PL103996B1 - Sposob wytwarzania nowej mieszaniny antybiotycznej a-30912 - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowej mieszaniny antybiotycznej A-30912, za¬ wierajacej co najmniej 7 pojedynczych czynni¬ ków oznaczonych A, B, C, D, E, F i G.

Mieszanine antybiotyczna A-30912 wytwarza sie w czasie hodowli nowego szczepu Aspergillus ru- gulosus NRRL 8113. Okreslenie „mieszanina anty¬ biotyczna" odnosi sie do mieszaniny jednoczesnie produkowanych pojedynczych czynników antybio- tycznych. Jak wiadomo specjalistom zajmujacym sie procesami biosyntezy antybiotyków, stosunek poszczególnych czynników produkowanych w mie¬ szaninie antybiotycznej jest zalezny od stosowa¬ nych warunków fermentacji. Poszczególne czynni¬ ki antybiotyczme antybiotyku A-30912, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, oznaczono jako czj^n- nik A, B, C, D, E, F i G.

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wy¬ twarzania i oddzielania nowej mieszaniny anty¬ biotycznej A-30912, zawierajacej czynniki A, B, C, D, E, F i G oraz wyodrejbniania czynników A, B, C, D, E, F i G z tej mieszaniny.

Sposób wytwarzania mieszaniny antybiotycznej A-30912, zawierajacej czynniki A, B, C, D, E, F i G, wedlug wynalazku polega ma tym, ze pro¬ wadzi sie hodowle podpowierzchniowa z napo¬ wietrzaniem szczepu Aspergillus rugulosus NRRL 8113 w pozywce hodowlanej, zawierajacej przyswa¬ jalne zródla weglowodanów, azotu oraz sole nie¬ organiczne, az do momentu osiagniecia znacznej aktywnosci antybiotycznej. Nastepnie mieszanine antybiotyczna A-30912 ewentualnie oddziela sie od pozywki i w razie potrzeby z mieszaniny antybio¬ tycznej A- 30912 wyodrebnia sie poszczególne czyn- niki antybiotyczne A-30912, oznaczone A, B, C, D, E, F lub G. Mieszanine antybiotyczna ekstra¬ huje sie iz (brzeczki fermentacyjnej za pomoca po¬ larnych rozpuszczalników organicznych.

Szczep Aspergillus rugulosus NRRL 8113 wy- twarza takze znany zwiazek — sterigmatocystyiiie.

Sterigmatocystyne ekstrahuje sie, albo oddzielnie, za pomoca niepolarnego rozpuszczalnika organicz¬ nego, albo razem z antybiotyczna mieszanina A-30912 za pomoca polarnych rozpuszczalników organicznych. W drugim przypadku sterigmatocy¬ styne oddziela sie od mieszaniny antybiotycznej A-30912 przez zatezenie ekstraktu, który nastepnie miesza sie z nadmiarem niepolarnego rozpuszczal¬ nika, takiego jak eter dwuetylowy, wytracajac mieszanine antybiotyczna A-30912. Sterigmatocy¬ styne oddziela sie z przesaczu, po czym prowadzi sie dalsze oczyszczanie mieszaniny antybiotycznej A-30912 metoda chromatografii kolumnowej. Mie¬ szanina antybiotyczna A-30912, jak równiez jej poszczególne czynniki A-#091(2 isa srodkami zwal¬ czajacymi grzyby. Widma absorpcji w podczer¬ wieni nizej podanych czynników A-30912, w KBr, przedstawiaja zalaczone rysunki, z których fig. .,1 odpowiada czynnikowi A antybiotyku A-30912, fig. 2 czynnikowi D antybiotyku A-30912, fig. ,3 103 ^96103 996 3 czynnikowi B antybiotyku A-30912, a fig. 4 czyn¬ nikowi C antybiotyku A-30912.

Czynnik A antybiotyku A-30912 jest podobny do polipeptydowego antybiotyku o nazw7ie Echinc- candin B, opisanego ostatnio przez F. Benza i wspólpracowników w Helvetioa Chimica Acta 57, 2459-2477 (1974). Czynnik ten stanowi bialy bez¬ postaciowy proszek. Analiza elementarna czynnika A antybiotyku A-30912 wykazala nastepujacy sklad procentowy: C 56,28%, H 7,29%, N 8,68% > O 27,09%.

Przyblizony wzór empiryczny dla czynnika A antybiotyku A-30912 jest nastepujacy: C5i_5sH7o_ss- -N7Oi7-i9. W podanych granicach wyniki analizy elementarnej odpowiadaja szczególnie nastepuja¬ cemu wzorowi empirycznemu: C52H81-N7O18 • H2O (obliczono: C 56,24, H 7,54, N 8,84, O 27,39). Przy¬ blizony ciezar czasteczkowy czynnika A antybiotyku A-30912 okreslony za pomoca spektrometrii ma¬ sowej i miareczkowania wynosi 1100. Widmo ab¬ sorpcji w podczerwieni czynnika A, oznaczone przy uzyciu KBr, przedstawia fig. 1. Widmo to wykazuje nastepujace charakterystyczne maksi¬ ma absorpcji okreslone w mikronach: 2,97 silne, 3,39 srednie, 3,47 slabe, 5,99 silne, 6,10 silne, 6,49 srednie, 6,56 srednie, 6,90 srednie, 8,00 slabe, 9,13 slabe, i 11,77 slabe. Widmo w nadfiolecie czynnika A antybiotyku A-30912, zarówno w obojetnym, jak i zakwaszonym metanolu, wykazuje maksima ab¬ sorbcji przy 225 nm (e-18 000), 275 nm (e-3 000) i 284 nm ( zbocze -s-2 500). Widmo w nadfiolecie czynnika A w zalkalizowanym metanolu wykazu¬ je maksima a'bsorbcji przy 245 nm (e-16000), 290 inm (£-3000) oraz absorbcje na granicy zakre¬ su w kierunku fal krótkich. Widmo 13C NMR czynnika A antybiotyku A-30912 w metanolu-d4 wykazuje charakterystyczne piki o nastepujacych wartosciach b ppm: 176,1; 174,3; 173,4; 172,7; 172,4; 169,8; 158,4; 132,8; 130,9; 129,6; 129,0; 116,2; 77,0; 75,7; 74,4; 71,3; 70,9; 69,6; 68,3; 62,4; 58,7; 56,9; 56,1; 52,9; 39,0; 38,5; 36,8; 35,2; 33,9; 32,9; 32,6; 30,7; 30,4; 30,2; 28,2; 27,0; 26,5; 23,6; 20,1; 19,6; 14,4; i 11,3. Czynnik A antybiotyku A-30912 posiada nastepujace skrecai- nosci wlasciwe: [a] 25D = -44° (stezenie pomiarowe 0,5%, CHsOH), [a] 25365 = -156° (stezenie pomiaro¬ we 0,5%, CHsOH). Miareczkowanie potencjometry- czne czynnika A w 66% wodnym roztworze dwu- metyloformamidu wykazalo obecnosc miareczko- walnych grup o wartosci pKa = 12,8, przy poczat¬ kowym pH = 6,9. Analiza aminokwasów zhydroii- zowanego czynnika antybiotycznego A wykazala obecnosc treoniny, hydroksyproliny oraz trzech dotychczas nie zidentyfikowanych aminokwasów.

