DD155178A5 - Verfahren zur herstellung von derivaten cyclischer peptidkerne - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer semisynthetischer antifungal wirksamer Verbindungen, die man durch Acylierung cyclischer Peptidkerne erhaelt, welche durch enzymatische Deacylierung eines entsprechenden cyclischen Peptidantibiotikums hergestellt werden. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate von cyclischen Peptidkernen zu schaffen, die sich durch eine besondere Wirksamkeit, vor allem eine besondere antifungale Wirksamkeit auszeichnen.Die oben erwaehnte Acylierung erfolgt beispielsweise nach der Methode eines aktiven Esters oder nach einem abgewandelten Schotten-Baumann-Verfahren. Erfindungsgemaesse Verbindungen werden beispielsweise hergestellt durch Acylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor A unter Verwendung von Actinoplanes utahensis NRRL 12052, Acylierung des A-30912 A Kerns mit der jeweiligen Seitenkettenalkylgruppe und abschliessende Alkylierung des jeweiligen Acylderivats des A-30912 A Kerns unter Bildung des gewuenschten Alkyloxyderivates.

Description

Aktenzeichen: X-5396A

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Anmelder:

Eli'Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V. St. A.

Vertreter: .

Patentanwaltsbüro Berlin ' · .

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung von Derivaten cyclischer Peptidkerne

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer semisynthetischer antifungal wirksamer Verbindungen, die man durch Acylierung cyclischer Peptidkerne erhält, welche durch enzymatisch^ Deacylierung eines entsprechenden cyclischen Peptidantibiotikums hergestellt werden. ·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Das oben erwähnte cyclische Peptidantibiotikum ist eine antifungal wirksame Verbindung der allgemeinen Formel I

22 6 033

H >j' *H ! Η—«

^Η\ > ^Η

On t· . . „,,

— * ^!jH

12 3 4

worin R₁ R _# R , R und R die später angegebenen Bedeutungen

haben.

Werden im folgenden Formeln für cyclische Peptide, wie die obige Formel I₁ angegeben^ dann ist dabei vorausgesetzt, daß die Aminosäuren in L-Konfiguration vorliegen.

Die Faktoren A, B, D und H des Antibiotikums A-30912 sind cyclische Peptidantibiotika der obigen allgemeinen Formel I₁ worin R für Linoleyl /eis,eis CH₃(CH₂)₄-CH=CHCH₂CH=CH-(CH₃)y C(W steht. · ' .

A-3091.2 Faktor A hat die Struktur der Formel I₁ worin R₁ R

und R- insgesamt OH bedeuten und R für H steht.

22 6 03 3

A-30912 Faktor B hat die Struktur der Formel I, worin R und

2 3 4

R jev/eils H sind und R sowie R jeweils OH bedeuten.

A-30912 Faktor D hat die Struktur der Formel I, worin R¹, R²,

3 4

R und R insgesamt H sind.·

A-30912 Faktor H hat die Struktur der Formel I, worin R und R⁴ beide OH sind, R² für H steht und R³ für CH₃O steht.

Das Antibiotikum S 31794/F-1 ist ein antifungal wirksames cyclisches Peptid der Formel I, worin R Myristoyl bedeutet,

13 4 2

R , R und R für OH stehen und R für -CO-NH« steht.

Jeder Faktor ist aus dem A-30912-Komplex isoliert, der die anderen Faktoren enthält, welche willkürlich als Faktoren B, C, D, E, F und G bezeichnet werden. Der A-30912-Komplex und die einzelnen Faktoren A bis G gehen aus US-PS 4 024 245 hervor. Das Antibiotikum A-30912 Faktor A ist identisch mit dem Antobiotikum A-22802, das in US-PS 4 024 246 beschrieben ist. Der Faktor A ist ferner auch identisch mit dem Antibiotikum Echinocandin B (siehe HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974) und CH-PS 568 386) und dem Antibiotikum SL 7810/F (siehe Tetrahedron Letters 4147 (1976) und BE-PS 834 289).

Das Antibiotikum A-30912 Faktor A wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, (c) Aspergillus nidulans var.echinulatus A-32204, NRRL 3860, (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 oder (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Auch der Faktor B hat sich als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum Echinocandin C /siehe HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979j_/ und dem Antibiotikum SL 7810/F-II /siehe 3E-PS 834 289/, Das Antibiotikum A-30912 Faktor B wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von meh-

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reren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL .8113, (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 oder (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Weiter hat sich auch der Faktor D als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum Echinocandin D /siehe KeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979}/ und dem Antibiotikum SL. 7810/F-III {siehe BE-PS 834 289). Das Antibiotikum A-30912 Faktor D wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 (siehe BE-PS 834 289) oder (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Der Faktor H ist ein später aufgefundener antibiotisch wirksamer Faktor von A-30912 und geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Karl H. Michel mit dem Titel "ANTIBIOTIC A-30912 FACTOR H", Serial No. 117 739 vom 1. Februar 1980 hervor, bei der es sich um eine continuation-in-part-Anmeldung mit der Serial No. 46,875 vom 8. Juni 1979 (zwischenzeitlich fallengelassen) handelt, und die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit in die vorliegende Anmeldung eingeführt.

Das Antibiotikum A-30912 Faktor H wird hergestellt durch Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 oder (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Eine Subkultur von A. nidulans var. roseus ist in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 114'40

- ⁵- 22 6 03 3

für die Öffentlichkeit zugänglich ist. Verwendet man einen Stamm von A. nidulans var. roseus NRRL 11440 zur Erzeugung irgendeines der Faktoren von A-30912, dann erhält man einen Komplex an Faktoren, der vorliegend einfach als A-42355 Antibiotikum-Komplex bezeichnet wird. Das Antibiotikum A-30912 Faktor A ist der überwiegende Faktor des A-4 2355 Antibiotikum-Komplexes, während die Faktoren B, D und H die in geringerer Menge vorhandenen Faktoren sind. Die später folgenden Herstellungsbeispiele 2 bis 7 erläutern die Herstellung des A-42355 Komplexes und die Isolierung . und Reinigung der einzelnen A-30912 Faktoren aus diesem Komplex.

Im Antibiotikummolekül der allgemeinen Formel I ist die Linoleylseitenkette (R) an der CC-Aminogruppe des Ornithinrests gebunden, überraschenderweise wurde dabei gefunden, daß sich die Linoleylseitenkette vom Kern enzymatisch abspalten läßt, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird. Das für diese Deacylierungsreaktion verwendete Enzym wird durch einen Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise durch den Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder eine Variante hiervon, gebildet. Zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung gibt man den jeweiligen Faktor des Antibiotikums A-30912 zu einer Kultur des Mikroorganismus und bebrütet die Kultur mit dem Substrat solange, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierbei erhaltene cyclische Kern wird in bekannter Weise von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Im Gegensatz zu den Faktoren A,- B, D und H des Antibiotikums A-30912 ist der cyclische Kern, der keine Linoleylseitenkette mehr enthält, praktisch nicht antifungal wirksam.

Jn DE-OS 26 28 965 und US-PS 4 173 629 wird das Antibiotikum S31794/F-1 beschrieben, welches durch Acrophialophora.

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limonispora nov. spec. Dreyfuss et Müller NRRL 8095 gebildet wird. Dieses Antibiotikum S31794/F-1 weist folgende charakteristische Eigenschaften auf: Schmelzpunkt 178 bis 180⁰C (Zersetzung) (amorph) oder 181 bis 183°C (Zersetzung) (kristallin) , /oC/^ =-24° (c=0,5, CH-OH). oder +37° (c=0,5, Pyridin)

— ~~ L) ο

(kristallin), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 194 nra

(e!!^% = 807), 225 nm (Schulter) e}^% = 132), 276 nm • 1cm 1cm

(e]^% = 12,8), 284 nm (Schulter) E^^% = 10,5); ¹³C-NMR-Spektrun

in Deuteromethanol (190 mg in 1,5 ml Deuteromethanol, Tetramethylsilan als interner Standard) mit folgenden Eigenschaften (kristallin):

	EPH	EPi*
176,2	75,5	51,2
175,0	74,0	39,7
173,7	71,0	38,8
172,6	70,5	36,6
172,0	69,7	34,8
171,8	68,0	32,8
171,7	62,2	30,6
168,6	58,3	26,7
157,7	57,0	23,5
132,5	56,2	19,7
129,0	55,4	14,3
115,9	52,9	11,1
76,6

und (nach Trocknung des kristallinen Materials über eine Zeitdauer von 2 Stunden in einem Hochvakuum bei 100⁰C etwa folgende Elementaranalyse: 55,5-56,5 % Kohlenstoff, 7,5-7,7 % Wasserstoff, 10,5-1.0,8 % Stickstoff und 25,5-26,0 % Sauerstoff, ist löslich in Methanol, Ethanol, Pyridin, Dimethylsulfoxid,

226033

schwachlöslich in Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Diethylether, Benzol und Hexan, und ist antifungal wirksam, und zwar insbesondere gegenüber Candida albicans.

