DE4126325C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aphidicolin (vgl. den Oberbegriff des Patentanspruchs).

Aphidicolin ist eine schwer wasserlösliche Substanz mit einer tetrazyklischen Diterpentetraolstruktur, dargestellt durch die folgende Formel

die aus Verticillium lecanii, einer Schimmelpilzart, gewonnen wird und bei der antivirale Wirkung gefunden wurde. Aphidicolin wirkt ebenfalls hochspezifisch inhibierend auf die DNA-Polymerase alpha aus eukaryotischen Zellen und wird daher zur Identifikation des Typs der DNA-Polymerase aus eukaryotischen Zellen verwendet. Ferner zeigt Aphidicolin keine solche Wirksamkeit gegenüber DNA-Polymerase aus prokaryotischen Zellen, ausgenommen spezifischen Viren, und wird hauptsächlich bei der Analyse der DNA-Replikation und des Reparaturmechanismus verwendet. Darüber hinaus kennt man bei Aphidicolin eine Antitumorwirksamkeit, eine antivirale Wirksamkeit und einen wachstumsinhibierenden Effekt auf pflanzliches Saatgut und daher wird seine Verwendung in diesen Bereichen in Erwägung gezogen.

Aphidicolin wird jedoch mit einer niedrigen Produktionsrate gebildet und ist daher nur als ein sehr teures biochemisches Mittel käuflich erhältlich. Es wird auch die Gewinnung von Aphidicolin unter Verwendung anderer Pilze als Cephalosporium aphidicola berichtet, z. B. Phoma betae (JP-OS 58-2 20 690), Harziella entomophila (Agri. Biol. Chem. 42, Nr. 9, Seite 1611 (1978)), Onychophora coprophila (Trans. Br. Mycol. Soc., 83, Nr. 1, Seite 149 (1984)), Nigrospora sphaerica (Can. J. Microbiol., 20, Seite 416 (1974)) usw., aber ihre Produktionsrate an Aphidicolin ist niedrig und nicht zufriedenstellend. Beispielsweise werden nur 120 mg Aphidicolin aus 1,5 l eines Kulturmediums von Nigrosphora sphaerica isoliert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein hochproduktives Verfahren zur Herstellung von Aphidicolin durch Kultur von Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Aphidicolin durch Kultur des zur Gattung Verticillium gehörenden Mikroorganismus Verticillium sp. FERM BP-3430, wobei Aphidicolin gebildet und akkumuliert wird, und das Aphidicolin hieraus gewonnen wird.

Als zur Gattung Verticillium gehörender Mikroorganismus wird der Stamm KN-04 (FERM BP-3430) verwendet, der aus dem Erdboden während der Suche nach biologisch aktiven, von Pilzen produzierten Substanzen isoliert wurde (die Erde haftete an Pilzen, die natürlich in einer Bambusgruppe in Gifu Stadt, Japan, wachsen).

Der Stamm KN-04 der Gattung Verticillium hat die folgenden mikrobiellen Eigenschaften:

a) Kultureigenschaften (Plattenkultur bei 25°C) 1) Kartoffeldextroseagarmedium

Kolonien zeigen schnelles Wachstum, erreichen ca. 42 mm Durchmesser in 8 Tagen. Flache nasse Kolonien mit stäbchenförmigen Hyphen, leicht erhaben und sich radial vom Koloniezentrum zur Peripherie hin ausdehnend. Die Kolonie hat eine kreisförmige Peripherie und ein erhabenes Zentrum mit einem hefeähnlichen Wachstum. Zunächst weiß, später leicht gelb in der Gegend des Zentrums auf der Rückseite. Die Kolonie hat keine gefurchte Oberfläche und Rückseite.

2) Sabourand′s Agarmedium

Kolonien zeigen schnelles Wachstum, erreichen ca. 38 mm im Durchmesser in 8 Tagen. Nasse Kolonien mit stäbchenförmigen Hyphen, leicht erhaben und sich radial vom Koloniezentrum zur Peripherie ausdehnend. Die Kolonie hat eine kreisförmige Peripherie und ein erhabenes Koloniezentrum mit hefeähnlichem Wachstum. Zunächst weiß, später leicht gelb am Koloniezentrum auf der Rückseite. Die Kolonie hat keine gefurchte Oberfläche und Rückseite.

