CH629531A5

CH629531A5 - Process for the preparation of the antibiotic A-30912 mixture and of factors A, B, C, D, E, F and G in this antibiotic mixture

Info

Publication number: CH629531A5
Application number: CH1241376A
Authority: CH
Inventors: Marvin Martin Hoehn; Karl Heinz Michel
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1975-10-02
Filing date: 1976-09-30
Publication date: 1982-04-30
Also published as: YU236076A; SE7610943L; JPS5242801A; ZA765320B; PT65617B; AR209993A1; PT65617A; NZ182123A; ATA730976A; DD127442A5; BE846829A; FR2326200A1; CA1080145A; GR61730B; DK143608C; GB1565821A; IE43663L; AT346479B; AU1808076A; DK143608B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum A-30912 Gemisches, welches die sieben einzelnen Faktoren A, B, C, D, E, Fund G enthält. Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Isolierung jedes dieser sieben Faktoren aus dem so erhaltenen Antibiotikum-Gemisch. The present invention relates to a method for producing the new antibiotic A-30912 mixture, which contains the seven individual factors A, B, C, D, E, Fund G. The invention further relates to methods for isolating each of these seven factors from the antibiotic mixture thus obtained.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das neue Antibiotikum Gemisch hergestellt, indem man einen neuen Stamm des Organismuses Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer N RRL 8113 besitzt, in einem N ährmedium unter aeroben submersen Fermentationsbedingungen züchtet, und aus der Gärmaische das Antibiotikum A-30912 Gemisch isoliert. The novel antibiotic mixture is produced by the process according to the invention by growing a new strain of the organism Aspergillus rugulosus, which has the deposit number N RRL 8113, in a nutrient medium under aerobic submerged fermentation conditions, and isolating the antibiotic A-30912 mixture from the fermentation mash .

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum A-30912 Gemisches, enthaltend die Faktoren A, B, C, D, E, F und G, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer NRRL 8113 besitzt, in einem Nährmedium, welches assimilierbare, Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter aeroben submersen Fermentationsbedingungen züchtet bis eine erhebliche antibiotische Aktivität erzeugt ist, und b) das Antibiotikum A-30912 Gemisch aus der Gärmaische abtrennt. The present invention therefore relates to a process for the preparation of the antibiotic A-30912 mixture, comprising the factors A, B, C, D, E, F and G, which is characterized in that a) Aspergillus rugulosus, which has the deposit number NRRL 8113 has grown in a nutrient medium which contains assimilable substances which provide carbohydrate, nitrogen and inorganic salts, under aerobic submerged fermentation conditions until considerable antibiotic activity is produced, and b) the antibiotic A-30912 mixture is separated from the fermentation mash.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, gemäss dem aus dem so erhaltenen neuen Antibiotikum A-30912 Gemisch einer der Faktoren A oder B oder C oder D oder E oder F oder G isoliert wird. Furthermore, the present invention relates to a method according to which one of the factors A or B or C or D or E or F or G is isolated from the new antibiotic A-30912 mixture thus obtained.

Es ist also möglich aus dem nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten neuen Antibiotikum A-30912 Gemisch einen beliebigen der sieben Faktoren A bis einschliesslich G zu isolieren. It is therefore possible to isolate any of the seven factors A to G inclusive from the new antibiotic A-30912 mixture produced by the process according to the invention.

In der vorliegenden Beschreibung wird unter «Antibioti-kum-A-30912 Gemisch» ein antibiotisch wirksames Gemisch verstanden, welches die sieben Faktoren A, B, C, D, E, F und G enthält. Dieses Antibiotikum A-30912 Gemisch ist neu. In the present description, “antibiotic-A-30912 mixture” is understood to mean an antibiotically active mixture which contains the seven factors A, B, C, D, E, F and G. This antibiotic A-30912 mixture is new.

Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es klar, dass bei einer Erzeugung eines Antibiotikum Gemisches durch Züchtung eines bestimmten Mikroorganismus das Mengenverhältnis der in dem Antibiotikum Gemisch enthaltenen einzelnen Faktoren zueinander von den angewandten Fermentationsbedingungen oder Züchtungsbedingungen abhängt. It is clear to the person skilled in the art that when an antibiotic mixture is produced by cultivating a specific microorganism, the quantitative ratio of the individual factors contained in the antibiotic mixture to one another depends on the fermentation conditions or breeding conditions used.

Obwohl, wie bereits erwähnt wurde, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum A-30912 Gemisch neu ist, ist es möglich, dass einer oder mehrere der in dem Gemisch enthaltenen sieben Faktoren A, B, C, D, E, F oder G bereits in der Literatur beschrieben ist. Although, as already mentioned, the antibiotic A-30912 mixture produced by the process according to the invention is new, it is possible that one or more of the seven factors A, B, C, D, E, F or G already contained in the mixture is described in the literature.

Wie bereits erwähnt wurde, wird im Schritt b) des erfindungsgemässen Verfahrens das Antibiotikum A-30912 Gemisch aus dem Zuchtmedium abgetrennt. Vorzugsweise erfolgt diese Abtrennung aus dem Fermentationsmedium indem man das erwünschte Antibiotikum A-30912 Gemisch mit s einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. As already mentioned, the antibiotic A-30912 mixture is separated from the growth medium in step b) of the method according to the invention. This separation from the fermentation medium is preferably carried out by extracting the desired antibiotic A-30912 mixture with a polar organic solvent.

Durch den neuen Mikroorganismusstamm Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer NRRL 8113 besitzt, wird auch die in der Literatur beschriebene Verbindung Sterig-matocystin erzeugt. Bei der Durchführung des erfindungsge-,0 mässen Verfahrens ist also im allgemeinen in dem Fermentationsmedium zusätzlich zu dem Antibiotikum A-30912 Gemisch auch Sterigmatocystin enthalten. In diesem Fall kann man das Sterigmatocystin entweder gesondert mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel aus dem Fermentationsmedium iso-15 lieren, oder es wird zusammen mit dem Antibiotikum A-30912 Gemisch mit einem polaren organischen Lösungsmittel aus dem Fermentationsmedium extrahiert. Im letzteren Fall kann dann das Sterigmatocystin von dem Antibiotikum A-30912 Gemisch dadurch abgetrennt werden, dass man den bei der so Extraktion erhaltenen Lösungsmittelextrakt einengt, das so gewonnene Konzentrat zu einem Überschuss eines nicht-pola-ren organischen Lösungsmittels zugibt, beispielsweise zu Di-äthyläther, wobei dann in diesem nicht-polaren Lösungsmittel das Antibiotikum A-30912 Gemisch ausfällt und der Nieder-25 schlag abgetrennt wird. Das als Nebenprodukt entstehende Sterigmatocysin kann aus dem Filtrat gewonnen werden. Das so erhaltene Antibiotikum A-30912 Gemisch kann, falls erwünscht, noch weiter gereinigt werden, beispielsweise indem man eine Säulenchromatographie durchführt. The new microorganism strain Aspergillus rugulosus, which has the accession number NRRL 8113, also produces the compound sterig-matocystin described in the literature. When the method according to the invention is carried out, the fermentation medium generally also contains sterigmatocystin in addition to the antibiotic A-30912 mixture. In this case, one can either isolate the sterigmatocystin separately from the fermentation medium with a non-polar organic solvent, or it is extracted together with the antibiotic A-30912 mixture with a polar organic solvent from the fermentation medium. In the latter case, the sterigmatocystin can then be separated from the antibiotic A-30912 mixture by concentrating the solvent extract obtained in the extraction, and adding the concentrate thus obtained to an excess of a non-polar organic solvent, for example to di ethyl ether, in which case the antibiotic A-30912 mixture fails in this non-polar solvent and the precipitate is separated off. The by-product sterigmatocysin can be obtained from the filtrate. The antibiotic A-30912 mixture thus obtained can be further purified, if desired, for example by performing column chromatography.

3o Das neue nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum A-30912 Gemisch und auch die in ihm enthaltenen einzelnen Faktoren A, B, C, D, E, F und G besitzen eine anti-fungale Wirkung. 3o The new antibiotic A-30912 mixture produced by the process according to the invention and also the individual factors A, B, C, D, E, F and G contained in it have an anti-fungal effect.

Die Erfindung sei anhand der folgenden Beispiele und der 35 Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung sind die Infrarotabsorptionsspektren des Faktors A, bzw. B, bzw. C. bzw. D des Antibiotikum A-30912 Gemisches, aufgenommen in KBr-Schei-ben, dargestellt. In den Fig. 1 bis 4 gezeigte Infrarot-absorp-tionsspektren sind diejenigen der in der Folge angeführten Fak-« toren. The invention is illustrated by the following examples and the drawing. The drawing shows the infrared absorption spectra of factor A or B or C. or D of the antibiotic A-30912 mixture, recorded in KBr disks. The infrared absorption spectra shown in FIGS. 1 to 4 are those of the factors listed below.

Fig. 1 - Antibioticum A-30912 Faktor A Fig. 2 - Antibioticum A-30912 Faktor D Fig. 3 - Antibioticum A-30912 Faktor B Fig. 4 - Antibioticum A-30912 Faktor C Fig. 1 - Antibiotic A-30912 factor A Fig. 2 - Antibiotic A-30912 factor D Fig. 3 - Antibiotic A-30912 factor B Fig. 4 - Antibiotic A-30912 factor C.

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Antibioticum A-30912 Faktor A Antibiotic A-30912 factor A

A-30912 Faktor A steht dem Polypeptidantibioticum Echi-nocandin B (F. Benz et al., Helv. Chim. Acta Band 57, S. 2459-2477,1974) nahe. A-30912 Factor A is close to the polypeptide antibiotic Echinocandin B (F. Benz et al., Helv. Chim. Acta Volume 57, pp. 2459-2477, 1974).

so Anticioticum A-30912 Faktor A ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,52 %; H 7,29 %; N 8,68 %; O 27,09 %. Anticioticum A-30912 Factor A is a white amorphous solid substance, the elemental analysis of which gives the following percentage composition: C 56.52%; H 7.29%; N 8.68%; O 27.09%.