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird hergestellt durch submerse aerobe Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095/ wie dies aus den später folgenden Herstellungsbeispielen 8 und 9 hervorgeht. Auch dieser Mikroorganismus ist in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der er unter der Nummer NRRL 8095 für die Öffentlichkeit zugänglich ist.

Das Antibiotikum S31794/F-1 ist antifungal wirksam, und zwar insbesondere gegenüber Stämmen von Candida, wie Candida albicans. Herstellung und Isolierung dieses Antibiotikums können durch Bioautographie unter Verwendung einer Spezies von Candida, wie Candida albicans, überwacht werden.

Im Molekül des Antibiotikums S31794/F-1 der Formel I, worin

1 3 4 · 2

R , R und R 'insgesamt OH sind und R für -CO-NH₂ steht, ist die Myristoylseitenkette (R) an die c*—Aminogruppe des Dihydroxyornithinrestes des cyclischen Peptidkerns gebunden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß diese Myristoylseitenkette vom Kern enzymatisch abgespalten werden kann, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird« Das zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung verwendete Enzym wird von einem Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise dem Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder einer Varianten hiervon > gebildet. Zur Durchführung dieser Deacylierung gibt man das Antibiotikum S31794/F-1 zu einer Kultur des Mikroorganis-

- 8 - 2 2 6 0 3 3

mus und läßt die Kultur solange auf das Substrat einwirken, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierdurch erhaltene cyclische Kern wird von der Fermentationsbrühe in bekannter Weise abgetrennt. Im Gegensatz zu dem Antibiotikum S31794/F-1 weist der cyclische Kern, der keine Myristoylseitenkette mehr enthält, praktisch keine antifungale Wirksamkeit auf.

Die durch die oben beschriebenen enzymatischen Deacylierungen der Antibiotika der allgemeinen Formel I erhaltenen cyclischen Peptidkerne entsprechen folgender allgemeiner Formel II

CH₃ ^H0

II

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Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R , R und R⁴ insgesamt OH bedeuten und R für H steht, stellt den Kern von A-30912 Faktor A dar und wird der Einfachheit halber im folgenden als A-30912A Kern bezeichnet. Der A-30912A Kern hat eine empirische Formel von ^C34^H5i^N7°-5 und ein Molekulargewicht von 797,83.

Die Verbindung aus der allgemeinen Formel II, worin R und

2 3 4

R jeweils H bedeuten und R sowie R beide OH sind, ist der Kern von A-30912 Faktor B und wird im folgenden als A-30912B Kern bezeichnet. Der A-30912B Kern hat die empi- ^?rische Formel C^.H^.N-O . und v/eist ein Molekulargewicht von 781,81 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin

12 3 4

R , R , R und R jeweils H sind, ist der Kern von A-30912 Faktor D und wird der Einfachheit halber im folgenden'als A-30912D Kern bezeichnet. Der A-30912D Kern hat eine empirische Formel von C-.,H N-O₁₂ und weist ein Molekulargewicht von 749,83 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R¹ und R^ jeweils OH sind, R² für H steht und R³ für CH₃O-steht, ist der Kern von A-30912 Faktor H und wird im folgenden einfach als A-30912H Kern bezeichnet.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R , R³' und R⁴ jeweils OH sind und R für -CO-NH₉ steht, ist der Kern des Antibiotikums S31794/F-1 und wird einfach als S31794/F-1 Kern bezeichnet. Der S31794/F-1 Kern hat eine empirische Formel von LJ L0_1fi und weist ein Molekulargewicht von 84 0,87 auf. ' .

Durch Abspaltung der Seitenkettengruppe erhält man eine freie primäre oC-Aminogruppe im Ornithinrest des cyclischen Peptids,

22 6 033

Die dabei erhaltenen Kerne können dabei selbstverständlich entweder die Form eines freien Amins oder eines Säureadditionssalzes haben. Es kann sich dabei um irgendwelche geeigneten Säureadditionssalze handeln, wobei die Säureadditionssalze nicht toxischer und pharmazeutisch unbedenklicher Säuren jedoch bevorzugt sind.

Das Verfahren zur Herstellung des jeweiligen Kerns aus dem entsprechenden Antibiotikum durch Fermentation unter Verwendung von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Bernard J. Abbott und

David S. Fukuda mit dem' Titel "A PEOCESS FOR THE PREPARATION OF CYCLIC PEPTIDE NUCLEI" und mit dem internen Aktenzeichen X-5399A hervor, und die Offenbarung dieser Anmeldung wird hierdurch vorliegend eingeführt.

Kulturen typischer Spezies von Actinoplanaceae sind in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory hinterlegt worden und bilden einen Teil der dortigen Sammlung, von der sie unter den im folgenden angegebenen Nummern für die Öffentlichkeit zugänglich sind.

Actinoplanes utahensis NRRL 12052

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp» NRRL 12065 Streptosporangium roseum

var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit irgendeines -bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der erfindungsgemäßen Deacylierung wird durch folgendes Verfahren ermittelt. Ein geeignetes Wachstumsmedium wird mit dem Mikroorganismus beimpft. Die Kultur wird dann zwei oder drei Tage bei etwa 28⁰C auf einem Rotations-

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.schüttler bebrütet. Sodann versetzt man die Kultur mit einem der.Substratantibiotika. Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird auf etwa pH 6,5 gehalten. Die Kultur wird bezüglich ihrer

Aktivität unter Verwendung yon Candida albicans durch Bioautographie überwacht. Eine Abnahme der antibiotischen Wirksamkeit ist ein Zeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacyiierung geeignete jeweilige . Enzym bildet. Diese Tatsache muß jedoch sichtbar gemacht werden, wozu man sich folgender Methoden bedienen kann: (1) Analyse durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bezüglich der Gegenwart des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer entsprechenden Seitenkette, beispielsweise Linoleyl, Stearoyl, Palmitoyi oder Myristoyl, zur Wiederherstellung der ursprünglichen Wirksamkeit.

Es ist bekannt, daß andere antibiotisch wirksame Substanzen den gleichen Kern enthalten wie das Antibiotikum A-30912 Faktor A.Diese Antibiotika unterscheiden sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor A darin, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I andere Acylgruppen enthalten. Beispiele für solche Antibiotika sind (a) Tetrahydro-A-30912 Faktor A (Tetrahydro-SL 7810/F, Tetrahydroechinocandin B gemäß BE-PS 834 289 und HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974)), das der allgemeinen Formel I entspricht, falls R Stearoyl ist, oder (b) Aculaecin A, das ein Bestandteil des Aculaecin'-Komplexes ist (hergestellt durch Fermentation mittels Aspergillus aculeatus NRRL 8075) gemäß üS-PS 3 978 210. Wie aus der BE-PS 859 067 hervorgeht, enthält das Aculaecin A eine Palmitoylseitenkette anstelle von Linoleyl. Tetrahydro-A-3091 2 Faktor A läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor A herstellen durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck. Sowohl Tetrahydro-A-30912 Faktor A als auch Aculaecin A können als Substrate für die enzymatische Deacyiierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren eingesetzt v/erden.

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Es ist weiter bekannt, daß auch eine andere antibiotische Substanz den gleichen Kern wie das Antibiotikum A-30912 Paktor B enthält. Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor B lediglich darin, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und bei ihr handelt es sich um Tetrahydro-A-30912 Faktor B (Tetrahydro-SL 7810/F-II, Tetrahydroechinocandin C) gemäß HeIv. Chim. Acta 62, 1252 .(1979). Tetrahydro-A-30912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I₇ falls R für Stearoyl steht. Tetrahydro-A-30912 Faktor B läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor B durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-30912 Faktor B kann als Träger anstelle des Antibiotikums A-30912 Faktor B für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Ferner ist bekannt, daß auch eine weitere antibiotische Substanz den gleichen Kern enthält wie das Antibiotikum A-30912 Faktor D. Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor D dadurch, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und hierbei handelt es sich um Tetrahydro-A-30912 Faktor D (Tetrahydro-SL 7810/F-III, Tetrahydroechinocandin D) gemäß HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979). Tetrahydro-A-30912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I, falls R für Stearoyl steht. Tetrahydro-A-30912 Faktor D läßt sich aus dem-Antibiotikum A-30912 Faktor D durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-30912 kann als Substrat anstelle des Antibiotikums A-30912 Faktor D für die enzymatische Deacylierung nach dem vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

2 2 6 0 3 3

Beim Antibiotikum A-30912 Faktor H ist die im Dihydroxyornithinrest des Peptidkerns vorhandene 5-Hydroxylgruppe methyliert, während beim Antibiotikum A-3 0912 Faktor A diese 5-Hydroxylgruppe unsubstituiert ist. Der Faktor H läßt sich demnach synthetisieren, indem man den Faktor A in für die Herstellung eines aliphatischen Ethers aus einem Alkohol üblicherweise methyliert. Der Faktor A kann selbstverständlich auch mit anderen niederen Alkylgruppen alkyliert werden, wodurch man zu Alkyloxyhomologen des Moleküls des Faktors H gelangt. Die Alkyloxyhomologen des Faktors H, die sich synthetisch aus dem Faktor A herstellen lassen, sind als Homologe des Antibiotikums A-30912 Faktor H bekannt. Die Verbindung aus der obigen all-

14 2

gemeinen Formel II, worin R und R jeweils OH sind, R für H steht und R für C₀-C, Alkyloxy steht, werden vorlieqend als A-30912H Kerne bezeichnet.

