DD153834A5

DD153834A5 - Verfahren zur herstellung eines neuen faktors von antibiotikum a-30912

Info

Publication number: DD153834A5
Application number: DD80221643A
Authority: DD
Inventors: Karl H Michel
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1979-06-08
Filing date: 1980-06-06
Publication date: 1982-02-03
Also published as: IT8022586A0; GB2050385A; AU5901680A; IT1209417B; YU146480A; CA1156218A; PT71350A; EP0021685A1; IL60216A0; PL224775A1; FR2458551A1; ES8105270A1; AR226848A1; GR69258B; FI801773A; GB2050385B; ES492232A0; DK244780A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen als Faktor H bezeichneten Faktors aus der A-30912-Antibiotikummischung, der niederen Alkyletherhomologen von A-30912-Faktor H und der Tetrahydroderivate der Homologen dieses neuen Faktors. Die neuen Antibiotika eignen sich besonders gut als Mittel gegen Fungi. A-30912-Faktor H ist ein Polypeptidantibiotikum, das dem A-30912-Faktor A nahe steht, der mit Echinocandin B identisch ist. Gegenueber letzterem weist A-3091 H eine weitere -CH tief 2 -Gruppe auf, die als -O-CH tief 3 anstelle einer der -OH- Gruppen in dem cyclischen Peptidteil des Molekuels vorliegt.

Description

21643

Aktenzeichen: · X-5281A

Vertreter; Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren'^zür Herstellung eines neuen Faktors von Antibiotikum A-30912

Anwendungsgebiet der- Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen als Faktor H bezeichneten Faktors aus der A-30912-Antibiotikummischung, der niederen Alkyletherhomologen von A-3091 2-Faktor.H und der Tetrahydroderivate der Homologen dieses neuen Faktors. Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen haben die Strukturformel I:

einen Linoleoyl- oder Stearoylrest und

R einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet,

mit der Maßgabe, daß R den Lmoleoylrest bedeutet, wenn R für eine Methylgruppe steht. Wenn R eine Linoleoylgruppe und R eine Methylgruppe bedeuten, handelt es sich bei der

Verbindung um A-30912-Faktor H. Wenn R eine Stearoylgruppe und R eine Methylgruppe bedeutet, dann handelt es sich bei der Verbindung um Tetrahydro--A-30912--Faktor H.

8 43 * - 3 -

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Die A-30912-Antibiotikummischung ist in der US-PS 4 024 abgehandelt. Sieben Einzelfaktoren der A-30912-Mischung sind erkannt worden und wurden als A-30912-Faktoren A, B, C, D, E, F und G bezeichnet.

Ziel der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika vom A-30912 Η-Typ der Formel I zur Verfügung zu stellen, die sich besonders gut als Mittel gegen Fungi eignen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die Verbindungen der Formel I werden durch Umsetzung von A-30912-Faktor A oder Tetrahydro-A-30912-Faktor A mit dem entsprechenden Alkohol erhalten. Die Tetrahydroderivate können auch durch Reduktion der entsprechenden Linoleoylverbindungen hergestellt werden. Eine der neuen erfindungsgemäß erhältlichen antibiotischen Substanzen ist als A-30912-Faktor H bezeichnet worden. Zur Vereinfachung der vorliegenden Beschreibung wird A-30912-Faktor H als A-30912H abgekürzt, und A-30912H, die niederen Alkylhomolog'en von A-30912H und ihre Tetrahydroderivate werden als Antibiotika vom A-30912H-Typ bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines A-30912H-Antibiotikums der Formel

HO

η? I ro.;

^H0\__r ^H'

. HO

^*β

H β-0

"oh

OH

β Η

>T

,CHs

H OH

•OH

einen Linoleoyl- oder Stearoylrest und

R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet,

mit der Maßgabe, daß R den Linoleoylrest bedeutet, wenn R für· eine Methylgruppe steht, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel ΊΓΙ

2 21 6-4 3 - - 5 -

ί* ^Hy Η0._ .OH

H—9 9 ·.

H _fl

Η···β β_ν

^Η0

worin R' eine Linoleoyl- oder Stearoylgruppe bedeutet,

A) wenn R eine Linoleoylgruppe bedeutet mit

1) einem Alkohol der Formel ROH, worin R die oben angegebene Bedeutung hat, oder

2) einem Alkohol der Formel R OH, worin

R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, .

B) wenn R einen Stearoylrest bedeutet, mit einem

Alkohol der Formel ROH

in einem polaren inerten Lösungsmittel oder in einem Überschuß des als Reaktionsteilnehmer verwendeten Alkohols bei 0 bis 70 ⁰C unter sauren Bedingungen umgesetzt und bei Verwendung eines Alkohols der Formel R OH und einer Ver-

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bindung der Formel II, worin R einen Linoleoylrest bedeutet, für die Umsetzung gegebenenfalls die Linoleoylgruppe in der gebildeten Verbindung zur Stearoylgruppe reduziert wird.

Die A-30912-Antibiotikummischung, aus der der neue Antibiotikumfaktor isoliert werden kann, wird durch Züchten eines Stamms von Aspergillus rugulosus NRRL 8113 unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen gemäß US-PS 4 024 245 erzeugt. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von A-30912H besteht in der Züchtung von Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440, unter Bildung der A-42355-Antibiotikummischung und Isolierung von A-3O912H aus dieser Mischung. Dieses Verfahren ist in der Anmeldung der· gleichen Anmelderin vom gleichen Tag mit dem internen Aktenzeichen X-5164A beschrieben.

Die beigefügten Zeichnungen dienen der' weiteren Erläuterung der Erfindung.

Figur 1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in einer KBr-Scheibe.

Figur 2 zeigt die relativen Wanderungen der A-30912~Faktoren bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Kieselgel (Merck-Darmstadt) als Adsorbens, eines Lösungsmittelsystems aus drei Teilen Ethylacetat und zwei Teilen Methanol und einer Bioautographie mit Candida albicans zum Nachweis. Der Pfeil gibt die Richtung des Lösungsmittelflusses an; das Zeichen "+" zeigt den Ausgangspunkt an. Das Gebiet, in dem die geringfügigen Faktoren E, F und G erscheinen, ist durch

2 2 1 6 A 3

eine Klammer bezeichnet. Gegenüberstellungen der R^-Werte von A-30912-Faktor A und der geringfügigen Faktoren E, F und G finden sich in US-PS 4 024 245 (siehe Tabelle I in Spalte 4 ).

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung neuer antifungaler Mittel. Zu diesen Mitteln gehören A-30912H, ein neu aufgefundener Faktor aus der A-30912-Antibiotikummischung, niedere Alkylhomologe von A-30912H und die Tetrahydroder ivate dieser Homologen. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung von Tetrahydro-A-30912H als Mittel gegen Fungi. Die Tetrahydroderivate von A-30912H und seinen Homologen v/erden durch Reduktion dieser Verbindungen hergestellt.

Die A-30912-Antibiotikummischung kann nach US-PS.4 024 245 hergestellt werden, auf die hierin ausdrücklich Bezug genom-' men wird. Die A-30912-Antibiotikummischung kann auch durch Züchten von Aspergillus nidulans var. roseus, NRRL 11440, wie hierin beschrieben, hergestellt werden.

A-30912H ist ein neuer Faktor der A-30912-Antibiotikummischung. Die Bezeichnung "Antibiotikummischung", wie sie auf dem Fermentationsgebiet und in der vorliegenden Beschreibung gebraucht wird, bezieht sich auf eine Mischung aus gleichzeitig erzeugten einzelnen Antibiotikafaktoren. Wie für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres ersichtlich, hängt das Verhältnis der erzeugten Einzelfaktoren in einem Antibiotikumgemisch von den angewandten Fermentationsbedingungen ab und ändert sich mit diesen. Unter den derzeit bekannten Bedingungen ist A-30912H ein geringfügiger Faktor in der A-30912-Mischung und liegt in einer Menge im Bereich von 0,01 bis 1,0 % des Gesamtkomplexes vor. Ein weiterer geringfügiger Faktor der A-30912-Mischung ist zwar erkannt, aber nicht in zu seiner Charakterisierung ausreichenden Menge isoliert worden« A-30912-Faktor H wird von diesem Faktor am besten durch Kieselgel-TCL unter Verwendung

• 2 2 1 6 4 3 · - 8 -

eines .Lösungsmittelsystems aus 3 Teilen Ethylacetat und 2 Teilen Methanol oder aus 95 Teilen Acetonitril und 5 Teilen Wasser abgetrennt. In beiden Systemen ist der nichtcharakterisierte-geringfügige Faktor stärker polar als die anderen A-30912-Faktoren.