Für Antibioticum A-30912 Faktor A wird folgende empiri-55 sehe Formel vorgeschlagen: C51.53H79_s3N7O17.1g. Innerhalb dieses Bereichs entspricht die Elementaranalyse von A-30921 Faktor A besonders gut der empirischen Formel CsîHsiNvOis- H2O (ber.: C 56,24; H 7,54; N 8,84; O 27,39). For antibiotic A-30912 factor A, the following empiri-55 see formula is suggested: C51.53H79_s3N7O17.1g. Within this range, the elementary analysis of A-30921 factor A corresponds particularly well to the empirical formula CsîHsiNvOis- H2O (calculated: C 56.24; H 7.54; N 8.84; O 27.39).

Antibioticum A-30912 Faktor A hat ein Molekulargewicht 60 von 1100, bestimmt durch Massenspektrometrie und Titration. Antibioticum A-30912 factor A has a molecular weight 60 of 1100, determined by mass spectrometry and titration.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor A in KBr-Scheibe ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,97 (stark), 3,39 65 (mittelstark), 3,47 (schwach), 5,99 (stark), 6,10 (stark), 6,49 (mittelstark), 6,56 (mittelstark), 6,90 (mittelstark), 8,00 (schwach), 9,13 (schwach) und 11,77 (schwach) Mikron. The infrared absorption spectrum of antibiotic A-30912 factor A in KBr disk is shown in Figure 1 of the accompanying drawings. The following characteristic absorption maxima can be observed: 2.97 (strong), 3.39 65 (medium strength), 3.47 (weak), 5.99 (strong), 6.10 (strong), 6.49 (medium strength) ), 6.56 (medium strength), 6.90 (medium strength), 8.00 (weak), 9.13 (weak) and 11.77 (weak) microns.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren von Antibioticum The ultraviolet absorption spectra of antibiotic

3 3rd

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A-30912 Faktor A in neutralem und in saurem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000), 275 nm (epsilon 3000) und 284 nm (Schulter, epsilon 2500). Das Ultraviolettspektrum von Faktor A in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 245 nm (epsilon 16 000) und 290 nm (epsilon 3000) und ausserdem Endabsorption. A-30912 factor A in neutral and in acidic methanol shows absorption maxima at 225 nm (epsilon 18,000), 275 nm (epsilon 3000) and 284 nm (shoulder, epsilon 2500). The ultraviolet spectrum of factor A in basic methanol shows absorption maxima at 245 nm (epsilon 16 000) and 290 nm (epsilon 3000) and also end absorption.

Das magnetisch "C-Kernresonanzspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor A in perdeuteriertem Methanol zeigt folgende Charakteristika: delta 176,1,174,3,173,4,172,7,172,4, 169,8,158,4,132,8,130,9,129,6,129,0,116,2,77,0,75,7,74,4,71,3, 70,9,69,6,68,3,62,4,58,7,56,9,56,1,52,9,39,0,38,5,36,8,35,2,33,9, 32,9,32,6,30,7,30,4,30,2,28,2,27,0,26,5,23,6,20,1,19,6,14,4, und 11,3 ppm. The magnetic "C nuclear magnetic resonance spectrum of antibiotic A-30912 factor A in perdeuterated methanol shows the following characteristics: delta 176.1,174,3,173,4,172,7,172,4, 169,8,158,4,132,8,130,9,129,6,129,0,116,2,77 , 0.75.7.74.4.71.3, 70.9.69.6.68.3.62.4.58.7.56.9.56.1.52.9.39.0 , 38.5,36,8,35,2,33,9, 32,9,32,6,30,7,30,4,30,2,28,2,27,0,26,5,23 , 6,20,1,19,6,14,4, and 11,3 ppm.

Antibioticum A-30912 Faktor A hat folgende Werte der spezifischen Drehung: Antibioticum A-30912 factor A has the following values of the specific rotation:

[alpha]D25 -44° (c 0,5, CHsOH), [alpha] D25 -44 ° (c 0.5, CHsOH),

[alpha]36525 -156° (c 0,5, CHaOH). [alpha] 36525 -156 ° (c 0.5, CHaOH).

Die elektrometrische Titration von Antibioticum A-30912 Faktor A in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 12,8 (Anfangs-pH 6,9). The electrometric titration of Antibioticum A-30912 factor A in 66 percent aqueous dimethylformamide shows the presence of a titratable group with a pKa of 12.8 (initial pH 6.9).

Die Aminosäureanalyse von Antibioticum A-30912 Faktor A nach dessen Hydrolyse zeigt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren. The amino acid analysis of antibiotic A-30912 factor A after its hydrolysis shows the presence of threonine, hydroxyproline and three other as yet unidentified amino acids.

Antibioticum A-30912 Faktor A ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Antibioticum A-30912 Faktor A ist ausserdem in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich. Antibioticum A-30912 factor A is soluble in a number of organic solvents such as methanol, ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and ethyl acetate, but insoluble in non-polar organic solvents such as diethyl ether and petroleum ether. Antibioticum A-30912 Factor A is also soluble in aqueous solutions, especially those with a pH of over 7.0.

A-30912 Faktor D A-30912 factor D.

Antibioticum A-30912 Faktor D ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,37 %;, H 8,17 %; N 8,54 %; O (durch Differenz) 26,92 %. Antibioticum A-30912 factor D is a white amorphous solid substance, the elemental analysis of which gives the following percentage composition: C 56.37% ;, H 8.17%; N 8.54%; O (by difference) 26.92%.

Antibioticum A-30912 Faktor D hat ein Molekulargewicht von etwa 1100, aufgrund der Aminosäureanalyse und seiner engen Strukturbeziehung zu Antibioticum A-30912 Faktor A. Antibiotic A-30912 factor D has a molecular weight of approximately 1100, based on amino acid analysis and its close structural relationship to antibiotic A-30912 factor A.

Das Infrarotabsorptionspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor D in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,98 (stark), 3,31 (schwach), 3,36 (Schulter), 3,40 (mittelstark), 3,48 (schwach), 5,76 (schwach), 6,01 (stark), 6,10 (Schulter), 6,49 (mittelstark), 6,57 (mittelstark), 6,90 (mittelstark), 7,81 (schwach), 8,07 (schwach) und 9,16 (schwach) Mikron. The infrared absorption spectrum of Antibiotic A-30912 factor D in a KBr disk is shown in Figure 2 of the accompanying drawings. The following characteristic absorption maxima can be observed: 2.98 (strong), 3.31 (weak), 3.36 (shoulder), 3.40 (medium strength), 3.48 (weak), 5.76 (weak) , 6.01 (strong), 6.10 (shoulder), 6.49 (medium strength), 6.57 (medium strength), 6.90 (medium strength), 7.81 (weak), 8.07 (weak) and 9.16 (weak) microns.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren von Antibioticum A-30912 Faktor D in neutralem und saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000) und 275 nm (epsilon 2500). Das UV-Spektrum von A-30912 Faktor D in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 240 nm (epsilon 11 000) und 290 nm (epsilon 3000). The ultraviolet absorption spectra of antibiotic A-30912 factor D in neutral and acidic methanol show absorption maxima at 225 nm (epsilon 18,000) and 275 nm (epsilon 2500). The UV spectrum of A-30912 factor D in basic methanol shows absorption maxima at 240 nm (epsilon 11,000) and 290 nm (epsilon 3000).

Antibioticum A-30912 Faktor D hat den folgenden Wert der spezifischen Drehung: Antibioticum A-30912 factor D has the following specific rotation value:

[alpha]D25 -50° (c 0,34, CHaOH). [alpha] D25 -50 ° (c 0.34, CHaOH).

Die Aminosäureanalyse von Antibioticum A-30912 Faktor D nach dessen Hydrolyse ergibt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin, Histidin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren. Eine der noch nicht identifizierten Aminosäuren von A-30912 Faktor D ist mit einer der noch nicht identifizierten Aminosäuren von Antibioticum A-30912 Faktor A identisch. The amino acid analysis of antibiotic A-30912 factor D after its hydrolysis shows the presence of threonine, hydroxyproline, histidine and three other as yet unidentified amino acids. One of the as yet unidentified amino acids of A-30912 factor D is identical to one of the as yet unidentified amino acids of antibiotic A-30912 factor A.

Antibioticum A-30912 Faktor D ist in einer Reihe verschiedener organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich, Antibioticum A-30912 factor D is soluble in a number of different organic solvents, such as methanol, ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and ethyl acetate,

aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Antibioticum A-30912 Faktor D ist in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich. but insoluble in non-polar organic solvents such as diethyl ether and petroleum ether. Antibioticum A-30912 factor D is soluble in aqueous solutions, especially those with a pH value above 7.0.