Die Linoleylsextenkette von A-30912 Faktor H oder von Homologen von A-30912 Faktor H können selbstverständlich in üblicher Weise hydriert werden, wodurch man zu Tetrahydro-A-30912 Faktor H oder dem entsprechenden Tetrahydroderivat der Alkyloxyhomologen (R=Stearoyl) gelangt. Wahlweise kann man die Tetrahydroderivate auch herstellen, indem man zuerst das Antibiotikum A-30912 Faktor A zu Tetrahydro-A-30912 Faktor A hydriert und daraus dann das jeweils gewünschte Alkyloxyderivat bildet.· . ' .

Die Antibiotika A-30912 Faktor H, Tetrahydro-A-30912 Faktor H, C₃-Cg Alkyloxyhomologe des Faktors H oder Tetrahydroderivate von C₂ ^-Cg Alkyloxyhomologendes Faktors H lassen sich selbstverständlich ebenfalls als Substrate für die enzymatisch^- Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren einsetzen.

- 14 - 22 6 03 3

Aufgabe der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate von cyclischen Peptidkernen zu schaffen, die sich durch eine besondere Wirksamkeit, vor allem eine besondere antifungale Wirksamkeit, auszeichnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Die obige Aufgabe wird erfindungsgemäß nun dadurch gelöst, daß man cyclische Peptxdkerne der oben erwähnten allgemeinen Formel II einfach acyliert und hierdurch in Derivate cyclischer Peptidkerne der folgenden allgemeinen Formel III überführt

	hfc»	• T	—'f/\	\
				I
			X H	H
	H\	Ϊ •
H(\	R HsC	H	\i-H
<	:>	a M	\
	\		β Il
	R1/
• H
*

HO ί? R³ R⁴

• Ii · ·

H——M

III

22 6 033

(a) falls R¹, R³ und R⁴ jeweils OH bedeutet und R² für H steht.(A-30912A), R⁵ für C^-C₁. Alkyl oder <2,-C~.

D Z 4 c O Δ 4

Alkenyl steht, mit den Maßgaben, daß R nicht n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n-Pentadecyl oder n-Heptadecyl bedeutet, falls R Alkyl ist, und daß R nicht eis, cis-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂-CH=CH(CH₂J₇-darstellt, falls R⁵ für Alkenyl steht,

1 2 3 4

(b) falls R und R jeweils H sind und R sowie R jeweils

OH bedeuten (A-30912B), R⁵ für Cg-C₃₄ Alkyl oder Cg-C₃₄ Alkenyl steht, mit den Maßgaben, daß R nicht n-Heptadecyl ist, falls R Alkyl bedeutet, und ferner R nicht eis,CiS-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇- ist, falls R⁵ Alkenyl darstellt,

(c) falls R¹, R², R³ und R⁴ jeweils H sind (A-30912D), R⁵ für Cg-C₂₄ Alkyl oder Cg-C₂₄ Alkenyl steht, mit den Maßgaben, daß R nicht n-Heptadecyl sein kann, falls

R Alkyl ist, und daß ferner R nicht eis,cis-CH^(CH₀).-

C -J ώ ft

CH=CHCH₂-CH=CH(CH₂J₇- sein kann, falls R Alkenyl bedeutet,

14 2 3

(d) falls R und R jeweils OH sind, R für H steht und R

für C₁-Cg Alkyloxy steht (A-30912H-Typ), R⁵ für C-C₃₄ Alkyl oder Cg-C₃₄ Alkenyl steht und R C₁-C- Alkyloxy ist, mit den Maßgaben, daß R nicht n-Heptadecyl sein kann, falls R Alkyl ist und R Methoxy bedeutet, und daß R⁵ nicht für eis,cis-CH (CH ) CH=CHCH CH=CH (CH₀).,-stehen kann, falls R Alkenyl ist und R Methoxy darstellt,

(e) falls R ,.R und R jeweils OH sind und R² für

-CO-NH₀ steht (S31794/F-1), R⁵ C^-C₁-. Alkyl oder C^-C₀. 2 6 24 ^u 6

Alkenyl ist, mit der Maßgabe, daß R nicht n-Tridecyl sein kann, falls R Alkyl ist.

22 6 033

Unter Alkyl werden einwertige gesättigte geradkettige oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste verstanden. Unter Alkenyl ist ein einwertiger ungesättigter geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit nicht mehr als drei Doppelbindungen zu verstehen. Die Doppelbindungen der ungesättigten Kohlenwasserstoffkette können entweder cis- oder trans-Konfiguration haben. Unter C_fi-C„^, ist ein Kohlenwasserstoff rest unter Einschluß gerader oder verzv/eigter Ketten mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen zu verstehen.

Unter Berücksichtigung der oben angeführten Maßgaben sind erfindungsgemäß folgende Verbindungen aus der allgemeinen Formel III bevorzugt:

(a) Die Verbindungen, worin R Alkyl der Formel CH_(CH„) bedeutet, worin η für 5 bis 23 steht.

(b) Die Verbindungen, worin R Alkyl der Formel CH-(CH-) ist, worin η für 10 bis 20 steht.

(c) Die Verbindungen, worin R Alkyl der Formel

CH₃

CH-(CH₂) CH(CH ) - ist, worin η und m jeweils unabhängig voneinander für 0 bis 21 stehen, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 3 und nicht größer als 21 sein . darf.

(d) Die Verbindungen, worin R Alkenyl mit einer eis- oder trans-Doppelbindung ist.

(e) Die Verbindungen, worin R eis- oder trans-Alkenyl der Formel CH,(CH ) CH=CH(CH₉) - bedeutet, worin η und m

O ^ -IX 4-t Al*

jeweils unabhängig voneinander für 0 bis 21 stehen, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 3 und nicht größer als 21 sein darf. '

2 2 6 0 3 3

(f) Die Verbindungen, worin R Alkenyl mit 2 eis- oder trans-Doppelbindungen ist.

(g) Die Verbindungen, worin R für eis- oder trans-Alkenyl

der Formel CH_(CH₀) CH=CH(CH_) CH=CH(CH_n) - steht, ο ζ η Z m ^P

worin η und ρ jeweils unabhängig voneinander für 0 bis 18 stehen und m für 1 bis 19 steht, mit der Maßgabe, daß m + η + ρ nicht kleiner als 1 und nicht größer als 19 sind und daß R nicht Linoleyl sein kann

(h)' Die Verbindungen, worin R folgende Bedeutungen hat

) ₅CH=CH

trans-CH^(CH₀).CH=CH(CH₀)₇-CiS-CH^(CH₀) τ „CH=CH (CH₉).-trans-CH-, (CH-J_1nCH=CH(CH₀) ,-cis-CH,(CH-)-CH=CH(CH₀)--

trans-CH₃(CH₂)_?CH=CH (CH

C_i£-CH₃ (CH₂) ₅CH=CH (CK₂) ₉-trans-CH-, (CH₉) .CH=CH (CH₉) _qcis-CH,(CH₀)-CH=CH(CH₀)Q-trans_-CH₃ (CH₂J₇CH=CH (CH₂) ₉-cis-CH-, (CH₀) ^CH=CH (CH₉) , , trans-CH

tranSjrtrans-CH, (CH₉) .CH=CHCH₉CH=CH (CH₉) _- ciSjCis-CH-(CH₀).CH=CHCH₉CH=CH(CH₉)_- eis,eis,cis-CH CH₂CH=CHCH₂CK=CHCH₀CH=Ch-

Beispiele für C₁-Cg Alkylaxy sind Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, "t-Butoxy, n-Pentyloxy oder n-Hexyloxy.

Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines cyclischen Peptidkerns der allgemeinen Formel III .

