CH629531A5 - Process for the preparation of the antibiotic A-30912 mixture and of factors A, B, C, D, E, F and G in this antibiotic mixture - Google Patents
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- CH629531A5 CH629531A5 CH1241376A CH1241376A CH629531A5 CH 629531 A5 CH629531 A5 CH 629531A5 CH 1241376 A CH1241376 A CH 1241376A CH 1241376 A CH1241376 A CH 1241376A CH 629531 A5 CH629531 A5 CH 629531A5
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum A-30912 Gemisches, welches die sieben einzelnen Faktoren A, B, C, D, E, Fund G enthält. Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Isolierung jedes dieser sieben Faktoren aus dem so erhaltenen Antibiotikum-Gemisch.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das neue Antibiotikum Gemisch hergestellt, indem man einen neuen Stamm des Organismuses Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer N RRL 8113 besitzt, in einem N ährmedium unter aeroben submersen Fermentationsbedingungen züchtet, und aus der Gärmaische das Antibiotikum A-30912 Gemisch isoliert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum A-30912 Gemisches, enthaltend die Faktoren A, B, C, D, E, F und G, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer NRRL 8113 besitzt, in einem Nährmedium, welches assimilierbare, Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter aeroben submersen Fermentationsbedingungen züchtet bis eine erhebliche antibiotische Aktivität erzeugt ist, und b) das Antibiotikum A-30912 Gemisch aus der Gärmaische abtrennt.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, gemäss dem aus dem so erhaltenen neuen Antibiotikum A-30912 Gemisch einer der Faktoren A oder B oder C oder D oder E oder F oder G isoliert wird.
Es ist also möglich aus dem nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten neuen Antibiotikum A-30912 Gemisch einen beliebigen der sieben Faktoren A bis einschliesslich G zu isolieren.
In der vorliegenden Beschreibung wird unter «Antibioti-kum-A-30912 Gemisch» ein antibiotisch wirksames Gemisch verstanden, welches die sieben Faktoren A, B, C, D, E, F und G enthält. Dieses Antibiotikum A-30912 Gemisch ist neu.
Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist es klar, dass bei einer Erzeugung eines Antibiotikum Gemisches durch Züchtung eines bestimmten Mikroorganismus das Mengenverhältnis der in dem Antibiotikum Gemisch enthaltenen einzelnen Faktoren zueinander von den angewandten Fermentationsbedingungen oder Züchtungsbedingungen abhängt.
Obwohl, wie bereits erwähnt wurde, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum A-30912 Gemisch neu ist, ist es möglich, dass einer oder mehrere der in dem Gemisch enthaltenen sieben Faktoren A, B, C, D, E, F oder G bereits in der Literatur beschrieben ist.
Wie bereits erwähnt wurde, wird im Schritt b) des erfindungsgemässen Verfahrens das Antibiotikum A-30912 Gemisch aus dem Zuchtmedium abgetrennt. Vorzugsweise erfolgt diese Abtrennung aus dem Fermentationsmedium indem man das erwünschte Antibiotikum A-30912 Gemisch mit s einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert.
Durch den neuen Mikroorganismusstamm Aspergillus rugulosus, der die Hinterlegungsnummer NRRL 8113 besitzt, wird auch die in der Literatur beschriebene Verbindung Sterig-matocystin erzeugt. Bei der Durchführung des erfindungsge-,0 mässen Verfahrens ist also im allgemeinen in dem Fermentationsmedium zusätzlich zu dem Antibiotikum A-30912 Gemisch auch Sterigmatocystin enthalten. In diesem Fall kann man das Sterigmatocystin entweder gesondert mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel aus dem Fermentationsmedium iso-15 lieren, oder es wird zusammen mit dem Antibiotikum A-30912 Gemisch mit einem polaren organischen Lösungsmittel aus dem Fermentationsmedium extrahiert. Im letzteren Fall kann dann das Sterigmatocystin von dem Antibiotikum A-30912 Gemisch dadurch abgetrennt werden, dass man den bei der so Extraktion erhaltenen Lösungsmittelextrakt einengt, das so gewonnene Konzentrat zu einem Überschuss eines nicht-pola-ren organischen Lösungsmittels zugibt, beispielsweise zu Di-äthyläther, wobei dann in diesem nicht-polaren Lösungsmittel das Antibiotikum A-30912 Gemisch ausfällt und der Nieder-25 schlag abgetrennt wird. Das als Nebenprodukt entstehende Sterigmatocysin kann aus dem Filtrat gewonnen werden. Das so erhaltene Antibiotikum A-30912 Gemisch kann, falls erwünscht, noch weiter gereinigt werden, beispielsweise indem man eine Säulenchromatographie durchführt.
3o Das neue nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antibiotikum A-30912 Gemisch und auch die in ihm enthaltenen einzelnen Faktoren A, B, C, D, E, F und G besitzen eine anti-fungale Wirkung.
Die Erfindung sei anhand der folgenden Beispiele und der 35 Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung sind die Infrarotabsorptionsspektren des Faktors A, bzw. B, bzw. C. bzw. D des Antibiotikum A-30912 Gemisches, aufgenommen in KBr-Schei-ben, dargestellt. In den Fig. 1 bis 4 gezeigte Infrarot-absorp-tionsspektren sind diejenigen der in der Folge angeführten Fak-« toren.