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A-30912 Faktor B A-30912 factor B

Antibioticum A-30912 Faktor B ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 57,36 %; H 5,92 %; N 8,75 %; O io 26,19%. Antibioticum A-30912 factor B is a white amorphous solid substance, the elemental analysis of which gives the following percentage composition: C 57.36%; H 5.92%; N 8.75%; O io 26.19%.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912 Faktor B in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten : 2,99,3,41,3,49,6,06,6,15,6,54,6,61, 15 6,94,7,62,8,07,9,26 und 9,39 Mikron. The infrared absorption spectrum of A-30912 factor B in a KBr disk is shown in Figure 3 of the accompanying drawings. The following characteristic absorption maxima can be observed: 2.99.3.41.3.49.6.06.6.15 ,.6.54.6.61, 15 6.94.7.62.8.07, 9.26 and 9.39 microns.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren von A-30912 Faktor B in neutralem und in saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 223 nm (Schulter, epsilon 16 000) und 278 nm (epsilon 2400). Das Ultraviolettspektrum von Antibioticum A-30912 20 Faktor B in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 242 nm (epsilon 13 900) und 292 nm (epsilon 2800). The ultraviolet absorption spectra of A-30912 factor B in neutral and in acidic methanol show absorption maxima at 223 nm (shoulder, epsilon 16,000) and 278 nm (epsilon 2400). The ultraviolet spectrum of antibiotic A-30912 20 factor B in basic methanol shows absorption maxima at 242 nm (epsilon 13 900) and 292 nm (epsilon 2800).

A-30912 Faktor B hat folgende Werte der spezifischen Drehung: A-30912 factor B has the following specific rotation values:

[alpha]D25 -47° (c 0,5, CHsOH) [alpha] D25 -47 ° (c 0.5, CHsOH)

25 [alpha]36525 — 170° (c 0,5, CH3OH). 25 [alpha] 36525-170 ° (c 0.5, CH3OH).

Die elektrometrische Titration von A-30912 Faktor B in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid ergibt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von etwa 13,0 (Anfangs-pH 7,91). The electrometric titration of A-30912 factor B in 66 percent aqueous dimethylformamide shows the presence of a titratable group with a pKa of approximately 13.0 (initial pH 7.91).

30 Die Aminosäureanalyse von A-30912 Faktor B nach üblicher Säurehydrolyse zeigt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin und mehreren noch nicht identifizierten Aminosäuren. 30 The amino acid analysis of A-30912 factor B after conventional acid hydrolysis shows the presence of threonine, hydroxyproline and several as yet unidentified amino acids.

A-30912 Faktor B ist in einer Reihe verschiedener organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylform-35 amid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Ausserdem ist A-30912 Faktor B in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich. A-30912 factor B is soluble in a number of different organic solvents such as methanol, ethanol, dimethylform-35 amide, dimethyl sulfoxide and ethyl acetate, but is insoluble in non-polar organic solvents such as diethyl ether and petroleum ether. In addition, A-30912 factor B is soluble in aqueous solutions, in particular those with a pH of more than 7.0.

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A-30912 Faktor C A-30912 factor C.

Antibioticum A-30912 Faktor C ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,76 %; H 7,88 %; N 10,61 %; O 45 25,09%. Antibioticum A-30912 factor C is a white amorphous solid substance, the elemental analysis of which gives the following percentage composition: C 56.76%; H 7.88%; N 10.61%; O 45 25.09%.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912 Faktor C in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind folgende charakteristische Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,98,3,39,3,43,3,51,6,01,6,12,6,47,6,90, 50 7,04,7,22,7,38,8,00,8,30 und 9,13 Mikron. The infrared absorption spectrum of A-30912 factor C in a KBr disk is shown in Figure 4 of the accompanying drawings. The following characteristic absorption maxima can be observed: 2.98.3.39.3.43.3.51.6.01.6.12.6.47.6.90, 50 7.04.7.22.7 , 38,8,00,8,30 and 9,13 micron.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren von A-30912 Faktor C in neutralem und in saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 223 nm (Schulter, epsilon 7300) und 275 nm (epsilon 1350). Das Ultraviolettspektrum von Antibioticum A-30912 55 Faktor C in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 240 nm (epsilon 12 400) und 290 nm (epsilon 5200). The ultraviolet absorption spectra of A-30912 factor C in neutral and in acidic methanol show absorption maxima at 223 nm (shoulder, epsilon 7300) and 275 nm (epsilon 1350). The ultraviolet spectrum of antibiotic A-30912 55 factor C in basic methanol shows absorption maxima at 240 nm (epsilon 12 400) and 290 nm (epsilon 5200).

A-30912 Faktor C hat folgende Werte der spezifischen Drehung: A-30912 factor C has the following specific rotation values:

[alpha]D25 -33° (c 0,5, CH3OH) [alpha] D25 -33 ° (c 0.5, CH3OH)

60 [alpha]36525 -1 19° (c 0,5, CH3OH). 60 [alpha] 36525-1 19 ° (c 0.5, CH3OH).

Die elektrometrische Titration von A-30912 Faktor C in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorhandensein einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von etwa 13,08 (Anfangs-pH 7,93). Electrometric titration of A-30912 factor C in 66 percent aqueous dimethylformamide shows the presence of a titratable group with a pKa of approximately 13.08 (initial pH 7.93).

65 Die Aminosäureanalyse von A-30912 Faktor C ergibt nach üblicher Säurehydrolyse das Vorhandensein von Threonin, Hydroxyprolin und mehreren noch nicht identifizierten Aminosäuren. 65 The amino acid analysis of A-30912 factor C shows the presence of threonine, hydroxyproline and several unidentified amino acids after usual acid hydrolysis.

629531 629531

4 4th

A-30912 Faktor C ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther, unlöslich. A-30912 Faktor C ist auch in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich. A-30912 factor C is soluble in a number of organic solvents, such as methanol, ethanol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and ethyl acetate, but is insoluble in non-polar organic solvents, such as diethyl ether and petroleum ether. A-30912 factor C is also soluble in aqueous solutions, especially those with a pH of more than 7.0.

Die sieben einzelnen Faktoren des Antibioticum A-30912-Gemisches können abgetrennt und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) indentifiziert werden. Kieselsäuregel ist ein bevorzugtes Adsorbens und Benzol Methanol (7:3, Vol.:Vol.) ist ein bevorzugtes Lösungsmittelsystem. The seven individual factors of the Antibioticum A-30912 mixture can be separated and identified by thin layer chromatography (TLC). Silica gel is a preferred adsorbent and benzene methanol (7: 3, v: v) is a preferred solvent system.

Die Rf-Werte der Antibioticum A-30912 Faktoren A bis G bei der TLC unter Verwendung von Kieselsäuregel (Merck, Darmstadt) und BenzokMethanol (7:3) als Lösungsmittelsystem sowie von Candida albicans zur Bioautographie sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt: The Rf values of Antibioticum A-30912 factors A to G in TLC using silica gel (Merck, Darmstadt) and BenzokMethanol (7: 3) as a solvent system as well as Candida albicans for bioautography are listed in Table I below:

Tabelle I Table I

Antibioticum A-30912 Faktor Antibiotic A-30912 factor

RfWert RfValue

A B C D E F G A B C D E F G

0,35 0,45 0,54 0,59 0,27 0,18 0,13 0.35 0.45 0.54 0.59 0.27 0.18 0.13

Die RfWerte von Anticioticum A-30912 Faktor A in verschiedenen papierchromatographischen Systemen wiederum unter Verwendung von Candida albicans als Feststellungsorganismus sind in Tabelle 11 angegeben. The Rf values of Anticioticum A-30912 factor A in various paper chromatographic systems, again using Candida albicans as the detection organism, are given in Table 11.

Tabelle II Table II

A-30912 Faktor A A-30912 factor A.

RpWert RpValue

Lösungsmittel solvent

0,76 0.76

mit Wasser gesättigtes Butanol butanol saturated with water

0,69 0.69

mit Wasser plus 2% with water plus 2%

p-Toluolsulfonsäure gesättiges p-toluenesulfonic acid saturated

Butanol Butanol

0,75 0.75

Methanol:0,ln HCl (3:1) Methanol: 0.1 in HCl (3: 1)

0,17 0.17

Butanol :ÄthanoI : Wasser Butanol: ethanoI: water

(13,5:15:150) (13.5: 15: 150)

0,78 0.78

Methanol:0,05 m Natriumeitrat von Methanol: 0.05 m sodium citrate from

pH 5,7 (7:3); Papier mit 0,05 m pH 5.7 (7: 3); 0.05 m paper

Natriumeitrat von pH 5,7 gepuffert Sodium citrate buffered at pH 5.7

Der zur Herstellung des Antibioticum A-30912-Gemisches geeignete Organismus wurde aus einer Bodenprobe aus den Ruinen von Pompeii, Italien, isoliert. Der A-30912 erzeugende Organismus wird klassifiziert als ein Stamm von Aspergillus rugulosus Thom and Raper, in der Aspergillus nidulans Form-Gruppe. Diese Klassifizierung beruht auf der Beschreibung von K.B. Raper und D.I. Fennel in «The Genus Aspergillus» The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., 1965. The organism suitable for the preparation of the antibiotic A-30912 mixture was isolated from a soil sample from the ruins of Pompeii, Italy. The A-30912 producing organism is classified as a strain of Aspergillus rugulosus Thom and Raper, in the Aspergillus nidulans form group. This classification is based on the description of K.B. Raper and D.I. Fennel in "The Genus Aspergillus" The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., 1965.

Farbnamen wurden zugeordnet entsprechend der ISCC-NBS Methode (K.L. Kelly und D.B. Judd, «The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names», U.S. Dept. of Commerce, Circ. 553, Washington, D.C., 1955). Die Maerz und Paul Farbblöcke sind von A. Maerz und M.R. Paul in «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950, beschrieben. Color names were assigned according to the ISCC-NBS method (K.L. Kelly and D.B. Judd, "The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names", U.S. Dept. of Commerce, Circ. 553, Washington, D.C., 1955). The Maerz and Paul color blocks are from A. Maerz and M.R. Paul in "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950.

Wenn nichts anderes angegeben, werden die Kulturen bei 25 °C gezüchtet. Unless otherwise stated, the cultures are grown at 25 ° C.