3) YpSs-Agarmedium

Kolonien zeigen schnelles Wachstum, erreichen ca. 40 mm Durchmesser in 8 Tagen. Weiße watteähnliche Kolonien mit relativ schlanken und wenig ausgebildeten, stäbchenförmigen Hyphen. Die Kolonie hat eine kreisförmige Peripherie und ein erhabenes Zentrum mit hefeähnlichem Wachstum. Weiß auf der Rückseite. Die Kolonie hat keine gefurchte Oberfläche und Rückseite.

4) Czapek′s Agarmedium

Die Kolonien zeigen schnelles Wachstum, erreichen 33 mm im Durchmesser in 8 Tagen. Weiße, watteähnliche, dünne Kolonien mit im wesentlichen keinen stäbchenförmigen Hyphen. Die Kolonie hat eine zirkuläre Peripherie und ein hervortretendes Koloniezentrum mit hefeähnlichem Wachstum. Weiß auf der Rückseite. Die Kolonie hat keine faltige Oberfläche und Rückseite.

b) Morphologische Eigenschaften

Die Hyphen sind verzweigt und haben eine glatte Oberfläche und Septen und sind einzeln oder im Verbund in einer stäbchenförmigen Anordnung. Die Conidiophore wird an der Lufthyphe oder vegetativen Hyphe produziert und ist einzeln oder als Wirbel ausgebildet.

Die Phialiden sind einzeln oder in einem Wirbel angeordnet, entspringen von den Conidiophoren und haben ein leicht verkleinertes Ende an der Spitze und ein leicht vergrößertes Ende am Ansatz. Die Größe ist variabel, gewöhnlich 15-30×2-4 µm. Die Conidien sind in einem klebrigen Sporenball, der an dem Spitzenende der Phialide gebildet wird, enthalten. Die Art der Conidiumbildung ist vom Phialo-Typ. Die Form entspricht dem Zigarren-Typ (oder dem Bacillus-Typ). Die Größe ist variabel, im allgemeinen 3-7×1-2 µm.

Wie oben beschrieben, besitzt der vorliegende Stamm kein sexuelles Reproduktionsorgan, sondern bildet nur eine Conidiophore als asexuelles Reproduktionsorgan und gehört daher zu Hyphomycetales von Hyphomycetes von Deuteromycotina. Die Conidiophore des vorliegenden Stammes wird einzeln oder verzweigt produziert (Fig. 3) und die Phialide wird lokal in einem Wirbel produziert (Fig. 1 bis 3). Die Phialoconidien werden als klebriger Sporenball am Spitzenende der Phialide (Fig. 1 bis 3) gebildet. Der vorliegende Stamm wurde als zur Gattung Verticillium zugehörig bestimmt (offenbart von J.W. Carmichael et al, Genera of Hyphomycetes, Seiten 196 und 208, veröffentlicht durch The University of Alberta Press, Albeta, Canada (1986) und George L. Barron: The Genera of Hyphomycetes from Soil, Seite 321, veröffentlicht von The Williams & Wilkins Company, Baltimore, USA (1968)).

Ferner ergab sich bei der Artbestimmung, daß der vorliegende Stamm Verticillium lecanii (Synonym Cephalosporium aphidicola), offenbart von Walter Gams: Cephalosporiumartige Schimmelpilze, Seite 176, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1971), ähnelt. Vergleichskulturen des vorliegenden Stammes und Cephalosporium aphidicola ATCC 28300 unter identischen Bedingungen (Plattenkultur bei 25°C auf einem Kartoffeldextroseagarmedium) zeigte jedoch bemerkenswerte Unterschiede in den Kultureigenschaften. Beispielsweise hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit erreicht die Kolonie des vorliegenden Stammes einen Durchmesser von ca. 42 mm am 8. Tag, wohingegen diejenige von Cephalosporium aphidicola nur einen Durchmesser von ca. 19 mm erreichte. Ferner bildet der vorliegende Stamm eine flache nasse Kolonie, auf der stäbchenförmige Hyphen radial vom Zentrum zur Peripherie sich ausdehnen, wohingegen Cephalosporium aphidicola ATCC 28300 eine erhabene dicke Kolonie in einem weiß-purpurnen Zustand bildet, auf der keine stäbchenförmigen Hyphen beobachtet werden. Ein weiterer großer Unterschied ist, daß die Kolonie des vorliegenden Stammes ein hefeähnliches Wachstum im Zentrum zeigt, wohingegen die Kolonie von Cephalosporium aphidicola ATCC 28300 keine besonderen Eigenschaften im Zentrum aufweist.

