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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika, nachstehend als aktive Komponenten A, B, C, D, E und F bezeichnet. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Komponenten A bis F ist dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme von der Basidiomycetenart Xeromphalina campanella unter üblichen Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert und aus der Kulturbrühe die aktiven Komponenten abtrennt. Die aktiven Komponenten sind wasserunlösliche, organische Verbindungen, die eine starke biologische Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien, Hefen und Mycelpilzen aufweisen.
Im Rahmen eines Screening nach neuen antibiotischen Substanzen bei Basidiomyceten wurden ungefähr 350 verschiedene Basidiomycetenstämme isoliert, auf Agarnährboden reinkultiviert und anschliessend auf Bildung antifungal wirksamer Substanzen untersucht. Hiebei zeigten die Isolate aller untersuchten Xeromphalina campanella Stämme nach entsprechender Oberflächen- bzw. Submerskultivierung im üblichen Agardiffusionstest eine beachtliche antibiotische Wirkung gegenüber dem Indikatorstamm Saccharomyces cerevisiae.
Im Kulturbrei aller dieser Stämme kann mittels Dünnschichtchromatographie und Bioautographie ein Gemisch von 6 aktiven Metaboliten, die als aktive Komponenten A, B, C, D, E und F bezeichnet wurden, nachgewiesen und charakterisiert werden. Die quantitative Zusammensetzung der Komponentenmischung jedes einzelnen Stammes schwankt etwas in Abhängigkeit von Wachstum, Nährmedium und Kultivierungscharge, doch streuen diese Titerschwankungen im üblichen Rahmen der Fermentation von Sekundärmetaboliten.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens besonders geeignete Pilzstämme sind die unter der Bezeichnung xpca l, xpca 2, xpca 3 und xpca 4 bei Prof. Dr. Meinhard Moser, Institut für Mikrobiologie der Universität Innsbruck, Sternwartestrasse 15, A 6020 Innsbruck, hinterlegten Stämme der zur Basidiomycetenfamilie der Tricholomataceae gehörenden Pilzart Xeromphalina campanella, die in den Jahren 1975 bis 1977 aus Basidiosporen von Pilzproben verschiedener Fund-
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:Ebersdorf bei Graz in der Steiermark, 1977) isoliert wurden. Die kleine Pilzart Xeromphalina campanella (geselliger Glöckchenstiel-Nabeling), die vom Fühjahr bis zum Herbst büschelig auf faulen Baumstrünken anzutreffen ist, trägt einen glockig gewölbten, stark gerieften Hut mit welligem Rand und gelblich rotbrauner Farbe.
Die Lamellen sind entfernt und blass gelb bis gelb rötlich. Der Stiel hat eine rotbraune, oben blassere Farbe.
Agar-Oberflächenkulturen der vier isolierten Stämme zeigen ein anfangs unpigmentiertes, mit zunehmender Kulturdauer aber sich rotbraun verfärbendes, flaches Substratmycel mit nur wenig und kurzen Lufthyphen. Eine vegetative Sporenbildung fehlt. In Submerskultur bilden die Stämme ein hellbraunes, wenig pigmentiertes Kugelmycel. Für die Heranzüchtung und Fermentation der Pilzstämme können z. B. die in der Tabelle 1 angeführten Nährböden bzw.
Nährlösungen eingesetzt werden :
Tabelle 1
Zusammensetzung (in g) pro Liter Nährboden
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<tb>
<tb> Nährmedium <SEP> BIV <SEP> Nährmedium <SEP> BM
<tb> Malzextrakt <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> Glucose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 10,0 <SEP> Bierhefeautolysatfiltrat
<tb> Glutaminsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> (zirka <SEP> 50 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Stickstoff) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> (N)
<tb> Pepton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> MgSO.. <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Ca <SEP> (NO.), <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> KH. <SEP> PO. <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Biotin <SEP> 10-6
<tb> MgSO. <SEP> 7 <SEP> H. <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Aneurin <SEP> 5.