Kulturcharakteristika von A. rugulosus NRRL 8113 Czapek-Lösung-Agar Culture characteristics of A. rugulosus NRRL 8113 Czapek solution agar

Die Kultur wächst langsam und erreicht in 15 Tagen bei 25 °C einen Durchmesser von 1,5 bis 2,0 cm. Die Oberfläche der Kolonie ist konvex und samtig, wird mit dem Alter nahe dem Mittelpunkt runzelig und dann vorgewölbt. Der äussere Mycel-rand besteht aus einem 2 mm starken Band tiefeingetauchter farbloser Hyphen und ist gebuchtet. Auf den Lufthyphen am Rand bildet sich ein rosabraunes Exudat. In der Zeit von 7 bis io 14 Tagen wird in dem die Kolonie umgebenden Agar ein blasspurpurfarbenes flüssiges Pigment gebildet. Nach 15 Tagen diffundiert das Pigment durch die gesamte Kolonie. The culture grows slowly and reaches a diameter of 1.5 to 2.0 cm in 15 days at 25 ° C. The surface of the colony is convex and velvety, wrinkles with age near the center, and then bulges. The outer mycelium edge consists of a 2 mm thick band of deeply immersed colorless hyphae and is bulged. A pink-brown exudate forms on the air hyphae on the edge. From 7 to 14 days a pale purple liquid pigment is formed in the agar surrounding the colony. After 15 days, the pigment diffuses throughout the colony.

Nach 5 Tagen reicht die Farbe der Oberfläche der Kolonie von weiss bis lederfarben, und die Kolonierückseite ist bräun-i5 lich-òrange im mittleren Teil und bräunlich bis bräunlich-pur-purfarben in den äusseren Bereichen. In 10 Tagen wird die Kolonie mässig gelblich-rosa (ISCC-NBS 29 und Maerz und Paul 1 l-A-7). Nach 14 Tagen ist die Kolonie hellgräulich-rot (ISCC-NBS 18 und Maerz und Paul 4-G-7). Der Randbereich so wird infolge von Conidienbildung mit kleinen Warzen bedeckt und ist kräftig gelb (ISCC-NBS 84 und Maerz und Paul 10-L-5). Verstreute stumpfgelbliche Büschel von Hüllzellen treten in willkürlicher Verteilung an der Oberfläche und entlang dem Rand der Kolonie auf. Mit dem Alter werden die kräftig gelben 25 Flecken und Randbereiche gelblich-grün. Nach drei Wochen ist in den neuen Luftbestandteilen des Randes ein orange-purpurfarbener Ton zu beobachten. Die Kolonierückseite ist anfänglich schwach konkav, flacht sich mit dem Reifen auf die Agar-oberfläche ab und wird etwas runzelig. Nach 10 Tagen ist die 30 Rückseite schwach braun (ISCC-NBS 57 und Maerz und Paul 5-A-10) und nach 15 Tagen gräulich-rot (ISCC-NBS 19 und Maerz und Paul 6-J-3). After 5 days the color of the surface of the colony ranges from white to leather-colored, and the back of the colony is brownish-orange-orange in the middle part and brownish to brownish-pure-pure-colored in the outer areas. In 10 days the colony turns moderately yellowish pink (ISCC-NBS 29 and Maerz and Paul 1 l-A-7). After 14 days the colony is light gray-red (ISCC-NBS 18 and Maerz and Paul 4-G-7). The marginal area is covered with small warts due to the formation of conidia and is bright yellow (ISCC-NBS 84 and Maerz and Paul 10-L-5). Scattered dull yellow tufts of enveloping cells occur in an arbitrary distribution on the surface and along the edge of the colony. With age, the bright yellow spots and margins turn yellowish green. After three weeks, an orange-purple tone can be observed in the new air components of the rim. The back of the colony is initially slightly concave, flattens with the tire on the agar surface and becomes somewhat wrinkled. After 10 days the 30 back is faintly brown (ISCC-NBS 57 and Maerz and Paul 5-A-10) and after 15 days grayish-red (ISCC-NBS 19 and Maerz and Paul 6-J-3).

Der conidiogene Zustand ist spärlich. Conidiophoren sind über die Oberfläche zerstreut und treten manchmal als Flecken 35 oder in einem Band nahe dem Rand auf. Conidialköpfe sind zunächst lose strahlenförmig und kugelförmig. Mit dem Altern können sie sich als kurze säulenärtige Formen entwickeln, die kompakter sind. Kugelartige Köpfe haben einen Durchmesser von 70 bis 80 u und sind im Mittel 50 |i. Säulenförmige Köpfe 40 können bis zu 140 jj, lang und 70 (i. dick sein. The conidiogenic state is sparse. Conidiophores are scattered across the surface and sometimes appear as spots 35 or in a band near the edge. Conidial heads are initially loosely radiating and spherical. As they age, they can develop into short, columnar forms that are more compact. Spherical heads have a diameter of 70 to 80 u and are 50 | i on average. Columnar heads 40 can be up to 140 years, long and 70 (i. Thick.

Die Conidien sind kugelförmig bis weniger als kugelartig, leicht gerunzelt und grünlich-gold in der Masse. Der Durchmesser beträgt 2,8 bis 3,9 jj., im Mittel 3,2 jj.. The conidia are spherical to less than spherical, slightly wrinkled and greenish-gold in mass. The diameter is 2.8 to 3.9 years, on average 3.2 years.

Sterigmata sind in zwei Reihen angeordnet und farblos. Pri-45 märe Sterigmata haben eine Länge von 4,7 bis 11,0 p, im Mittel 7,9 [i. An ihrer dicksten Stelle sind sie 2,4 |_i und laufen auf 1,6 jx zu. Sekundäre Sterigmata können einzeln oder in Paaren vorkommen, gehen aus den primären hervor und sind flaschenför-mig. An ihrer dicksten Stelle messen sie 3,0 ja. und laufen apical auf 0,4 u zu, wo sie rohrförmig werden. Die rohrförmige Spitze ist 1,2 p. lang. Die Gesamtlänge beträgt von 5,5 bis 12,6 u, im Mittel 9,2 ji. Sterigmata are arranged in two rows and are colorless. Pri-45 stereotypes have a length of 4.7 to 11.0 p, on average 7.9 [i. At their thickest point they are 2.4 | _i and run to 1.6 jx. Secondary sterigmas can occur individually or in pairs, emerge from the primary and are bottle-shaped. At their thickest point they measure 3.0 yes. and taper apically to 0.4 u where they become tubular. The tubular tip is 1.2 p. long. The total length is from 5.5 to 12.6 u, on average 9.2 ji.

Bläschen sind kugelförmig bis unterkugelartig oder halbkugelförmig und können an der Spitze abgeflacht sein, wobei sie mit dem Alter bräunlich werden. Der Durchmesser reicht von 7,4 bis 11,2 n und beträgt im Mittel 9,4 n. Vesicles are spherical to hemispherical or hemispherical in shape and may be flattened at the top, becoming brownish with age. The diameter ranges from 7.4 to 11.2 n and averages 9.4 n.

Conidiophoren sind glatt, verhältnismässig dickwandig und zunächst glasig durchsichtig und werden dann hellzimtbraun. Bei den Bläschen sind sie etwas dicker, und sie können sich 60 nahe der Fusszelle leicht zuspitzen. Die durchschnittliche Dicke beträgt 5,9 (i. Conidiophoren haben eine Länge von 47,7 bis 166,6 ji, im Durchschnitt 106 p.. Sie geben von eingetauchten Hyphen oder seitlich von Lufthyphenfäden aus. Der ascogene Zustand tritt bis zu 20 Tage auf. Die kleinen gelblichen Büschel es von Hüllzellen, die auf der Oberfläche erscheinen, können auch innerhalb des Mycels an beliebigen Stellen vorkommen. Sie bestehen aus Hüllzellen, die ein oder mehr Kleistothecia einhüllen. Hüllzellen sind kugelförmig bis unterkugelartig oder oval Conidiophores are smooth, relatively thick-walled and initially glassy transparent and then turn light cinnamon brown. The vesicles are a little thicker, and they can easily worsen near the foot cell. The average thickness is 5.9 (i. Conidiophores have a length of 47.7 to 166.6 ji, on average 106 p .. They emit from immersed hyphae or laterally from aerial hyphae threads. The ascogenic state occurs up to 20 days The small yellowish tufts of enveloping cells that appear on the surface can also occur anywhere in the mycelium, consisting of enveloping cells that envelop one or more Kleistothecia

50 50

55 55

5 5

629531 629531

bis länglich, sind dickwandig und durchsichtig. Kugelförmige Hüllzellen haben einen Durchmesser von 18 bis 24 ja., im Durchschnitt 21,8 n. to elongated, are thick-walled and transparent. Spherical enveloping cells have a diameter of 18 to 24 y., On average 21.8 n.

Kleistothecia sind kugelförmig bis unterkugelartig, dickwandig, relativ zäh und faserig. Zunächst relativ farblos, werden sie rötlich-purpurfarben und dunkel mit dem Alter. Der Durchmesser misst von 165 bis 470 p, im Durchschnitt 275 jx. Kleistothecia are spherical to hypodermic, thick-walled, relatively tough and fibrous. At first relatively colorless, they become reddish-purple and dark with age. The diameter measures from 165 to 470 p, on average 275 jx.