Fig. 1 - Antibioticum A-30912 Faktor A Fig. 2 - Antibioticum A-30912 Faktor D Fig. 3 - Antibioticum A-30912 Faktor B Fig. 4 - Antibioticum A-30912 Faktor C
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Antibioticum A-30912 Faktor A
A-30912 Faktor A steht dem Polypeptidantibioticum Echi-nocandin B (F. Benz et al., Helv. Chim. Acta Band 57, S. 2459-2477,1974) nahe.
so Anticioticum A-30912 Faktor A ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,52 %; H 7,29 %; N 8,68 %; O 27,09 %.
Für Antibioticum A-30912 Faktor A wird folgende empiri-55 sehe Formel vorgeschlagen: C51.53H79_s3N7O17.1g. Innerhalb dieses Bereichs entspricht die Elementaranalyse von A-30921 Faktor A besonders gut der empirischen Formel CsîHsiNvOis- H2O (ber.: C 56,24; H 7,54; N 8,84; O 27,39).
Antibioticum A-30912 Faktor A hat ein Molekulargewicht 60 von 1100, bestimmt durch Massenspektrometrie und Titration.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor A in KBr-Scheibe ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,97 (stark), 3,39 65 (mittelstark), 3,47 (schwach), 5,99 (stark), 6,10 (stark), 6,49 (mittelstark), 6,56 (mittelstark), 6,90 (mittelstark), 8,00 (schwach), 9,13 (schwach) und 11,77 (schwach) Mikron.
Die Ultraviolettabsorptionsspektren von Antibioticum
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A-30912 Faktor A in neutralem und in saurem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000), 275 nm (epsilon 3000) und 284 nm (Schulter, epsilon 2500). Das Ultraviolettspektrum von Faktor A in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 245 nm (epsilon 16 000) und 290 nm (epsilon 3000) und ausserdem Endabsorption.
Das magnetisch "C-Kernresonanzspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor A in perdeuteriertem Methanol zeigt folgende Charakteristika: delta 176,1,174,3,173,4,172,7,172,4, 169,8,158,4,132,8,130,9,129,6,129,0,116,2,77,0,75,7,74,4,71,3, 70,9,69,6,68,3,62,4,58,7,56,9,56,1,52,9,39,0,38,5,36,8,35,2,33,9, 32,9,32,6,30,7,30,4,30,2,28,2,27,0,26,5,23,6,20,1,19,6,14,4, und 11,3 ppm.
Antibioticum A-30912 Faktor A hat folgende Werte der spezifischen Drehung:
[alpha]D25 -44° (c 0,5, CHsOH),
[alpha]36525 -156° (c 0,5, CHaOH).
Die elektrometrische Titration von Antibioticum A-30912 Faktor A in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 12,8 (Anfangs-pH 6,9).
Die Aminosäureanalyse von Antibioticum A-30912 Faktor A nach dessen Hydrolyse zeigt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren.
Antibioticum A-30912 Faktor A ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Antibioticum A-30912 Faktor A ist ausserdem in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich.
A-30912 Faktor D
Antibioticum A-30912 Faktor D ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,37 %;, H 8,17 %; N 8,54 %; O (durch Differenz) 26,92 %.
Antibioticum A-30912 Faktor D hat ein Molekulargewicht von etwa 1100, aufgrund der Aminosäureanalyse und seiner engen Strukturbeziehung zu Antibioticum A-30912 Faktor A.
Das Infrarotabsorptionspektrum von Antibioticum A-30912 Faktor D in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,98 (stark), 3,31 (schwach), 3,36 (Schulter), 3,40 (mittelstark), 3,48 (schwach), 5,76 (schwach), 6,01 (stark), 6,10 (Schulter), 6,49 (mittelstark), 6,57 (mittelstark), 6,90 (mittelstark), 7,81 (schwach), 8,07 (schwach) und 9,16 (schwach) Mikron.
Die Ultraviolettabsorptionsspektren von Antibioticum A-30912 Faktor D in neutralem und saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 225 nm (epsilon 18 000) und 275 nm (epsilon 2500). Das UV-Spektrum von A-30912 Faktor D in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 240 nm (epsilon 11 000) und 290 nm (epsilon 3000).
Antibioticum A-30912 Faktor D hat den folgenden Wert der spezifischen Drehung:
[alpha]D25 -50° (c 0,34, CHaOH).
Die Aminosäureanalyse von Antibioticum A-30912 Faktor D nach dessen Hydrolyse ergibt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin, Histidin und drei anderen noch nicht identifizierten Aminosäuren. Eine der noch nicht identifizierten Aminosäuren von A-30912 Faktor D ist mit einer der noch nicht identifizierten Aminosäuren von Antibioticum A-30912 Faktor A identisch.
Antibioticum A-30912 Faktor D ist in einer Reihe verschiedener organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich,
aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Antibioticum A-30912 Faktor D ist in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich.
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A-30912 Faktor B
Antibioticum A-30912 Faktor B ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 57,36 %; H 5,92 %; N 8,75 %; O io 26,19%.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912 Faktor B in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima zu beobachten : 2,99,3,41,3,49,6,06,6,15,6,54,6,61, 15 6,94,7,62,8,07,9,26 und 9,39 Mikron.
Die Ultraviolettabsorptionsspektren von A-30912 Faktor B in neutralem und in saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 223 nm (Schulter, epsilon 16 000) und 278 nm (epsilon 2400). Das Ultraviolettspektrum von Antibioticum A-30912 20 Faktor B in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 242 nm (epsilon 13 900) und 292 nm (epsilon 2800).