Ein Vergleich des vorliegenden Stammes mit bekannten Arten der Gattung Verticillium zeigte, daß weder eine identische Art noch Unterart vorlag und daher der vorliegende Stamm nun als Verticillium sp. bezeichnet werden kann. Obwohl der vorliegende Stamm morphologische Eigenschaften der Gattung Verticillium zeigt, hat er eine hefeähnliche Wachstumsperiode (Fig. 4), die nicht in der Beschreibung der Gattung Verticillium vorkommt und daher sind ferner ausführliche taxonomische Studien erforderlich zu einer exakten taxonomischen Bestimmung der Art.

c) Physiologische Eigenschaften

• 1) Optimale Wachstumstemperatur 23 bis 28°C, der vorliegende Stamm wächst bei 10 bis 35°C.
• 2) Optimaler Wachstums-pH liegt im Bereich von 5 bis 8, der vorliegende Stamm wächst im pH-Bereich von 2 bis 10.
• 3) Während der Kultur auf einem Kartoffeldextroseagar-Kulturmedium können Aphidicolinkristalle im Medium ausfallen.

Der Stamm KN-04 kann entsprechend üblicher Methoden zur Kultur von Pilzen kultiviert werden, d. h. durch Festkultur oder Schüttelkultur. Jedes synthetische Medium, halbsynthetische Medium und natürliches Medium kann als Kulturmedium verwendet werden, sofern es eine für den Stamm verwertbare Versorgungsquelle enthält.

Das Medium enthält eine Kohlenstoffquelle, wie Glukose, Maltose, Saccharose, Dextrin, Glycin, Stärke, Kartoffelextrakt, Saw Dusts, Maismehl usw., eine Stickstoffquelle, wie Sojabohnenpulver, Cornsteep Liquor, Baumwollsamenpulver, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Peptone, Kartoffelextrakt, Kaseinhydrolysat, getrocknete Hefe, Reismehl, Ammoniumsalze, Nitrate usw., und gegebenenfalls anorganische Salze, wie Sulfate, Nitrate, Carbonate, Phosphate, Chloride usw., von Natrium, Kalium, Magnesium, Kalzium, Zink, Eisen usw. Wenn das Medium als Festmedium verwendet wird, enthält das Medium ferner ein Geliermittel, wie Agar, Gelatine, Kieselgel, Gerangummi usw.

Es ist im allgemeinen bevorzugt, die Kultur unter aeroben Bedingungen bei einer Kulturtemperatur von ca. 20 bis 30°C und einem pH von ca. 5 bis ca. 8 durchzuführen. Die Kulturzeit hängt von der Zusammensetzung des Mediums, der Kulturtemperatur usw. ab und beträgt im allgemeinen 1 Woche bis 1 Monat. Aphidicolin kann gebildet und im Medium während der Kulturzeit akkumuliert werden.

Das im Medium gebildete und akkumulierte Aphidicolin kann nach einer geeigneten Kombination üblicher Methoden zur Gewinnung und Reinigung metabolischer Produkte aus einem Kulturmedium von Mikroorganismen gewonnen werden.

Zum Beispiel kann Aphidicolin aus einem Festkulturmedium durch Pulverisieren des festen Kulturmediums, Suspendieren des gepulverten Kulturmediums in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das in der Lage ist, Aphidicolin zu lösen, z. B. Methanol, wodurch das Aphidicolin in das Lösungsmittel bei Raumtempertur oder unter Erwärmung extrahiert wird, Filtrieren des Extraktes, Konzentrieren des Filtrates zur Trockne bei einer Temperatur unterhalb 60°C und Reinigen des Rückstandes durch Kieselgel-Säulenchromatografie isoliert werden.