A. A-30912-Faktor H

A-30912-Faktor H, der neu aufgefundene Bestandteil der A-30912-Antibiotikummischung, ist ein Polypeptidantibiotikum, das dem A-30912-Faktor A nahe steht. Neuere Unterschungsergebnisse haben gezeigt, daß A-30912-Faktor A mit Echinocandin B /vgl. F. Benz et al., HeIv. Chim. Acta 57, 2459-2477 (1974) und CH-PS 568 386 (Defwent Abstract -75884W_-)./ identisch ist. Auch Antibiotikum SL 7810/F ist als Echinocandin B identifiziert v/orden /C. Keller-Juslen, et. al., Tetrahedron Letters 1976 (46), 4147-4150, und BE-PS 834 289 (Derwent Abstract 3O159X)./.

Von Keller-Juslen und Mitarbeiter sind für Echinocandin B (SL 7810/F; A-30912-Faktor A) und sein Tetrahydroderivat die Strukturformeln 2 und 3 vorgeschlagen worden: ·

OH

2 16 4 3 - 9 -

Die Ergebnisse der Elementaranalyse von A-30912-Faktor H stimmen^ besonders gut mit der empirischen Formel C₁J-H₀₀N-O.. ,..H₀O (ber. : C 58,30, H' 7,79, N 8,98, 0 24,93) überein.

Das in Figur 1 dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum von A-3o912-Faktor H in einer KBr-Scheibe zeigt die folgeden charakteristischen Absorptionsmaxima: 2,9 (sehr stark), 3,4 (stark), 3,5 (mittel), 5,9-6,1 (sehr stark), 6,6 (stark), 6,9 (stark), 7,9-8,1 (mittel) und 9,1 (stark) Mikron.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-309-1 2-Faktor H in neutralem sowie in saurem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 223 mti (epsilon 13 100) und 275.nm, breites Peak (epsilon 2 100). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-30912-Faktor H in basischem Methanol zeigt Absorptionsmaxima bei 245 nm (epsilon 14 700) und 290 nm, breites Peak (epsilon 3 500) und auch Endabsorption.

Das C magnetische Kernresonanzspektrum von A-30912 Faktor Ή in Perdeuteromethanol zeigt folgende Werte: .

delta 176,07, 174,15, 173,49, 172,56, 172,47, 169,88, 158,45, 133,01, 130,90,, 129,52, 129,04, 116,21, 82,15, 77,00, 75,98, 75,71, 71,27, 69,55, 69;42, 68,22, 62,44, 58,69, 57,25, 56,81, 56,08, 52,88, 51,32, 39,08, 38,60, 36,89, 32,65, 30,77, 30,45, 30,26, 28,18, 27,14, 26,55, 20,11, 19,60, 11,33,

A-30 912'-Faktor H hat die folgenden spezifischen Drehungswerte:

/alpha/^⁵ -40° (c 0,5, CH₃OH) /alpha/^₅ -151° (c 0,5, CHOH)

2 2 16 4

Elektrometrische Titration-von A-30912-Faktor H in 66-prozentigem wäßrigen Dimethylforraamid ergibt das Vorliegen einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 12,90

el

(Anfangs-pH 7,12). <

A-30912-Faktor H ist in vielen verschiedenen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Ethylacetat löslich, aber in unpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Diethylether und Petrolether unlöslich. A-30912-Faktor H ist auch in wäßrigen Lösungen, insbesondere solchen mit einem pH-Wert von über 7,0, löslich.

A-30912-Faktor H (Mol. Gew. 1073) unterscheidet sich von A-30912-Faktor A (Mol. Gew. 1059) nur durch 14 Masseeinheiten. Beide Verbindungen sind hinsichtlich.ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sehr ähnlich und bilden bei der Hydrolyse Linoleinsäure. A-30912H weist eine weitere -CH₂-Gruppe auf, die als -O-CH- anstelle einer der -OH-Gruppen in dem cyclischen Peptidteil des Moleküls vorliegt.

A-30912H und Tetrahydro-A-30912H haben die Strukturformeln. 4 und 5: . . -

OH

£ R¹ - Linoieoyl .3 R¹ - Stearoyl

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B. Homologe von A-30912-Faktor H

Nach der Aufklärung der Struktur von A-30912-Faktor H hat sich gezeigt, daß die niederen Alkyl (C₀-C,-) etherhomologen von A-30912-Faktor H wertvolle Produkte darstellen. Vor dieser Zeit hat sich gezeigt, daß die niederen Alkyletherderivate von A-30912-Faktor A keine wertvollen Eigenschaften haben, und sie wurden mir als Mittel für die Strukturermittlung hergestellt. Die niederen Alkyletherhomologen von A-30912-Faktor H werden aus A-30912-Faktor A hergestellt.

A-30912-Faktor A kann durch Fermentation von Stämmen der folgenden Mikroorganismen hergestellt werden:

1) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 (US-PS 4 024 245).

2) Aspergillus nidulans NRRL 8112 (US-PS 4 024 246).

3) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860 (CH-PS 568 386) oder

4) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (Be-PS 834 289).

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von A-30912-Faktor A durch Fermentation von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 ist in der Anmeldung der gleichen Anmelderin vom gleichen Tag mit dem internen Aktenzeichen X-5154A beschrieben..

C. Herstellung von A-30912-Faktor H

A-30912-Faktor H wird aus der A-30912-Antibiotikummischung isoliert. Die A-30912-Mischung kann wie in US-PS 4 024 24 5 angegeben hergestellt werden.

Stattdessen kann'A-30912-Faktor H aber auch aus der A-4235.5-Mischung isoliert werden. Die A-42355-Mischung wird durch Züchten einer neuen Varietät von Aspergillus

nidulans, die wie hierin beschrieben, als A. nidulans var, roseus, bezeichnet worden ist, hergestellt. Diese Kultur ist in der Kultürensammlung des Northern Regional Research Center U. S. Departmant of Agriculture, Agricultural Research, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 11440 für die Öffentlichkeit zugänglich ist.

Taxonomie von Aspergillus nidulans var. roseus

Die zur Erzeugung der A-30912~Antibiotika geeignete Kultur von Aspergillus niduians var. roseus ist von Thomas H. Sands der Lilly Research Laboratories untersucht und charakterisiert worden.

Zur Vereinfachung wird die neue Kultur Aspergillus nidulans var. roseus im folgenden als Kultur A-42355 bezeichnet. Die taxonomische Grundlage, worauf diese Kultur als neue Varietät von Aspergillus nidulans klassifiziert und als A. nidulans var. roseus bezeichnet worden ist, wird im folgenden abgehandelt. Bei dieser Abhandlung beziehen sich die .Bezeichnungen "ISCC-NBS" auf Farbhamen auf der Grundlage der ISCC-NBS-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd,

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"The ISCC-NBS-Methods of Designating Colors and A Dictionary of Color Names", U. S. Department .of Commerce, Circ. 553, Washington/ D. C. 1955). Die Bezeichung "Maerz. und Paul" bezieht sich auf Farbblöcke nach A. Maerz und M. R. Paul in "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, New York, N. Y., 1950.

Vergleiche beruhen auf der Arbeit von K. B. Raper und D. I. Fennel, "The Genus Aspergillus", Williams and Wilkins, 1965.