A-30912 Faktor B hat folgende Werte der spezifischen Drehung:
[alpha]D25 -47° (c 0,5, CHsOH)
25 [alpha]36525 — 170° (c 0,5, CH3OH).
Die elektrometrische Titration von A-30912 Faktor B in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid ergibt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von etwa 13,0 (Anfangs-pH 7,91).
30 Die Aminosäureanalyse von A-30912 Faktor B nach üblicher Säurehydrolyse zeigt das Vorliegen von Threonin, Hydroxyprolin und mehreren noch nicht identifizierten Aminosäuren.
A-30912 Faktor B ist in einer Reihe verschiedener organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylform-35 amid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Ausserdem ist A-30912 Faktor B in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich.
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A-30912 Faktor C
Antibioticum A-30912 Faktor C ist eine weisse amorphe Festsubstanz, deren Elementaranalyse folgende prozentuale Zusammensetzung ergibt: C 56,76 %; H 7,88 %; N 10,61 %; O 45 25,09%.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912 Faktor C in einer KBr-Scheibe ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es sind folgende charakteristische Absorptionsmaxima zu beobachten: 2,98,3,39,3,43,3,51,6,01,6,12,6,47,6,90, 50 7,04,7,22,7,38,8,00,8,30 und 9,13 Mikron.
Die Ultraviolettabsorptionsspektren von A-30912 Faktor C in neutralem und in saurem Methanol zeigen Absorptionsmaxima bei 223 nm (Schulter, epsilon 7300) und 275 nm (epsilon 1350). Das Ultraviolettspektrum von Antibioticum A-30912 55 Faktor C in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 240 nm (epsilon 12 400) und 290 nm (epsilon 5200).
A-30912 Faktor C hat folgende Werte der spezifischen Drehung:
[alpha]D25 -33° (c 0,5, CH3OH)
60 [alpha]36525 -1 19° (c 0,5, CH3OH).
Die elektrometrische Titration von A-30912 Faktor C in 66prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorhandensein einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von etwa 13,08 (Anfangs-pH 7,93).
65 Die Aminosäureanalyse von A-30912 Faktor C ergibt nach üblicher Säurehydrolyse das Vorhandensein von Threonin, Hydroxyprolin und mehreren noch nicht identifizierten Aminosäuren.
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A-30912 Faktor C ist in einer Reihe von organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Äthylacetat löslich aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diäthyläther und Petroläther, unlöslich. A-30912 Faktor C ist auch in wässrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0 löslich.
Die sieben einzelnen Faktoren des Antibioticum A-30912-Gemisches können abgetrennt und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) indentifiziert werden. Kieselsäuregel ist ein bevorzugtes Adsorbens und Benzol Methanol (7:3, Vol.:Vol.) ist ein bevorzugtes Lösungsmittelsystem.
Die Rf-Werte der Antibioticum A-30912 Faktoren A bis G bei der TLC unter Verwendung von Kieselsäuregel (Merck, Darmstadt) und BenzokMethanol (7:3) als Lösungsmittelsystem sowie von Candida albicans zur Bioautographie sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt:
Tabelle I
Antibioticum A-30912 Faktor
RfWert
A B C D E F G
0,35 0,45 0,54 0,59 0,27 0,18 0,13
Die RfWerte von Anticioticum A-30912 Faktor A in verschiedenen papierchromatographischen Systemen wiederum unter Verwendung von Candida albicans als Feststellungsorganismus sind in Tabelle 11 angegeben.
Tabelle II
A-30912 Faktor A
RpWert
Lösungsmittel
0,76
mit Wasser gesättigtes Butanol
0,69
mit Wasser plus 2%
p-Toluolsulfonsäure gesättiges
Butanol
0,75
Methanol:0,ln HCl (3:1)
0,17
Butanol :ÄthanoI : Wasser
(13,5:15:150)
0,78
Methanol:0,05 m Natriumeitrat von
pH 5,7 (7:3); Papier mit 0,05 m
Natriumeitrat von pH 5,7 gepuffert
Der zur Herstellung des Antibioticum A-30912-Gemisches geeignete Organismus wurde aus einer Bodenprobe aus den Ruinen von Pompeii, Italien, isoliert. Der A-30912 erzeugende Organismus wird klassifiziert als ein Stamm von Aspergillus rugulosus Thom and Raper, in der Aspergillus nidulans Form-Gruppe. Diese Klassifizierung beruht auf der Beschreibung von K.B. Raper und D.I. Fennel in «The Genus Aspergillus» The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., 1965.
Farbnamen wurden zugeordnet entsprechend der ISCC-NBS Methode (K.L. Kelly und D.B. Judd, «The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Names», U.S. Dept. of Commerce, Circ. 553, Washington, D.C., 1955). Die Maerz und Paul Farbblöcke sind von A. Maerz und M.R. Paul in «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Company, New York, N.Y., 1950, beschrieben.
Wenn nichts anderes angegeben, werden die Kulturen bei 25 °C gezüchtet.
Kulturcharakteristika von A. rugulosus NRRL 8113 Czapek-Lösung-Agar
Die Kultur wächst langsam und erreicht in 15 Tagen bei 25 °C einen Durchmesser von 1,5 bis 2,0 cm. Die Oberfläche der Kolonie ist konvex und samtig, wird mit dem Alter nahe dem Mittelpunkt runzelig und dann vorgewölbt. Der äussere Mycel-rand besteht aus einem 2 mm starken Band tiefeingetauchter farbloser Hyphen und ist gebuchtet. Auf den Lufthyphen am Rand bildet sich ein rosabraunes Exudat. In der Zeit von 7 bis io 14 Tagen wird in dem die Kolonie umgebenden Agar ein blasspurpurfarbenes flüssiges Pigment gebildet. Nach 15 Tagen diffundiert das Pigment durch die gesamte Kolonie.