Malzextraktagar Malt extract agar

Bei 25 °C gezüchtete Kolonien expandieren rasch und erreichen in 10 bis 12 Tagen 4 bis 5 cm. Zunächst gräulich weiss, werden die Kolonien in 4 Tagen olivgrün (ISCC-NBS 90 und Maerz und Paul 23-E-6). Der eingebuchtete schwach gelappte äussere Rand besteht aus dichtgepackten kurzen weissen Luft-hyphen. Kleine gelbliche Büschel von Hüllzellen erscheinen als Punkte am Rand und sind willkürlich über die filzartige Agar-oberfläche verstreut. Nach 20 Tagen neigen diese Hüllzellenbüschel zum Verkrusten eines grossen Teils der Oberfläche. Die Unterseite der Kolonie ist gräulich-gelb (ISCC-NBS 90 und Maerz und Paul 11-B-l). Colonies grown at 25 ° C expand rapidly and reach 4 to 5 cm in 10 to 12 days. Initially greyish white, the colonies turn olive green in 4 days (ISCC-NBS 90 and Maerz and Paul 23-E-6). The indented, slightly lobed outer edge consists of densely packed short white air hyphae. Small yellowish tufts of envelope cells appear as dots on the edge and are randomly scattered over the felt-like agar surface. After 20 days, these tufts of enveloping cells tend to crust over a large part of the surface. The underside of the colony is greyish-yellow (ISCC-NBS 90 and Maerz and Paul 11-B-l).

Der ascogene Zustand erscheint in 15 Tagen. Die kleinen gelblichen Büschel von Hüllzellen, die auf der Oberfläche auftreten, kommen auch innerhalb des Mycels an beliebigen Stellen vor. Sie bestehen aus Hüllzellen, die ein oder mehr Kleistothecia einhüllen. Hüllzellen können grosse Gebiete über den Conidienköpfen verkrusten. Sie sind kugelförmig bis unterkugelartig oder oval bis länglich, sind dickwandig und durchsichtig. Kugelförmige Hüllzellen haben einen Durchmesser von 18 bis 24 |x, im Durchschnitt 21,8 p.. The ascogenic state appears in 15 days. The small yellowish tufts of enveloping cells that appear on the surface also occur anywhere in the mycelium. They consist of enveloping cells that envelop one or more Kleistothecia. Envelope cells can crust over large areas above the conidial heads. They are spherical to hypodermic or oval to oblong, are thick-walled and transparent. Spherical envelope cells have a diameter of 18 to 24 | x, an average of 21.8 p ..

Kleistothecia sind kugelförmig bis unterkugelartig und dun-kelrötlichbraun. Sie haben einen Durchmesser von 389 bis 700 H-, im Durchschnitt 506 p. Kleistothecia are spherical to sub-spherical and dark reddish brown. They have a diameter of 389 to 700 H-, on average 506 p.

Asci sind zerbrechlich, durchsichtig und unterkugelartig bis oval. Unterkugelartige Asci haben einen Durchmesser von 8,7 bis 11,9 p, im Durchschnitt 10,3 p. Ovale Asci haben Abmessungen von 10,3 bis 14,2 p. x 8,7 bis 10,3 p, im Durchschnitt 12,2 x 9,1 p. Asci are fragile, see-through and have a spherical to oval shape. Lower-spherical asci have a diameter of 8.7 to 11.9 p, on average 10.3 p. Oval asci have dimensions from 10.3 to 14.2 p. x 8.7 to 10.3 p, average 12.2 x 9.1 p.

Ascosporen sind rotorangefarben, leicht gerunzelt, mit zwei parallelen feingefalteten äquatorialen Erhebungen, die 0,8 p breit und ungebrochen sind. Über die lange Achse erscheinen die Ascosporen linsenförmig. Wenn die Erhebung peripher ist, sind die Ascosporen kugelförmig. In der Kugelformaufsicht haben sie einen Durchmesser von 4,9 bis 6,3 jx, im Durchschnitt 5,4 jl Ascospores are reddish-orange in color, slightly wrinkled, with two parallel, finely folded equatorial bumps that are 0.8 p wide and unbroken. The ascospores appear lenticular along the long axis. If the elevation is peripheral, the ascospores are spherical. In the spherical shape supervision they have a diameter of 4.9 to 6.3 jx, on average 5.4 jl

Zwei Charakterika des Antibioticum A-30912 erzeugenden Stamms von Aspergillus rugulosus sind von den Charakteristika des von Raper und Fennel (a.a.O.) beschriebenen A. rugulosus verschieden. Der A-30912 erzeugende Stamm hat grössere Conidienköpfe und Ascosporen. Two characteristics of the Aspergillus rugulosus strain producing Antibioticum A-30912 are different from the characteristics of the A. rugulosus described by Raper and Fennel (op. Cit.). The A-30912 producing strain has larger conidia heads and ascospores.

Eine Aspergillus rugulosus Kultur, die sich für die Erzeugung des antibiotisch wirksamen A-30912-Gemisches eignet, wurde am 22. September 1975 beim Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratori Peoria, Illinois 61604, mit der Nummer NRRL 8113 hinterlegt. Proben des hinterlegten Stammes sind der Allgemeinheit zugänglich. An Aspergillus rugulosus culture suitable for producing the antibiotic A-30912 mixture was deposited on September 22, 1975 with the number NRRL 8113 at the Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratori Peoria, Illinois 61604. Samples of the deposited strain are available to the general public.

Für die Züchtung von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 können mehrere verschiedene Nährmedien verwendet werden. Im Hinblick auf eine wirtschaftliche Erzeugung, optimale Ausbeuten und Einfachheit der Produktisolierung sind jedoch bestimmte Nährmedien bevorzugt. So ist beispielsweise Glucose eine bevorzugte Kohlehydrat liefernde Substanz bei Fermentationen in grossem Massstab, doch können auch Melasse, Stärke, Latose, Saccharose, Maltose, Glycerin und dergleichen verwendet werden. Bevorzugte Stickstoffquellen sind enzym-hydrolysiertes Casein und lösliches Fleischpepton, doch können auch Korndestillatrückstände, Mononatriumglutamat und Several different culture media can be used to grow Aspergillus rugulosus NRRL 8113. However, certain nutrient media are preferred in terms of economical production, optimal yields and simplicity of product isolation. For example, glucose is a preferred carbohydrate-providing substance in large-scale fermentations, but molasses, starch, latose, sucrose, maltose, glycerin, and the like can also be used. Preferred nitrogen sources are enzyme-hydrolyzed casein and soluble meat peptone, but grain distillate residues, monosodium glutamate and

ähnliche Stoffe verwendet werden. Anorganische Salze können in das Nährmedium aufgenommen werden; hierzu gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlor-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und der-5 gleichen Ionen zu liefern vermögen. similar fabrics are used. Inorganic salts can be taken up in the nutrient medium; These include the usual soluble salts, which are able to supply sodium, magnesium, calcium, ammonium, chlorine, carbonate, sulfate, nitrate and the like ions.

Das Nährmedium soll auch essentielle Spurenelemente enthalten, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus nötig sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Me-io diums in Mengen vor, die den Wachstumsanforderungen des Organismus genügen. The nutrient medium should also contain essential trace elements that are necessary for the growth and development of the organism. Such trace elements usually occur as impurities in the other constituents of the medium in amounts which meet the growth requirements of the organism.

Bei Fermentationen in grossem Massstab kann es nötig sein, kleine Mengen (zum Beispiel 0,2 ml/1) eines Entschäumers, wie Polypropylenglycol, zuzusetzen, wenn das Schäumen zu 15 Schwierigkeiten führt. For large scale fermentations, it may be necessary to add small amounts (e.g. 0.2 ml / l) of a defoamer, such as polypropylene glycol, if foaming leads to 15 difficulties.

Für die Erzeugung beträchtlicher Mengen des Antibioticum A-30912-Gemischs wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen des Antibioticum A-30912-Gemischs können durch Schüttelkolbenkultur erhal-20 ten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung des Beginns der Antibioticumerzeugung, die beim Beimpfen von grossen Tanks mit der Sporenform des Organismus gewöhnlich eintritt, ist die Verwendung eines vegetativen Inokulums bevorzugt. Das vegetative Inokulum wird durch Inokulieren eines kleinen 25 Volumens Nährmedium mit der Sporenform oder Mycelfrag-menten des Organismus zubereitet, wodurch eine frische gut wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen grossen Tank überführt. Das für die Züchtung des vegetativen Inokulums verwendete 30 Medium kann das gleiche sein wie das für grössere Fermentationen verwendete, doch können auch andere Medien verwendet werden. Der Antibioticum A-30912 erzeugende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 43 °C gezüchtet werden, und er wächst gut bei Temperaturen von 35 etwa 25 bis 30 °C. Eine optimale Erzeugung des Antibioticum A-30912-Gemisches erfolgt offensichtlich bei einer Temperatur von etwa 25 °C. Submerged aerobic fermentation in tanks is preferred for the production of substantial amounts of the Antibioticum A-30912 mixture. Small amounts of the Antibioticum A-30912 mixture can be obtained by shake flask culture. Because of the time delay in the start of antibiotic production, which usually occurs when inoculating large tanks with the spore shape of the organism, the use of a vegetative inoculum is preferred. The vegetative inoculum is prepared by inoculating a small volume of nutrient medium with the spore shape or mycelium fragments of the organism, thereby maintaining a fresh, well-growing culture of the organism. The vegetative inoculum is then transferred to a large tank. The medium used to grow the vegetative inoculum may be the same as that used for larger fermentations, but other media may be used. The antibiotic A-30912 producing organism can be grown at temperatures between about 20 and 43 ° C, and it grows well at temperatures of about 35 to 25 to 30 ° C. Optimal production of the antibiotic A-30912 mixture obviously takes place at a temperature of approximately 25 ° C.

Wie bei aeroben Submers-Züchtungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Nährmedium geblasen. Im Interesse einer 40 wirksamen Antibioticumerzeugung liegt das bei der Tankproduktion angewandte Luftvolumen vorzugsweise über 0,4 Volumina Luft pro Volumen des Nährmediums und Minute (V/V/M). As usual with aerobic submerged breeding methods, sterile air is blown through the nutrient medium. In the interest of effective antibiotic production, the volume of air used in tank production is preferably above 0.4 volumes of air per volume of nutrient medium and minute (V / V / M).