Czynnik .antybiotyczny A jest rozpuszczalny w róznorodnych rozpuszczalnikach organicznych, ta¬ kich jak metanol, etanol, dwumetyloformamid, dwumety.losulfotlenek i octan etylu, natomiast jest nierozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczal- niikach organicznych, takich jak eter diwuetylo- wy i eter naftowy. Czynnik antybiotyczny A jest takze rozpuszczalny w wodnych roztworach, a zwlaszcza w roztworach o wartosci pH wiekszej od 7,0.

Czynnik D antybiotyku A-30912stanowi todaly bez¬ postaciowy proszek. Analiza elementarna czynnika D wykazala nastepujacy sklad procentowy: C 56,37%, H 8,17%, N 8,54%, O (z róznicy) 26,92%. Ciezar cza¬ steczkowy czynnika antybiotycznego D, okreslony w oparciu o analize aminokwasów i bliskie po¬ krewienstwo strukturalne z czynnikiem antybio- tycznym A, wynosi w przyblizeniu 1100. Widmo w podczerwieni czynnika D, otrzymane przy uzyciu KBr. przedstawia fig. 2. iWdmo to wykazuje na- lt) stepujace charakterystyczne maksima absorbcji okreslone w mikronach: 2,98 silne, 3,31 slabe, 3,31 slabe, 3,36 zbocze, 3,40 srednie, 3,48 slabe, 5,57 sla¬ be, 6,01 silne, 6,10 zbocze, 6,49 srednie, 6,57 sred¬ nie, 6,90 srednie, 7,81 slabe, 8,07 slabe, 9,16 slabe.

Widmo w nadfiolecie czynnika D, w obojetnym i zakwaszonym metanolu wykazuje maksima ab- . sorbcji przy 225 nm (s — 18000) i 275 nm (e — 2500). Widmo UV czynnika antybiotycznego A-30912 D w zalkalizowanym metanolu wykazuje 2Q maksima absorbcji przy 240 nm (e — 11000) i 290 (e — 3000). Czynnik antybiotyczny A-30912 D po¬ siada nastepujaca skrecalnosc wlasciwa: [a] 25d = = —50° (stezenie pomiarowe 0,35% CH3OH).

Analiza aminokwasów zhydrolizowanego czynni- ka antybiotycznego A-30912 D wykazala obecnosc treoniny, hydroksyproliny, hastycyny oraz trzech innych niezidentyfikowanych dotychczas amino¬ kwasów. Jeden z niezidentyfikowanych amiinokwa- sów czynnika antybiotycznego D jest identycz- ny z jednym z niezidentyfikowanych aminokwa¬ sów czynnika antybiotycznego A. Czynnik antybio¬ tyczny D jest rozpuszczalny w róznorodnych roz¬ puszczalnikach organicznych, takich jak metanol, etanol, dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek i octan etylu, natomiast jest nierozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, ta¬ kich jak eter dwuetylowy i eter naftylowy. Czyn¬ nik antybiotyczny D jest rozpuszczalny w wod¬ nych roztworach, a zwlaszcza w roztworach 40 o wartosci pH wiekszej od 7,0.

Czynnik B antybiotyku A-30912 stanowi bialy bezpostaciowy proszek. Na podstawie analizy ele¬ mentarnej okreslono nastepujacy przyblizony sklad procentowy czynnika B: C 57,36%, H 5,92%, 45 N 8,75%, O 26,19%. Widmo w podczerwieni czyn¬ nika antybiotycznego B w KBr przedstawia fig. 3.

Widmo to wykazuje nastepujace charakterystyczne maksima absorbcji okreslone w mikronach: 2,99, 3,41, 3,49, 6,06, 6,15, 6,54, 6,61, 6,94, 7,62, 8,07, 9,26 i 9,33. Widmo w nadfiolecie czynnika B za¬ równo w .obo*jetnym, jak i zakwaszonym metano¬ lu wykazuje maksima absorbcji przy 223 nm (zbocze, £ — 16000) i 278 nm (e — 2400). Widmo w nadfiolecie czynnika antybiotycznego B w alkali- zowanyim metanolu wykazuje maksima absorbcji przy 242 nm (s — 13900) i 292 nm (e — 2800).

Czynnik B posiada nastepujace skrecalnosci wla¬ sciwe 3[«] 25D = —47° (stezenie pomiarowe 0,5%, CH3OH); (a]25365 = il70° (stezenie pomiarowe 0,5%.

CH3OH). Miareczkowanie potencjometryczne czyn¬ nika antybiotyczneigo B w 66% wodnym roztworze dwumetyloformamid^ wykazalo obecnosc grup miareczkowalnych o wartosci pKa okolo 13,0, przy 05 poczatkowym pH = 7,91. 50 55 60\ 103 996 Analiza aminokwasów czynnika antybiotyczne- go B, po jego standardowej hydrolizie kwasowej, wykazala obecnosc treoniny, hydroksyproliny i kilku niezidentyfikowanych dotychczas amino¬ kwasów. Czynnik B jest rozpuszczalny w rózno¬ rodnych rozpuszczalnikach organicznych, takim jak metanol, etanol dwumetylofO'rm.aimid, dwume- tylosulfotlenek i octan etylu, natomiast jest nieroz- pusizczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach orga¬ nicznych, takich jak eter dwuetylowy i eter nafto¬ wy. Czynnik B jest takze rozpuszczalny w roztwo¬ rach wodnych, a zwlaszcza w roztworach o war¬ tosci pH wiekszej od 7,0.

Czynnik C antybiotyku A-30912 stanowi bialy bezpostaciowy proszek. Na podstawie analizy ele¬ mentarnej okreslono nastepujacy przyblizony sklad procentowy czynnika C: C 56,76%, H 7,83%, N 10,61%, O 25,09%. Widmo- w podczerwieni czyn¬ nika C w KBr przedstawia fig. 4. Widmo to wy¬ kazuje nastepujace charakterystyczne maksima absorbcji okreslone w mikronach: 2,98, 3,39, 3,43, 3,51, 6,01, 6,12, 6,47, 6,90, 7,04, 7,22, 7,38, 8,00 i 9,13. Widmo w ultrafiolecie czynnika C zarów¬ no w obojetnym, jak i zakwaszonym metanolu wykazuje maksima przy 223 nm (zbocze, e — 7300) i 275 nm (e — 1350). Widmo w ultrafiolecie czyn¬ nika antybiotycznego C w alkalicznym metanolu wykazuje maksima absorbcji przy 240 nm (e — 12400) i 290 nm (e — 5200). Czynnik A-30912 C posiada w przyblizeniu nastepujace skrecalnosci wlasciwe: [a] 25D = —33°( stezenie po¬ miarowe 0,5%, CH3OH), [a] 25366 = —113° (steze¬ nie pomiarowe 0,5%, CH3OH). Miareczkowanie po¬ tencjometryczne czynnika C w 66% roztworze wodnym dwumetyloformamidu wykazalo obecnosc miareczkowalnych grup o wartosci pKa okolo 13,08, przy poczatkowej wartosci pH = 7,93.