Nach 5 Tagen reicht die Farbe der Oberfläche der Kolonie von weiss bis lederfarben, und die Kolonierückseite ist bräun-i5 lich-òrange im mittleren Teil und bräunlich bis bräunlich-pur-purfarben in den äusseren Bereichen. In 10 Tagen wird die Kolonie mässig gelblich-rosa (ISCC-NBS 29 und Maerz und Paul 1 l-A-7). Nach 14 Tagen ist die Kolonie hellgräulich-rot (ISCC-NBS 18 und Maerz und Paul 4-G-7). Der Randbereich so wird infolge von Conidienbildung mit kleinen Warzen bedeckt und ist kräftig gelb (ISCC-NBS 84 und Maerz und Paul 10-L-5). Verstreute stumpfgelbliche Büschel von Hüllzellen treten in willkürlicher Verteilung an der Oberfläche und entlang dem Rand der Kolonie auf. Mit dem Alter werden die kräftig gelben 25 Flecken und Randbereiche gelblich-grün. Nach drei Wochen ist in den neuen Luftbestandteilen des Randes ein orange-purpurfarbener Ton zu beobachten. Die Kolonierückseite ist anfänglich schwach konkav, flacht sich mit dem Reifen auf die Agar-oberfläche ab und wird etwas runzelig. Nach 10 Tagen ist die 30 Rückseite schwach braun (ISCC-NBS 57 und Maerz und Paul 5-A-10) und nach 15 Tagen gräulich-rot (ISCC-NBS 19 und Maerz und Paul 6-J-3).
Der conidiogene Zustand ist spärlich. Conidiophoren sind über die Oberfläche zerstreut und treten manchmal als Flecken 35 oder in einem Band nahe dem Rand auf. Conidialköpfe sind zunächst lose strahlenförmig und kugelförmig. Mit dem Altern können sie sich als kurze säulenärtige Formen entwickeln, die kompakter sind. Kugelartige Köpfe haben einen Durchmesser von 70 bis 80 u und sind im Mittel 50 |i. Säulenförmige Köpfe 40 können bis zu 140 jj, lang und 70 (i. dick sein.
Die Conidien sind kugelförmig bis weniger als kugelartig, leicht gerunzelt und grünlich-gold in der Masse. Der Durchmesser beträgt 2,8 bis 3,9 jj., im Mittel 3,2 jj..
Sterigmata sind in zwei Reihen angeordnet und farblos. Pri-45 märe Sterigmata haben eine Länge von 4,7 bis 11,0 p, im Mittel 7,9 [i. An ihrer dicksten Stelle sind sie 2,4 |_i und laufen auf 1,6 jx zu. Sekundäre Sterigmata können einzeln oder in Paaren vorkommen, gehen aus den primären hervor und sind flaschenför-mig. An ihrer dicksten Stelle messen sie 3,0 ja. und laufen apical auf 0,4 u zu, wo sie rohrförmig werden. Die rohrförmige Spitze ist 1,2 p. lang. Die Gesamtlänge beträgt von 5,5 bis 12,6 u, im Mittel 9,2 ji.
Bläschen sind kugelförmig bis unterkugelartig oder halbkugelförmig und können an der Spitze abgeflacht sein, wobei sie mit dem Alter bräunlich werden. Der Durchmesser reicht von 7,4 bis 11,2 n und beträgt im Mittel 9,4 n.
Conidiophoren sind glatt, verhältnismässig dickwandig und zunächst glasig durchsichtig und werden dann hellzimtbraun. Bei den Bläschen sind sie etwas dicker, und sie können sich 60 nahe der Fusszelle leicht zuspitzen. Die durchschnittliche Dicke beträgt 5,9 (i. Conidiophoren haben eine Länge von 47,7 bis 166,6 ji, im Durchschnitt 106 p.. Sie geben von eingetauchten Hyphen oder seitlich von Lufthyphenfäden aus. Der ascogene Zustand tritt bis zu 20 Tage auf. Die kleinen gelblichen Büschel es von Hüllzellen, die auf der Oberfläche erscheinen, können auch innerhalb des Mycels an beliebigen Stellen vorkommen. Sie bestehen aus Hüllzellen, die ein oder mehr Kleistothecia einhüllen. Hüllzellen sind kugelförmig bis unterkugelartig oder oval
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bis länglich, sind dickwandig und durchsichtig. Kugelförmige Hüllzellen haben einen Durchmesser von 18 bis 24 ja., im Durchschnitt 21,8 n.
Kleistothecia sind kugelförmig bis unterkugelartig, dickwandig, relativ zäh und faserig. Zunächst relativ farblos, werden sie rötlich-purpurfarben und dunkel mit dem Alter. Der Durchmesser misst von 165 bis 470 p, im Durchschnitt 275 jx.
Malzextraktagar
Bei 25 °C gezüchtete Kolonien expandieren rasch und erreichen in 10 bis 12 Tagen 4 bis 5 cm. Zunächst gräulich weiss, werden die Kolonien in 4 Tagen olivgrün (ISCC-NBS 90 und Maerz und Paul 23-E-6). Der eingebuchtete schwach gelappte äussere Rand besteht aus dichtgepackten kurzen weissen Luft-hyphen. Kleine gelbliche Büschel von Hüllzellen erscheinen als Punkte am Rand und sind willkürlich über die filzartige Agar-oberfläche verstreut. Nach 20 Tagen neigen diese Hüllzellenbüschel zum Verkrusten eines grossen Teils der Oberfläche. Die Unterseite der Kolonie ist gräulich-gelb (ISCC-NBS 90 und Maerz und Paul 11-B-l).