Die Bildung des Antibioticum A-30912-Gemisches kann während der Fermentation in der Weise verfolgt werden, dass 45 Proben von alkoholischen Extrakten der Gärmaischen gegen einen Organismus, dessen Empfindlichkeit gegenüber den A-30912-Antibiotica bekannt ist, auf antibiotische Aktivität geprüft werden. Ein Probeorganismus, der sich für die Prüfung auf Vorliegen der Antibioticum A-30912-Mischung eignet, ist so Candida albicans. Die Bioprobe wird zweckmässigerweise durch Papierscheibenproben auf besamten Agarplatten durchgeführt. The formation of the Antibioticum A-30912 mixture can be monitored during the fermentation in such a way that 45 samples of alcoholic extracts of the fermentation mash against an organism, whose sensitivity to the A-30912 antibiotics is known, are tested for antibiotic activity. Candida albicans is a test organism that is suitable for testing for the presence of the antibiotic A-30912 mixture. The bioprobe is expediently carried out using paper disk samples on inseminated agar plates.

Im allgemeinen kann eine antibiotische Aktivität am zweiten Tag der Fermentation nachgewiesen werden. Das Maxi-55 mum der Bildung von antibiotischer Aktivität tritt gewöhnlich zwischen etwa dem dritten und sechsten Tag auf. In general, antibiotic activity can be demonstrated on the second day of fermentation. The maxi-55 mum of antibiotic activity usually occurs between about the third and sixth day.

Die Antibioticum A-30912-Faktoren sind antifungaie Mittel. Die antifungaie Wirkung der Antibioticum A-30912-Faktoren wird durch in-vitro-Tests mit Antibioticum A-30912 Faktor A 60 und D veranschaulicht. Diese Tests sind in Tabelle III zusammengestellt. Die antifungaie Wirkung wurde durch die herkömmliche Scheibendiffusionsmethode bestimmt (6 mm Bäusche werden in Lösungen getaucht, die die zu prüfende Verbindung enthalten. Die Bäusche werden auf Agarplatten aufge-65 bracht, die mit dem Testorganismus besamt sind). Die Ergebnisse sind als minimale inhibierende Konzentration (MIC) je Scheibe, in welcher die geprüfte Verbindung den Testorganismus inhibiert, angegeben. Antibiotic A-30912 factors are antifungal agents. The antifungal effect of the antibiotic A-30912 factors is illustrated by in vitro tests with antibiotic A-30912 factors A 60 and D. These tests are summarized in Table III. The antifungal effect was determined by the conventional disk diffusion method (6 mm balls are immersed in solutions containing the compound to be tested. The balls are applied to agar plates which are inseminated with the test organism). The results are given as the minimum inhibitory concentration (MIC) per disc in which the tested compound inhibits the test organism.

629531 629531

6 6

Tabelle III Table III

A-30912 Faktor A ist bei in-vitro-Scheibendiffusionstests gegen Dermatophytes sehr wirksam. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle IV zusammengestellt. A-30912 factor A is very effective in in vitro disc diffusion tests against dermatophytes. The results of these tests are summarized in Table IV.

Tabelle IV A-30912 Faktor A gegen Dermatophytes Table IV A-30912 Factor A vs. Dermatophytes

Test-Organismus Test organism

MIC (mcg/Scheibe) MIC (mcg / disk)

Antibioticum Antibiotic

A-30912 A-30912

Faktor A Factor A

Faktor D Factor D

Candida albicans Candida albicans

0,625 0.625

0,5 0.5

Trichophyton Trichophyton

mentagrophytes mentagrophytes

0,078 0.078

0,07 0.07

bioticum A-30912-Faktors hängt von mehreren Bedingungen ab, zum Beispiel der Art und Schwere der jeweiligen Infektion. bioticum A-30912 factor depends on several conditions, for example the type and severity of the respective infection.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. The invention is further illustrated by the following examples.

5 5

Beispiel 1 example 1

A. Schüttelkolbenfermentation A. Shake flask fermentation

Eine Kultur von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 wird auf Schrägagar der folgenden Zusammensetzung bereitet und io erhalten: A culture of Aspergillus rugulosus NRRL 8113 is prepared and maintained on slant agar of the following composition:

Bestandteil component

Menge (%) Amount (%)

Anzahl der number of

MIC MIC

Dermatophytes Dermatophytes

Isolate Isolates

(mcg/Scheibe) (mcg / disk)

Trichophyton mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

13 13

1,25-0,039 1.25-0.039

Trichophyton gallinae Trichophyton gallinae

1 1

>1,25 > 1.25

Trichophyton meginini Trichophyton meginini

1 1

0,0195 0.0195

Trichophyton quinckeanum Trichophyton quinckeanum

1 1

>1,25 > 1.25

Trichophyton rubrum Trichophyton rubrum

1 1

<0,0098 <0.0098

Trichophyton schoenceinii Trichophyton schoenceinii

1 1

0,0195 0.0195

Trichophyton terrestre Trichophyton terrestre

1 1

0,0195 0.0195

Trichophyton tonsurans Trichophyton tonsurans

9 9

>1,25-0,156 > 1.25-0.156

Microsporium gypseum Microsporium gypseum

5 5

0,156-0,038 0.156-0.038

Microsporium audouinii Microsporium audouinii

4 4th

1,25-0,156 1.25-0.156

Microsporium canis Microsporium canis

6 6

1,25-0,0098 1.25-0.0098

Microsporium cookei Microsporium cookei

2 2nd

1,25-0,0195 1.25-0.0195

Nannizzia incurvata Nannizzia incurvata

1 1

0,312 0.312

Phalaphere jean salemi Phalaphere jean salemi

1 1

>1,25 > 1.25

Epidermatophyton floccosum Epidermatophyton floccosum

1 1

1,25 1.25

Geotrichum candidum Geotrichum candidum

4 4th

>1,25-0,156 > 1.25-0.156

Keratinomyces ajellio Keratinomyces ajellio

1 1

0,156 0.156

20 20th

Dextrin 1,0000 Enzymatisches Hydrolysat von Casein* 0,2000 Dextrin 1.0000 Enzymatic hydrolyzate of casein * 0.2000

Hefeextrakt 0,1000 Yeast extract 0.1000

Fleischextrakt 0,1000 Meat extract 0.1000

KCl 0,0200 KCl 0.0200

MgSCWHîO 0,0200 MgSCWHîO 0.0200

FeSCWHîO 0,0004 FeSCWHîO 0.0004

Wasser 98,5596 Water 98.5596

25 * N-Z-Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y. 25 * N-Z-Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Die Schräge wird mit Aspergillus rugulosus NRRL 8113 inokuliert und danach etwa 7 Tage bei 25 °C inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit Rinderserum bedeckt und zum Lösen 30 der Sporen mit einer sterilen Schlinge abgeschabt. Die Hälfte der erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet: The slant is inoculated with Aspergillus rugulosus NRRL 8113 and then incubated at 25 ° C for about 7 days. The mature slant culture is covered with bovine serum and scraped with a sterile loop to loosen the spores. Half of the suspension obtained is used to inoculate 50 ml of a vegetative medium of the following composition:

Die antifungaie Wirkung der Antibioticum A-30912-Fakto-ren wird auch durch in-vivo-Tests nachgewiesen. Diese in-vivo-Tests werden in folgender Art und Weise durchgeführt: Drei Dosen der Testverbindung werden an mit Candida albicans infizierte Mäuse 0,4 und 24 Stunden nach der Infektion verabreicht. Der mit der Testverbindung erzielte Schutz wird als EDso-Wert ermittelt (die wirksame Dosis in mg/kg, die zu einem Schutz von 50% der Mäuse führt; vgl. W. Wiek et al., J. Bacte-riol. Bd. 81, S. 233-235, (1961). Die ED50-Werte für Antibioticum A-30912 Faktor A gegen Candida albicans bei Mäusen betragen 30 mg/kg (intraperitoneal) und 50 mg/kg (subkutan). Der EDso-Wert für Antibioticum A-30912 Faktor D gegen Candida albicans bei Mäusen beträgt 33 mg/kg (subkutan). The antifungal effect of the antibiotic A-30912 factors is also demonstrated by in vivo tests. These in vivo tests are carried out in the following manner: Three doses of the test compound are administered to mice infected with Candida albicans 0.4 and 24 hours after the infection. The protection achieved with the test compound is determined as the ED 50 value (the effective dose in mg / kg which leads to protection of 50% of the mice; cf. W. Wiek et al., J. Bacte-riol. Vol. 81 , Pp. 233-235, (1961) The ED50 values for antibiotic A-30912 factor A against Candida albicans in mice are 30 mg / kg (intraperitoneal) and 50 mg / kg (subcutaneously). The ED 50 for antibiotic A-30912 factor D against Candida albicans in mice is 33 mg / kg (subcutaneously).

Es treten keinerlei Anzeichen einer akuten Toxizität auf, wenn das Antibioticum A-30912 Faktor A intraperitoneal (ip) oder subkutan (sc) an Mäuse in einer Dosis von 100 mg/kg zweimal täglich drei Tage lang verabreicht wird (insgesamt 600 mg/ kg). Auch dann werden keinerlei Anzeichen akuter Toxizität beobachtet, wenn Antibioticum A-30912 Faktor A dreimal am Tag in einer Dosis von 200 mg/kg (Gesamtdosis 600 mg/kg) ip an Mäuse verabreicht wird. There are no signs of acute toxicity when the antibiotic A-30912 factor A is administered intraperitoneally (ip) or subcutaneously (sc) to mice at a dose of 100 mg / kg twice a day for three days (total 600 mg / kg) . No signs of acute toxicity are observed even when antibiotic A-30912 factor A is administered ip three times a day in a dose of 200 mg / kg (total dose 600 mg / kg) to mice.