Aphidicolin kann auch aus einem flüssigen stationären Kulturmedium durch Konzentrieren des Kulturmediums (Kulturflüssigkeit) zur Trockne bei einer Temperatur unterhalb 60°C, worauf sich dieselben Schritte, wie im Falle des festen Kulturmediums anschließen, mit der Ausnahme, daß ein Rekristallisationsschritt des Rückstandes aus einer Lösungsmittelmischung von Methanol und Wasser unter Erhalt von Rohkristallen vor der Kieselgel-Säulenchromatografie durchgeführt wird, isoliert werden.

Aphidicolin wird mit einer hohen Produktionsrate durch Kultur eines zur Gattung Verticillium gehörenden Mikroorganismus, nämlich des Stammes KN-04 (FERM BP-3430), im Kulturmedium produziert.

Fig. 1 bis 4 zeigen die mikroskopischen Merkmale von Verticillium sp., wobei Fig. 1 und 2 Zeichnungen aufgrund direkter Beobachtung von Objektträgerkulturen zeigen, Fig. 3 ist eine Zeichnung aufgrund einer Präparatbeobachtung einer Objektträgerkultur und Fig. 4 ist eine Zeichnung aufgrund einer Präparatbeobachtung eines Koloniezentrums (hefeähnliche Region).

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele erklärt.

Beispiel 1

Eine Schrägkultur des Stammes KN-04 der Gattung Verticillium wurde in 30 ml Saatkulturmedium (hergestellt durch Suspension von 39 g Kartoffeldextroseagar-Kulturmedium in 1 l destilliertem Wasser mit anschließender Filtration unter Entfernung des unlöslichen Agars und Sterilisation in einem Autoklaven bei 120°C für 15 Minuten) in 200 ml-Kolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 25°C für 3 Tage unterworfen. Anschließend wurden 100 µl der erhaltenen Kulturflüssigkeit in 10 ml Kulturmedium (hergestellt durch Suspension von 39 g Kartoffeldextroseagar-Kulturmedium in 1 l destilliertem Wasser mit anschließender Sterilisation in einem Autoklaven bei 120°C für 15 Minuten und Gießen von 10×10 ml der heißen Agarlösung in Petrischalen) in Petrischalen angeimpft (jeweils 9 cm im Durchmesser und 15 mm tief) und einer Stationärkultur bei 25°C für 20 Tage unterworfen.

Das so kultivierte Medium (625 ml) wurde pulverisiert und in 2 l Methanol unter Erhitzen 3 Stunden rückflußgekocht. Nach Abkühlen wurde die erhaltene Mischung filtriert und das Filtrat bei einer Temperatur unter 60°C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatografie (Wako Gel C-300; Elutionsmittel: Chloroform/Methanol) gereinigt und anschließend das Eluat aus Ethanol unter Erhalt von 905 mg farblosen Nadeln von Aphidicolin (Schmelzpunkt 237 bis 239°C) umkristallisiert. Das Produkt wurde durch Vergleich seines IR-Spektrums, Massenspektrums, Dünnschichtchromatografie und optischer Rotation mit authentischen Proben von Aphidicolin identifiziert.

Beispiel 2

40 ml eines flüssigen Mediums (entsprechend dem Samenkulturmedium) in einem 500 ml-Kolben wurden mit der aus Beispiel 1 erhaltenen Samenkultur (100 µl) angeimpft und einer Stationärkultur bei 25°C für 20 Tage unterworfen.

Das so kultivierte Medium (80 µl) wurde bei einer Temperatur unterhalb 60°C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene Rückstand wurde durch Säulenchromatografie gereinigt und aus Ethanol unter Erhalt von 24 mg farbloser Nadeln von Aphidicolin umkristallisiert, das durch Vergleich mit einer authentischen Probe von Aphidicolin identifiziert wurde.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von Aphidicolin durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium und Gewinnen von Aphidicolin hieraus, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Verticillium sp. FERM BP-3430 züchtet.