Analiza aminokwasów czynnika C, po jego stan¬ dardowej hydrolizie kwasowej, wykazala obec¬ nosc treoniny, hydroksyproliny i kilku nieziden¬ tyfikowanych dotychcizts aminokwasów. Czynnik C jest rozpuszczalny w róznorodnych rozpusz¬ czalnikach organicznych, takich jak metanol, etanol, dwumetyloformaimid, dwumetylosulfotlenek i octan etylu, natomiast jest nierozpuszczalny w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter dwuetylowy i eter naftowy. Czyn¬ nik C jest takze rozpuszczalny w wodnych roz¬ tworach, a zwlaszcza w roztworach o wartosci pH wiekszej cd 7,0. Siedeim indywidualnych czynników mieszaniny antybiotycznej A-30912 mozna rozdzielic i zidentyfikowac metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej. Korzystnym ad¬ sorbentem jest zel krzemionkowy, a korzystnym ukladem rozwijajacym, mieszanina benzen-meta- nol w stosunku objetosciowym 7:3. W tablicy I podano wartosci RF czynników antybiiotycznych A-G, otrzymane metoda chromatografii cienko¬ warstwowej na zelu krzemionkowym (Merck, Darmstadt) w ukladzie rozwijajacym benzen-me- tanol 7:3 i przy bioautografii za pomoca Candida albicans. W tablicy II podano wartosci RF dla czynnika antybiotycznego A, otrzymane metoda chromatografii bibulowej w róznorodnych ukla- 40 55 dach rozwijajacych, i przy uzyciu do detekcji drob¬ noustroju Candida albicans.

Tablica I Czynnik antybiotyku A-30912 A B C D 1 E F G Wartosc RF 0,35 0,45 ¦ ¦ 0,54 0,59 0,27 0,18 0,13 | Tablica II Czynnik A anty¬ biotyku A-30912, Wartosc RF 0,76 0,69 0,75 0,17 0,78 Uklad rozwijajacy butanol nasycony woda butanol nasycony woda z dodatkiem 2% kwasu p-tro-i luenosulfonowego, metanol — 0,1 n HCL 3:1 butanol-etanol-woda 13,5:15: :150, metanol-0,05 m cytrynian sodowy 0 pH = 5,7 (7:3) na bibule buforowanej 0,05 m cytrynianem sodowym 0 pH = 5,7. . | 65 Drobnoustrój, zdolny do produkcji mieszaniny antybiotycznej A-30912, wyodrebniono z próbek ziemi z ruin Pompei we Wloszech. Drobnoustrój, produkujacy mieszanine antybiotyczna A-30912, zostal sklasyfikowany przez Thoma i Rapera jako szczep Aspergillus rugulosus, nalezacy do grupy Aspergillus nidulans. Klasyfikacje przeprowadzono w oparciu o o£>is K. B. Rapera. i D. I. Fennela w „The Genus Aspergillus" The Williams and Wil- kins Company, Baltimore, Md. 1965. Okreslenia barw dokonano zgodnie z metoda ISCC-NBS (K.L.

Kelly i D. B. Judd, „The ISCC-NBS Method of Designating Color and a Dictionary of Color Na- mes" U. S. Dept. of Coimme;rce, Oinc 553, Washing¬ ton D. C. 1955). Wzorce barw Maerza i Paula sa opisane w A. Maerz i M. R. Paul „Dictionary of Color" Mc Graw — Hill Book Company, New York, N. Y., 1950. Hodowle szczepu prowadzono w temperaturze 25°C, o ile inna nie zostala po¬ dana.

Charakterystyka hodowli szczepu Aspergillus rugulosus NRRL 8113 na podlozu, zawierajacym roztwór agarowy Czapek'a.

Hodowla rosnie wolno, osiagajac srednice 1,5— 2,0 cm po 15 dniach inkubacji w temperaturze °C. Powierzchnia kolonii jest wypukla i aksami¬ tna, w miare starzenia sie staje sie^ pofaldowana w poblizu srodka, przechodzac nastepnie w kolo¬ nie o guzikowatym srodku. Na' obwodzie grzybnia usytuowana jest 2 mm spiralna obwódka z glebo-103 996 8 boko zanurzonych bezbarwnych strzepków. Na brzegowych strzepkach powietrznych tworzy sie ¦4 rózowawo-brazowa wydzielina. Miedzy 7 i 14 dniem iw agarze, otaczajacym kolonie, tworzy sa rozpuszczalny pigment o barwie blado-purpuro- wej. Pigment ten dyfunduje w kolonie w ciagu dni. Po; uplywie 5 dni powierzchnia kolonii przyjmuje barwe od bialej do^ plowozóltej, spód kolonii ma w srodku zabarwienie brazowawo-po- maranczowe, a w partiach brzegowych od brazo¬ wawego do brazowawo-purpurowego.

Po 10 dniach kolonia jest umiarkowanie zólta- wo-rózowa (ISCC-NBS 29,, Maerz i Paul ll-A-7).

Po 14 dniach kolonia jest jasno szarawo-czerwona (ISCC-NBS 18, Maerz i Paul 4-G-7). Obrzeze staje sie brodawkowate o intensywnie zóltym zabar¬ wieniu (ISCC-NBS 84, Maerz i Paul 10-L-5), z po¬ wodu tworzenia sie zarodników. Na powierzchni kolonii i wzdluz brzegu pojawiaja sie porozrzuca¬ ne ciemno zóltawe skupiska grubosciennych ko¬ mórek, otaczajacych askokarp. W miare starzenia, intensywne zólte plamy i obrzeze istajasie zóltawo- -zielone. Po uplywie 3 tygodni w nowych czesciach - powietrznych obrzeza obserwuje sie odcien poma- ranczowo-purpurowy. Poczatkowo kolonia jest od spodu ..lekko wklesla. W miare dojrzewania kolo¬ nia przylega plasko do powierzchni agaru i spód jej staje sie lekko pofaldowany.