Der ascogene Zustand erscheint in 15 Tagen. Die kleinen gelblichen Büschel von Hüllzellen, die auf der Oberfläche auftreten, kommen auch innerhalb des Mycels an beliebigen Stellen vor. Sie bestehen aus Hüllzellen, die ein oder mehr Kleistothecia einhüllen. Hüllzellen können grosse Gebiete über den Conidienköpfen verkrusten. Sie sind kugelförmig bis unterkugelartig oder oval bis länglich, sind dickwandig und durchsichtig. Kugelförmige Hüllzellen haben einen Durchmesser von 18 bis 24 |x, im Durchschnitt 21,8 p..
Kleistothecia sind kugelförmig bis unterkugelartig und dun-kelrötlichbraun. Sie haben einen Durchmesser von 389 bis 700 H-, im Durchschnitt 506 p.
Asci sind zerbrechlich, durchsichtig und unterkugelartig bis oval. Unterkugelartige Asci haben einen Durchmesser von 8,7 bis 11,9 p, im Durchschnitt 10,3 p. Ovale Asci haben Abmessungen von 10,3 bis 14,2 p. x 8,7 bis 10,3 p, im Durchschnitt 12,2 x 9,1 p.
Ascosporen sind rotorangefarben, leicht gerunzelt, mit zwei parallelen feingefalteten äquatorialen Erhebungen, die 0,8 p breit und ungebrochen sind. Über die lange Achse erscheinen die Ascosporen linsenförmig. Wenn die Erhebung peripher ist, sind die Ascosporen kugelförmig. In der Kugelformaufsicht haben sie einen Durchmesser von 4,9 bis 6,3 jx, im Durchschnitt 5,4 jl
Zwei Charakterika des Antibioticum A-30912 erzeugenden Stamms von Aspergillus rugulosus sind von den Charakteristika des von Raper und Fennel (a.a.O.) beschriebenen A. rugulosus verschieden. Der A-30912 erzeugende Stamm hat grössere Conidienköpfe und Ascosporen.
Eine Aspergillus rugulosus Kultur, die sich für die Erzeugung des antibiotisch wirksamen A-30912-Gemisches eignet, wurde am 22. September 1975 beim Agricultural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratori Peoria, Illinois 61604, mit der Nummer NRRL 8113 hinterlegt. Proben des hinterlegten Stammes sind der Allgemeinheit zugänglich.
Für die Züchtung von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 können mehrere verschiedene Nährmedien verwendet werden. Im Hinblick auf eine wirtschaftliche Erzeugung, optimale Ausbeuten und Einfachheit der Produktisolierung sind jedoch bestimmte Nährmedien bevorzugt. So ist beispielsweise Glucose eine bevorzugte Kohlehydrat liefernde Substanz bei Fermentationen in grossem Massstab, doch können auch Melasse, Stärke, Latose, Saccharose, Maltose, Glycerin und dergleichen verwendet werden. Bevorzugte Stickstoffquellen sind enzym-hydrolysiertes Casein und lösliches Fleischpepton, doch können auch Korndestillatrückstände, Mononatriumglutamat und
ähnliche Stoffe verwendet werden. Anorganische Salze können in das Nährmedium aufgenommen werden; hierzu gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlor-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und der-5 gleichen Ionen zu liefern vermögen.
Das Nährmedium soll auch essentielle Spurenelemente enthalten, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus nötig sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Me-io diums in Mengen vor, die den Wachstumsanforderungen des Organismus genügen.
Bei Fermentationen in grossem Massstab kann es nötig sein, kleine Mengen (zum Beispiel 0,2 ml/1) eines Entschäumers, wie Polypropylenglycol, zuzusetzen, wenn das Schäumen zu 15 Schwierigkeiten führt.
Für die Erzeugung beträchtlicher Mengen des Antibioticum A-30912-Gemischs wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen des Antibioticum A-30912-Gemischs können durch Schüttelkolbenkultur erhal-20 ten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung des Beginns der Antibioticumerzeugung, die beim Beimpfen von grossen Tanks mit der Sporenform des Organismus gewöhnlich eintritt, ist die Verwendung eines vegetativen Inokulums bevorzugt. Das vegetative Inokulum wird durch Inokulieren eines kleinen 25 Volumens Nährmedium mit der Sporenform oder Mycelfrag-menten des Organismus zubereitet, wodurch eine frische gut wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen grossen Tank überführt. Das für die Züchtung des vegetativen Inokulums verwendete 30 Medium kann das gleiche sein wie das für grössere Fermentationen verwendete, doch können auch andere Medien verwendet werden. Der Antibioticum A-30912 erzeugende Organismus kann bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 43 °C gezüchtet werden, und er wächst gut bei Temperaturen von 35 etwa 25 bis 30 °C. Eine optimale Erzeugung des Antibioticum A-30912-Gemisches erfolgt offensichtlich bei einer Temperatur von etwa 25 °C.
Wie bei aeroben Submers-Züchtungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Nährmedium geblasen. Im Interesse einer 40 wirksamen Antibioticumerzeugung liegt das bei der Tankproduktion angewandte Luftvolumen vorzugsweise über 0,4 Volumina Luft pro Volumen des Nährmediums und Minute (V/V/M).