Die Kultur A-42355'erreicht einen Durchmesser von 14 mm in 7 Tagen und von 35 mm in 21 Tagen, wenn sie bei 25 ⁰C auf Czapek-Lösung-Agar gezüchtet wird. Die Oberfläche der Kolonie ist radial bucklig, konvex und zunächst samtartig bis schwach flockig. Das Aussehen der Oberfläche ändert sich mit dem Altern infolge der Bildung eines rosafarbenen Exudats, das nach erfolgtem Trocknen eine Pockenoberfläche ergibt. Der Randbereich ist stark gekerbt bis gelappt und scharf begrenzt, wobei nur spärliches peripheres Wachstum unter der Oberfläche erkennbar ist. Mit dem Altern der Kolonie verursachen Pigmentänderungen eine Gürtelwirkung. Die Rückseite der Oberfläche erscheint konkav und nur an der Peripherie in Berührung mit dem Agar. Es wird ein rosafarbenes lösliches Pigment gebildet. Die Mycelschicht ist sehr zäh und bildet keinen deutlichen Geruch. In jungen Kolonien wird die Pigmentierung durch unreife Conidien beeinflußt, die hellgrünlich gelb sind (ISCC-NBS 101 und Maerz und Paul 11-K-l). Diese Farbe ist schließlich auf die .Peripherie der Kolonie beschränkt. Nach 10 Tagen sind fast runde Massen von Hüllzellen, die schwärzlich purpurfarbene Cleistothecien umkrusten, über die gesamte Kolonie verteilt, sind aber am auffälligsten in der Mitte angehäuft. Nach 21 Tagen ist der schmale, etwas abgeflachte

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Randbereich grau-grünlich gelb (ISCC-NBS 105 und Maerz und Paul 12-1-2). Innerhalb dieses Randbereichs ist die Kolonie mäßig gelblich-rosafarben (ISCC-NBS 29 und Maerz und Paul 11-A-6), und die Färbung wird durch das Exudat beeinflußt. Nach 21 Tagen wird die Mitte durch gräulich-grüne Conidien und von Hüllzellen umkrustete schwärzlich-purpurfarbene Cleistothecien verdunkelt. Die Rückseite reicht von hellbraun (ISCC-NBS 57 und Maerz und Paul 13-A-7) bis mäßig rötlichbraun (ISCC-NBS 43 und Maerz und Paul 6-F-9). Nach 3 Wochen oder langer weist die Rückseite Schattierungen von sehr dunkel purpurfarben, nahezu schwarz auf.

Der Conidienkopf ist zuerst radiär und glänzend gelb und wird dann dunkelgrün und engsäulig. Im Zustand der Reife haben die Köpfe eine Länge von 93,4 bis 116,7 μπι und eine durchschnittliche Größe von 106 χ 47 μπι* Die Blase ist in etwa spateiförmig bis birnenförmig und wie die Conidiophoren hellbraun. Die Blasen sind über die oberen zwei Drittel fortpflanzungsfähig und haben Größen von 10 bis 12 χ 8 bis 10 μπι (Dxirchschnittsgröße 9,2 χ 11,3 μπι) . Die Conidiophoren sind gewunden, glatt und verhältnismäßig dickwandig. Ihre Länge reicht von 88 μπι bis 112 μπι (Durchschnitt 101 μπι) . Diese Dicke kann zwar 4 bis 6 μπι betragen, doch sind die meisten 6 μΐη dick.

Die Sterigmata sind beidseitig gezahnt, glasartig bis hellbraun und glattwandig. Primärsterigmata sind nahezu keilförmig. Ihre Länge reicht von 6,3 bis 10,3 μπι und ihre Dicke von 2 bis 3 μΐη an der dicksten Stelle (Durchschnittsgröße: 9,3 χ 2,7 μπι) . Sekundär sterigmata sind ei- bis birnenförmig und haben Größen von 5,5 bis 11,0 χ 2,4 bis 3,2 μπι (Durchschnittsgröße 9,9 χ 2.9 μπι) . Die Conidien sind kugelförmig, schwach gerauht bis stachelig und dunkelgrün. Ihr Durchmesser reicht von 2,4 bis 4,0 μΐη und der mittlere Durchmesser liegt bei 3,2 μπι.

- is -

Auf Malzextraktagar von 35 ⁰C bildet sich in· 7 Tagen eine Kolonie von 14 mm Durchmesser. In 21 Tagen erreicht der Durchmesser der Kolonie 30 mm. Anfangs besteht die Kolonie aus weißen Lufthyphen. Conidienbildung erfolgt in der ersten Woche, und die verhältnismäßig flache samtartige gekerbte Kolonie wird dunkelgelblich-grün (ISCC-NBS 137 und Maerz und Paul 24-J-6). Infolge konzentrischer Ringe gelber kugelförmiger Massen von Hüllzellen, die dunkle purpurfarbene Cleistothecien umgeben oder einkrusten, sieht die Kolonie gegürtelt aus. Der conidiogene Zustand auf Malzextraktagar ist diesem Zustand auf Czapek-Lösung-Agar mit Ausnahme der Abmessungen vergleichbar.

Conidienköpfe haben Längen vpn 100 bis 170 pm und Durchschnittsgrößen von 138 χ 50 μπι. Die Länge der 6 μπι dicken Conidiophoren reicht von 100 bis 210 pm (Durchschnitt 182 pm). Die Blasengrößen liegen zwischen 8 bis 12 χ 6 bis 12 pm (Durchschnittsgröße: 12 χ 9,2 pm). Die Größe der Primärsterigmaten liegt zwischen 5,5 bis 8,7 χ 2,4 bis 4..O pm (Durchschnittsgröße 7., 2 χ 6,6 pm).' Die Größe der Sekundärsterigmaten liegt zwischen 5,5 bis 10,3 χ 2,0 bis 3,6 pm (Durchschnittsgröße 7,4 χ 3,5 pm). Der Conidiendurchmesser liegt zwischen 2,3. und 3,2 pm, im Mittel aber bei 3,2 pm.

Die ascogene Form ist auf beiden AgarSorten praktisch gleich. Zahlreiche dunkelpurpurfarbene Cleistothecien sind mit kugelförmigen bis fast kugelförmigen dickwandigen glasigen bis blassgelben Hüllzellen mit einem Durchmesser von 32,6 bis 18,2 pm (Durchschnittsgröße' 15,3 pm) verkrustet. Die Cleistothecien sind kugelförmig bis nahezu kugelförmig und haben Wandungen bis zu drei Schichten dick, wobei die äußere Schicht aus pseudoparenchymatischen Zellen besteht. Der Durchmesser der Cleistothecien liegt zwischen 140 und 800 pm, in den meisten-Fällen 165 bis 250 pm bei einem

2 16

Durchschnittsdurchmesser von 229 μΐη. Die achtsporigen glasigen Asci sind kugelförmig bis fast kugelförmig oder unregelmäßig ellipsoid. Sind sie kugelförmig, dann haben sie einen Durchmesser von 9,2 μτα bei wenig Abweichung von dieser Größe. Ellipsoide Asci sind 9,3 χ 8,3 μπι groß. Die Ascosporen sind orangerot pigmentiert, kugelförmig in der Aufsicht und linsenförmig von der Seite gesehen. Zwei feingefaltete vollständige parallel äquatoriale Grate sind in der Längsachse der Seitenansicht zu erkennen. In der Aufsicht ist ein einziger Grat peripher zu dem Sporenhauptkörper zu erkennen, der glatt und von zweiklappiger Konstruktion ist. Der Grat ist 0,5 μΐη breit. Der Sporenkörper hat einen Durchmesser von 4,4 μπκ Die Durchschnittsgröße der Seitenansicht beträgt 4,7 χ 3,7 μΐη.

Gelblichgrüne leicht gerunzelte Conidien, säulenförmige Conidienköpfe, glattwandige hellbraune Conidiophoren und Blasen, beidseitig gezahnte Sterigmata und die Bildung von kugeligen dickwandigen Hüllzellen ordnen A42355 in die Aspergillus nidulans-Gruppe ein. Aufgrund dieser Eigenschaften in Verbindung mit der Tatsache, daß die Kultur einen ascogenen Zustand aufweist, worin dunkelpurpurfarbene kugelförmige Cleistothecien mit Hüllzellen (siehe oben) eng verbunden oder sogar damit verkrustet sind und •organgerote linsenförmige Ascosporen aufweist, die mit zwei gefalteten parallel äquatorialen Graten versehen sind, gehört A42355 zum Genus Emericella, der vollkommenen Form der A.· nidulans-Gruppe.