Po 10 dniach spód jest jasno-brazowy (ISCC- -NlBiS 57, Maerz i Paul 5-A^10). Po 15 dniach spód jest szarawo-czerwony (ISCC-NBS 19, Maerz i Paul 6-J-3). Zarodnikowanie jest ubogie, a ko- nidiofory sa rozproszone na powierzchni, czasem wystepuja w skupiskach lub w obwódce brzego¬ wej. Poczatkowo glówki konidialne rozchodza sie luzno, przyjmujac ksztalt kulisty, a w miare sta¬ rzenia sie moga formowac bardziej zwarte krótkie kolumny. Kuliste glówki konidialne maja srednice 70—80 fi, przecietnie 50 fi. Kolumnowe glówki ko- nidalne moga miec dlugosc do 140 \i i szerokosc do 70 fi. Zarodniki sa ksztaltu od kulistego do pra¬ wie kulistego, pofaldowane, w masie daja zabar¬ wienie zielonkawo-zlote. Srednica zarodników wa¬ ha \ sie w granicach 2,8—3,9 fi, przecietnie 3,2 fi.

Strzepki, utrzymujace zarodnik, sa dwuseryjne i bezbarwne. Strzepki pierwotne maja dlugosc 4,7—1.1 (x,przeciietnie 7,9 fi. W najgrubszym miejscu imajja 2,4fx , zmmiejisizajac sie do 1,6 fi. Strzepki wtór¬ ne moga tworzyc sie pojedynczo lub parami, wy¬ rastajac, ze strzepków pierwotnych, przyjmujac ksztalt butelkowaty." Strzepki wtórne w swoim najgrubszym miejscu maja 3,0 fi, zmniejszajac sie do 0,4 fi, od tego miejsca sa rurkowate. Rurkowaty wierzcholek ma dlugosc 1,2 fi. Calkowita dlugosc zgrubialych strzepków waha sie w granicach 5,5— 12,6 fi i wyinosi przecietnie 9,2 fi.

Pecherzyki sa ksztaltu od kulistego do prawie kuli tego lub pólkulistego i moga byc plasko za¬ konczone, w miare starzenia sie przyjmuja bar¬ we brazowawa. Konidiofory sa gladkie, stosunkowo gruboscienne, poczatkowo bezbarwne przechodzac w jasno-cynornonowo-birazowe. Konidofory sa nie¬ co grubsze przy pecherzyku i nieco* ciensze u pod¬ stawy. Przecietna gr.u/bosc ich wynosi 5,9 >. Dlu¬ gosc konidioforów waha sie w granicach 47,7— 166,6 fi, przy czym preciietna wynosi 106 fi. Koni¬ diofory wyrastaja z podpowierzchniowych strzep¬ ków lub w pózniejszym okresie z powietrznych wlókien strzepków. Stadium worko-twórcze poja- wia sie w czasie do 20 dni.

Male zóltawe skupiska komórek grubosciennych, otaczajacych askokarp, wystepujacych na powierz¬ chni, mozna takze znalezc na dowolnej glebokosci grzybni. Skladaja sie one z grubosciennych ko¬ lo morek, otaczajacych'askokarp, które oslaniaja jed¬ na lub wiecej kleistotecji. Komórki, otaczajace askokairp, maja ksztalt od kulistego do prawie kulistego lub owalny do wydluzonego, sa grubo¬ scienne i bezbarwne, a ich srednica wynosi 8—24 fi, przecietnie do 21,8 fi. Kleistotecje sa od kulistych lub prawie kulistych o grubych sciankach, stosun¬ kowo twarde1 .i wlókniste. Poczatkowo sa one stosunkowo bezbarwne, a w miare starzenia sie przyjmuja barwe czerwor^awo-purpurowa i stop- niowo ciemnieja. Srednica kleistotecji wynosi 165—470 fi, a przecietnie 175 fi.

Hodowla na agarze z wyciagiem slodowym.

Kolonie hodowane w temperaturze 25°C wzra¬ staja gwaltownie osiagajac srednice 4^5 cm w ciagu 10—12 dni. Kolonie poczatkowo szarawo-bia- le przyjmuja z czasem zabarwienie umiarkowanie oliwkowo-zielone (ISCC-NBS 90, Maerz i Paul 23- -E-6) w ciagu 4 dni. Obrzeze krete do lekko kla¬ powanego tworza ciasno upakowane, krótkie, biale strzepki powietrzne. Male zóltawe skupiska komó¬ rek, otaczajacych askokarp, tworza sie w postaci plamek na obrzezu i jednoczesnie sa dowolnie po¬ rozrzucane na filcowatej powierzchni agaru. Po uplywie 20 dni skupiska komórek, otaczajacych askokarp, maja tendencje do zasklepiania wiekszej czesci powierzchni. Spód kolonii jest szarawo-zól- ty (ISCC-NBS 90, Maerz i Paul 11-B-l). Stadium workotwórcze pojawia sie w ciagu 15 dni. Male zóltawe skupiska komórek, otaczajacych askokarp, 40 mozna znalezc na dowolnej glebokosci grzybni.

Skladaja sie one z komórek grubosciennych, osla¬ niajacych jedna lub wiecej kleistotecji. Komórki, otaczajace askokarp, sa od kulistych do prawie kulistych i od owalnych do wydluzonych, sa gru- 45 boscienne i bezbarwne. Srednica tych komórek wynosi 8—24 fi, a przecietnie 21,8fi. Kleistotecje sa od kulistych do prawde kulistych o barwie ciem- noczerwonawo-brazowej. Sredtaica ich waha sie w granicach 389—700 fi, a przecietnie wynosi 500 ji. 50 Worki nasienne sa delikatne, bezbarwne o ksztal¬ cie od prawie kulistego do owalnego. Worki o ksztal¬ cie prawie kulistym maja srednice 8,7—11,9 fi, a przecietnie 10,3 fi. Worki owalne maja wymiary ,314,2 fi X 8,7—10,3 fi a przecietnie 12,2 X 94 fi- 55 Askospory sa czerwono-pomaranczowe, drobno pofaldowane z dwoma równoleglymi, delikatnie pofaldowanymi, nieprzerwanymi pionowymi zgru¬ bieniami o szerokosci do 0,8 fi. Askospory wzdluz dlugiej osi wydaja sie soczewkowate. W przypad¬ lo ku, gdy zgrubienie jest na calym obwodzie, asko- spor jest kulisty. Kuliste askospory maja srednice; w granicach 4,9—6,3 fi, a przecietnie 5,4 fi.

Dwie cechy charakterystyczne róznia szczep Aspergillus rugulosus, produkujacy antybiotyk 65 A-30912, od szczepu Aspergillus rugulosus, opisa-9 nego przez Rapera i Fennela, a mianowicie szczep produkujacy A-30912 ma wieksze glówki konidial- ne i askospory. Hodowla szczepu Aspergillus ru- gulosus, produkujaca mieszanine antybiotyczna A-30912, zostala zdeponowana, wchodzac w sklad kolekcji szczepów Northen Regional Research, w Laboratory U. S. Departament of Agroculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, gdzie jest ogólnie dostepna pod numerem NRRL 8113.

Do hodowli Aspergillus rugulosus NRRL 8113 moze byc uzyta dowolna pozywka hodowlana.