<SEP> 10-5
<tb>
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Nährmedium <SEP> BIV <SEP> Nährmedium <SEP> BM
<tb> Ca <SEP> (N03) <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> Inosit <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Biotin <SEP> 10-6 <SEP> (Agar) <SEP> (20-25)
<tb> Aneurin <SEP> 5. <SEP> 10- <SEP> 5 <SEP>
<tb> Inosit <SEP> 0,05
<tb> (Agar) <SEP> (20-25) <SEP>
<tb>
Pro Liter Nährmedium werden jeweils noch 20 ml einer Spurenelementlösung folgender Zusammensetzung dazugegeben : Eisen (II) sulfat 0, 5 g, Mangan (II) sulfat 0, 3 g, Zinkchlorid 0, 2 g, Kupfer (II) sulfat 0, 05 g/l H20 dest. Nach PH-Einstellung (PH 6, 5) wird die Nährlösung oder der
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gen Nährböden, insbesondere nach dem Submersverfahren unter Schütteln der Kulturlösung.
Die Züchtungstemperatur liegt bei 24 C. Die Antibiotika haben sich gewöhnlich nach etwa 10 bis 14 Tagen in ausreichender Menge in der Kulturbrühe angereichert. Sobald die Ausbeute an den Verbindungen in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse abgetrennt, z. B. abfiltriert, und aus dem Filtrat das Produkt isoliert und gereinigt. Die Isolierung und Reinigung der aktiven Komponenten wird nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt.
Beispielsweise werden zur Erzeugung des Impfgutes für das Submersverfahren, von den Stammkulturen (Agaroberflächenkulturen auf B IV Agar) ausgehend, Subkulturen herangezüchtet. Dazu werden die Oberflächenkulturen (Substratmycelien) von zwei bis drei Schrägagarröhrchen in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit 60 ml BM-Nährlösung überimpft. Der beimpft Kolben wird dann zirka
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Mixgerät steril gemixt. Die so gewonnene Mycelsuspension des Pilzes kann nun dazu dienen, weitere Oberflächenkulturen zur schnelleren Vermehrung des Pilzes herzustellen, oder diese Suspension kann direkt als Impfgut für die Hauptstufen eingesetzt werden. Ersteres wird wegen des eher langsamen Wachstums der xpca-Stämme vorgezogen.
Dazu werden mit je 150 ml Nährboden BIV beschickte Roux-Flaschen mit jeweils zirka 5 bis 10 ml Impfsuspension beimpft und zirka 3 Wochen bei 24 C bebrütet. Diese Oberflächenkulturen dienen dann als Impfmaterial für die Vorstufen. Pro Roux-Flasche werden drei 500 ml Erlenmeyerkolben mit je 60 ml BM-Nährlösung beimpft. Diese Vorstufen werden dann zirka 1 Woche bei 240C und 60 bis 70% relativer Luftfeuchte auf dem Schüttler mit 55 mm Hub bei rund 200 Umdr/min geschüttelt. Nach dieser Inkubationszeit wird der Pilz in jedem Vorstufenkolben steril gemixt und anschliessend in einen 2 1-Erlenmeyerkolben (Hauptstufe, Produktionsstufe) mit je 250 ml BM-Nährlösung geleert. Die Hauptstufen werden dann unter denselben Bedingungen wie die Vorstufen bebrütet.
Das Produktionsmaximum für die aktiven Verbindungen (Filterblättchentest mit dem Testkeim Saccharomyces cerevisiae Y-567) tritt je nach Kulturbedingungen nach einer Inkubationszeit von 12 bis 16 Tagen auf. Die hefeaktiven Substanzen werden dabei grösstenteils in die Nährlösung ausgeschieden.
Die sechs aktiven Verbindungen lassen sich mit einem Lösungsmittel aus der Kulturbrühe extrahieren und im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur anreichern.