Bei sc-Verabreichung von Antibioticum A-30912 Faktor D an Mäuse dreimal pro Tag in einer Dosis von je 14 mg/kg (Gesamtdosis 42 mg/kg) sind keine Anzeichen akuter Toxizität zu beobachten. With sc administration of antibiotic A-30912 factor D to mice three times a day in a dose of 14 mg / kg (total dose 42 mg / kg), no signs of acute toxicity are observed.

Wenn sie als antifungaie Mittel verwendet werden, werden die Antibioticum A-30912-Faktoren parenteral und gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Die Dosierung des Anti- When used as an antifungal agent, the antibiotic A-30912 factors are administered parenterally and usually together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The dosage of the anti

40 40

45 45

Bestandteil component

Menge (%) Amount (%)

Saccharose Sucrose

2,5 2.5

Melasse molasses

3,6 3.6

Maisquellwasser Corn steep liquor

0,6 0.6

Enzymatisches Hydrolysat von Casein* Enzymatic hydrolyzate of casein *

1,0 1.0

K2HPO4 K2HPO4

0,2 0.2

Wasser water

92,1 92.1

* N-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y. * N-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml Erlenmeyer-Weithalskolben bei 25 °C 24 Stunden auf einem 50 Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser rotiert. The inoculated vegetative medium is incubated in a 250 ml Erlenmeyer wide-necked flask at 25 ° C. for 24 hours on a 50 shaker, which rotates at 250 revolutions / minute through an arc of 5 cm in diameter.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann direkt zum Inokulieren des vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann es für eine spätere Verwen-55 dung aufgehoben werden, was bevorzugt ist, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff hält. Für eine derartige Aufbewahrung wird die Kultur folgendermassen in viele kleine Phiolen eingebracht: In jede Phiole werden 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lac-60 tose-Lösung folgender Zusammensetzung eingebracht: This incubated vegetative medium can be used directly to inoculate the second stage vegetative medium. Instead, it can be saved for later use, which is preferred by keeping the culture in the vapor phase of liquid nitrogen. For such storage, the culture is introduced into many small vials as follows: 2 ml of incubated vegetative medium and 2 ml of a glycerol-Lac-60 tose solution of the following composition are introduced into each vial:

Bestandteil component

Menge amount

Glycerin Glycerin

20% 20%

Lactose Lactose

10% 10%

entionisiertes Wasser deionized water

70% 70%

7 7

629531 629531

Die so hergestellten Suspensionen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. The suspensions produced in this way are stored in the vapor phase of liquid nitrogen.

1 ml einer so hergestellten und gelagerten Suspension wird zum Inokulieren von 50 ml vegetativen Mediums der ersten Stufe mit der oben angegebenen Zusammensetzung verwendet. Dann wird das inokulierte Medium in einem 250 ml-Erlen-meyer-Weithalskolben 22 Stunden bei 25 °C auf einem Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm rotiert. 1 ml of a suspension prepared and stored in this way is used to inoculate 50 ml of vegetative medium of the first stage with the composition indicated above. Then the inoculated medium is incubated in a 250 ml Erlen-Meyer wide-necked flask for 22 hours at 25 ° C. on a shaker which rotates at 250 revolutions / minute through an arc with a diameter of 5 cm.

B. T ankfermentation B. T fermentation

Zur Erzielung eines grossen Volumens an Inokulum werden 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums der ersten Stufe zum Inokulieren von 400 ml vegetativem Medium der zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben 25 Stunden bei 25 °C auf einem Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm rotiert. To achieve a large volume of inoculum, 10 ml of the above-described incubated vegetative medium of the first stage are used to inoculate 400 ml of vegetative medium of the second stage with the same composition as the vegetative medium. The medium of the second stage is incubated in a 2 liter Erlenmeyer wide-necked flask at 25 ° C. for 25 hours on a shaker which rotates at 250 revolutions / minute through an arc with a diameter of 5 cm.

800 ml des inkubierten vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, werden zum Inokulieren von 100 Litern sterilem Produktionsmedium folgende Zusammensetzung verwendet: 800 ml of the incubated second stage vegetative medium, prepared as described above, are used to inoculate 100 liters of sterile production medium with the following composition:

Bestandteil component

Menge amount

Glucose glucose

25 g/Liter 25 g / liter

Stärke Strength

10g/LIter 10g / liter

Pepton* Peptone *

10g/LIter 10g / liter

Blackstrap Melasse Blackstrap molasses

5 g/Liter 5 g / liter

Enzymatisches Hydrolysat von Enzymatic hydrolyzate of

Casein** Casein **

4 g/Liter 4 g / liter

MgSCWHîO MgSCWHîO

0,5 g/Liter 0.5 g / liter

Czapek Mineralmischung*** Czapek mineral mix ***

2,0 ml/Liter 2.0 ml / liter

CaCCb CaCCb

2,0 g/Liter entionisiertes Wasser, auf 2.0 g / liter of deionized water

1 Liter 1 liter

*W.P. No. 159, Inolex Biomedicai Corp., Glenwood, III. **N-Z Amine A, Shefield Chemical Co., Norwich, N.Y. ***Czapek Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung: * W.P. No. 159, Inolex Biomedicai Corp., Glenwood, III. ** N-Z Amine A, Shefield Chemical Co., Norwich, N.Y. *** Czapek mineral mix has the following composition:

Bestandteil component

Menge amount

FeS04- 7H2O (gelöst in 2 ml konz. HCl) 2 g FeS04-7H2O (dissolved in 2 ml conc. HCl) 2 g

KCl 100 g KCl 100 g

MgSCWHzO 100 g entionisiertes Wasser, auf 1 Liter MgSCWHzO 100 g deionized water, per 1 liter

Nach dem Sterilisieren durch 30minütige Behandlung in einem Autoklaven bei 121 °C und einem Druck von etwa 1,1 bis 1,25 atü liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,8. Man lässt das inokulierte Produktionsmedium in einem 165-Liter-Fermenta-tionstank bei einer Temperatur von 25 °C 4 Tage lang fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einem Verhältnis von 0,5 V/V/M belüftet und mit einem herkömmlichen Rührer bei 300 Umdrehungen/Minute gerührt. After sterilization by treatment in an autoclave at 121 ° C. and a pressure of about 1.1 to 1.25 atü for 30 minutes, the pH of the medium is 6.8. The inoculated production medium is left to ferment in a 165 liter fermentation tank at a temperature of 25 ° C for 4 days. The fermentation medium is aerated with sterile air in a ratio of 0.5 V / V / M and stirred with a conventional stirrer at 300 revolutions / minute.

Beispiel 2 Example 2

Abtrennung des Antibioticum A-30912-Gemisches Separation of the antibiotic A-30912 mixture

200 ml der wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen Gesamtgärmaische werden mit 200 ml Methanol eine Stunde lang gründlich verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird durch Zugabe von 5 n HCl auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 4 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird zu etwa 60 Liter Diäthyläther gegeben, wodurch das A-30912-Gemisch ausfällt. Der Niederschlag wird durch Abfiltrieren gewonnen und getrocknet, und man erhält 38 g des Antibioticum A-30912-Gemisches als grauer Pulver. Durch Einengen des Filtrats im Vakuum erhält man ein öl, das in 500 ml Methanol gelöst wird. Die Methanollösung wird zu 7,5 Liter Diäthyläther gegeben, wodurch weiteres Antibioticum A-30912-Gemisch ausfällt. Dieser Niederschlag wird gleichfalls abfiltriert und getrocknet, wodurch weitere 3,5 g des Anitioticum 15 A-30912-Gemisches erhalten werden. 200 ml of the total fermentation mash obtained as described in Example 1 are thoroughly stirred with 200 ml of methanol for one hour and then filtered using a filter aid (Hyflo Super-Cel, diatomaceous earth, Johns-Manville Products Corp.). The pH of the filtrate is adjusted to 4.0 by adding 5N HCl. The acidified filtrate is extracted twice with equal volumes of chloroform. The chloroform extracts are combined and concentrated in vacuo to a volume of approximately 4 liters. The concentrate is added to about 60 liters of diethyl ether, causing the A-30912 mixture to precipitate out. The precipitate is collected by filtration and dried, and 38 g of the antibiotic A-30912 mixture are obtained as a gray powder. Concentrating the filtrate in vacuo gives an oil which is dissolved in 500 ml of methanol. The methanol solution is added to 7.5 liters of diethyl ether, causing further antibiotic A-30912 mixture to fail. This precipitate is also filtered off and dried, whereby a further 3.5 g of the Anitioticum 15 A-30912 mixture are obtained.

Beispiel 3 Example 3

Isolierung von Antibioticum A-30912 Faktor A Isolation of Antibiotic A-30912 Factor A

20 g des wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen Antibioti-20 cum A-30912-Gemisches werden auf eine Kieselgelsäule (4x 107 cm, Woelm) in Acetonitril .-Wasser (95:5) aufgegeben. Die Säule wird mit AcetonitrihWasser (95:5) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 bis 2 ml/Minuten eluiert, wobei Fraktionen von jeweils etwa 20 ml aufgefangen werden. Die 25 Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und des AcetonitrihWasser (95:5) Lösungsmittelsystems und Bioautographie mit Candica albicans geprüft. 20 g of the Antibioti-20 cum A-30912 mixture obtained as described in Example 2 are applied to a silica gel column (4 × 107 cm, Woelm) in acetonitrile water (95: 5). The column is eluted with acetonitrile water (95: 5) at a flow rate of 1 to 2 ml / minutes, with fractions of about 20 ml each being collected. The 25 fractions are checked by thin layer chromatography using silica gel and the acetonitrile water (95: 5) solvent system and bioautography with Candica albicans.