22 6 033

III

worin R für H oder OH steht, wobei, falls R für H steht,

2 3 4

dann R für H steht und R sowie R jeweils H oder

jeweils OH sind,

1 2

wobei, falls R für OH steht, dann R für H steht,

3 4

R für OH oder C₁-C Alkyloxy steht und R für OH

2 3 4

steht oder R für -C0-NH„ steht und R sowie R jeweils

OH sind, und

R für C..-C . Alkyl oder C,-C₉. Alkenyl steht,

7 · 3 4 mit den Maßgaben, daß, falls R , R und R jeweils

2 5

OH sind, R für H steht und R Alkyl bedeutet, dann

R nicht.n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n-Pentadecyl oder n-Heptadecyl sein kann.oder, falls R Alkenyl ist, dann R⁵ nicht eis,CiS-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇~ sein kann,

-19- 22 6 03 3

12 3 4

falls R und R jeweils H sind, R sowie R jeweils

12 3 4 OH bedeuten oder, falls R , R , R und R jeweils H

14 2

sind oder falls R und R jeweils OH bedeuten, R für H steht, R³ Methoxy ist und R Alkyl darstellt, dann

5 5

· R nicht n-Heptadecyl sein kann, oder falls R Alkenyl

'darstellt, dann R⁵ nicht eis,CiS-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH-(CH₂)_- sein kann,

13 4 2 falls R , R und R jeweils OH bedeuten, R für

j -CO-NH- steht und R Alkyl ist, dann R nicht n-Tridecyl sein kann.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III hemmen das Wachstum pathogener Pilze, wie sich anhand üblicher biologischer Testverfahren.zeigen läßt. Diese Verbindungen eignen sich daher zur Bekämpfung des Wachstums von Pilzen auf entsprechenden Flächen (als Antiseptikum) oder zur Behandlung von durch Pilze hervorgerufenen Infektionen. Die antifungale Wirksamkeit dieser Verbindungen ist gegenüber Candida albicans in vitro durch die sogenannte Agar-Scheibendiffusionsmethode und die sogenannte Agar-Verdünnungsmethode bestimmt worden und in vivo durch Untersuchungen von mit C. albicans infizierten Mäusen ermittelt worden. Die vorliegenden Verbindungen eignen sich daher insbesondere zur Behandlung von Infektionen, die durch Stämme von C. albicans (Candidosis) verursacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel III haben sich im Agar-Scheibendiffusionsversuch ferner auch als wirksam erwiesen gegenüber Trichophyton mentagrophytes, nämlich einem dermatophytischen Organismus. Ferner haben sich diese Verbindungen in vitro bei Agaf-Scheibendiffusionsversuchen als wirksam erwiesen gegenüber Saccharoxnyces

- 20 - 22 6 03 3

pastorianus und Neurospora crassa. Bestimmte der vorliegenden Verbindungen (Beispiel 27, Tabelle V) ergeben bei oraler Verabreichung an Mäuse stark erhöhte Blutspiegel.

13 Verabreicht man die Verbindung der Formel III, worin R , R

4 2 5

und R jeweils OH bedeuten, R für H steht und R für

n-Dodecyl steht (nämlich das n-Tridecanoylderivat von A-30912A Kern), in einer Dosis von 100 mg/kg täglich über eine Zeitdauer von 5 Tagen intravenös an Hunde, dann lassen sich keinerlei Anzeichen einer Toxizität feststellen, obwohl die SGPT-Spiegel erhöht sind und Anzeichen einer

Hämolyse vorliegen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden hergestellt, indem man den entsprechenden Kern an der oC-Aminogruppe von Ornithin mit der jeweiligen N-Alkanoyl-

- oder N-Alkenoyl seitenkette · · in zur Bildung einer Amidbindung üblicher Weise acyliert. Diese Acylierung läßt sich im allgemeinen erreichen, indem man den Kern mit einem aktivierten Derivat der Alkansäure oder Alkensäure (R CO„H) umsetzt, die der gewünschten Acylsöitenkettengruppe

5 (R CO-) entspricht.

Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels gegenüber einer Kupplung mit der primären Aminogruppe reaktionsfähig macht, so daß die Amidbindung; entsteht, die die Acylseitenkette mit dem Kern verbindet. Beispiele für geeigneteaktivierte Derivate dieser Art, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden für ihren Einsatz als Acylierungsmittel für primäre Amine sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte

aktivierte Derivate sind: (a) Säurehalogenide, wie Säurechloride, (b) Säureanhydride, wie Alkoxyameisensäureanhydrid oder Aryloxyameisensäureanhydrid, oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5-Trichlorphenylester „

21 - 22 6 03 3

Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der Carboxylfünktion gehören eine Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyldiimid, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid, wodurch man zu einem reaktionsfähigen Zwischenprodukt gelangt, das infolge Instabilität nicht isoliert wird. Die Umsetzung mit dem primären Amin wird hierbei . im Reaktionsgemisch durchgeführt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden vorzugsweise nach der Methode unter Verwendung eines aktiven Esters hergestellt. Als Acylierungsmittel am meisten bevorzugt wird hierzu der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten N-Alkansäure oder N-Alkensäure. Zu diesem Zweck setzt man einen Überschuß des aktiven Esters mit dem Kern bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel um, wie Dimethylformamid (DMF). Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, wobei jedoch Umsetzungszeiten von etwa 6 bis Stunden bevorzugt sind. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand gereinigt, beispielsweise durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Silicagel LP-1/C18 als stationäre. Phase und eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril als Lösungsmittelsystem.

Eine andere Methode zur Acylierung besteht in einem abgewandelten Schotten-Baumann-Verfahren, bei welchem der Kern mit dem Säurechlorid der gewünschten Alkansäure oder Alkensäure unter alkalischem pH-Wert behandelt wird. Zur Durchführung dieses Verfahrens gibt man einen Überschuß des Säurechlorids in einem nichtreaktionsfähigen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, langsam zu einer Lösung aus dem Kern in einen /KHPO₄7-Puffer (pH =7,5 bis 8,0) und Aceton. Das hierdurch erhaltene Rohprodukt wird aus dem Reaktionsprodukt durch Extraktion in ein nichtmischbares organisches Lösungsmittel

- 22 - 2 2 6 O 3 3

(Chloroform und Ethylacetat) abgetrennt. Es wird dann durch die oben beschriebenen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie abschließend gereinigt.

Die Verbindungen vom A-30912H-Typ der Formel III lassen sich wie folgt herstellen:

(a) durch enzymatische Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor A unter Verwendung von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 nach dem in der Parallelanmeldung von Bernard J. Abbott und Davis S. Fukuda mit dem Titel "A PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CYCLIC PEPTIDE NUCLEI" und dem internen Aktenzeichen X-5399A beschriebenen Verfahren,

(b) anschließende Acylierung des in obiger Weise gebildeten A-30912A Kerns mit der jeweiligen Seitenkettenalkylgruppe unter Anwendung des oben im Zusammenhang mit der Acylierung von A-30912H Kern beschriebenen Verfahrens und

(c) Alkylierung des jeweiligen Acylderivats des A-30912A Kerns unter Bildung des gewünschten Alkyloxyderivats.

Die Alkylierung (Stufe c) läßt sich in zur Bildung eines aliphatischen Ethers aus einem Alkohol in üblicher Weise durchführen. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise das jeweilige Acylderivat von A-30912A Kern methylieren, indem man ein Lösung dieses Derivats in einem inerten' organischen · Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, mit Methanol in Gegen- · wart einer organischen Säure , wie 3 % HCl-Methanol, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt kann dann in üblicher Weise isoliert und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden.

22 6 033

Die als Ausgangsmaterialien für die Acylierungsreaktion verwendeten Alkansäuren oder Alkensäuren und ihre aktivierten derivate, insbesondere die Säurechloride und die 2,4,6-Trichlorphenylester, sind bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen in üblicher Weise hergestellt werden. Zu den 2,4,5-Trichlorphenylestern gelangt man durch Behandlung des Säurechlorids der Alkansäure oder Alkensäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von Pyridin oder durch Behandlung der freien Alkansäure oder Alkensäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid als Kupplungsmittel. Das dabei jeweils erhaltene 2,4,5-Trichlorphenylesterderivat kann dann säulenchromatographisch über Silicagel in Toluol gereinigt werden.

Bei einer systemischen Anwendung kann die Dosis der jeweils zu verabreichenden Verbindung aus der allgemeinen Formel III schwanken in Abhängigkeit von der einzelnen Verbindung, der Stärke und Art der Inefktion und dem physikalischen Zustand des jeweiligen Empfängers. Bei einer entsprechenden Therapie sollte man mit niedrigen Dosen beginnen und die Dosis bis zur Erzielung der gewünschten antifungalen Wirkung dann erhöhen. Die vorliegenden Verbindungen lassen sich intravenös oder intramuskulär durch Injektion in Form einer sterilen wässrigen Lösung oder Suspension verabreichen, die gewünschtenfalls verschiedene herkömmliche pharmazeutisch unbedenkliche Konservierungsmittel, Puffermittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel enthalten kann. Zur Herstellung isotonischer Lösungen können auch andere Zusätze verwendet werden, wie Kochsalz oder Glucose. Das jeweils .anzuwendende Mengenverhältnis und die jeweilige Art solcher Zusätze sind dem Fachmann geläufig.