A42355 entspricht nicht vollständig der Beschreibung der verschiedenen veröffentlichten Species oder Varietäten in der A. nidulans-Gruppe. Die A42355 am nächsten kommende Species ist A. nidulans (Eidam) Wint. aufgrund der Typkultur WB 187 (NRRI. 187). Diese Kulturen sind hinsichtlich

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Farbq und. Ascosporentyp vergleichbar, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Gratbreite. Die Cleistothecien sind ähnlich, aber die Wandung von A42355 besteht aus einer Mehrfachschicht von Zellen anstelle einer einzigen Schicht. Beide Kulturen zeigen eine gelbgrüne, überwiegend conidiale Stufe auf Malzextraktargar, aber die ascogene Form von A42355 ist stärker ausgeprägt als die der Typkultur, bei der sie teilweise überwachsen und trüb pigmentiert ist. Bei beiden Kulturen sind die Hyphen, Conidiophoren und Blasen glattwandig ohne Verkrustung. Die Blasen von A42355 sind jedoch spatel- bis birnenförmig, wohingegen die Blasen von A. nidulans halbkugelförmig sind. Bei der Züchtung auf Czapeklösung-Agar unterscheiden sich Kolonien von A42355 und A. nidulans hinsichtlich Wachstumsgeschwindigkeit, Exudatbildung, Anzahl und Größe der Conidienköpfe und der meisten anderen Abmessungen.

Wenn auch zwischen A42355 und A. nidulans (Eidam) Wint. Ähnlichkeiten bestehen, so bestehen doch andererseits genügend signifikante Unterschiede, weshalb A42355 als neue Varietät anzusehen ist, die die Bezeichnung A. nidulans var. roseus erhalten hat.

Züchtung von A. nidulans var. roseus

Das zur Züchtung von A. nidulans var. roseus verwendete Nährmedium kann jedes aus einer Reihe von Medien sein, wobei jedoch bestimmte Nährmedien wegen der Einfachheit ihrer Herstellung, optimaler Ausbeute und der leichten Isolierung des Produkts bevorzugt sind. So ist beispielsweise eine bevorzugte Kohlenstoffquelle für Fermentationen in großtechnischem Maßstab Baumwollsaatöl oder Glucose, doch können auch Melasse, Stärke, Dextrin, Lactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Fettsäuren und dergleichen verwendet werden. Bevorzugte Ausgangsmaterialieri für Stickstoff sind enzymhydrolysiertes Casein, Sojabohnenmehl und lösliches

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Fleischpepton, doch können auch Rückstände der Korndestillation, Nitrate, Mononatriumglutamat und dergleichen, verwendet werden. Anorganische Nährsalze können in das Nährmedium aufgenommen werden. Hierzu gehören die üblichen löslichen Salze, die Ionen von Natrium, Magnesium, Zink, Eisen, Calcium, Ammonium, Chlor, Carbonat, Sulfat, Nitrat, Phosphat und dergleichen liefern.

Wesentliche Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus nötig sind, sollen gleichfalls in das Nährmedium aufgenommen werden. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des-Mediums in Mengen vor, die den Wachsturnserfordernissen des Organismus genügen.

Es kann erforderlich sein, geringe Mengen (d. h. 0,2 ml/1) eines Schaumverhütungsmittels, wie Polypropylenglykol, Fermentationsmedien zuzusetzen, wenn die Schaumbildung Schwierigkeiten bereitet.

Zur Erzeugung' beträchtlicher Mengen der A-30912-Antibiotikummischung ist submerse, aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen der A-30912-Antibiotikummischung können durch Schüttelflaschenkultüren erhalten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung der Antibiotikumbildung, die gewöhnlich als Folge der Inokulierung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus auftritt, ist es vorzuziehen, ein vegetatives Inokulum zu verwenden. Das vegetative Inokulum wird durch Beimpfen eines kleinen Volumens Nährmedium mit der Sporenform oder Mycelfragmenten des Organismus hergestellt, wodurch eine frische kräftig wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank überführt. Das zur Züchtung des vegetativen Inokulums 'verwendete Medium kann das gleiche sein wie das für die Fermentationen

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in größerem Maßstab verwendete, aber es können auch andere Medien verwendet werden.

A. nidulans var. roseus NRRL 11440 kann bei Temperaturen zwischen 20 und 43 ⁰C gezüchtet werden; der Organismus wächst am besten bei Temperaturen von 30 bis 37 ⁰C. Optimale Erzeugung der A-30912-Antibiotikummischung erfolgt bei Temperaturen von etwa 30 ⁰C.

Wie bei submersen aeroben Züchtungsverfahren üblich, wird durch das Nährmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung einer guten Antibiotikumbildung soll die Belüftung und Eewegung zur Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von wenigstens 40 % Luftsättigung bei Atmosphärendruck ausreichen. Rühren oder Schütteln dient auch zum Aufbrechen des dicken und kräftigen Kulturwachstums während der Fermentation.

Die Erzeugung.der A-30912-Antibiotikummischung kann während der Fermentation durch Untersuchung von Proben des fermentierten Nährmediums oder alkoholischer Extrakte der Biomasse oder der gesamten Maische auf antibiotische Aktivität gegenüber einem Organismus verfolgt werden, von dem bekannt ist, daß er gegenüber den A-30912-Antibiotika empfindlich ist. Ein für die Prüfung auf das Vorhandensein von A-30912-Antibiotika geeigneter PrüfOrganismus ist Candida albicans. Die Bioprobe erfolgt zweckmäßigerweise mit Hilfe der Papierscheiben- oder Agarquellprobe auf besamten Agarplatten.

Antibiotische Wirksamkeit kann im allgemeinen am zweiten Fermentationstag nachgewiesen werden. Maximale Bildung.an antibiotischer Aktivität"erfolgt gewöhnlich zwischen dem sechsten und achten Tag. . .

1 6 4

Α~309'ί 2-Faktor H kann durch Dünnschichtchromatographie (TLC) identifiziert und von dem übrigen Teil der A-30912-Mischüng abgetrennt v/erden. Kieselgel ist ein bevorzugtes Adsorbens. In Figur 2 der beigefügten Zeichnungen ist die Bewegung von A-3O912H im Verhältnis zu der der übrigen A-30912-Faktoren in einem Kieselgel TLC-Systern dargestellt. Die R_f-Werte der A-30912-Faktoren A, B, C, D und H in verschiedenen Lösungsmittel systemen, unter Verwendung von Kieselgel TLC (Merck-Darmstadt'Kieselgel # 60 Platten, 20 χ 20 cm) und Nachweis durch Candida albicans Bioautographie sind in Tabelle.I angegeben.

Tabelle

A-30912 Faktor

Faktor A Faktor B Faktor C Faktor D Faktor H

Lösungsmittelsysterne

a: Ethylacetat;Methanol (3:2) b: Ethylacetat:Methanol (7.: 3) c_: Acetonitril:Wasser (95:5) d: Ethylacetat:Ethanol Essigsäure (40:60:0,25)

R_f-Werte	- Lösungsmittelsysteme	C	d
a	b	0,28	0,43
0,28	0,14	0,42	0,47
0,39	0,21	0,51	0,58
0,46	0,31	0,57	0,61
0,50	0,38	0,36	0,53
0,42	0,27

A-30912-Faktor H kann nach auf dem Fermentationsgebiet bekannten Verfahren aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die beste Gewinnung wird durch Extraktion der Gesamtmaische erreicht. Vorzugsweise wird ein gleiches Volumen Methanol zu der Gesamtmaische gegeben und der pH-Wert der Gesamtmaische vor der Extraktion auf etwa 4 bis 6 eingestellt. Chloroform ist ein besonders vorteilhaftes Lösungsmittel für die Extraktion von A-30912-Faktor K, doch können auch andere vergleichbare Lösungsmittel verwendet werden. .

