (die Sulfate, Hydrochloride, Nitrate und anderen Salze von Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen usw.),
Spuren-Nährstoffen (z.B. Vitamine, Aminosäuren, Nucleotide usw.), anderen günstig wirkenden Substanzen (z.B. p-Hydroxybenzoesäure,
Chorisminsäure, Shikimisäure usw.) und dergl. zugesetzt werden; insbesondere ist ein Zusatz von mindestens
10 ug pro Liter, vorzugsweise L000 ug pro Liter bis 30.000 ug pro Liter, p-Hydroxybenzoesäure wirksamer zur Erhöhung
der Ausbeute der gewünschten Verbindung. Auch Salze (z.B. das Natriumsalz, das Kaliumsalz usw.) der p-Hydroxybenzoesäure
und Fettsäureester (z.B. der Aethylester, der n-Nonylester, der Laurylester usw.) von p-Hydroxybenzoesäure
sind verwendbar.
Obgleich beliebige stationäre und Schüttelkulturmethoden
angewandt werden können, ist im allgemeinen die submerse Kultur unter aeroben Bedingungen vorteilhaft. Im
allgemeinen liegt die Bebrütungstemperatur zwecknässig im
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Bereich von 15 bis 1JO 0C, wobei die Züchtung zweckmässig
ca. 10 Stunden bis ca. 10 Tage lang fortgesetzt wird, wobei der pH-Wert des Nährbodens im Bereich von 2 bis 10,
vorzugsweise im Bereich von 3 bis 8, gehalten wird. Aus der resultierenden Brühe werden die Zellen durch Verfahren
wie Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt und gewonnen. Weil das Ubichinon-10 in den so geernteten Zellen angereichert
ist, können diese nach geeigneter Verarbeitung (z.B. Trocknen, Mahlen usw.) direkt als Nährmittel oder als pharmazeutische
Mittel verv/endet werden. Erforderlichenfalls kann Ubichinon-10 aus dem zelligen Produkt isoliert werden.
Die Isolierung von Ubichinon-10 aus den Zellen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Ubichinon-10 ist
ein neutrales Lipid. Es ist in Wasser unlöslich, in polaren organischen Lösungsmitteln löslich und in nichtpolaren Lösungsmitteln,
insbesondere Kohlenwasserstoffen, gut löslich. Die Isolierung wird durch Ausnutzung der obigen Eigenschaften
ausgeführt. Im folgenden wird ein typisches Isolierungsverfahren für Ubichinon-10 beschrieben: Die Zellen werden
zu Aethanol gegeben und unter Erhitzen auf 50 bis 90 0C eine
bis mehrere Stunden lang extrahiert. Die Phospholipide und anderen verseifbaren Komponenten der Zellen können aber auch
zuerst mit einem Gemisch aus Methanol, Natriumhydroxyd und Pyrogallol verseift werden, worauf ein mit V/asser nicht
mischbares Lösungsmittel, wie η-Hexan, zu der verseiften
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Flüssigkeit zugesetzt wird, um das Ubichinon-10 zu extrahieren.
Danach kann der Extrakt einem fraktionierten Reinigungsverfahren, z.B. unter Verwendung von Kieselgel oder
Florisil (Floridin Co., USA) unterworfen werden, um die genannte Verbindung zu isolieren.
Die Identität des so aus den Zellen extrahierten Ubichinon-10 kann durch Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie,
Elementaranalyse, Schmelzpunktsbestimmung, Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektrometrie, magnetische
Kernresonanzspektrometrie, Massenspektrometrie und andere Verfahren bewiesen werden.
Quantitative Bestimmungen können z.B. nach dem Verfahren von Redfarn [Methods in Enzymology, Band 10, S.
381 (1967)] vorgenommen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Teile sind Gewichtsteile, wenn nichts anderes angegeben ist, und Teile verhalten sich zu Volumenteilen wie g zu ml;
Prozentangaben sind auf das Verhältnis Gewicht/Volumen bezogen, wenn nichts anderes bemerkt ist.