Beispielsweise wird das Kulturfiltrat, gewonnen aus geernteten Hauptstufen eines xpca-Stammes durch Filtration der Kulturlösung durch ein Nylonsieb mit 125 pm Maschenweite, anfangs zweimal mit Essigsäureäthylester (jeweils 1/4 des Kulturfiltrat-Ausgangsvolumens) bei PH 3, 0 (5 N Hel) und Raumtemperatur über 10 min auf dem Magnetrührer extrahiert. Die Trennung der beiden Phasen im Scheidetrichter wird durch vorherige Filtration der Mischung über eine Filtercelschicht (Diatomit, Kieselgur) erleichtert. Die beiden organischen Phasen enthalten einen Grossteil der Aktivi-
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tät. Sie werden vereinigt und einmal mit destilliertem Wasser (1/4 des Kulturfiltrat-Ausgangsvolumens) bei PH 3, 0 gewaschen. Das Waschwasser wird verworfen.
Der gewaschene Essigsäureäthylester-Extrakt wird dann in einem weiteren Reinigungsschritt zweimal mit 1% iger NaHCO -Lösung (jeweils 1/8 des Kulturfiltrat-Ausgangsvolumens) bei PH 7 bis 8 extrahiert. Die aktiven Komponenten A bis F verbleiben dabei nahezu quantitativ in der organischen Phase. Nach Phasentrennung wird diese über ein Faltenfilter mit wasserfreiem Na. SO, filtriert und im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur eingeengt (neutraler Rohextrakt : zirka 0, 3 bis 0, 4 g Gesamtsubstanz pro Liter Kulturfiltrat).
Durch Dünnschichtchromatographie und anschliessende Bioautographie auf einem geeigneten Testkeimrasen können die aktiven Verbindungen A bis F im neutralen Rohextrakt gut charakterisiert werden.
Dazu werden beispielsweise Aliquots einer 5 bis 10%igen Rohextraktlösung auf Kieselgel-DCFertigplatten (Kieselgel 60 F-254 nm, 20 x 20 cm, 0, 25 mm Schichtdicke, Firma Merck) in jeweils verschiedenen Laufmittelsystemen chromatographiert und nach Erreichen der Laufstrecke und Trocknen des Laufmittels teils mit ZAK-Reagens (0, 1 g Eisen (III) chlorid in 1 ml Eisessig lösen und mit konzentrierter Schwefelsäure ad 100 ml auffüllen ; ZAK-Bad : 7 ml ZAK-Reagens und 300 ml Aceton frisch mischen) entwickelt bzw. teils (nach Einzeichnen der bei 254 nm das UV-Licht löschenden Substanzen) auf einem Testkeimrasen (z. B. Saccharomyces cerevisiae Y-567 auf SDA-Agar von Difco) aufgelegt. Die DC-Platten bleiben dabei rund 15 min auf dem inkokulierten Agarrasen.
Nachher werden die Chromatogramme entfernt, und die Testplatten (bei Saccharomyces cerevisiae zirka 15 h bei 37 C) bebrütet. Eine kurze Charakterisierung der Komponenten A bis F findet man in der Tabelle 2.
Tabelle 2
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<tb>
<tb> RF-Wert <SEP> in <SEP> Bezeichnung <SEP> der <SEP> hefeaktiven <SEP> Komponenten
<tb> Laufaittel <SEP> Nr. <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP> O, <SEP> 09 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 46-0.