A-30912-Faktor H kann aus der abgetrennten A-30912- oder A-42355-Mischung durch Chromatographie unter Verwendung verschiedener Adsorbentien isoliert werden. Zu geeigneten Adsorbentien gehören Kieselgele, wie Quantum L'P-1 ; ümkehrphasenharze, wie Kieselgel/Cg, Kieselgel/C.g, LiChroprep RP-8 oder RP-18; Florisil; Sephadex G~25, LH-2O und G-15; Aluminiumoxid; Diaion HP-2O und Amberlite XAD-4 und X-384. Diaion ist von Mitsubishi Chemical Industries, Tokyo; die Amberlite-Harze sind von Rohm und Haas Co., Philadelphia, Pa.; die Sephadex-Harze von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden? Florisil von Floridin Co., Tallahassee, Fla und Kieselgel/Cg, Kieselgel/C.g, LiChroprep RP-8 und RP-18 von Έ'. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, erhältlich'. Die Herstellung eines Kieselgel/Cjo mit hoher Beladungsfähigkeit aus LP-1 Kieselgel (Whatman) ist in Beispiel 6 beschrieben.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Endreinigung der A-30912-Antibiotika ist die Umkehrphase-Hochleistungs-Niederdruck- . Flüssigkextschromatographie (HPLPLC) unter Verwendung von . Kieselgel/C..ο als Adsorbens. Bei diesem Verfahren wird eine A-30912-oder A-42355-Mischung (beispielsweise durch Extraktion der filtrierten Maische mit Chloroform erhalten) in einem Lösungsmittel gelöst und auf eine mit dem gleichen Lösungsmittel äquilibrierte Säule aufgebracht. Die Säule wird dann mit dem Lösungsmittel eluiert. .Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) ist ein bevorzugtes Lösungsmittelsystem. Die aufgefangenen Fraktionen werden durch Bioautographie mit Candida albicans und/oder mit Hilfe von UV-Licht (auf der Grundlage relativer Rückhaltzeiten) geprüft. Die den gewünschten A-30912-Faktor enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. In manchen Fällen ist es nötig, eine weitere chromatographische Trennung durchzuführen, um den A-30912-Faktor H in gereinigter Form zu erhalten.

A-30912-Faktoren A, B, D und H können durch Hochleistungs-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen getrennt werden:

Säule: Glas, 0,8 χ 15,0 cm

Füllung: Nucleosil^^R' ¹°-C₁₈ (Machery-Nagel

arid Company); nach der Aufschlämmungs füllmethode von Beispiel 7 gefüllt

Lösungsmittel: Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) Proben: 8 μΐ

Probengewicht: 8 μg

- - 24 -

Säulentemperatur: Zimmertemperatur

FJLießgeschwindigkeit: . 1,8 ml/Min. Druck: 14 bar (200 psi)

Kachweismittel: UV von 222 nm (ISCO'Model 1800

Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor)

Pumpe: LDC Duplex Minipump

Injektion: Schleifeninjektion

Die angenäherten Rückhaltzeiten für A-30912-Faktoren A, B, D und H unter diesen Bedingungen sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Rückhaltzeit A-30912-Faktore (Sekunden).

A 792-

B 870

H 990

D 1 140

Tetrahydro-A-30912H kann durch übliche Hydrierungen hergestellt werden, wobei die Reduktion fortgesetzt wird, bis beide Doppelbindungen der Linoleoylseitenkette reduziert sind. .

1643

D. Herstellung der A-30912H-Homologen

Die A-30912H-Antibiotika der Formel I, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet (die A-30912H-Homologen) werden durch Umsetzung von A-30912-Faktor A oder Tetrahydro-A-3091 2A mit dem entsprechenden Alkohol in das gewünschte C^-Cg-Alkyletherderivat übergeführt. Da A-30912-Faktor A der Hauptbestandteil der Antibiotikummischungen darstellt, in denen er anfällt, handelt es sich bei diesem Verfahren auch um eine bevorzugte Art der Herstellung von A-30912-Faktor H und Tetrahydro-A-3091 2H.

Die A-30912H-Homologen der Formel I, worin R eine Stearoylgruppe und R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, können durch (a) Herstellung von Tetrahydro-A-3091 2A und Umsetzung mit dem entsprechenden Alkohol zu dem Etherderivat oder (b) Umsetzung von A-30912-Faktor A mit dem entsprechenden Alkohol zu dem Etherderivat und anschließende Reduktion der Doppelbindungen der Linoleoyl-Seitenkette hergestellt werden.

Tetrahydro-A-30912A, Tetrahydro-A-30912H und die Verbindungen der Formel I, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R eine Stearoylgruppe bedeutet, werden aus den A-30912-Faktoren A und H und aus den Verbindungen der Formel I, worin R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und R eine Linoleoylgruppe bedeutet, durch übliche Hydrierung hergestellt, wobei die Reduktion durchgeführt wird, bis beide-Doppelbindungen der Linoleoylseitenkette reduziert sind.

Die Antibiotika vom Typ A-30912H sind antifungale Mittel, die gegen Candida-Species besonders wirksam sind. Die er-

findungsgemäß erhältlichen Produkte können daher zur Behandlung von Pilzinfektionen von Säugern verwendet werden, wobei dem Lebewesen eine wirksame Menge eines Antibiotikums vom Typ A-3O912H verabreicht wird. Die Prüfungsergebnisse, die diese antifungale Wirksamkeit veranschaulichen, sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Bei diesen Prüfungen wurde die antifungale Wirksamkeit durch die 'Scheibendiffusionsmethode bestimmt (6 mm-Scheiben werden in die Prüfverbindungen enthaltende Lösungen eingetaucht und auf mit dem Testorganismus besamte Agarplatten aufgebracht) . In Tabelle III ist die Mindestinhibierungskonzentration (MIC) je Scheibe angegeben, bei der A-3O912H den Testorganismus inhibiert.

T a b e 1 1 e III

Testorganismus MIC ^g/Scheibe)

Candida albicans 1,25

. Trichophyton inentagrophytes 0,078

In Tabelle IV sind die Durchmesser (in mm). der Inhibierungs-.zone für repräsantive Vertreter der A-30912H-Typ-Derivate angegeben. Bei den Prüfverbindungen handelt es sich um Verbindungen der Formel I, worin R eine Linoleoylgruppe bedeutet. Die Scheiben wurden in 10 mg/ml Prüfverbindung enthaltende Lösungen eingetaucht.

2 18 4 3

Tabelle IV

Testorganismus	R =	Neurospora crassa	Zonendurchmesser	(mm)
Candida albicans	n-Propyl R =	n-Hexyl
Trichophyton mentagrophvtes	20	25
16	14
35	35

Bei üblichen Agar-Verdünnungstests zeigt Α-3Ο912Ή Mindestinhibierungskonzentratidnen von 100 μg/ml gegenüber Blastomyces dermatitidis und Histoplasma capsulatum.

Die A-30912H-Typ-Antibiotika' sind verhältnismäßig untoxisch. Bei ihrer Verwendung als antifungale Mittel werden sie parenteral und üblicherweise zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel angewandt. Die angewandte Dosierung hängt von einer Reihe verschiedener Voraussetzungen ab, z.B. der Art und Schwere der jeweiligen Infektion.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

22i6Ad - 28 -

Beispiel 1

Herstellung von A-30912-Faktor H aus A-42355-Mischung A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Aspergillus riidulans var. roseus NRRL 11440 wird auf einer 18 χ 150 mm Agarschräge aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt und erhalten.

Bestandteil Menge

Glucose

Hefeextrakt

CaCO₃

Pflanzensaft*

Agar**

entionisiertes Wasser auf

(Anfangs pH 6,1)

*V-8 Saft, Campbell Soup Co., Camden, N. J. **Meer Corp.

Die mit Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 beimpfte Schräge wird etwa 7 Tage bei 25 ⁰C inkubiert. Die reife Kultur wird mit Wasser bedeckt und mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen gekratzt. Die so erhaltene Suspension wird mit 10 ml sterilem entionisierten Wasser aufgenommen.

1 ml der so erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 55 ml vegetativen Mediums in einem 250 ml Kolben verwendet. Das vegetative Medium hat folgende Zusammensetzung:

5	g
2	g
3	g
200	ml
20	g
1	Liter

2 21643

25	g
36	g
6	g.
10	g
2	g
10	g
1100	ml

Bestandteil " Menge

Saccharose Portwein-Melasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymatisches Hydrolysat von Casein*

Leitungswasser

(Anfangs-pH 6,5-6,7) . *N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N. J.

Das inokulierte vegetative Medium wird bei 25 ⁰C 48 Stunden auf einer Rundschüttelvorrichtung bei 250 U/Min, inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit in einer Mischvorrichtung (Waring) homogenisiert und dann die übrigen 24 Stunden inkubiert." Stattdessen kann das inokulierte vegetative Medium aber auch 48 .Stunden inkubiert und dann 15 Sekunden bei geringer Geschwindigkeit homogenisiert werden.

.Dieses inkubierte vegetative Medium kann zum Beimpfen von Schüttelkolbenfermentationskulturmedium oder zum Inokulieren eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann es für eine spätere Verwendung gelagert werden, wobei es in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gehalten wird. Für eine derartige Lagerung wird die Kultur in einer Mehrzahl von kleinen Phiolen folgendermaßen hergestellt. . .