2 2 6 0 3 3

Bestimmte Verbindungen aus der allgemeinen Formel III ergeben nach oraler Verabreichung stark erhöhte Blutspiegel (ßeipiel 27) und können systemisch oral verabreicht werden. Zur oralen Anwendung können diese Verbindungen in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Hilfsstoffen in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulvern eingesetzt werden. Art und Menge, in der solche Träger oder Hilfsstoffe zur Anwendung gelangen, sind dem Fachmann bekannt.

Zur Behandlung vaginaler candida-Infektionen können die Verbindungen der allgemeinen Formel III in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsmitteln verwendet werden, wie sie für intravaginale Anwendungen üblich sind. Auch solche intravaginal verabreichbare Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.

- 25 - 2 2 6 0 3 3

Herstellungsbeispiel 1

Fermentation von Actinoplanes utahensis NRRL 12052

Es wird eine Stammkultur von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 hergestellt und auf einer Agar-Schräge gehalten. Das zur Bildung der Schräge verwendete Medium wird aus folgenden Medien ausgewählt.

MEDIUM A Bestandteile . Mengen

Babyhafermehl . . 60,0 g

Hefe 2,5 g

K₂HPO₄ ' 1,0 g

Czapek-Mineralgrundmischung* 5,0 ml .

Agar · 25,0 g. . Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert vor der Behandlung im Autoklav beträgt etwa 5,9. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt. Nach der Behandlung im Autoklav liegt der pH-Wert bei etwa 6,7,

* Die Czapek-Mineralgrundmischung weist folgende Zusammensetzung auf

Bestandteile Mengen

FeSO.·7Η₂Ο (gelöst in 2 ml

konz. HCl) 2 g

KCl . 100 g

MgSO₄-7H₂O · 100 g Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

- 26 - 2 2 6 0 3 3

5,0	g	g	g
0,5	g	ml
3,0	g	g
0,5	g	1 Liter
12,5	g
5,0	g
5,0	g
2,5	g
0,25
no
. 2,0
20,0
auf

MEDIUM B Bestandteile Mengen

Kartoffeldextrin

Hefeextrakt ·

Enzymhydrolysat von Casein* Rinderextrakt

Dextrose

Maisstärke

Fleischpepton

Portweinmelasse

MgSO₄-7H₂O

CaCO₃

Czapek-Mineralgrundmischung Agar

Deionisiertes Wasser q.s

* N-Z-AmineA von Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Die Schräge wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 beimpft und die beimpfte Schräge bei 30⁰C etwa 8 bis 10 Tage bebrütet. Mit etwa der Hälfte des Schrägenwachstums beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung

Bestandteile . Mengen

Babyhafermehl

Saccharose ··

Hefe

Getrocknete Destillationsschlempe* K₂HPO₄

Czapek-Mineralgrundmischung

Deionisiertes Wasser q.s

20,0	g
20,0	g
2,5	g
5,0	g
1,0	g
5,0	ml
.. auf 1 Lite

- 27 - 22 6 03 3 ,

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 6,8.

* National Destillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N.Y. ·

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben bei 3O⁰C etwa 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler bebrütet, der unter einer Geschwindigkeit von 250 Upm und unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser rotiert. .

Das so erhaltene bebrütete vegetative Medium läßt sich direkt zur Beimpfung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwenden. Wahlweise und vorzugsweise wird dieses vegetative Medium jedoch bis zu einem späteren Gebrauch aufgehoben, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für eine derartige Lagerung wird die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen hergestellt:

In jede Ampulle gibt man 2 ml des bebrüteten vegetativen .Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung (siehe W. A-Dailey und C. E. Higgens "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen", Cryobiol 10, 364 bis 367 (1973). Die so hergestellten Suspensionen werden dann in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine aufbewahrte Suspension (1 ml) des obigen vegetativen Mediums verwendet man dann zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe (das die oben bereits beschriebene Zusammensetzung hat). Das beimpfte vegetative Medium der ersten Stufe wird dann wie oben beschrieben bebrütet,

22 6 03 3

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum werden 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zu 400 ml eines vegetativen Nährmediums der zweiten Stufe verwendet, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben 48 Stunden bei 30⁶C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser mit 250 üpm rotiert.

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 Liter eines sterilen Produktionsmediums mit einer der folgenden Zusammensetzungen:

MEDIUM I

Bestandteile

Erdnußmehl Lösliches Fleischpepton Saccharose .KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄·7H₂O

Leitungswasser

Der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6,9 nach Sterilisation durch Behandlung im Autoklav bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei einem Druck von etwa 1,1 bis 1,3 bar.

Mengen	(g/l)
10,0
5,0
20,0
0,5
1,2
0,25
'q.s. auf 1	Liter

- 29 -	Bestandteile	2 2 6 0 3 3
MEDIUM II	Saccharose
Pepton	Mengen (g/l)
K2HPO4	30,0
KCl	5,0 .
MgSO4·7H2O	1,0
FeSO4-7H2O	.0,5
Deionisiertes Wasser	0,5
0,002
σ.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert wird mit Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 7,0.

	MEDIUM III	Mengen (g/D
Bestandteile		C 20,0
Glucose		: 3,0
NH4Cl		2,0
Na2SO4		0,019
ZnCl2		0,304
MgCl2-6H2O		0,063
FeCl3-OH2O		0,035
MnCl2-4H2O		0,005
CuCl2-2H2O		6,0
CaCO3		0,67
KH2PO4*		σ.s. auf 1 Liter
Leitungswasser

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen

zugesetzt

Der pH'-Wert am Ende beträgt etwa 6,6.

- 30 - 2 2 6.0 3 3

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank bei einer Temperatur von etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 42 Stunden fermentieren. Hierbei wird das Fermentationsmedium mit herkömmlichen Rührern unter einer Geschwindigkeit von etwa 200 Upm gerührt und mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von über 30 % der Luftsättigung bei atmosphärischem Druck belüftet.

Herstellungsbeispiel 2 Herstellung des A-42355 Antibiotikum-Komplexes A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 wird auf einer Agar-Schräge aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt und gehalten.

Bestandteile . Mengen

Glucose Hefeextrakt CaCO₃

Pflanzensaft* Agar**

Deionisiertes Wasser q.s.

(anfänglicher pH-6,1) · . . * V-8 Juice, Campbell Soup Co., Camden, N.J. . ** Meer Corp. '

Die Schräge wird mit Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 beimpft, und die beimpfte Schräge wird etwa 7 Tage bei 25⁰C bebrütet. Die reife Kultur.wird mit. Wasser bedeckt und

5	g
2	g
3	g
200	ml
20	g
auf 1 Liter

-31 -.226033

mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen abgekratzt. Die so erhaltene Suspension wird mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser aufgenommen.

Ein ml der so erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 55 ml vegetativen Mediums in einem 250-ml-Kolben verwendet. Das vegetative Medium hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile- Mengen

Saccharose Portweinmelasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymhydrolysat von Casein* Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,5 bis 6/7)

* N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Das inokulierte vegetative Medium wird bei 25⁰C 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 250 Upm inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit in einer Mischvorrichtung (Waring) homogenisiert und dann die übrigen 24 Stunden inkubiert. Stattdessen kann man das inokulierte vegetative Medium aber auch 48 Stunden inkubieren und anschließend 15 Minuten bei geringer Geschwindigkeit homogenisieren.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann zum Beimpfen von Schüttelkolbenfermentationskulturmedium oder zum Inokulieren eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann man es auch für eine spätere Verwendung .-aufheben, indem man es in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff

25	g
36	g
6	g
10	g
2	g
10	g
1100	ml

- 32 _ 2 2 6 0 3 3

hält. Für eine derartige Aufbewahrung wird die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen zubereitet.

Die vegetativen Kulturen werden mit gleichen Volumina einer Suspendierlösung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

Bestandteile Mengen

- Glycerin . 20 ml

Lactose 10 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 100 ml

Die Suspensionen werden auf kleine sterile Schraubverschlußhülsen (4 ml pro Hülse) verteilt. Die so erhaltenen Hülsen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine in dieser Weise zubereitete und aufbewahrte Suspension läßt sich dann zum Inokulieren von Agar-Schrägen oder flüssigen Saat-Medien verwenden. Die Schrägen werden bei 25°C im Licht 7 Tage inkubiert.