<SEP> 23 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0,49 <SEP> 0,38 <SEP> 0,23 <SEP> 0,62
<tb> 7 <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP>
<tb> 8--0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> 9--0, <SEP> 29 <SEP>
<tb> Absorption <SEP> des
<tb> UV-Lichtes <SEP> vor <SEP> 254 <SEP> stark <SEP> mässig <SEP> stark <SEP>
<tb> nm
<tb> ZAK-Entwicklung <SEP> 366
<tb> Farbe <SEP> nach <SEP>
<tb> ZAK-Bad <SEP> bei <SEP>
<tb> Tageslicht <SEP> gelb-braun <SEP> nausgrau <SEP> eierschalen--- <SEP>
<tb> bis <SEP> gelb <SEP> farben <SEP>
<tb> 254 <SEP> braun <SEP> grau <SEP> blau-- <SEP>
<tb> nm
<tb> 366 <SEP> bräunlich <SEP> grauschwarz <SEP> gelblich- <SEP>
<tb> Hefeaktivität <SEP> +++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb>
Es bedeutet :
+++ sehr starke, ++ starke, + deutliche Hemmung
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Laufmittelsysteme für die Auftrennung des neutralen Rohextraktes :
Tabelle 3
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<tb>
<tb> Laufmittelsystem <SEP> Volumenverhältnis <SEP> Laufstrecke <SEP> (cm) <SEP>
<tb> l <SEP> Essigsaureathylester/Benzol <SEP> 3/1 <SEP> (Hassergesättigt) <SEP> 1x10 <SEP>
<tb> 2 <SEP> Diisopropyläther/EE <SEP> 4/1 <SEP> (wassergesättigt) <SEP> 1x10 <SEP>
<tb> 3 <SEP> n-Butylacetat <SEP> (was <SEP> sergesättigt) <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 10 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Diisopropyläther/MeOH <SEP> 9/1 <SEP> (wassergesättigt)
<SEP> 2#10
<tb> 5 <SEP> DIPA/HCOOH/Wasser <SEP> 90/7/3-1x10
<tb> 6 <SEP> DIPA/HAc/Me0H <SEP> 90/7/3-1x10
<tb> 7 <SEP> EE/HCOOH/Wasser <SEP> 90/7/3-1x10
<tb> 8 <SEP> Ch1oroform/MeOH <SEP> 9/1-1 <SEP> x <SEP> 10 <SEP>
<tb> 9 <SEP> Chloroform/Aceton <SEP> 9/1 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 10 <SEP>
<tb>
Abkürzungen : EE = Essigsäureäthylester
DIPA = Diisopropyläther HAc = Essigsäure
MeOH = Methanol
Die Isolierung der aktiven Komponenten A bis F aus dem EE-Rohextrakt kann mit bekannten
Isolierung-un Reinigungsmethoden durchgeführt werden.
Die Antibiotika A bis F besitzen bei geringer Toxizität interessante biologische, insbesondere antimikrobielle Eigenschaften und können daher als Heilmittelwirkstoffe verwendet werden. Sie entfalten eine Hemmwirkung gegen Bakterien, wie sich durch Untersuchungen in vitro mit dem Reihen- verdünnungstest in vivo durch Versuche an Mäusen unter Verwendung verschiedener Bakterienstämme zeigen lässt. Diese Hemmwirkung wurde ab einer Konzentration von zirka 1 bis 25 g/ml festgestellt.
Die Antibiotika A bis F können allein oder in geeigneten Arzneiformen gemeinsam mit anorganischen oder organischen, pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden. Beispielsweise werden sie als Bestandteil von Kapseln, Injektions- oder Instillationszubereitungen eingesetzt, die eine zur Erreichung eines optimalen Blutspiegels ausreichende Menge aktiver Verbindungen enthalten, das sind zirka 10 bis 500 mg/Kapsel. Für die Anwendung hängt die zu verabreichende Dosis von der verwendeten Verbindung und der Verabreichungsart sowie der Behandlungsart ab.
Man erhält bei grösseren Säugetieren zufriedenstellende Ergebnisse bei Verabreichung einer täglichen Dosis von zirka 1 bis 3 g. Diese Menge kann gegebenenfalls in entsprechend kleineren Dosen zweibis viermal täglich oder in Retardform gegeben werden.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren erläutern, ohne jedoch die Erfindung zu beschränken. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 : Ausgehend von 4 bei 40 gelagerten Schrägagar-Stammkulturen des Stammes Xeromphalina campanella xpca l werden 12 Subkulturen in grossen Schrägagarröhrchen (20 mm Durchmesser) mit je 15 ml sterilem Nähermedium B IV angelegt und diese bei 240 3 bis 4 Wochen bebrütet. Nach dieser Inkubationszeit wird das rostbraun pigmentierter Mycel eines jeden Röhrchens in je einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit 80 ml steriler Nährlösung BM überführt. Die mit Pilzinokula beimpften Vorstufenkolben werden darauf 1 Woche bei 24 und 60 bis 70% relativer Feuchte auf einem Schüttler (55 mm Hubraum) bei 180 Umdr/min geschüttelt.