Die vegetativen Kulturen werden mit gleichen Volumina einer Suspendierlösung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

I h 4 ö - 30 ~

Bestandteil Menge

Glycerin 20 ml

Lactose ' 10 g entionisiertes Wasser auf 100 ml

Die Suspensionen werden auf kleine sterile 4 ml Schraubyerschlußrohre verteilt. Diese Rohre werden in der Gasphase von flüssigem Stickstoff.aufgehoben.

Eine so hergestellte gelagerte Suspension kann zum Inokulieren von Agarschrägen oder flüssigen Medien verwendet werden. Die Schrägen werden bei 25 ⁰C im Licht 7 Tage inkubiert. . - '

B. Tankfermentation

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zu 400 ml eines' vegetativen Nährmediums der zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung verwendet. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 1 Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 U/Min, rotiert.

800 ml des wie oben beschrieben hergestellten inkubierten Mediums der zweiten Stufe werden zum Inokulieren von 100 sterilen Produktionsmediums mit einer der folgenden Zusammensetzungen verwendet:

2 2 1 6

Medium I

Bestandteil Menge

ZnSO₄.7H₂O 0,00455 g/l

lösliches Fleischpepton* 30,5 g/l

Sojabohnenmehl - 15,5 g/l

Tapioca-Dextrin** 2,0 g/l

Portwein-Melasse 10,5 g/l

enzymatisches Hydrolysat

von Casein*** 8,5 g/l

Na₃HPO₄ 4,5 g/l

MgSO₄.7H₂O · 5,5 g/l

FeSO₄.7H₂O .0,1 g/l

Baumwollsaatöl 40,0 ml

(Antifoam)**** 1,0 ml Leitungswasser 1000,0 ml

(Anfangs-pH 6,8-7,0)

*0.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

**Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

***N-Z-Amine A, Huiriko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

****P2000, Dow Corning, Midland, Mich.

Medium II Bestandteil . Menge

Glucose 2,5.%^

Stärke 1,0 %

lösliches Fleischpepton* 1,0 %

Portwein-Melass 1,0 % CaCO₃ . 0,2 %

MgSO₄.7H₂O 0,05 %

enzymatisches Hydrolysat von

Casein** . 0,4 %

(Antifoam)*** 0,02 % Leitungswasser · . zum Auffüllen

*0.M. Peptone **N-Z-Amine A

***Antifoam "A", Dow Corning

Das inokulierte Produktionsmedium überläßt man in einem Fermentationstank von 165 1 Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 25 ⁰C 7 Tage der Fermentation. Dabei wird mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von etwa 50 % der LuftSättigung belüftet.

C. Vegetatives Medium der dritten Stufe

I-mmer dann, wenn die Fermentation in größeren Tanks als für 100 1 Fermentationen durchgeführt wird, ist zu empfehlen, daß zum Beimpfen' der größeren Tanks eine vegetative Kultur der dritten Stufe verwendet wird. Ein bevorzugtes vegetatives Medium der dritten Stufe hat folgende Zusammensetzung:

25	g
25	g
6	g
10	g
10	g
2	g
1000	ml

2 2 16 4 3- - 33 -

Bestandteil Menge .

Saccharose Portwein-Melasse Maisgueliwasser

enzymatisches Hydrolysat von Casein*

Malzextrakt K₂HPO₄

Leitungswasser

(Anfangs-pH 6,1) *N-Z~Case

D. Abtrennung der A-42355-Mischung

Die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Produktionsmedium II erhaltene Gesamtfermentationsmaisehe (4127 1) wird 1 Stunde lang gründlich mit 4280 1 Methanol verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Super-cel, eine Diatomeenerde, Johns Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird unter Verwendung von 5n HCl auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von 20 1 eingeengt. Dieses Konzentrat wird zu 200 1 Diethylether gegeben, wodurch die A-42355-Mischung ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und man erhält 2775 g der A-42355-Mischung als grau-weißes Pulver.

Beispiel 2 Isolierung von. A-30912-Faktor H aus der A-42355-Mischung

5_t0 g der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten A-42355-Antibiotikummischung werden in 35 ml Methanol: Wasser!Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und auf eine 42 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm (Michel-Miller-' Column) mit Hilfe eines Ventilsystems durch eine Schlaufe aufgebracht. Die Säule war wie in Beispiel 7 beschrieben mit LP-1/C.gKieselgel-Uinkehrphasenharz (10 - 20 Mikron) in Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1) gefüllt worden. Das Lösungsmittel wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 13 ml/Min, bei etwa 8,4 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch die Säule geführt, wobei alle 2 Minuten eine Fraktion aufgefangen wird. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 ran, wie in Beispiel 3 beschrieben, verfolgt. Die Fraktionen 112 bis 132 werden mit den Fraktionen 106 bis "117 einer zweiten gleichartigen Reinigung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 173 raq roher A-3.09.1 2-Faktor H erhalten werden.

2 2 16 4 3 - 35 -

150 mg des rohen A-30912-Faktor H werden in 8 ml Methanol: 'Wasser!Acetonitril (7:2:1) gelöst, die gebildete Lösung wird filtriert und auf eine 32 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 2,0 cm, wie oben beschrieben, aufgegeben,. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Min, bei.5,6 bar, wie in Beispiel 3 beschrieben, durch die Säule geführt, wobei alle 3 Minuten eine Fraktion aufgefangen wird. Die Elution des Antibiotikums wird wie in Beispiel 3 beschrieben, bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 17 und 18 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 29 mg A-3O9T2-· Faktor H erhalten werden. .

Beispiel 3 Isolierung von A-30912-Faktor K aus einer A-30912-Mischung

6 g einer wie in US-PS 4 024 245 angegeben hergestellten A-30912-Antibiotikum-Mischung werden in 33 ml Methanol: Wasser:Acetonitril (7:2:1) gelöst, filtriert und auf eine 45 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 4,7 cm /Michel-Millex High Performance Low Pressure (HPLPLC) Chromatograph Column, Ace Glass, Inc., Vineland, NJ 08360/ durch eine Schlaufe mit Hilfe eines Ventilsystems aufgegeben. Die Säule war mit dem in Beispiel 6 beschriebenen LP-1/C.jo Kieselgel-Umkehrphasenharz (10 - 20 Mikron) unter Verwendung von Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) nach der in Beispiel 7 beschriebenen Aufschlämmfüllmethode gefüllt worden. Zur Förderung des-Lösungsmittels durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 14 ml/Min. (7 bar) wird eine F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung verwendet (Höchstfluß 19,5 ml/Min). Es werden Fraktionen von jeweils etwa 14 n?l aufgefangen. Die

2 2 16 4 8

Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Geräts (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Type 6) bei 280 nm verfolgt.

Die Fraktionen 109 bis 151 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem öl eingeengt. Dieses öl wird in 50 ml tert.-Butanol gelöst. Durch Lyophilisieren der Lösung werden 2,927 g A-30912-Faktor A erhalten. :

Die Fraktionen 152 bis 185 werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem ΟΓ eingeengt. Dieses öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Eutanol gelöst, und die Lösung wird gefriergetrocknet, wodurch 46,6 mg.roher A-30912-Faktor H erhalten werden.

B e i s ρ i e 1 4

Reinigung von A-30912-Faktor H

59-7 mg des wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten teilweise gereinigten.A-30912-Faktor H werden in 3 ml Methanol :Wasser:Acetonitril (7:2:1) gelöst, filtriert und auf eine 35 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 crn (Michel-Miller Column) mit Hilfe eines Ventilsystems durch eine Schlaufe aufgebracht. Die Säule war mit LP-V/C.g Kieselgel-Ümkehrphasenharz, wie in Beispiel 3 beschrieben, in Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1) gefüllt worden. Das Lösungsmittel wird mit einer. Fließgeschwindigkeit von 7,5 ml/Min. (7 bar) durch die Säule geführt, wobei jede Minute eine Fraktion aufgefangen wird. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 nm mit einem UV-Gerät (ISCO Model UA-5) mit einer optischen Einheit (ISCO Type 6) verfolgt.