Die Fraktionen 74 bis 125 werden vereinigt und eingeengt. 30 Aus der konzentrierten Lösung fallen beim Stehenlassen Kristalle aus, durch deren Abtrennung 124 mg Sterigmatocystin erhalten werden. Die Fraktionen 212 bis 273 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, bis ein öl erhalten wird. Dieses öl wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst und dann zu 15 35 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet und liefert 23 mg Antibioticum A-30912 Faktor D. Die Fraktionen 274 bis 437 enthalten die Antibioticum A-30912 Faktoren A, B, C und D. Die Fraktionen 482 bis 900 enthalten die Antibioticum A-30912 Faktoren A, E, 40 F und G. Die Fraktionen 438 bis 481 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst und dann zu 15 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet und ergibt 2,17 g Antibioticum A-30912 45 Faktor A. Fractions 74 to 125 are combined and concentrated. 30 Crystals precipitate out of the concentrated solution when left to stand, and 124 mg of sterigmatocystin are obtained when separated. Fractions 212-273 are combined and concentrated in vacuo until an oil is obtained. This oil is dissolved in a small volume of methanol and then added to 15 to 35 volumes of diethyl ether. The precipitate formed is separated off and dried and gives 23 mg of antibiotic A-30912 factor D. Fractions 274 to 437 contain antibiotic A-30912 factors A, B, C and D. Fractions 482 to 900 contain antibiotic A-30912 factors A, E, 40 F and G. Fractions 438 to 481 are combined and concentrated in vacuo to an oil. This oil is dissolved in a small volume of methanol and then added to 15 volumes of diethyl ether. The precipitate formed is separated off and dried and gives 2.17 g of antibiotic A-30912 45 factor A.

Beispiel 4 Example 4

Isolierung von Antibioticum A-30912 Faktor D Isolation of antibiotic A-30912 factor D.

Ein teilweise gereinigtes Antibioticum A-30912-Gemisch, 50 das die Antibioticum A-30912 Faktoren B, C und D enthält, A partially purified mixture of Antibiotic A-30912, 50 containing Antibiotic A-30912 factors B, C and D,

wird wie in Beispiel 3 im Zusammenhang mit den Fraktionen 274 bis 437 beschrieben, erhalten. 750 mg dieses Materials werden an einer Kieselsäuregelsäule (2,2x51 cm, Woelm) Chromatographien, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 15 55 ml aufgefangen werden. Das Eluieren erfolgt mit folgenden Lösungsmitteln: is obtained as described in Example 3 in connection with fractions 274 to 437. 750 mg of this material are chromatographed on a silica gel column (2.2 × 51 cm, Woelm), fractions with a volume of approximately 15 55 ml being collected. Elution is carried out with the following solvents:

Fraktionen Fractions

Lösungsmittel solvent

1-25 1-25

Acetonitril Acetonitrile

26-62 26-62

Acetonitril + 1% Wasser Acetonitrile + 1% water

63-700 63-700

Acetonitril + 1,5% Wasser Acetonitrile + 1.5% water

65 65

Die aus der Säule austretenden Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und AcetonitrihWasser (95:5) sowie Benzol:Methanol The fractions emerging from the column are determined by thin layer chromatography using silica gel and acetonitrile water (95: 5) and benzene: methanol

629531 629531

8 8th

(7:3) als Lösungsmittelsysteme und Bioautographie mit Candida albicans überprüft. Die Fraktionen 535 bis 685 enthalten Antibioticum A-30912 Faktor D, und werden vereinigt und im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und dann zu 15 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet und ergibt 69 mg Antibioticum A-30912 Faktor D. (7: 3) as solvent systems and bioautography with Candida albicans. Fractions 535 to 685 contain Antibiotic A-30912 factor D and are pooled and concentrated in vacuo to an oil. This oil is dissolved in a small amount of methanol and then added to 15 volumes of diethyl ether. The precipitate formed is filtered off and dried and gives 69 mg of Antibioticum A-30912 factor D.

Beispiel 5 Example 5

Isolierung der Antibioticum A-30912 Faktoren B und C Isolation of antibiotic A-30912 factors B and C

Ein teilweise gereinigtes A-30912-Antibioticumgemisch, das die A-30912-Faktoren A, B, C und E enthält, wird wie in Beispiel 3 für die Fraktionen 212 bis 437 beschrieben, erhalten. 18 g dieses Materials werden in einem möglichst kleine Volumen Ace-tontrikWasser (4:1) gelöst und an einer Aluminiumoxydsäule (3,8x56 cm, Woelm) chromatographiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 20 ml aufgefangen werden. Die Säule wird mit folgenden Lösungsmitteln eluiert: A partially purified A-30912 antibiotic mixture containing A-30912 factors A, B, C and E is obtained as described in Example 3 for fractions 212 to 437. 18 g of this material are dissolved in the smallest possible volume of acetic acid water (4: 1) and chromatographed on an aluminum oxide column (3.8x56 cm, Woelm), fractions with a volume of about 20 ml being collected. The column is eluted with the following solvents:

Fraktionen Fractions

Gewicht (g) Weight (g)

Faktor factor

6-28 6-28

0,23* 0.23 *

6-28 6-28

5,80 5.80

A-30912 C,D A-30912 C, D

34-114 34-114

2,90 2.90

A-30912 B A-30912 B

115-164 115-164

1,20 1.20

A-30912 A,B A-30912 A, B

165-509 165-509

1,90 1.90

A-30912 A A-30912 A.

10 10th

Fraktionen Fractions

Lösungsmittel solvent

1-300 Acetonitril:Wasser(4:l) 301:509 AcetonitrikWasser (7:3) 1-300 acetonitrile: water (4: l) 301: 509 acetonitric water (7: 3)

20 20th

25 25th

Die erhaltenen Fraktionen werden durch die in Beispiel 4 beschriebene Dünnschichtchromatographie überwacht. Auf der Grundlage der dabei erhaltenen Ergebnisse werden die 30 Fraktionen vereinigt und bis zu einem Öl eingeengt. Die öligen Rückstände werden in kleinen Volumina Methanol gelöst, The fractions obtained are monitored by the thin layer chromatography described in Example 4. Based on the results obtained, the 30 fractions are pooled and concentrated to an oil. The oily residues are dissolved in small volumes of methanol,

worauf mit 10 bis 15 Volumina Diäthyläther gefällt wird. Die Art der Vereinigung der Fraktionen, das jeweils erhaltene Gewicht und der Faktorgehalt der vereinigten Fraktionen sind im fol- 35 genden zusammengestellt: which is precipitated with 10 to 15 volumes of diethyl ether. The way in which the fractions are combined, the weight obtained in each case and the factor content of the combined fractions are summarized below:

* Unlösliches Material vor Ätherfällung. * Insoluble material before ether precipitation.

Zur Erzielung von gereinigtem A-30912 Faktor C werden 2 g der Festsubstanz der Fraktionen 6 bis 28 in Methanol gelöst, an einer ausreichenden Menge Kieselsäuregel (Sorte 62) adsorbiert,und nachTrocknen auf eine Kieselsäuregelsäule (1,9x80 cm, Sorte 62, in Acetonitrit) aufgegeben. Die Säule wird mit Acetonitril mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/ Minute eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 10 ml aufgefangen werden. Bei Fraktion 117 wird das Lösungsmittel gewechselt und AcetonitrikWasser (99:1) verwendet. Die aus der Säule austretenden Fraktionen werden wiederum mit Dünnschichtchromatographie überwacht. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie werden Fraktionen vereinigt und bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Der ölige Rückstand wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst, worauf mit 10 bis 15 Volumina Diäthyläther gefällt wird. Die Gewichtsmengen und der Faktorgehalt der interessanten Fraktionen sind im folgenden zusammengestellt: To obtain purified A-30912 factor C, 2 g of the solid substance of fractions 6 to 28 are dissolved in methanol, adsorbed on a sufficient amount of silica gel (grade 62), and after drying on a silica gel column (1.9x80 cm, grade 62, in acetonitrite ) given up. The column is eluted with acetonitrile at a flow rate of 20 ml / minute, with fractions with a volume of about 10 ml being collected. For fraction 117 the solvent is changed and acetonitric water (99: 1) is used. The fractions emerging from the column are again monitored by thin layer chromatography. Based on the results of thin layer chromatography, fractions are pooled and concentrated to an oily residue. The oily residue is dissolved in a small volume of methanol, followed by 10 to 15 volumes of diethyl ether. The amounts by weight and the factor content of the interesting fractions are summarized below:

Fraktionen Fractions

Gewicht, g Weight, g

Faktor factor

341-479 341-479

0,250 0.250

D D

480-540 480-540

0,015 0.015

D D

541-899 541-899

0,391 0.391

C, D C, D

900-1675 900-1675

0,340 0.340

C C.

G G

2 Blatt Zeichnungen 2 sheets of drawings

Claims

629531 2 PATENT CLAIMS

1. Process for the preparation of a new antibiotic A-30912 mixture containing the factors A, B, C, D, E, F and G, characterized in that a) Aspergillus rugu-Iosus, which has the deposit number NRRL 8113, in cultivates a nutrient medium which contains assimilable substances which provide carbohydrate, nitrogen and inorganic salts, under aerobic submerged fermentation conditions until considerable antibiotic activity is produced, and b) separates the antibiotic A-30912 mixture from the fermentation mash.

2. The method according to claim 1, characterized in that one of the factors A or B or C or D or E or F or G is isolated from the new antibiotic A-30912 mixture.