B. Tankfermentation

Zur 'Herstellung eines größeren Volumens an Inokulum verwendet man 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zum Inokulieren von 400 ml eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat.. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25°C auf. einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von etwa 5 cm bei 250 Upm rotiert.

.-· 33 -

22 6 033

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 1 steriles Produktionsmedium mit einer der folgenden Zusammensetzungen:

MEDIUM IV Bestandteile Mengen

ZnSO. ·7H₂O

Lösliches Fleischpepton* ., So j abohnenmehl Tapiocadextrin** Portweinmelasse Enzymhydrolysat von Casein*** Na₂HPO₄ MgSO.-7H₀O FeSO₄'7H₂O Baumwollsaatöl Antischaummittel**** Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,8 bis 7,0)

* O.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

** Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

*** N-Z-AmirEA, Humko Sheffield Chemical, L'yndhurst, .N.J- **** P2000, Dow Corning, Midland, Michigan

0,00455	g/i
30,5	g/i
15,5	g/i
2,0	g/i
10,5	g/i
.8,5	g/i
4,5	g/i
5,5	g/i
0,1	g/i
40,0	ml
1/0	ml
1000,0	ml

_ 34 _

2 2 6 0 3 3

MEDIUM V

Bestandteile	Mengen
Glucose	2,5 %
Stärke	1,0 %
Lösliches Fleischpepton*	1,0 %
Portweinmelasse	1,0 %
CaCO3	0,2 %
MgSO.'7H 0	0,05 %
Enzymhydrolysat von Casein**	0,4 %
Antischaummittel***	0,02 %
Leitungswasser <	j.s. auf Volumen

* O.M. Peptone

** N-Z-AmineA

*** Antifoam "A", Dow Corning

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem Fermentationstank von 165 1 Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 25⁰C etwa 7 Tage fermentieren. Das Fermentationsmedium wird dabei mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von über etwa 50 % der Luftsättigung belüftet.

C. Vegetatives Medium der dritten Stufe · · .

Immer dann, wenn die Fermentation in größeren Tanks als für 100 1 Fermentationen durchgeführt wird,, ist zu empfehlen, daß zum Beimpfen größerer Tanks eine vegetative Kultur der dritten Stufe verwendet wird. Ein bevorzugtes vegetatives Medium der dritten Stufe hat folgende Zusammensetzung:

25	g
25	g
6	g
10	g
10	g
2	g
1000	ml

- 35 - 2 26033

Bestandteile Mengen

Saccharose Portweinmelasse Maisquellwasser Enzymhydrolysat von Casein* • Malzextrakt K₂HPO₄ Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,1) *N-Z-Case

Herstellungsbeispiel 3 Abtrennung des A-42355 Antibiotikum-Komplexes

Die nach dem im Beispiel 22 beschrieben Verfahren unter Verwendung des ProduktionsKiediums V erhaltene Gesamtfermentationsmaische (4127 1), wird eine Stunde gründlich mit Methanol (4280 1) verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe auf Basis von Diatomeenerde (Hyflo Supercel von Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird mittels 5 normaler Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter Vakuum auf ein Volumen von 20 1 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird zu 200 1 Diethylether gegeben, wodurch der A-42355 Komplex ausfällt. Durch Abfiltrieren des angefallenen Niederschlags gelangt man zu 2775 g des A-42355 Komplexes in Form eines grauweißen Pulvers.

22 6 033

Isolierung und Identifizierung der Faktoren von A-30912

Herstellungsbeispiel 4 Isolierung von A-30912 Faktor A

Zu diesem Zweck löst man zuerst 1 g des in den Herstellungsbeispielen 2 und 3 beschrieben A-42355 Antibiotikum-Komplexes in 7 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Die erhaltene Lösung wird filtriert und auf eine 35 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm (Michel-Miller Hihgh Performance Low Pressure (HPLPLC) Chromatography Column, Ace Glass Incorporated, Vineland, N.J. 08360) aufgegeben, die man über eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems · mit dem gemäß Herstellungsbeispiel 10 hergestellten LP-l/Cjo~Siliciagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) füllt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlämmfüllverfahren in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) bepackt. Das Lösungsmittel wird mittels einer F.M.I.-Pumpe mit ventilloser Kolbenauslegung (maximale Strömungsgeschwindigkeit 19,5 ml/min) durch die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 9 ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar bewegt, wobei man jede Minute eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model üÄ-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

- s?- 22 6 03 3

Herstellungsbeispiel 5 Isolierung von A-30912 Faktor B

Zur Auftrennung von A-42355 Komplex geht man wie im Herstellungsbeispiel 3 beschrieben vor, mit der Ausnahme, daß man die konzentrierten Chloroformextrakte (285 1) über eine Silicagelsäule (150 1 Grace-Silicagel, Sorte 62) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 l/min chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform (200 1) gewaschen, mit Acetonitril (500 1) eluiert*und dann kontinuierlich mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/min eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 aufgefangen und einzeln bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit analysiert. Hierzu verwendet man Papierscheiben auf Agar-Platten, die mit Candida albicans beimpft sind. Die Fraktionen 77 bis 103 (1365 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt.Die konzentrierte Lösung (4,5 1) enthält einen Niederschlag, durch dessen Abfiltrieren man zu 119 g A-4 2355 Komplex mit angereichertem Faktor B gelangt. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird wieder in einem entsprechenden Volumen Methanol gelöst. Die Methanollösung wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der den Faktor B enthaltende Komplex des Antibiotikums ausfällt. Dieser Niederschlag wird ebenfalls abfiltriert und getrocknet, wodurch man weitere 24 g A-42355 Komplex mit angereichertem Faktor B in Form eines grauen Pulvers erhält.

Der in obiger Weise hergestellte A-4 2355 Komplex mit angereichertem Faktor B (1,0 g) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe über ein Ventilsystem auf eine Silicagelsäule (Länge 33 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule wird über eine Schlaufe mit einem Ventilsystem mit LP-l/C ' -Silicagel^-Umkehrphasenhars (10 bis· 20 Micron), hergestellt nach.dem Herstellungsbeispiel

22 6 03 3

10,in einer Mischung aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Zum Füllen der Säule wird das im Herstellungsbeispiel 11 beschriebene Aufschlämmfüllverfahren verwendet. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 1Ö ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer.ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt. Jede Minute wird eine Fraktion aufgefangen.. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 15 verfolgt. Die Fraktionen 102 bis 110 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und die Lösung wird lyophilisiert, wodurch man zu 22 mg A-30912 Faktor B gelangt.

Herstellungsbeispiel 6 Isolierung von A-30912 Faktor D

Konzentrierte Chloroformextrakte von zwei nach dem Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen Fermentationsversuchen (3800 1 und 4007 1) werden vereinigt und auf einer Silicagelsäule (Grace, Sorte 62) chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform gewaschen und dann zuerst mit Acetonitril und anschließend mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 gesammelt und bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit durch Verwendung von Papierscheiben auf mit Candida albicans angeimpftem Agar analysiert. Die aktiven Fraktionen (850 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt. Die eingeengte Lösung (0,7 1) wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex ausfällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch man 32 g des an Faktor D angereicherten A-42355 Komplexes in Form eines grauen Pulvers erhält.

22 6 033

Der obige, an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex (1,0 g) wird in 5 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Länge 30 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule ist mit LP-l/Cjg-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) gefüllt, das nach dem Herstellungsbeispiel 10 hergestellt worden ist. Zum Füllen der Säule bedient man sich des beim Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlämmfüllverfahrens unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min unter einem Druck von etwa 3,1 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenführung durch die Säule geführt. Alle 2 Minuten wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model UA-5) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt. Die Fraktionen 96 bis 108 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Dieses öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren der Lösung gelangt man zu 89 mg A-30912 Faktor D.

Herstellungsbeispiel 7

Isolierung von A-30912 Faktor H

Der nach den Herstellungsbeispielen 2 und 3 erhaltene A-42355 Antibiotikum-Komplex (5,0 g) wird in 35 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Glassäule mit 42 cm Länge und 3,7 cm Innendurchmesser (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Verfahren

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mit LP-l/C, Q-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) in I ö

einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Die Herstellung des verwendeten Silicagel-Umkehrphasenharzes ist im Herstellungsbeispiel 10 beschrieben. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 13 ml/min unter einem Druck von etwa 8,4 bar mit einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt, wobei man alle 2 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm nach der im Herstellungsbeispiel 19, Abschnitt C, beschriebenen Methode überwacht. Die Fraktionen 112 bis 132 werden mit den Fraktionen 106 bis 117 aus einer zweiten ähnlichen Reinigung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tertv-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 173 mg rohem A-30912 Faktor H.