Jednak ze wzgledów ekonomicznych w produkcji, ze wzgledu na optymalna wydajnosc i latwosc wyodrebniania produktu, niektóre z pozywek sa korzystne.

Korzystnym zrójdlem weglowodanów w fermen¬ tacji w duzej skali jest na przyklad glukoza, cho¬ ciaz mozna takze uzyc melase, skrobie, laktoze, sacharoze, maltaze, gliceryne itp. Jako korzystne zródlo azotu istosiuje sie hydrolizowana enzymaty¬ cznie kazeine i rozpuszczalny pepton miesny, cho¬ ciaz mozna takze uzyc zbozowe pozostalosci go- rzelnicze, glutaminian jednosodowy itp. Odzywcze sole nieorganiczne moga takze wchodzic w sklad pozywki hodowlanej. Do soli tych naleza rozpu¬ szczalne sole, stanowiace zródlo jonów sodowych, magnezowych, wapniowych, amonowych, chlorko¬ wych, weglanowych, siarczanowych, azotanowych itp. Podstawowe pierwiastki sladowe, niezbedne dla wzrostu i rozwoju drobnoustroju, powinny byc takze zawarte w pozywce. Tego rodzaju pierwia¬ stki sladowe wystepuja powszechnie jako zanie¬ czyszczenia innych skladników pozywki w ilo¬ sciach, wystarczajacych do zaspokojenia zapotrze¬ bowania drobnoustroju w czasie wzrostu.

W przypadku wystapienia pienienia w czasie fermentacji w duzej skali, moze okazac sie ko¬ nieczny dodatek malej ilosci, np. 0,2 ml/l srodka przeciwpieniacego, takiego jak glikol polipropyle¬ nowy. Do produkcji znacznej ilosci mieszaniny an- tybiotycznej A-30912 korzystna jest podpowierz- chniowa fermentacja z napowietrzaniem, prowa¬ dzona w tkankach. Niewielkie ilosci mieszaniny antybiotycznej A-30912 mozna wytworzyc, prowa¬ dzac hodowle w kolbach na trzesawce. Ze wzgle¬ du na wydluzanie sie czasu wytwarzania antybio¬ tyku, zazwyczaj zwiazane ze szczepieniem duzych tanków drobnoustrojem w formie zarodnikowej, korzystne jest stosowanie inokulum wegetatywne¬ go. Inokulum wegetatywne grzybni przygotowuje sie przez szczepienie nieduzej objetosci pozywki drobnoustrojem w postaci zarodnikujacej lub ka¬ walkami grzybni, otrzymujac swieza aktywna ho¬ dowle wzrostowa drobnoustroju. Otrzymane ino¬ kulum wegetatywne przenosi sie do duzego fer- mentora. Do hodowli inokulum wegetatywnego mozna. uzyc tej samej pozywki, która jest stoso¬ wana w wiekszych fermentacjach, jak równiez zastosowac inne podloze. Drobnoustrój, produku¬ jacy antybiotyk A-30912, moze byc hodowany w temperaturach okolo 20?C do okolo 43°C. Drobno¬ ustrój ten wzrasta dobrze w temperaturach okolo —30PC Optymalne warunki - produkcji miesza¬ jmy antybiotycznej A-30912 "wystepuja* w teimpe^ l 996 raturze 25°C. W normalnym procesie hodowli pod- powierzchnioweij z napowietrzaniem przepuszcza sie jalowe powietrze przez brzeczke fermentacyjna.

W celu wydajnego wytwarzania antybiotyku, g korzystne jest przepuszczanie powyzej 0,4 obje¬ tosci powietrza przez objetosc brzeczki na minute (obj./obj./min.). Produkcja mieszaniny antybiotycz¬ nej moze byc kontrolowana w czasie fermentacji za pomoca badan; w których oznacza sie aktyw- nosc antybiotyku w alkoholowym ekstrakcie z ca¬ lej bnzeczlki w stosunku do drobnoustroju, wrazli¬ wego na dzialanie antybiotyków A-30912. Drobno¬ ustrojem wzorcowym, nadajacym sie do badania % zawairtosci mieszaniny antybiotycznej. A-30912 jest Candida albicans. Oznaczenia biologicznego dokonuje sie dogodna metoda dyfuzyjna krazków bibulowych na zaszczepionych plytkach agaro¬ wych. Na ogól aktywnosc antybiotyku mozna wy¬ kryc w drugim dniu fermentacji. Maksymalny wzrost aktywnosci antybiotycznej nastepuje w przyblizeniu miedzy 3 i 6 dniem.

Stwierdzono, ze zawartosc antybiotyku w po¬ zywce fermentacyjnej wynosi 200 u-g/ml, a aktyw¬ nosc w brzeczce wynosi okolo 10%. Pozostalosc jest zwiazana z biomasa. Próbki pofermentacyjne do oznaczen mozna otrzymac na drodze ekstrakcji bio¬ masy przez 15 minut za pomoca metanolu w ilosci równej pierwotnej objetosci brzeczki lub przez eks¬ trakcje jednej objetosci brzeczki fermentacyjnej, zawierajacej biomase, dwoma objetosciami meta¬ nolu. Oznaczenie aktywnosci antybiotyku A-30912 w brzeczkach pofermentacyjnych oraz w wyodreb¬ nionych próbkach prowadzi sie metoda dyfuzyjna krazków bibulowych na plytach agarowych, sto- sujac drozdze, Hansenula silvicola NRRL. Y-1678, jako drobnoustrój testowy. Zaszczepione plytki aga¬ rowe otrzymuje sie przez szczepienie agarowego podloza hodowla drozdzy o odpowiednim stezeniu i rozlanie na plastikowych plytkach Petriego o roz- miarach 20X100 mm tak, aby plytka zawierala ml agaru. Jako wzorzec stosuje sie preparat an¬ tybiotyku A-30912 (A79-V60-14B), zawierajacy w przyblizeniu 80—90% czynnika A.

Preperat ten stosuje sie za podstawe do okre- 45 slenia jednostki. Aktywnosc czynnika A o duzej czystosci wynosi 2500 jednostek/mg. Krzywa wzor¬ cowa wykresla sie dla 60-40-20-10 jednostek/ml.

Rozcienczalnikiem dla wzorca i dla próbek jest- metanol z woda w stosunku 1 : 1. Roztwory próbek 50 i wzorca nanosi sie na bibulowe krazki o srednicy 12,7 mm za pomoca automatycznej pipety. Inkuba¬ cje prowadzi sie w temperaturze 30°C przez 40— 48 godzin. Srednice strefy hamowania w mm od¬ czytuje sie na urzadzeniu Modified Fischer Lilly 55 Antibiotic Zone Reader. Czynniki antybiotyczne A-30912 sa srodkami zwalczajacymi grzyby. Aktyw¬ nosc w zwalczaniu grzybów, czynników antybio- tycznych A-30912 ilustruja* testy in vitro czynni¬ ków antybiotycznych A, , B, D i E. Wyniki tych g^ testów zebrano w tablicy 3 i 4. Aktywnosc w zwal¬ czaniu grzybów mierzono metoda dyfuzyjna kraz¬ ków bibulowych, stosujac krazki o srednicy 6 mrii, które zanurzano w roztworze, zawierajacym bada¬ ny zwiazek, .a nastepnie nakladano na uprzednie? g$ zaszczepione drobnoustrojem testowym, podloze'103 996 , 11 agarowe w plytce. Wyniki testu podano jako war¬ tosci najmniejszego stezenia hamujacego (MIC) dla krazka, przy którym badany zwiazek hamowal drobnoustrój testowy.