Die Bildung des Antibioticum A-30912-Gemisches kann während der Fermentation in der Weise verfolgt werden, dass 45 Proben von alkoholischen Extrakten der Gärmaischen gegen einen Organismus, dessen Empfindlichkeit gegenüber den A-30912-Antibiotica bekannt ist, auf antibiotische Aktivität geprüft werden. Ein Probeorganismus, der sich für die Prüfung auf Vorliegen der Antibioticum A-30912-Mischung eignet, ist so Candida albicans. Die Bioprobe wird zweckmässigerweise durch Papierscheibenproben auf besamten Agarplatten durchgeführt.
Im allgemeinen kann eine antibiotische Aktivität am zweiten Tag der Fermentation nachgewiesen werden. Das Maxi-55 mum der Bildung von antibiotischer Aktivität tritt gewöhnlich zwischen etwa dem dritten und sechsten Tag auf.
Die Antibioticum A-30912-Faktoren sind antifungaie Mittel. Die antifungaie Wirkung der Antibioticum A-30912-Faktoren wird durch in-vitro-Tests mit Antibioticum A-30912 Faktor A 60 und D veranschaulicht. Diese Tests sind in Tabelle III zusammengestellt. Die antifungaie Wirkung wurde durch die herkömmliche Scheibendiffusionsmethode bestimmt (6 mm Bäusche werden in Lösungen getaucht, die die zu prüfende Verbindung enthalten. Die Bäusche werden auf Agarplatten aufge-65 bracht, die mit dem Testorganismus besamt sind). Die Ergebnisse sind als minimale inhibierende Konzentration (MIC) je Scheibe, in welcher die geprüfte Verbindung den Testorganismus inhibiert, angegeben.
629531
6
Tabelle III
A-30912 Faktor A ist bei in-vitro-Scheibendiffusionstests gegen Dermatophytes sehr wirksam. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV A-30912 Faktor A gegen Dermatophytes
Test-Organismus
MIC (mcg/Scheibe)
Antibioticum
Antibioticum
A-30912
A-30912
Faktor A
Faktor D
Candida albicans
0,625
0,5
Trichophyton
mentagrophytes
0,078
0,07
bioticum A-30912-Faktors hängt von mehreren Bedingungen ab, zum Beispiel der Art und Schwere der jeweiligen Infektion.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
5
Beispiel 1
A. Schüttelkolbenfermentation
Eine Kultur von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 wird auf Schrägagar der folgenden Zusammensetzung bereitet und io erhalten:
Bestandteil
Menge (%)
Anzahl der
MIC
Dermatophytes
Isolate
(mcg/Scheibe)
Trichophyton mentagrophytes
13
1,25-0,039
Trichophyton gallinae
1
>1,25
Trichophyton meginini
1
0,0195
Trichophyton quinckeanum
1
>1,25
Trichophyton rubrum
1
<0,0098
Trichophyton schoenceinii
1
0,0195
Trichophyton terrestre
1
0,0195
Trichophyton tonsurans
9
>1,25-0,156
Microsporium gypseum
5
0,156-0,038
Microsporium audouinii
4
1,25-0,156
Microsporium canis
6
1,25-0,0098
Microsporium cookei
2
1,25-0,0195
Nannizzia incurvata
1
0,312
Phalaphere jean salemi
1
>1,25
Epidermatophyton floccosum
1
1,25
Geotrichum candidum
4
>1,25-0,156
Keratinomyces ajellio
1
0,156
20
Dextrin 1,0000 Enzymatisches Hydrolysat von Casein* 0,2000
Hefeextrakt 0,1000
Fleischextrakt 0,1000
KCl 0,0200
MgSCWHîO 0,0200
FeSCWHîO 0,0004
Wasser 98,5596
25 * N-Z-Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.
Die Schräge wird mit Aspergillus rugulosus NRRL 8113 inokuliert und danach etwa 7 Tage bei 25 °C inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit Rinderserum bedeckt und zum Lösen 30 der Sporen mit einer sterilen Schlinge abgeschabt. Die Hälfte der erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:
Die antifungaie Wirkung der Antibioticum A-30912-Fakto-ren wird auch durch in-vivo-Tests nachgewiesen. Diese in-vivo-Tests werden in folgender Art und Weise durchgeführt: Drei Dosen der Testverbindung werden an mit Candida albicans infizierte Mäuse 0,4 und 24 Stunden nach der Infektion verabreicht. Der mit der Testverbindung erzielte Schutz wird als EDso-Wert ermittelt (die wirksame Dosis in mg/kg, die zu einem Schutz von 50% der Mäuse führt; vgl. W. Wiek et al., J. Bacte-riol. Bd. 81, S. 233-235, (1961). Die ED50-Werte für Antibioticum A-30912 Faktor A gegen Candida albicans bei Mäusen betragen 30 mg/kg (intraperitoneal) und 50 mg/kg (subkutan). Der EDso-Wert für Antibioticum A-30912 Faktor D gegen Candida albicans bei Mäusen beträgt 33 mg/kg (subkutan).
Es treten keinerlei Anzeichen einer akuten Toxizität auf, wenn das Antibioticum A-30912 Faktor A intraperitoneal (ip) oder subkutan (sc) an Mäuse in einer Dosis von 100 mg/kg zweimal täglich drei Tage lang verabreicht wird (insgesamt 600 mg/ kg). Auch dann werden keinerlei Anzeichen akuter Toxizität beobachtet, wenn Antibioticum A-30912 Faktor A dreimal am Tag in einer Dosis von 200 mg/kg (Gesamtdosis 600 mg/kg) ip an Mäuse verabreicht wird.