Nach dieser Schüttelinkubation wird das in Form leicht pigmentierte Mycelklumpen herangewachsene Pilzgewebe jedes Erlenmeyerkolbens mit einem sterilen Ultraturrax"Mixgerät unter sterilen Bedingungen gemixt. Die homogene Mycelsuspension eines jeden Vorstufenkolbens wird sodann zur Beimpfung eines 2 1-Erlenmeyerkolbens mit 300 ml Nährlösung BM verwendet.
Nach 12-tägigem Schütteln bei 240, 60 bis 70% relativer
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Luftfeuchte und 180 Umdr/min werden alle Hauptstufenkolben geerntet und vereint (4350 ml Kulturbrei mit PH 5, 6). Die antibiotische Aktivität der Fermentationsflüssigkeit, gemessen als Hemmhofdurchmesser im Näpfchentest (50 pl Kulturfiltration pro Näpfchen, 8 mm Näpfchendurchmesser) gegen- über dem Testkeim Saccharomyces cerevisiae X-567 (BC 445 auf Sabouraud Dextrose Agar von Difco) beträgt 25 mm (analog einer Nystatin-Standardlösung von 80 bis 95 Jlg/m1).
Beispiel 2 : Die analog wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführte Anzucht und Fermentation des Stammes Xeromphalina campanella xpca 2 ergibt einen Antibiotika-Endtiter von 21 mm (wie im Beispiel 1 gemessen als Hemmhofdurchmesser im Näpfchentest gegenüber Saccharomyces cerevisiae Y-567).
Beispiel 3 : Die analog wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführte Anzucht und Fermentation des Stammes Xeromphalina campanella xpca 4 ergibt einen Antibiotika-Endtiter von 23 mm (Aktivitätsbewertung wie im Beispiel 1).
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10 ml einer analog wie im Beispiel 1 beschrieben gewonnenen Mycelimpfsuspension des Stammes
Xeromphylina campanella xpca 3 beimpft und bei 240 vier Wochen bebrütet. Nach dieser Inkubations- zeit wird das Oberflächenmycel jeder Roux-Flasche in einen 500 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils
80 ml steriler Nährlösung B IV2 (Zusammensetzung wie Nährlösung B IV, aber statt 50 g Malz- extrakt 30 g Glucose und statt 10 g Sojabohnenmehl l g Stickstoff als Futterhefe von der belgischen
Firma Biolux) überimpft.
Die Vorstufenkolben (Vorstufe 1) werden darauf 10 Tage bei 240 auf dem Schüttler bei 150 Umdr/min geschüttelt, steril gemixt und in 20 2 1-Erlenmeyerkolben (Vorstufe 2) mit jeweils 300 ml Nährlösung B IV 3 (Zusammensetzung wie Nährlösung B IV, aber statt 50 g Malzextrakt 30 g Glucose und statt 10 g Sojabohnenmehl 1 g Stickstoff als Amber BYF 100 von der Firma Amber) geimpft (pro 2 l Kolben 4 Vorstufenkolben). Diese werden unter denselben Wachstumsbedingungen wie die ersten Vorstufen 11 Tage geschüttelt. Danach wird die Mycelsuspension aller 2 l Kolben (12 1) unter sterilen Bedingungen in eine Nirosta-Impfkanne überführt und damit über ein Propagationsgefäss (P 8) der Hauptfermenter (Z 8-Fermenter mit 150 l Nutzvolumen) beimpft.
Dieser enthält 120 l sterilisierte Nährlösung B IV (Zusammensetzung wie Nährlösung B IV, aber statt 50 g Malzextrakt 30 g Glucose und statt 10 g Sojabohnenmehl 1 g Stickstoff als Witte Pepton von der Firma F. Witte).