Tablica III 12 Tablica V. i Badany drobnoustrój Candida albicans Trichophyton \ mentagrophytes MIC (^krazek) Antybiotyk A-30912 Czynnik A 0,625 0,078 Antybiotyk A-30912 Czynnik D 0,5 0,07 Tablica IV Badany drobno¬ ustrój Candida albicans Tricho¬ phyton mentagro¬ phytes MIC (jjtg/krazek) £ < biot 912 nik >» o fl V> °? >» < < O 0,156 0,78 £ « biot 912 nik >» o G "£ °? ^ < < U 0,156 0,078 * Q biot 912 nik >» o fl G °? & < 1,25 0,312 £ W biot 912 nik >> o C ** co >> £ ¦ N < ,0 0,625 | Czynnik A jest bardzo aktywny in vitro, w tes¬ cie metoda dyfuzji krazków bibulowych, w stosun¬ ku do dermatofitów. Wyniki tych testów zebrano w tablicy 5.

Aktywnosc przeciw grzybom oceniano w testach in vtitro. Czynniki antybiotyczne A-30912 cwprowa- dizano do agarowej pozywki, która rozlano na plyt¬ ki. Plytki pokryto drobnoustrojem Testowym, Wy¬ niki podano jako wartosci najmniejiszego stezenia hamujacego MIC w ng/iml agarowej pozywki. Wy¬ nikli przedstawia tablica VI.

Aktywnosc przeciw grzybom czynników antybio- tycznych A-30912 zostala wykazana w testach in vivo. Testy in vivo prowadzono w nastepujacy spo¬ sób: 3 dawki badanego zwiazku podawano myszom zakazonym Candida albicans w 0,4 i 24 godziny po infekcji. Ochrone, jaka daje badany zwiazek, mierzono jako dawke skuteczna ED50 (dawka sku¬ teczna w miligramach/kg, która chronila 50% ba¬ danych myszy, patrz W. Wiek i inni, J. Bacteriol. 81, 233—235 (1961)). Dawka ED50 czynnika A anty¬ biotyku A-30912 przeciwko Candida albicans u myszy wynosila 30 mg/kig przy podawaniu do- otrzewnym i 50 mg/kg przy podawaniu podskór¬ nym. Dawka ED50 czynnika D antybiotyku A-30912 przeciwko Candida albicans u myszy wynosila 33 mg/kg przy podawaniu podskórnym. Pózniej¬ szy test porównawczy wykazal, ze dawka ED50 przeciwko Candida albicans u myszy wynosi 75 mg/kg dla czynnika A antybiotyku A-30912, 40 45 50 I Czynnik A antybiotyku A-30912 — aktywnosc w stosunku do Dermatofit Trichophyton mentagrophytes Trichophyton gallinae Trichophyton meginini Trichophyton qinckeanum Trichophyton rubrum Trichophyton schoenceinii Trichophyton terrestre Trichophyton tonsurans Microsporium gypseum Microsporium audouinii Microsporium canis 1 Microsporium cookei Nannizzia incurvata Phalaphere jean salemi Epidermatophyton floccosum Geotrichum candidum Keratinomyces ajellio 13 9 4 6 2 1 1 1 4 1 dermatofitów MIC (^g/krazek) 1,25—0,039 >1,25 0,0195 1,25 <0,0098 0,0195 0,0195 / >1,25—0,156 0,156—0,038 1,25—0,156 1,25—0,0098 1,25—0,0195 0,312 >1,25 1,25 1,25—0,156 0,156 | Tablica VI Badany ustrój drobno- Cryptococ- cus neofor- mans myces Blasto- dermati- tidis Histo- plasma capsula- tus Antybiotyk A-30912 Czynnik A >20 * >20 >20 MIC Antybiotyk A-30912 Czynnik B >20 >20 (wg/ml) Antybiotyk A-30912 Czynnik D >20 Antybiotyk A-30912 Czynnik E >20 >20 >20 | 60 62 mg/kg dla czynnika B, natomiast dla czynnika D nie stwierdzono aktywnosci (stosowano podawa¬ nie podskórne). U myszy, którym podawano czyn¬ nik antybiotyczny A dootrzewnowo lub podskór¬ nie w dawkach 100 mg/kg dwa razy dziennie w 45 ciagu 3 dni (dawka calkowita 600 mg/kg), nie103 996 13 14 stwierdzano ostrej toksycznosci. Nie stwierdzono takze ostrej toksycznosci przy podawaniu podskór¬ nym czynnika A myszom w dawkach 200 mg/kg trzy razy dziennie (dawka calkowita wynosila 600 mg/kg). W przypadku podawania czynnika an- tybiotycznego D myszom w dawkach 14 mg/kg 3 razy dziennie (dawka calkowita 42 mg/kg) nie stwierdzono równiez zadnych objawów ostrej to¬ ksycznosci. Czynniki antybiotyczne A-30912 stoso¬ wane jako srodki przeciw grzybom sa podawane pozajelitowo, zazwyczaj lacznie z dopuszczonym w farmacji nosnikiem lub rozpuszczalnikiem. Daw¬ kowanie czynnika antybiotycznego A-30912 bedzie zalezalo od wielu warunków, takich jak rodzaj i ostrosc konkretnej infekcji.

Podane nizej przyklady ilustruja wynalazek.

Przyklad I. A. Fermentacja w kolbach na trzesawce. Hodowle Aspergillus rugulosus NRRL 8113 prowadzono w akosie agarowym (18X150 ml) o nastepujacym skladzie: Skladnik Zawartosc % Dekstryna 1,0000 Enzymatyczny hydrolizat kazeiny *) 0,2000 Ekstrakt drozdzowy 0,1000 Ekstrakt wolowy 0,1000 KC1 0,0200 MgS04-7 H20 0,0200 FeS04 • 7 H20 0,0004 Woda 98,5596 *) N-Z-Amine A, Sheffield Chemical Co., Nor- wich, N.Y.