Ein kleiner Fermentationsbehälter (mit einem Fassungsvermögen von 5.000 VoL-Teilen) wurde mit 3.000 VoI.-Teilen
eines Nährbodens (pH = 6,0) beschickt, der 3 %
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Glucose, 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,5 % Malzextrakt
enthielt. Der Nährboden wurde durch Erhitzen in herkömmlicher Weise sterilisiert und abgekühlt. Dieser
Nährboden wurde mit 150 Vol.-Teilen einer Vorkultur von Sporidiobolus ruinenii CBS-5001 geimpft, die hergestellt
worden war, indem man den gleichen Stamm auf einem Nährboden mit der gleichen Zusammensetzung wie oben einen Tag bei
28 0C züchtete. Der beimpfte Nährboden wurde bei 28 0C und
unter Rühren mit 800 Umdrehungen pro Minute sowie unter Durchblasen in einer Menge von 3.000 Vol.-Teilen pro Minute
2k Stunden lang bebrütet. Während dieser Fermentierungszeit wurde der Mährboden mit Ammoniak und Schv/efelsäure auf pH =
6,0 gehalten.
Die resultierende Fermentierungsbrühe wurde zentrifugiert,
um die Mikrobenzellen zu ernten, und diese wurden mit Wasser gewaschen und ein zweites Mal zentrifugiert,
worauf eine lebende Zellpaste erhalten wurde. Es wurde eine Menge an Zellen erhalten, die 5Ί Teilen auf Trockenbasis
äquivalent war und 920 ^ig Ubichinon-10 pro g trockene ZeI-len
enthielt.
Die feuchten Zellen wurden in 750 Vol.-Teilen Aethanol suspendiert und durch einstündiges Erwärmen auf
60 0C extrahiert. Insgesamt drei Extraktionen wurden in ähnlicher
Weise ausgeführt; die Extrakte wurden vereinigt, mit V/asser verdünnt und weitere dreimal mit 1.000 Vol.-Teilen
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•VI-
η-Hexan extrahiert. Die n-Hexanschicht wurde unter vermindertem
Druck zur Trockene eingeengt, wobei Ί,12 Teile eines gelben OeIs erhalten wurden. Dieser ölige Rückstand wurde
in 6 Vol.-Teilen Benzol gelöst und durch eine mit Floridil (0,075 bis 0,15 mm Teilchengrösse) gefüllte Säule (Fassungsvermögen
500 Vol.-Teile) geleitet. Die Eluierung erfolgte unter Verwendung von Benzol, und das Eluat wurde in Fraktionen
von je 10 Vol.-Teilen aufgefangen. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie und Farbreaktionen
analysiert, und die an Ubichinon-10 reichen Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Durch
dieses Verfahren wurden 0,562 Teile eines gelben OeIs erhalten. Dieses Produkt wurde in 5 Vol.-Teilen Chloroform
gelöst, auf eine Dünnschichtplatte von Kieselgel GF 25^
(Kieselgel mit Calciumsulfat) aufgebracht und mit Benzol entwickelt. Die Ubichinon-10 entsprechenden Fraktionen
wurden extrahiert, wobei 0,05*1 Teile eines gelben OeIs erhalten
wurden. Dieses OeI wurde in 10 Vol.-Teilen Aethanol gelöst und abkühlen gelassen, v/orauf 0,029 Teile gelbe Kristalle
von Ubichinon-10 erhalten v/urden.
Die physikalischen Eigenschaften dieser Kristalle - Schmelzpunkt ^8 bis 50 0C, Ultraviolettspektrum :
^Aethanol ^5 nm; und Massenspektrum . m/ej m+862, Hydrochi-
!•ld A
nonform 86*J, Pyryliumionenpeak 235, Benzyliumionenpeak 197 zeigten,
dass das ölige Produkt mit Ubichinon-10 identisch
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war.
Nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurde Sporidiobolus johnsonii IFO-69O3 gezüchtet, um eine
lebende Zellpaste zu erhalten (^5 Teile auf Trockenbasis).
Die Zellen enthielten 520 ug Ubichinon-10 pro g trockene
Zellen. Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 13,6 χ 10 Teile gelbe Kristalle von Ubichinon-10
erhalten wurden. Die Identifizierung des Produktes wurde
nach ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 ausgeführt.
Portionen von je 30 VcI.-Teilen eines Nährbodens mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden
in 200 VoI.-Teile-Kolben verteilt und sterilisiert. Jeder Kolben wurde mit einer Oese voll Oosporidium margaritiferum
CBS-2531 geimpft und 1 Woche lang bei 2*J 0C bebrütet. 1.620
Vol.-Teile der bebrüteten Kulturbrühe wurden gesammelt. Die Zellen wurden aus der Brühe geerntet. Das obige Verfahren
ergab I69 Teile feuchte Zellen (entsprechend *J1 Teilen trokkenen
Zellen), die *J50 ^ug Ubichinon-10 pro g trockene Zellen
enthielten. Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 behandelt und ergaben 4,^7 Teile eines gelben öligen Produktes.
Dieses Produkt wurde wie in Beispiel 1 weiter behandelt, v/o-
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bei 11 χ 10 Teile gelbe Kristalle von Ubichinon-10 erhalten
wurden. Die Identifizierung des Produktes erfolgte wie in Beispiel 1.
Nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 3 wurde Oosporidium margaritiferum CBS-6177 gezüchtet, wobei
1.020 Vol.-Teile bebrütete Kulturbrühe erhalten wurden. Die Zellen wurden aus der Brühe geerntet. Das obige Verfahren
ergab 120 Teile feuchte Zellen (entsprechend 25 Teilen trockenen Zellen), die 550 |ig Ubichinon-10 pro g trokkene
Zellen enthielten. Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 weiter behandelt, wobei 5,6 χ 10"3 Teile gelbe Kristalle
von Ubichinon-10 erhalten wurden. Die Identifizierung dieses
Produktes mit Ubichinon-10 wurde ähnlich wie in Beispiel
1 ausgeführt.
Ein Fermentierungsgefäss mit 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen wurde mit 30 Vol.-Teilen eines Nährbodens
(pH = 6,0) beschickt, der 3 % Glucose, 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,5 ί Malzextrakt enthielt. Der Nährboden
wurde durch Erhitzen in herkömmlicher Weise sterilisiert und abgekühlt. Dieser Nährboden wurde mit Sporidi-
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2708U9 4Ϊ
obolus johnsonii IFO 6903 geimpft. Der geimpfte Nährboden
wurde unter Rühren 48 Stunden lang bei 28 0C bebrütet, um
eine Impfkultur herzustellen.
Ein Fermentationsbehälter (5.000 Vol.-Teile Fassungsvermögen)
wurde mit 3-000 Vol.-Teilen eins Nährbodens beschickt, der 6 % Glucose, 0,3 % Trockenhefe, 0,12 %
KCl, 0,1 % MgSO14, 0,02 % FeSO14, 0,2 % (NH14J2SO14, 0,5 %
Harnstoff, 0,015 % CaCl3, 0,25 % H3PO14, 0,002 % ZnSO14,
0,001 % MnSO14, 0,0005 % CuSO115S x 10 % Vitamin B1 und
5 χ 10 % p-Hydroxybenzoesäure enthielt. Der Nährboden
wurde durch Erhitzen in herkömmlicher V/eise sterilisiert und abgekühlt.