Nach 10-tägiger Fermentationsdauer (24 , 4, 2 m'Sterilluft/h, 0, 5 x 101 Pascal Innenüberdruck, 100 Umdr/min, Schaumbekämpfung mit 60 ml Spermöl) wird die Fermentation abgebrochen. Im Näpfchentest gegenüber Saccharomyces cerevisiae zeigt das Kulturfiltrat des Erntebreis einen Hemmhofdurchmesser von 18 mm. Bei Candida albicans S-2869 (BC 450) liegt die minimale Hemmkonzentration des Kulturfiltrats bei einer Verdünnung von 1 : 64.
Beispiel 5 : 1 I Kulturbrei, erhalten gemäss Beispiel 1, wird zur Abtrennung des Pilzmaterials durch ein 125 pm Nylonsieb (z. B. MD nyl, 125 HD) filtriert und anschliessend über eine Filtercelschicht (Diatomit, Kieselgur) geklärt. Das klare Kulturfiltrat wird darauf zweimal mit jeweils 300 ml Essigsäureäthylester bei p H 7 und Raumtemperatur jeweils 10 min extrahiert. Nach der Phasentrennung werden die organischen Phasen vereinigt (500 ml) und einmal mit 300 ml H20 bidest gewaschen.
Die gewaschene organische Phase, welche den hefeaktiven Antibiotikakomplex : quantitativ enthält, wird über wasserfreiem Na ;, SO., entwässert und im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur aufkonzentriert (neutraler Rohextrakt : 0, 35 g Gesamtsubstanz pro Liter Kulturfiltrat).
Beispiel 6 : Zu 10 l Kulturbrei, erhalten gemäss Beispiel 4, werden 5 l EssigsäureäthylesterMethanol Gemisch (9/1) zugesetzt, die Mischung 5 min ultraturraxiert, dann 1 h bei PH 6 und Raumtemperatur extrahiert. Die beiden Phasen werden durch Zentrifugation bei 5000 Umdr/min getrennt ; mit der wässerigen Phase und dem Mycelsediment wird dieser Extraktionsschritt noch zweimal wiederholt. Die organischen Phasen werden dann vereint (11, 5 1) und einmal mit 10 l 1% NaHCOa-Lösung (p 8, 5) ausgezogen. Die ausgezogene organische Phase mit der gesamten anti-
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;, SO,,Raumtemperatur bis zur Trockne eingeengt (3, 3 g neutraler Rohextrakt).
Beispiel 7 : Die 3,3 g des im Beispiel 6 gewonnenen neutralen Rohextrakts werden in 30 ml Elutionsmittel (Essigester/Benzol = 1/2, wassergesättigt) gelöst und in einer Chromatographiesäule
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(Innendurchmesser = 3, 85 cm, Gelschichthöhe = 63, 7 cm) mit 370 g Kieselgel 60 mit Hilfe eines kontinuierlichen Eluensgradienten mit steigender Polarität (das Elutionsmittel bestand aus zwei wassergesättigten Eluensmischungen verschiedener Polarität : Essigester/Benzol = 1/2 und Essig- ester/Benzol = 2/1) aufgetrennt.
Die Trennleistung der Säule (Durchflussgeschwindigkeit = 0, 55 ml/min cm", hydrostatischen Druck) wird über ein Durchfluss-UV-Absorptionsmessgerät (LKB-Uvicord und Servo- gor-Kompensationsschreiber) und über DC (Kieselgel DC-Fertigplatten der Firma Merck) verfolgt.
Die beiden aktivsten Substanzen werden neben wenigen Verunreinigungen mit dem Elutionsvolumen von 500 bis 900 ml für die Komponente D bzw. von 900 bis 1400 ml für die Komponente A eluiert.
Diese Fraktionen werden getrennt, bis zur Trockne eingeengt (zirka 250 mg Konzentrat D ; zirka
400 mg Konzentrat A) und das Konzentrat der jeweiligen Komponente im Eluens der nächsten Auf- trennung aufgenommen (zirka 5 bis 10%ig).