Na skos naniesiono szczep Aspergillus rugulosus NRRL 8113, po czym szczepiony skos inkubowano w temperaturze 25°C przez 7 dni. Dojrzala ho¬ dowle skosna pokryto surowica wolowa, po czym zeskrobano zarodniki eza. Polowe otrzymanej za¬ wiesiny uzyto do szczepienia 50 ml pozywki o na¬ stepujacym skladzie: Skladnik , Zawartosc % Sacharoza 2,5 Melasa 3,6 Wyciag namoku kukurydzy 0,6 Enzymatyczny hydrolizat kazeiny *) 1,0 K2HP04 0,2 Woda 92,1 *) N-Z-case, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Szczepiona pozywke inkubowano w 250 ml kol¬ bach Erlenmeyera z szeroka szyja przez 24 godzi¬ ny, w temperaturze 25°C, na trzesawce obrotowej przy 250 obr./min (ampfttuida 5yl cm). Po inkubacji szczepiona pozywke mozna uzyc bezposrednio do szczepienia pozywki II generacji. Alternatywnie i korzystnie mozna ja przechowywac do pózniej¬ szego uzycia, trzymajac hodowle w parach ciekle¬ go azotu. Do teigo rodizaju przechowywania hodowle przygotowuje sie w wielu malych fiolkach w na¬ stepujacy sposób: w kazdej fiolce umieszcza sie 2 ml szczepionej pozywki po inkubacji i 2 ml roz¬ tworu glicerynowoJlaktozowego o nastepujacym skladzie: Skladnik Zawartosc % Gliceryna, 20% Laktoza 10% Wóda dejonizowana 70% Przygotowane zawiesiny przechowuje sie w pa¬ rach cieklego azotu. 1 ml tak przygotowanej i przechowywanej zawiesiny uzyto do szczepienia 50 ml pozywki I generacji o tym samym skladzie, jak wyzej opisany. Szczepiona pozywke I genera¬ cji inkubowano w 250 ml kolbach Erlenmeyera o szerokiej szyjce, w temperaturze 25°C, przez 22 godziny, na wytrzasarce przy 250 obr./min. (amplituda 5,1 cm).

B. Fermentacja w tanku. W celu uzyskania , wiekszej objetosci inokulum, 10 ml wyzej opisa¬ nej pozywki I generacji uzyto do szczepienia 400 ml pozywki II generacji o tym samym skladzie i in¬ kubowano w 2 litrowej kolbie Erlenmeyera z sze- roka szyjka, w temperaturze 25°C, przez 25 go¬ dzin, na trzesawce obrotowej przy 250 obr./min. (amplituda 5,1 cm). 800 ml inkubowanej pozywki II generacji uzyto do szczepienia 100 litrów jalowego podloza posie- wowego o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc Glukoza 25 g/litr Skrobia 10 g/litr Pepton *) ¦ ¦ 10 g/litr Melasa 5 g/litr Enzymatyczny hydrolizat kazeiny**) 4 g/litr MgS04.7H20 0,5 g/litr Zestaw mineralny Czapka***) 2,0 ml/litr CaC03 2,0 g/litr Woda dejonizowana do objetosci 1 litra.

*) W.P No. 159, Inolex Biomedlical Corp., Glen- wood, I 11.

**) N-Z-Amine A, Sheffield Chemical Co., Nor- - wich, N.Y. ***) zestaw mineralny Czapka posiada nastepu¬ jacy sklad: Skladnik * Ilosc FeS04 - 7 H20 (rozpuszczony w 2 ml stezonego kwasu solnego) 2g KC1 100g MgSC4 • 7HzO 100 g Dejonizowana woda do objetosci 1 litra. 40 Pozywka do sterylizacji w autoklawie w tempe- 45 raturze 121 °C przez 30 minut przy cisnieniu 1,12—1,26 atm. miala wartosc pH = 6,8. Szczepione podloze produkcyjne pozostawiono do fermenta¬ cji w 165 litrowym tanku fermentacyjnym w tem¬ peraturze 25°C na cztery dni. Podloze fermenta- 50 cyjne napowietrzano jalowym powietrzem w ilo¬ sci 0,5 obj. (obr./min.) Mieszanie prowadzono przy uzyciu typowych mieszadel z szybkoscia 300 obr./min.

Przyklad II. Wyodrebnienie mieszaniny an- 55 tybiotycznej A-30912. l 200 litrów brzeczki pofermentacyjnej, calosc brzeczki, otrzymanej sposobem, opisanym w przy¬ kladzie I, mieszano starannie z 200 litrami meta¬ nolu przez 1 godzine, a nastepnie przesaczono 60 przy uzyciu pomocniczego materialu filtracyjnego, takiego jak (Hyflo Supeir-cel, ziemia okrzemkowa, Johna-Manville Products Corp.).1 Wartosc pH prze¬ saczu doprowadzono do wartosci 4,0 przez doda¬ nie 5n HC1. Zakwaisizony przesacz ektrahowaino 65 dwukrotnie chloroformem o równowaznej objeto-15 103 996 16 sci. Ekstrakty chloroformowe polaczono i zate¬ zono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 4 litrów.

Otrzymany koncentrat dodano do okolo 60 litrów eteru dwuetylowego, wytracajacmieszanine A-30912.

Wytracony osad oddzielono przez saczenie i osu¬ szono, otrzymujac 38 g mieszaniny antybiotycznej A-30912 w postaci szarego proszku. Przesacz za- tezono pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac olej, który nastepnie rozpuszczono w 500 ml me¬ tanolu. Roztwór metanolowy dodano do 7,5 1 eteru dwuetylowego w celu wytracenia dodatkowej par¬ tii mieszaniny antybiotycznej A-30912. Otrzymany osad oddzielono takze za pomoca filtracji i wy¬ suszono, otrzymujac dodatkowo 3,5. g mieszaniny antybiotycznej A-30912.

Przyklad III. Wyodrebnianie czynnika A an¬ tybiotyku A-30912. g mieszaniny antybiotycznej A-30912, otrzyma¬ nej w przykladzie II, naniesiono w mieszaninie acetonitryl—woda (95:5) na kolumne wypelnio¬ na zelem krzemionkowym, (4X107 cm, Woelm).

Eluacje prowadzono mieszaoma acetonitryl—woda (95:5) przy szybkosci przeplywu 1 do 2 ml/min, zbierajac frakcje o objetosci okolo 20 ml. Frakcje kontrolowano metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej na zelu krzemionkowym, uzywajac ukla¬ du rozwijajacego acetonitryl—woda (9^:5) oraz Candida albicans do bioautografii.

Frakcje 74-125 polaczono i zatezono. Zatezony roztwór krystalizowal, dajac dodatkowo 124 mg sterigmatocystyny. Po polaczeniu i zatezeniu frak¬ cji 212—273 pod zmniejszonym cisnieniem otrzyma¬ no olej. Olej ten rozpuszczono w niewielkiej ob¬ jetosci metanolu. Otrzymany roztwór metanolowy wlano do 15 objetosci eteru dwuetylowego. Wy¬ tracony osad oddzielono i wysuszono, otrzymujac 23 mg czynnika D antybiotyku A-30912. Frakcje 274—437 zawieraly czynniki antyibiotycizne A, B, C i D. Frakcje 4®2—900 zawieraly czynniki A, E, F i G antybiotyku A-30912. Frakcje 438^181 pola¬ czono i zatezono pod zmniejszonym cisniendem otrzymujac olej. Otrzymany olej rozpuszczono w malej objetosci metanolu, a otrzymany roztwór metanolowy dodano do 15 objetosoi eteru dwuetylo¬ wego. Wytracony osad oddzielono i wysuszono, otrzymujac 2,17 g czynnika A antybiotyku A-30912.