Dieser Nährboden wurde mit 150 Vol.-Teilen der Impfkultur geimpft, und der geimpfte Nährboden wurde unter
Rühren mit 800 Umdrehungen pro Minute und Durchblasen in einer Menge von 3.000 Vol.-Teilen pro Minute 21 Stunden
lang bei 28 0C bebrütet. Während dieser Fermentierungszeit
wurde der Nährboden mit Ammoniak und Schwefelsäure auf pH = 6,0 gehalten.
Die resultierende Fermentierungsbrühe wurde filtriert,
um die Mikrobenzellen zu ernten.
Das obige Verfahren ergab 38Ο Teile feuchte Zellen (entsprechend 84 Teilen trockenen Zellen), die
740 jjg Ubichinon-10 pro g trockene Zellen enthielten.
Die Zellen v/urden wie in Beispiel 1 behandelt
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und ergaben 0,038 Teile Kristalle von Ubichinon-10.
Ein Fermentierungsgefäss (200 Vol.-Teile Fassungsvermögen)
wurde mit 30 Vol.-Teilen eines Nährbodens (pH = 6,0) beschickt, der 6 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt,
0,12 % KCl, 0,1 % MgSO11, 0,02 % FeSO14, 0,3 % (NH^)3SO14,
0,3 % Harnstoff, 0,15 % H3PO14, 0,002 % ZnSO14, 0,001 % MnSO14,
0,0005 % CuSO^, 5 x 10 % Vitamin B1, 5 x 10 % p-Hydroxybenzoesäure
und 0,3 % CaCO, enthielt. Der Mährboden wurde durch Erhitzen in herkömmlicher Weise sterilisiert und abgekühlt.
Dieser Nährboden wurde mit Oosporidium margaritiferum
CBS-2531 geimpft. Der geimpfte Nährboden wurde I1I1I
Stunden lang bei 21 0C bebrütet.
2.010 Teile der resultierenden Fermentierungsbrühe wurden filtriert, um die Mikrobenzellen zu ernten.
Das obige Verfahren ergab 250 Teile feuchte Zellen (entsprechend *»0 Teilen trockenen Zellen), die J6O jig
Ubichinon-10 pro g trockene Zellen enthielten.
Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 behandelt und ergaben 0,022 Teile gelbe Kristalle von Ubichinon-10.
Nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 6 709837/0673
wurde Oosporidium margaritiferum CBS-6177 gezüchtet, wobei
210 Teile feuchte Zellen (entsprechend ^3 Teilen trockenen
Zellen), die 750 ug Ubichinon-10 pro g trockene Zellen enthielten,
erhalten wurden.
Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 behandelt und ergaben 0,02 Teile gelbe Kristalle von Ubichinon-10.
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Claims (11)
- 2708U9Patentansprüche! 1) !Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zur Gattung Sporidiobolus oder zur Gattung Oosporidium gehört und Ubichinon-10 zu erzeugen vermag, in einem Nährboden, der eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff enthält, züchtet, bis Ubichinon-10 wesentlich angereichert worden, ist, und das Ubichinon-10 gewinnt.
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- | net, dass man einen Mikroorganismus verwendet, der zur Gattung Sporidiobolus gehurt.
- 3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus verwendet, der zur Gattung Oosporidium gehört.
- 4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mährboden verwendet, der p-Hydroxybenzoesäure enthält.
- 5) Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Sporidiobolus johnsonii verwendet.
- 6) Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekonnzeichnet, dass man als Mikroorganismus Sporidiobolus ruinenii verwendet.709837/0673ORIGINAL INSPECTED_2_ 2708U9
- 7) Verfahren nach Anspruch 3 oder ^, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Oosporidium margaritiferum verwendet.
- 8) Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Sporidiobolus johnsonii IFO-6903 verwendet.
- 9) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Sporidiobolus ruinenii CBS-5001 verwendet.
- 10) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Oosporidium margaritiferum CBS-2531 verwendet.
- 11) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Oosporidium margaritiferum CDS-6177 verwendet.709837/0673
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