2 21

Die Fraktionen 159 bis 190 werden vereinigt und zu 100 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird mit 1n HCl auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die beiden Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird in einer Lösung aus 20 ml tert.-Butanol und einigen ml Methanol gelöst. Durch Gefriertrocknung der Lösung werden 222 mg gereinigter A-30912-Faktor H erhalten.

Beispiel 5 Herstellung von Tetrahydro-A-30912H

Wie in Beispiel 2 oder. 4 beschrieben hergestelltes A-3O912H wird in Ethanol gelöst. PtO₂ wird in Ethanol zu Pt reduziert,-das seinerseits'zur katalytischen Reduktion von A-3O912H. bei einem positiven Wasserstoffdruck bis zur vollständigen Umsetzung (etwa 2 bis 3 Stunden) verwendet wird. Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst und gefriergetrocknet, wodurch Tetrahydro-A-30912H erhalten wird.

Beispiel 6

Herstellung von Kieselgel/C₁₈~Umkehrphasenharz

Stufe 1: Hydrolyse

1000 g LP-1 Kieselgei (Quantum Corp., nun Whatman) werden zu einer Mischung von 1650 ml konzentrierter Schwefelsäure mit 1650 ml konzentrierter Salpetersäure in einem 5 1 Rundkolben gegeben und bis zur Ausbildung einer guten

Suspension geschüttelt. Die Mischung wird über Nacht (16 Stunden) auf einem Dampfbad erwärmt, wobei der Kolben mit einem Wasserkühler versehen ist..

Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt und sorgfältig unter Verwendung eines Sinterglastrichters filtriert. Das Kieselgel wird mit entionisiertem Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. Dann wird es mit 4 1 Aceton gewaschen und 2 Tage im Vakuum bei 100 ⁰C getrocknet.

Stufe 2: Erste Silylierung

Das in Stufe 1 erhaltene trockene Kieselgel wird in einem Rundkolben in 3,5 1 Toluol suspendiert. Der Kolben wird 2 Stunden auf einem Dampfbad erwärmt, wodurch etwas zurückgebliebenes Wasser azeotrop entfernt wird. 321 ml Gctadecyltrichlorsilan (Aldrich Chemical Company) werden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird über Nacht (16 Stunden) unter mäßigem mechanischen Rühren bei 60 ⁰C zum Sieden unter Rückfluß erwärmt. Dabei wird dafür gesorgt, daß der Rührer der Kolbenwandung nicht nahe kommt, um ein Vermählen der Kieselgelteilchen zu vermeiden.

Nach Abkühlenlassen der Mischung wird das silanisierte Kieselgel abfiltriert, mit 3 1 Toluol und 3 1 Aceton gewaschen und über Nacht (16 bis 20 Stunden) an der Luft getrocknet. Das getrocknete Kieselgel wird in 3,5 1 Acetonitril:Wasser (1:1) in einem "5 1 Kolben suspendiert, bei Zimmertemperatur 2" Stunden sorgfältig gerührt, mit 3 1 Aceton gewaschen und über Nacht an der Luft getrocknet.

16 4 3 - 39 -

Stufe 3: Zweite Silylierung

Die in der ersten Silylierung angewandte Arbeitsweise wird unter Verwendung von 200 ml Octadecyltrichlorsilan wiederholt. Die Suspension wird 2 Stunden bei 6.0 ⁰C zum Sieden unter Rückfluß erwärmt, wobei· sorgfältig gerührt wird. Das schließlich gebildete Produkt wird abfiltriert, mit 3 1 Toluol und 6 1 Methanol gewaschen und im Vakuum bei 50 ⁰C über Nacht (16 bis 20 Stunden) getrocknet.

Beispiel 7

Aufschlämmfüllverfahren für Michel-Miller-Säulen Allgemeine Angaben;

A. Nach dieser Arbeitsweise können Säulen für analytische oder präparat-ive Zwecke gefüllt werden.

B. Kieselgel- und KieselgeJ.-Umkehrphasenfüllungen (z. B. Quantum LP-1, Teilchengröße 10 bis 20 Mikron; LiChroprep RP-8 und RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Mikron) sind zu empfehlen. Andere Kieselgele (z. B. Shandons ODS Hypersil, Teilchengröße 5 Mikron) sowie andere Arten von Harzen sind jedoch gleichfalls mit Erfolg verwendet worden.

C. Im allgmeinen sind Drucke von weniger als 14 bar und Fließgeschwxndigkeiten zwischen 5 und 40 ml/Min, für diese Aufschämmfülltechnik erforderlich. Im einzelnen richten sich die Werte nach Säulenvolumen und Umfang. Zu beachten ist folgendes: Der Druck beim Füllen soll um 2 bis 3,5 bar höher sein als der bei der Trennung angewandte Druck. Dadurch wird sichergestellt, daß während der Trennungen keine

1 6 43 - 4o -

weitere Kompression des Adsorbens erfolgt» Auf diese Weise können mit Umkehrphasenkieselgel gefüllte Säulen ohne Wirksamkeitseinbuße mehrere Jahre betrieben werden.

D. Plötzliche Erniedrigung des Drucks kann die Bildung von Sprüngen oder Kanälen in dem Füllungsmaterial verursachen, die das wirksame Arbeiten der Säule stark beeinträchtigen. Deshalb ist es von Bedeutung für ein langsames Abfallen des Drucks auf 0 zu sorgen, wenn die Pumpe abgestellt worden ist. .

E. Ungefähres Volumen der Säulen (Ace Glass Cat. No., ungepackt): 5795-04, 12 ml; 5795-10, 110ml; 5795-16, 3OO ml; 5795-24, 635 ml und 5796-34, 34 ml.

F. Die zum Füllen einer Glassäule erforderliche Zeit liegt je nach Säulenumfang und Geschicklichkeit zwischen Minuten und mehreren Stunden.

Beispiel.;

1. Die Glassäule wird über eine Kupplung mit einer Vorratssäule verbunden (das Volumen der Vorratssäule soll doppelt so groß sein wie das der Säule). Beide Säulen werden mit der Vorratssäule oben in senkrechte Stellung gebracht.

2. Das Füllmaterial wird abgewogen (100 g für eine Säule von 200 ml).

3. Das Füllmaterial wird mit 5 Volumina Lösungsmittel, und zwar -einer Mischung aus 70 bis 80 % Methanol und 20 bis 30 % Wasser, versetzt.

2 2 1 64.3 - 41 -

4. Dann wird gut geschüttelt bis alle Teilchen befeuchtet sind, und über Nacht oder langer stehengelassen, damit eine vollständige Tränkung der Teilchen durch Lösungsmittel gewährleistet wird. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen.

5. Das Harz wird mit zur Füllung der Vorratssäule ausreichendem Lösungsmittel aufgeschlämmt und dann schnell in diese eingegossen. Dabei ist zu beachten: Die Säule muß mit dem gleichen Lösungsmittel vorgefüllt und die Vorratssäule soll vor dem Eingießen der Aufschlämmung mit Lösungsmittel teilweise gefüllt sein. Die Verwendung grösserer Aufschlämmungsvolumina kann gleichfalls zu guten' Ergebnissen führen, doch erfordert dies (a) einen größeren Vorratsraum oder (b) mehrere Vorratsraumfüllungen während des Einfüllvorgangs.

6. Die Vorratssäule wird mit dem Teflonstopfen unterhalb der Säule, geschlossen (vergleiche Figur 1 von US-PS 4 131 547, Stopfen Nr. 3), dann wird mit der Pumpe verbunden und sofort mit dem Pumpen von Lösungsmittel durch das System bei einer Höchstfließgeschwindigkeit von 20 ml/Min. wenn Ace Cat. No. 13265-25 Pumpe oder ein vergleichbares Losungsmittelabgabesystem verwendet wird, begonnen.

7. Diese Arbeitsweise wird fortgesetzt, bis die Säule vollständig, mit Adsorbens gefüllt ist. Der Druck soll die Höchsttoleranz der Säule während dieses Vorgangs nicht übersteigen (14 bar für große Säulen und 21 bar für Analysensäulen) . In den meisten Fällen genügen Drucke von weniger als 14 bar.

2 2 1 643"

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8. Wenn der Druck Höchstwerte übersteigt, wird die Fließgeschwindigkeit vermindert', wodurch der Druck fällt.