Przyklad IV. Wyodrebnianie czynnika D an- Czesciowo oczyszczona mieszanine antybiotyczna A-30912, zawierajaca czynnik B, C i D, otrzyma¬ no sposobem opisanym w przykladzie III — frak- me3,-Ana5ooezJ432 . cje 274—437. 750 ml tej mieszaniny poddano chro¬ matografii na kolumnie 2,2X51 cm, wypelnionej zelem krzemionkowym Woelm, zbierajac frakcje o objetosci okolo 15 ml i stosujac do eluacji naste¬ pujace rozpuszczalniki: Frakcje Rozpuszczalnik 1^25 acetonitryl 26— 62 acetonitryl + 1% wody 63—700 acetonitryl + 1,5% wody Frakcje z kolumny kontrolowano metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej, w ukladach roz¬ wijajacych acetonitryl—woda (95:5) i benzen—me¬ tanol (7:3), uzywajac do bidautografii, Cahdida al¬ bicans. Frakcje 535—685, zawierajace czynnik D antybiotyku A-30912, polaczono i zatezono pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac olej, który nastepnie roizpuszczono w malej ilosci metanolu i dodano do 15 objetosci eteru dwuetylowego. Wy- / tracony osad odsaczono i wysuszono, otrzymujac 69 mg czynnika D antybiotyku A-30912.

Przyklad V. Wyodrebnianie czynników B i C antybiotyku A-30912.

, Czesciowo oczyszczona mieszanine antybiotyczna A-30912, zawierajaca czynniki A, B, C i D, otrzy¬ mano sposobem, opisanym w przykladzie III dla frakcji 212—437. 18 g tak ottrzymanej mieszaniny rozpuszczono w jak najmniejszej objetosci mie- szaniny acetonitryl—woda (4:1) i naniesiono na kolumne chromatograficzna 3,8X56 cm, napelnio¬ na tlenkiem glinowym Woelm, po czym eluowa- no mieszanine rozpuszczalników o nizej podanym skladzie, zbierajac frakcje o objetosci okolo 20 ml.

Frakcje , Rozpuszczalnik 1—300 acetonitryl—woda (4:1) 301^509 acetonitryl—woda (7:3) Frakcje z kolumny badano metoda chromatogra¬ fii cienkowarstwowej sposobem, opisanym w przy- kladzie IV. W oparciu o wyniki chromatografii cienkowarstwowej laczono frakcje i zatezano do oleistej pozostalosci, które z kolei rozpuszczono w malej objetosci metanolu. Roztwory metanolowe rozcienczano 10—15 objetosciami eteru dwuetylo- wego w celu wytracenia osadu. Sposób laczenia frakcji, ilosc otrzymanych substancji i zawartosc czynników w polaczonych frakcjach podano w po¬ nizszym zestawieniu: Frakcje Waga (g) Czynniki 6— 28 6— 28 34^114 115—164 165—509 0,23 *) ,80 2,90 1,20 1,90 — A-30912 C, D A-30912 B A-30912 A, B A-30912 A 40 *), substancje nierozpuszczalne, otrzymane przed wytraceniem za poinoca eteru dwuetylowego.

W celu. otrzymania oczyszczonego czynnika A-30912 C, czesc frakcji 6—28 w ilosci 2 g roz¬ puszczono w metanolu i zaadsorbowano na wy- 45 starczajacej ilosci zelu krzemionkowego o grada¬ cji 62, osuszono i naniesiono na kolumne 1,9X80 cm, napelniona w acetonitrylu zelem krze¬ mionkowym o gradacji 62. Kolumne eluowano ace- tonitryiem przy szybkosci wycieku okolo 2 ml na 50 minute, zbierajac frakcje o objetosci okolo 10 ml.

Przy frakcji 117 zmieniono eluent na acetoni¬ tryl—woda (99:1). Frakcje z kolumny kontrolowa¬ no metoda ' chromatografii cienkowarstwowej.

W oparciu o wyniki chromatografii cienkowarstwo- 55 wej laczono frakcje i zatezano do oleistych pozo¬ stalosci. Otrzymane pozostalosci oleiste rozpusz-^ czano w malej objetosci metanolu, po czym roz¬ twory metanolowe mieszano z 10—15 objetosci eteru dwuetylowego w celu wytracenia osadu. Za- 60 wartosc czynników oraz ich ilosci w istotnych frakcjach podano ponizej.

Frakcje Waga (g) Czynniki 341^479 0,250 D 480—540 0,015 D 65 541—899 0,391 C, D17 * 103 996 18

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowej mieszaniny anty- biotycznej A-30912, zawierajacej czynniki A, B, C, D, E, F i G, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle podpowierzchniowa z napowietrzaniem s-czepu Aspergillus regulosus NRRL 8113 w po¬ zywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zród¬ la weglowodanów, azotu oraz sole nieorganiczne do momentu wytworzenia znacznej aktywnosci an- tybiotycznej, po czym ewentualnie oddziela sie mieszanine antybiotyczna A-30912 od pozywki wyodrebnia czynniki A, D, E, F i G antybiotyku 10 A-30912 z mieszaniny antybiotycznej A-30912.

2. Sposób wytwarzania nowej mieszaniny anty¬ biotycznej A-30912, zawierajacej czynniki A, B, C, D, E, F i G, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle podpowierzchniowa z napowietrzaniem szczepu Aspergillus rugulosus NRRL 8113 w po¬ zywce hodowlanej, zawierajacej przyswajalne zród¬ la weglowodanów, azotu oraz sole nieorganiczne, do momentu wytworzenia znacznej aktywnosci an¬ tybiotycznej, oddziela sie mieszanine antybiotyczna A-30912 od pozywki i wyodrebnia czynnik B lub C antybiotyku A-30912 z mieszaniny antybiotycz¬ nej A-30912. \ ,M-/y •? 14 16 1P 20 25 30_40 4000 3500 3000 2100 2000 1800 1600 14C0 120C 10CIP. 600 6CC 40C 253 9 10 1/ 14 16 1H 20 25 30 40 4030 3500 3000 2500 2000 18C0 160C 1400 1200 1000 600 600 400 250 9 10 12 14 16 IB 20 25 30 40 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 B00 600 400 250 i-IG. 3 6 7 B 9 10 12 14 16TS20 25 30 40 <000 3500 3000 2500 2000 1600 1400 12n0 1000 RD0 600 400 2!>ff [CM '| FIG. 4