Das rohe A-30912 Faktor H (150 mg) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und wie oben beschrieben in eine Glassäule mit einer Länge von 32 cm und einem Innendurchmesser von 2,0 cm eingeführt. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 mm/min unter einem Druck von etwa 5,6 bar durch die Säule geführt, wobei man alle 3 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 17 und 18 werden vereinigt und unter Vakuum zu- einem Öl eingeengt. Das. Öl wird in einem kleinen Volumen tertr-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 29 mg A-30912 Faktor H. '

Indentifizierung der Faktoren von A-30912

Die einzelnen Faktoren von A-30912 lassen sich durch Dünnschichtchromatographie (TLC) identifizieren. Die dabei für die Faktoren A bis G des Antibiotikums A-30912 unter Verwendung von Silicagel

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(Merck, Darmstadt) in einem Lösungsmittelsystem aus Benzol und Methanol (7:3) und durch Bioautographie mit Candida albicans erhaltenen R_£-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

Tabelle	VII	£-Werte
A-30912 Faktoren	R	X 0,35
A		0,45
B		0,54
C		0,59
D		0,27
E		0,18
F		0,13
G

Die ungefähren R^-Werte der Faktoren A, B, C, D und K von A-30912 in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, die man durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel (Merck,Darmstadt, Silicagel-Platten Nr. 60, 20x20 cm) und Bioautographie mit Candida albicans erhält, können der folgenden Tabelle VIII entnommen werden.

Tabelle VIII

A-30912 Faktoren

Faktor A Faktor B Faktor C Faktor D Faktor H

R_-Werte - .Lösungsmittelsysteme

a	b	C	d
0,28	0,14	0,28	0,43
0,39	0,21	0,42	0,47
0,46	0,31	0,51	0,58
0,50	0,38	0,57	0,61
0,42	0,27	0,36	0,53

Lösungsmittelsysteme:

a: Ethylacetat:Methanol (3:2)

b: EthylacetatrMethanol (7:3)

c: Acetonitril:Wasser (95:5)

d: Ethylacetat:Ethanol!Essigsäure (40:60:0,25)

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22 6 03 3

Die Faktoren A, B, D und H von A-30912 lassen sich ferner auch durch analytische Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie unter folgenden Bedingungen identifizieren.

Säule: Packung:

Lösungsmittel: Probenvolumen: Probengröße: Säulentemperatur:

Strömungsgeschwindigkeit:

Druck: Detektor:

Pumpe: Injektion:

0,8 χ 15,0 cm Nucleosil 10-C_1ß (Machery-Nagel and Company),

nach dem im Beispiel 8 beschriebenen

Aufschlämmungsverfahren abgepackt Methanol:Wasser Acetonitril (7:2:1) 8 mcl 8 meg Umgebung

1/8 ml/min etwa 14 bar

UV bei 222 nm (ISCO Model 1800 Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor) LDC Duplex-Minipumpe Schlaufeninjektion

Die unter diesen Bedingungen ermittelten ungefähren Verweilzeiten für die Faktoren A₇ B, D und H von A-30912 gehen aus folgender Tabelle IX hervor:

	Tabelle IX
A-30912 Faktoren	Verweilzeit
	(Sekunden)
A B H D	792 870 990 1140

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Herstellungsbeispiel 8

Herstellung von Antibiotikum S31794/F-1

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird durch submerse Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095 unter Rühren, Schütteln und/oder Belüften bei einem pH-Wert von 3 bis 8, vorzugsweise einem pH-Wert von 5 bis 7, und bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C/ vorzugsweise .einer Temperatur von 18 bis 27°C, über eine Zeitdauer von 48 bis 360 Stunden, vorzugsweise eine Zeitdauer von 120 bis 288 Stunden, hergestellt.

Zur Isolierung des Antibiotikums S31794/F-1 wird die Kulturbrühe (90 1) mit einem Gemisch aus Ethylacetat.und Isopropanol (4:1, 90 1) behandelt und das Ganze dann 30 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und unter Vakuum bei etwa 4O⁰C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit einer 10-fachen Menge Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (95:5 bis 60:40) chromatographiert. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und mit einer 100-fachen Menge Silicagel (Sephadex LH-20) mit Methanol chromatographiert. Die aus der Sephadex-Säule kommenden Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und erneut mit einer 100-fachen Menge Silicagel (O₇05 bis 0,2 mm) unter Verwendung eines ' Lösungsmittelsystems aus Chloroform, Methanol und Wasser (71:25:4) chromatographiert. Die eluierten Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu rohem Antibiotikum S31794/F-1 gelangt. Dieses Produkt wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und mit Diethylether ausgefällt, wodurch man S31794/F-1 in Form eines weißen amorphen Pulvers erhält, das nach Trocknen unter Kochvakuum bei 25 bis 30⁰C bei 178 bis 180⁰C unter Zersetzung schmilzt. Durch Urnkristallisation aus einer 10-fachen Menge eines Gemisches aus Ethylacetat, Methanol und Wasser (80:12:8) gelangt man zu kristallinem S31794/F.-1, das nach Trocknen unter

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Hochvakuum bei 20⁰C bei 181 bis 183°C unter Zersetzung schmilzt.

Herstellungsbeispiel 9 Isolierung des Antibiotikums S3T794/F-1

Das gemäß Herstellungsbeispiel 8 nach Chromatographie über Sephadex erhaltene rohe Antibiotikum S31794/F-1 wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems mit LP-l/C.,«- Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) (hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 10) in einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser (71:25:4) gefüllt. Zur Förderung des Lösungsmittels durch die Säule wird eine F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung verwendet. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 22 verfolgt. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man das Antibiotikum S31794/F-1 erhält. Bei einer entsprechenden dünnschichtchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von Silicagel (Merck, 0,25 mm) ergeben sich für dieses Antibiotikum S31794/F-1 folgende R_£-Werte.

Lösungsmittelsystem R_f-Werte

Chloroform:Methanol:Wasser (71:25:4) 0,17

Chloroform:Methanol:konz. Essigsäure (70:29:1) 0,19 Chloroform:Methanol (2:1) 0,27

Das Antibiotikum S31794/F-1 läßt sich ferner auch durch Ioddampf erkennen. .

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Herstellungsbeispiel 10 Herstellung von Silicagel/C.. g-Umkehrphasenharz

Stufe 1; Hydrolyse

Man gibt LP-1 Silicagel (1000 g von Quantum Corp., jetzt Whatman)'zu einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure (1650 ml) und konzentrierter Salpetersäure (1650 ml) in einem 5~1-Rundkolben und schüttelt das Ganze solange, bis es sauber suspendiert ist. Sodann erhitzt man das Gemisch über Nacht (16 Stunden) auf einem Dampfbad, wobei man auf den Kolben einen mit Wasser gekühlten Kühler aufsetzt.

Anschließend wird das Gemisch in einem Eisbad abgekühlt und vorsichtig unter Verwendung einer Sinterglasnutsche filtriert. Das Silicagel wird solange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis sein pH-Wert neutral ist. Sodann wird das Silicagel mit Aceton (4 1) gewaschen und unter Vakuum bei 100⁰C zwei Tage getrocknet.

Stufe .2; Erste Silylierung

Das nach Stufe 1 erhaltene trockne Silicagel wird in einen Rundkolben übertragen und in Toluol (3,5 1) suspendiert. Der Kolben wird zwei Stunden auf einem Dampfbad erhitzt, um das noch vorhandene restliche Wasser azeotrop zu entfernen. Sodann versetzt man das Ganze mit Octadecyltrichlorsilan (321 ml, Aldrich Chemical Company) und rührt das Reaktionsgemisch über Nacht (16 Stunden) unter langsamem mechanischem Rühren bei etwa 60⁰C. Es ist darauf zu achten, daß der Rührer nicht bis zum Boden des Kolbens reicht, damit die Silicagelteilchen nicht gemahlen werden. ·. .

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Im Anschluß daran läßt man das Gemisch abkühlen. Sodann wird das silanierte Silicagel gesammelt, mit Toluol (3 1) und Aceton (3 1) gewaschen und anschließend über Nacht (16 bis 20 Stunden) an der Luft getrocknet. Das getrocknete Silicagel wird in 3,5 1 eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (1:1) in einem 5-1-Kolben suspendiert, worauf man das Ganze vorsichtig 2 Stunden bei Raumtemperatur rührt, filtriert, mit Aceton (3 1) wäscht und über Nacht an der Luft trocknet.

Stufe 3: zweite Silylierung . .

Das Verfahren der obigen ersten Silylierung wird unter Verwendung von 200 ml Octadecyltrichlorsilan wiederholt. Die Suspension wird 2 Stunden unter vorsichtigem Rühren bei 6O⁰C unter Rückfluß gehalten. Das hierdurch erhaltene Produkt wird abfiltriert, mit Toluol (3 1) und Methanol (6 1) gewaschen und dann unter Vakuum bei 50⁰C über Nacht (16 bis 20 Stunden) getrocknet.