9« Nach Füllung der Säule mit Adsorbens wird die Pumpe abgestellt, der Druck auf null abfallen gelassen und die Verbindung zur Vorratssäule gelöst. Die Vorratssäule wird durch eine Vorsäule ersetzt, die mit Lösungsmittel und einer kleinen Menge Adsorbens gefüllt wird, wonach bis zur vollständigen Füllung der Säule mit Höchstdruck gepumpt wird. Bezüglich weiterer Hinweise siehe Beispiel 7.

Zu beachten:

Nach dem Abstellen der Pumpe· muß dafür gesorgt werden, daß der Druck immer langsam abfällt, dadurch wird die. Bildung von Sprüngen oder Kanälen in dem Füllmaterial vermieden.

10. Nach Aufheben des Drucks wird die Verbindung zur Vorsäule sorgfältig gelöst. Einige mm (2 bis 4 mm) der Füllung werden mit einem kleinen Spatel vom oberen Ende der Säule entfernt. Auf das obere Ende der Säule werden 1 oder 2 Filter gelegt, die gelinde auf das Füllmaterial aufgedrückt werden, worauf der Teflonstopfen bis zu festem Verschluß auf die Säule.aufgebracht wird. Die Säule wird mit der Pumpe verbunden, worauf Druck angelegt wird (gewöhnlich weniger als 14 bar) und durch die Glaswandung am oberen Ende der Säule beobachtet wird/ ob sich das Harz noch weiter zusammenpackt. Sollte sich das Füllmaterial noch weiter absetzen (was bei größeren Säulen der. Fall sein kann), erscheint ein kleiner Leerraum oder Kanalbildung, und die Stufe 9 sollte wiederholt werden.

16 43 _₄₃_

Beispiel 8 Herstellung von ä-30912-Faktor H aus Ä-30912-Faktor A

A-30912-Faktor H wird nach folgender Arbeitsweise aus A-30912-Faktor A hergestellt:

19,6 mg Antibiotikum A-30912-Faktor A werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst. 0,06 ml eines 3 % HCl enthaltenden Methanols werden zu dieser Lösung gegeben, und die erhaltene Lösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene'Rückstand wird wie·in Beispiel 2 beschrieben durch Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie (HPLPLC) unter Verwendung von Umkehrphasenkieselgel (LP-1/C..g, hergestellt wie in Beispiel .6 beschrieben) und CH₃OHrH₂OtCH₃CN (7:2:1) als Elutionslösungsmxttel chromatographiert, wodurch 1,4 mg A-30912-Faktor H erhalten werden (die Verbindung der Formel I, worin R eine Methylgruppe und R die Linoleoylgruppe bedeuten).

Beispiel 9

Das A-3091 2H--Typ~Antibiotikum der Formel I, worin R eine Ethylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode hergestellt und gereinigt, wobei jedoch Ethanol anstelle von Methanol für die Umsetzung verwendet wird.

Beispiel 10

Das A-3Q912H-Typ~Antibiotikum der Formel I, worin R eine n-Propylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt und gereinigt mit der Ausnahme, daß anstelle von Methanol n-Propanol bei der Umsetzung verwendet wird.

Beispiel 11

Das A-30912H-Typ-Antibiotikum der Formel I, worin R eine Isobutylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode hergestellt und gereinigt, wobei jedoch Isobutanol anstelle von Methanol bei der Umsetzung verwendet wird.

Beispiel 12

Das A-30912H-Typ~Antibiotikum der Formel I, worin R n-Pentyl und R Linoleoyl bedeuten, wird nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, wobei jedoch anstelle von Methanol für die Umsetzung n-Pentanol verwendet wird. '

Beispiel 13

Das A-30912H-Typ-Antibiotikum der Formel I, worin R eine n-Hexylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, wobei jedoch anstelle von Methanol n-Hexanol für die Umsetzung verwendet wird.

2 16 4

Beispiel 14

Das A-30912H-Typ-Antibiotikurn der Formel I, worin R eine Ethylgruppe und R eine Stearoylgruppe bedeuten, wird wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt und gereinigt, wobei jedoch anstelle von A-30912-Faktor A Tetrahydro-A-30912-Faktor A und anstelle von Methanol Ethanol für die Umsetzung verwendet wird.

Beispiel 15

Das A-30912-Typ-Antibiotikum der Formel I, worin R eine 2-Ethyl-1-butylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, wobei jedoch anstelle von Methanol 2-Ethyl-1-butanol für die Umsetzung verwendet wird.

B e i s ρ i el 16

Das A-30912H-Typ-Antibiotikum der" Formel I, worin R eine

3-Methyl-1-butylgruppe und R eine Linoleoylgruppe bedeuten, wird nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, wobei jedoch 3-Me~ thyl-1-butanol anstelle von Methanol für die Umsetzung verwendet wird.

ei *"jft * »

eispiel 17

Das A-30912~Typ-Antibiotikum der Formel I, worin R eine n-Propylgruppe und R exne Stearoylgruppe bedeuten, wird nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, wobei jedoch anstelle von A--3O912-Faktor A Tetrahydro-A-30912-Faktor A verwendet wird.

Beispiel 18

Das A-30912-Tyρ-Antibiotikum der Formel I, worin R eine Isöbutylgruppe und R eine Stearoylgruppe bedeuten, wird durch Hydrierung der Verbindung, in deren Formel R Isobutyl und R Linoleoyl bedeuten (hergestellt wie in Beispiel 11 beschrieben) nach der in Beispiel 5 beschriebenen Methode hergestellt.

Claims

Erfindungsansprüche

1 .

mit der Maßgabe, daß R den Linoleoylrest bedeutet, wenn-R für eine Methylgruppe steht, dadurch gekenn zeichnet , daß eine Verbindung der Formel Il

1. Verfahren.zur Herstellung eines A-30912H-Antibiotikuras der Formel

CH₃ ^H2 J RO OH

< > "ν

^H0

-•••OH

R einen Linoleoyl- oder Stearoylrest und

R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet

2. Verfahren nach Punkt 1 zur- Herstellung des A-30912-H-Antibiotikums der· Formel I, worin R für eine Linoleoylgruppe und R für -"CH₃ steht, d.h. Antibiotikum-A-30912-Faktor H, dadurch gekennzeichnet, daß A-30912-Faktor A in Dimethylformamid gelöst, mit saurem Methanol (HCl) bei Zimmertemperatur unter Rühren über Nacht umgesetzt, das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und das Produkt durch Hochleistungschromatographie gereinigt wird.

2 1643 - 49 -

2) einem Alkohol der Formel R OH, worin

R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet,

B) wenn R einen Stearoylrest bedeutet, mxt einem

Alkohol der Formel R³OH

in einem polaren inerten Lösungsmittel oder in einem Überschuß des als Reaktionsteilnehmer verwendeten Alkohols bei 0 bis 70 ⁰C unter sauren Bedingungen umgesetzt und bei

2 2-1643

HO. _#OH

T~!/\7— '

^Ιχ.-Λ

©••CH H

worin R eine Linoleoyl- oder Stearoylgruppe bedeutet,

. A) wenn R eine Linoleoylgruppe bedeutet, itixt

3. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung des A-30912-Antibiotikums der Formel I, worin R eine Linoleoylgruppe und R -C₃H₇ bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß A-30912-Faktor A in Dimethylformamid gelöst, mit saurem Propanol (HCl) bei Zimmertemperatur unter Rühren über Nacht umgesetzt, das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und das Produkt durch Hochleistungschromatographie gereinigt wird.

3 Verwendung eines Alkohols der Formel R OH und einer Ver-

4. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung des A-30912-Antibiotikums der Formel I, worin R eine Linoleoylgruppe und R -CgH₁₃ bedeutet, dadurch gekennzeichnet , daß A-30912~Faktor A in Dimethylformamid gelöst, mit saurem Hexanol (HCl) bei Zimmertemperatur unter Rühren über.Nacht umgesetzt, das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und das. Produkt durch Hochleistungschromatographie gereinigt, wird.

5. "Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung eines Ä-30912H-Antibiotikums der Formel I, worin R eine Stearoylgruppe und R eine Alkylgruppe mit 2 bis

6 Kohlenstoffatomen bedeutet, dadurch gekennzeichnet , daß ein A-30912H-Antibiotikum der Formel I, worin R eine Linoleoylgruppe bedeutet und R die oben angegebene Bedeutung hat, hydriert wird.

Hierzu....o^__SeUen Zeichnungen.