Bei sc-Verabreichung von Antibioticum A-30912 Faktor D an Mäuse dreimal pro Tag in einer Dosis von je 14 mg/kg (Gesamtdosis 42 mg/kg) sind keine Anzeichen akuter Toxizität zu beobachten.
Wenn sie als antifungaie Mittel verwendet werden, werden die Antibioticum A-30912-Faktoren parenteral und gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Die Dosierung des Anti-
40
45
Bestandteil
Menge (%)
Saccharose
2,5
Melasse
3,6
Maisquellwasser
0,6
Enzymatisches Hydrolysat von Casein*
1,0
K2HPO4
0,2
Wasser
92,1
* N-Z-Case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.
Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 250 ml Erlenmeyer-Weithalskolben bei 25 °C 24 Stunden auf einem 50 Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen von 5 cm Durchmesser rotiert.
Dieses inkubierte vegetative Medium kann direkt zum Inokulieren des vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann es für eine spätere Verwen-55 dung aufgehoben werden, was bevorzugt ist, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff hält. Für eine derartige Aufbewahrung wird die Kultur folgendermassen in viele kleine Phiolen eingebracht: In jede Phiole werden 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lac-60 tose-Lösung folgender Zusammensetzung eingebracht:
Bestandteil
Menge
Glycerin
20%
Lactose
10%
entionisiertes Wasser
70%
7
629531
Die so hergestellten Suspensionen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
1 ml einer so hergestellten und gelagerten Suspension wird zum Inokulieren von 50 ml vegetativen Mediums der ersten Stufe mit der oben angegebenen Zusammensetzung verwendet. Dann wird das inokulierte Medium in einem 250 ml-Erlen-meyer-Weithalskolben 22 Stunden bei 25 °C auf einem Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm rotiert.
B. T ankfermentation
Zur Erzielung eines grossen Volumens an Inokulum werden 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums der ersten Stufe zum Inokulieren von 400 ml vegetativem Medium der zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben 25 Stunden bei 25 °C auf einem Schüttler inkubiert, der mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm rotiert.
800 ml des inkubierten vegetativen Mediums der zweiten Stufe, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, werden zum Inokulieren von 100 Litern sterilem Produktionsmedium folgende Zusammensetzung verwendet:
Bestandteil
Menge
Glucose
25 g/Liter
Stärke
10g/LIter
Pepton*
10g/LIter
Blackstrap Melasse
5 g/Liter
Enzymatisches Hydrolysat von
Casein**
4 g/Liter
MgSCWHîO
0,5 g/Liter
Czapek Mineralmischung***
2,0 ml/Liter
CaCCb
2,0 g/Liter entionisiertes Wasser, auf
1 Liter
*W.P. No. 159, Inolex Biomedicai Corp., Glenwood, III. **N-Z Amine A, Shefield Chemical Co., Norwich, N.Y. ***Czapek Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteil
Menge
FeS04- 7H2O (gelöst in 2 ml konz. HCl) 2 g
KCl 100 g
MgSCWHzO 100 g entionisiertes Wasser, auf 1 Liter
Nach dem Sterilisieren durch 30minütige Behandlung in einem Autoklaven bei 121 °C und einem Druck von etwa 1,1 bis 1,25 atü liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,8. Man lässt das inokulierte Produktionsmedium in einem 165-Liter-Fermenta-tionstank bei einer Temperatur von 25 °C 4 Tage lang fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einem Verhältnis von 0,5 V/V/M belüftet und mit einem herkömmlichen Rührer bei 300 Umdrehungen/Minute gerührt.
Beispiel 2
Abtrennung des Antibioticum A-30912-Gemisches
200 ml der wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen Gesamtgärmaische werden mit 200 ml Methanol eine Stunde lang gründlich verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-Cel, Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird durch Zugabe von 5 n HCl auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 4 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird zu etwa 60 Liter Diäthyläther gegeben, wodurch das A-30912-Gemisch ausfällt. Der Niederschlag wird durch Abfiltrieren gewonnen und getrocknet, und man erhält 38 g des Antibioticum A-30912-Gemisches als grauer Pulver. Durch Einengen des Filtrats im Vakuum erhält man ein öl, das in 500 ml Methanol gelöst wird. Die Methanollösung wird zu 7,5 Liter Diäthyläther gegeben, wodurch weiteres Antibioticum A-30912-Gemisch ausfällt. Dieser Niederschlag wird gleichfalls abfiltriert und getrocknet, wodurch weitere 3,5 g des Anitioticum 15 A-30912-Gemisches erhalten werden.
Beispiel 3
Isolierung von Antibioticum A-30912 Faktor A
20 g des wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen Antibioti-20 cum A-30912-Gemisches werden auf eine Kieselgelsäule (4x 107 cm, Woelm) in Acetonitril .-Wasser (95:5) aufgegeben. Die Säule wird mit AcetonitrihWasser (95:5) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 bis 2 ml/Minuten eluiert, wobei Fraktionen von jeweils etwa 20 ml aufgefangen werden. Die 25 Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und des AcetonitrihWasser (95:5) Lösungsmittelsystems und Bioautographie mit Candica albicans geprüft.