Eine 5%ige Lösung des Konzentrats D wird im Elutionsmittel Diisopropyläther/Essigester (Vo- lumensverhältnis 9/1, wassergesättigt) über eine Kieselgel 60 Merck-Fertigsäule (Grösse B, Durch- flussgeschwindigkeit 80 ml/h, hydrostatischer Druck) aufgetrennt. Die Komponente D (90 mg) wird dabei mit einem Elutionsvolumen von 130 bis 150 ml von der Fertigsäule eluiert.
Für die Isolierung der Komponente A wird eine 10%ige Lösung des Konzentrats A (400 mg) im Eluens DIPA/Essigester (Volumensverhältnis 9/1, wassergesättigt) hergestellt und diese auf einer
Kieselgelsäule 60 Merck Fertigsäule (Grösse C, Durchflussgeschwindigkeit 180 ml/h, hydrostatischer
Druck) aufgetrennt. Die aktive Komponente A (gute UV-Absorption bei 254 nm) wird mit dem Elu- tionsvolumen von 800 bis 1100 ml eluiert. Mehrere säulenchromatographische Reinigungsschritte im Eluenssystem DIPA/Essigester (Volumensverhältnis 9/1, wassergesättigt) ergeben nach dem Auf- konzentrieren ein öliges Reinprodukt der Komponente A (150 mg).
Beispiel 8 : 3, 4 g eines analog wie im Beispiel 6 beschrieben gewonnenen neutralen Essig- ester-Rohkonzentrats werden auf einer Merck Kieselgel 60-Fertigsäule (Grösse C, Durchflussge- schwindigkeit 450 ml/h) mit dem Eluenssystem DIPA/Essigester (Volumensverhältnis 9/1, wasserge- sättigt) aufgetrennt. Die aktiven Hauptkomponenten werden mit dem Elutionsvolumen von 480 bis 690 ml für die Komponente D, 960 bis 1530 ml für die Komponente A und 2410 bis 2870 ml für die Komponente C von der Säule eluiert.
Das Konzentrat D (zirka 150 mg) wird in einer Merck Kieselgel 60-Fertigsäule (Grösse B, Durchflussgeschwindigkeit 495 ml/h) mit dem Eluenssystem Chloroform/Cyclohexan (Volumenverhältnis 65/35) aufgetrennt. Die Komponente D wird neben sehr geringen Spuren von wahrscheinlich verwandten Begleitsubstanzen mit dem Elutionsvolumen von 140 bis 220 ml von der Fertigsäule eluiert.
Die reine Komponente A wird in gelöster Form (im Eluat) dadurch erhalten, indem man das Konzentrat A (zirka 250 mg) auf Merck Kieselgel 60-Fertigsäulen mit dem Eluenssystem DIPA/Essigester (Volumensverhältnis 95/5, wassergesättigt) und Chloroform/Cyclohexan (Volumensverhältnis 9/1) hintereinander mehreren säulenchromatograhischen Aufreinigungen unterzieht.
Eine säulenchromatographische Auftrennung des Konzentrats C auf einer Merck Kieselgel 60-Fertigsäule (Grösse B) mit dem Eluens Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 97, 5/2, 5) ergibt schliesslich ein reines Produkt der Komponente C.
Beispiel 9 : Angereicherte und vorgereinigte Fraktionen der Komponente A, C und D werden auch dadurch erhalten, dass man das neutrale Essigester-Rohkonzentrat mittels eines Stufengradienten mit steigender Eluens-Polarität auf einer grossen Kieselgel G 60-Merck-Fertigsäule (z. B. Grö- sse C) einer säulenchromatographischen Trennung unterzieht.
Mit dem Eluens Chloroform/Cyclohexan (Volumensverhältnis 65/35) erscheint die Komponente D nebst einigen apolaren Begleitsubstanzen im Eluat. Die Komponente A lässt sich mit Chloroform allein von der Säule eluieren. Die dritte der aktiven Hauptsubstanzen, die Komponente C, verlässt die Säule erst bei einer weiteren Polaritätserhöhung des Eluenssystems, z. B. durch Zugabe von etwas Methanol zum Chloroform (Chloroform/Methanol = 95, 7/2, 5).