Die Fraktionen 74 bis 125 werden vereinigt und eingeengt. 30 Aus der konzentrierten Lösung fallen beim Stehenlassen Kristalle aus, durch deren Abtrennung 124 mg Sterigmatocystin erhalten werden. Die Fraktionen 212 bis 273 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, bis ein öl erhalten wird. Dieses öl wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst und dann zu 15 35 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet und liefert 23 mg Antibioticum A-30912 Faktor D. Die Fraktionen 274 bis 437 enthalten die Antibioticum A-30912 Faktoren A, B, C und D. Die Fraktionen 482 bis 900 enthalten die Antibioticum A-30912 Faktoren A, E, 40 F und G. Die Fraktionen 438 bis 481 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst und dann zu 15 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet und ergibt 2,17 g Antibioticum A-30912 45 Faktor A.
Beispiel 4
Isolierung von Antibioticum A-30912 Faktor D
Ein teilweise gereinigtes Antibioticum A-30912-Gemisch, 50 das die Antibioticum A-30912 Faktoren B, C und D enthält,
wird wie in Beispiel 3 im Zusammenhang mit den Fraktionen 274 bis 437 beschrieben, erhalten. 750 mg dieses Materials werden an einer Kieselsäuregelsäule (2,2x51 cm, Woelm) Chromatographien, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 15 55 ml aufgefangen werden. Das Eluieren erfolgt mit folgenden Lösungsmitteln:
Fraktionen
Lösungsmittel
1-25
Acetonitril
26-62
Acetonitril + 1% Wasser
63-700
Acetonitril + 1,5% Wasser
65
Die aus der Säule austretenden Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäuregel und AcetonitrihWasser (95:5) sowie Benzol:Methanol
629531
8
(7:3) als Lösungsmittelsysteme und Bioautographie mit Candida albicans überprüft. Die Fraktionen 535 bis 685 enthalten Antibioticum A-30912 Faktor D, und werden vereinigt und im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und dann zu 15 Volumina Diäthyläther gegeben. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet und ergibt 69 mg Antibioticum A-30912 Faktor D.
Beispiel 5
Isolierung der Antibioticum A-30912 Faktoren B und C
Ein teilweise gereinigtes A-30912-Antibioticumgemisch, das die A-30912-Faktoren A, B, C und E enthält, wird wie in Beispiel 3 für die Fraktionen 212 bis 437 beschrieben, erhalten. 18 g dieses Materials werden in einem möglichst kleine Volumen Ace-tontrikWasser (4:1) gelöst und an einer Aluminiumoxydsäule (3,8x56 cm, Woelm) chromatographiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 20 ml aufgefangen werden. Die Säule wird mit folgenden Lösungsmitteln eluiert:
Fraktionen
Gewicht (g)
Faktor
6-28
0,23*
6-28
5,80
A-30912 C,D
34-114
2,90
A-30912 B
115-164
1,20
A-30912 A,B
165-509
1,90
A-30912 A
10
Fraktionen
Lösungsmittel
1-300 Acetonitril:Wasser(4:l) 301:509 AcetonitrikWasser (7:3)
20
25
Die erhaltenen Fraktionen werden durch die in Beispiel 4 beschriebene Dünnschichtchromatographie überwacht. Auf der Grundlage der dabei erhaltenen Ergebnisse werden die 30 Fraktionen vereinigt und bis zu einem Öl eingeengt. Die öligen Rückstände werden in kleinen Volumina Methanol gelöst,
worauf mit 10 bis 15 Volumina Diäthyläther gefällt wird. Die Art der Vereinigung der Fraktionen, das jeweils erhaltene Gewicht und der Faktorgehalt der vereinigten Fraktionen sind im fol- 35 genden zusammengestellt:
* Unlösliches Material vor Ätherfällung.
Zur Erzielung von gereinigtem A-30912 Faktor C werden 2 g der Festsubstanz der Fraktionen 6 bis 28 in Methanol gelöst, an einer ausreichenden Menge Kieselsäuregel (Sorte 62) adsorbiert,und nachTrocknen auf eine Kieselsäuregelsäule (1,9x80 cm, Sorte 62, in Acetonitrit) aufgegeben. Die Säule wird mit Acetonitril mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/ Minute eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von etwa 10 ml aufgefangen werden. Bei Fraktion 117 wird das Lösungsmittel gewechselt und AcetonitrikWasser (99:1) verwendet. Die aus der Säule austretenden Fraktionen werden wiederum mit Dünnschichtchromatographie überwacht. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie werden Fraktionen vereinigt und bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Der ölige Rückstand wird in einem kleinen Volumen Methanol gelöst, worauf mit 10 bis 15 Volumina Diäthyläther gefällt wird. Die Gewichtsmengen und der Faktorgehalt der interessanten Fraktionen sind im folgenden zusammengestellt:
Fraktionen
Gewicht, g
Faktor
341-479
0,250
D
480-540
0,015
D
541-899
0,391
C, D
900-1675
0,340
C
G
2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikum A-30912 Gemisches, enthaltend die Faktoren A, B, C, D, E, F und G, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Aspergillus rugu-Iosus, der die Hinterlegungsnummer NRRL 8113 besitzt, in einem Nährmedium, welches assimilierbare, Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthält, unter aeroben submersen Fermentationsbedingungen züchtet bis eine erhebliche antibiotische Aktivität erzeugt ist, und b) das Antibiotikum A-30912 Gemisch aus der Gärmaische abtrennt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem neuen Antibiotikum A-30912 Gemisch einen der Faktoren A oder B oder C oder D oder E oder F oder G isoliert.
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