Herstellungsbeispiel 11

Aufschlämmfüllverfahren für Michel-Miller-Säulen Allgemeine Angaben . .

Dieses Verfahren wird zum Füllen entsprechender Säulen mit Silicagel-C₁g""Umkehrphasenharz verwendet, wie es beispielsweise nach der Methode des. Herstellungsbeispiels 10 gebildet wird.

Für diese Aufschlämmfülltechnik sind im allgemeinen Drücke von weniger als etwa 14 bar und Fließgeschwindigkeiten von 5 bis 40 ml/min erforderlich. Im einzelnen richten sich diese Werte nach dem Säulenvolumen und den Säulenabmessungen. Der Druck beim Füllen soll um etwa 2 bis 3,5 bar höher sein als der bei.der Trennung angewandte Druck. Dadurch" wird sicher-

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gestellt, daß während der Trennung keine weitere Kompression des Adsorbens erfolgt.

Eine plötzliche Erniedrigung des Drucks kann die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial verursachen, was ein wirksames Arbeiten der Säule stark beeinträchtigen würde. Nach Abstellen der Pumpe muß daher für ein langsames Abfallen des Drucks auf den Wert Null gesorgt werden.

Die verwendeten Säulen (Ace Glass Cat. No. unbepackt) haben etwa folgende Volumina: No. 5795-04=12 ml, No. 5795-10=110 ml, No. 5795-16=300 ml, No. 5795-24=635 ml und No. 5796-34= 34 ml.

Die zum Füllen einer Glassäule erforderliche Zeit liegt je nach Säulenabmessung und Geschicklichkeit zwischen Minuten und mehreren Stunden..

Stufen

1. Die Glassäule wird über eine Kupplung mit einer Vorratssäule verbunden (das Volumen der Vorratssäule soll doppelt so groß sein wie das der Säule). Beide Säulen werden mit der Vorratssäule oben in senkrechte Stellung gebracht.

2. . Das Füllmaterial ist abgewogen (etwa 100 g für eine Säule von etwa 200 ml).

3. Das Füllmaterial wird mit fünf Volumina Lösungsmittel, und zwar einem Gemisch aus 70 bis 80 %'Methanol und 20 bis 30 % Wasser, versetzt.

4. Es wird gut geschüttelt, bis alle Teilchen befeuchtet sind, worauf man das Ganze über Nacht oder langer stehenläßt, damit eine vollständige Tränkung der Teilchen durch Lösungsmittel gewährleistet ist. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen. ·

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5. Das Harz wird mit zur Füllung der Vorratssäule ausreichendem Lösungsmittel aufgeschlämmt und dann schnell in diese gegossen. Die Säule muß dabei mit dem gleichen Lösungsmittel vorgefüllt sein, und die Vorratssäule soll vor dem Eingießen der Aufschlämmung mit Lösungsmittel teilweise gefüllt sein. Die Verwendung größerer Auf schlämmungsvolumina kann gleich- · falls zu guten Ergebnissen führen, erfordert jedoch (a) einen größeren Vorratsraum oder (b) mehrere Vorratsraumfüllungen während des Einfüllvorgangs.

6. Die Vorratssäule wird mit dem Tetrafluorethylenstopfen unterhalb der Säule verschlossen (vgl. Fig. 1 von US-PS 4 131 547, Stopfen Nr. 3), worauf man die Pumpe anschließt und sofort mit dem Pumpen von Lösungsmittel durch das System bei einer Höchstfließgeschwindigkeit von 20 ml/min, wenn eine Ace Cat. No. 13265-25-Purnpe oder ein ähnliches Lösungsmittelabgabesystem verwendet wird.

7. Die obige Arbeitsweise wird solange fortgesetzt, bis die Säule vollständig mit Adsorbens gefüllt ist. Der Druck soll die Höchsttoleranz der Säule während dieses Vorgangs nicht übersteigen (etwa 14 bar für große Säulen und etwa 21 bar für' Analysensäulen). In den meisten Fällen genügen Drücke von weniger als etwa 14 bar.

8. Wenn der Druck Höchstwerte übersteigt, dann wird die Fließgeschwindigkeit herabgesetzt, so daß der Druck abfällt.

9. Nach Füllung der Säule mit dem Adsorbens wird die Pumpe abgestellt, der Druck auf Null fallengelassen und die Verbindung zur Vorratssäule gelöst. Die Vorratssäule wird durch eine Vorsäule ersetzt, die mit Lösungsmittel und einer kleinen Menge Adsorbens gefüllt wird, wonach bis zur vollständigen Füllung der Säule mit Höchstdruck gepumpt wird. Bezüglich weiterer Hinweise wird auf die allgemeine Verfahrensbeschreibung verwiesen. "

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Nach dem Abstellen der Pumpe muß dafür gesorgt werden, daß der Druck immer langsam abfällt, wodurch die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial vermieden wird.

10. Nach Aufheben des Druckes wird die Verbindung zur Vorsäule sorgfältig gelöst. Einige mm (2 bis 4 mm) der Füllung werden mit einem kleinen Spatel vom oberen Ende der Säule entfernt. Auf das obere Ende der Säule werden ein oder zwei Filter gelegt, die gelinde auf das Füllmaterial aufgedrückt werden, worauf man den Tetrafluorethylenstopfen bis zum festen Verschluß auf die Säule aufbringt. Die Säule wird mit der Pumpe verbunden, worauf Druck angelegt wird (gewöhnlich weniger als etwa 14 bar) und durch die Glaswandung am oberen Ende'der Säule beobachtet wird, ob sich das Harz noch weiter zusammenpackt. Sollte sich das Füllmaterial noch weiter absetzen (was bei größeren Säulen der Fall sein kann), dann erscheint ein kleiner Leerraum oder eine Kanalbildung, und in diesem Fall sollte die Stufe 9 wiederholt werden.

Herstellungsbeispiel 12

Herstellung von A-30912A Kern A. Deacylierung von Antobiotikum A-30912 Faktor A

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wird eine Fermentation unter Verwendung von A. utahensis durchgeführt, wobei man das Schrägenmedium A und das Produktionsmedium I verwendet, und das Produktionsmedium etwa 4 2 Stunden inkubiert. Das Fermentationsmedium versetzt man mit A-30912 Faktor A (340 g Rohsubstrat, das etwa 19,7 g A-30912 Faktor A enthält, und zwar gelöst in 1,5 1 Ethanol). Die Deacylierung von A-309-12 Faktor A wird durch einen entsprechenden Versuch unter Verwendung von Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch ein Verschwinden der Aktivität gegenüber C. albicans

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äußert.

B. Isolierung von A-30912A Kern .

Die gemäß obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe (100 1), welche etwa 20 g A-30912 Faktor A enthält, wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene klare Filtrat (etwa 93 1) führt man mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min durch eine Säule, die 4,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche Filterbrühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) (35 1) mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 300 ml/min eluiert.

Die Eluierung wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Von jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines· Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das •hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans. Zeigt die unbehandelte Teilmenge keine Wirksamkeit, während die acylierte Teilmenge wirksam ist, dann enthält diese Fraktion A-30912A Kern. Das den. A-30912A Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt, und durch Lyophilisieren dieses Konzentrats gelangt man zu etwa 97 g rohem Kern.

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C. Reinigung von A-30912A Kern durch Umkehrphasen-Flüssig-Chromatographie . ·

Der nach obiger Stufe C erhaltene A-30912A Kern (25 g) wird in 300 ml eines Gemisches aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mittels einer 4 1 fassenden Säule aus rostfreiem Stahl (8 cm χ 80 cm) chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 4 0 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chrornatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird unter einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model i'UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISO Typ 6) bei 280 nm verfolgt. Jede Minute werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 500 ml aufgefangen.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912A Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zu 2,6 g des gewünschten Kerns gelangt. Bis zur vollständigen chromatographischen Trennung ist eine Lösungsmittelmenge von 7 bis 8 1 erforderlich.

D. Eigenschaften vom A-3 0912A Kern

(a) Empirische Formel: C₃₄H N-O₁,-.

(b) Molekulargewicht: 797,83.

(c) Weißer amorpher Feststoff,·der inWasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Methanol -löslich ist,

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sich in Chloroform/ Toluol und Diethylether jedoch nicht löst.

(d)' IR-Absorptionsspektrum (KBr-Scheiben) mit folgenden Absorptionsmaxima:

3340 breit (OH, H-gebunden); 297O₇ 2930 und 2890 (CH-Streckung, aliphatische CH₃₇ CH-, CH Gruppen) 1660 und 1625 (mehrere Carbonyle C=O); 1510-1550; 1430-1450 (CH Bewegung) ; 1310-1340; 1230-1260; 1080; 835, 650 breit und 550 breit cm .

(e) Die elektrometrische Titration in 66%-igem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 7,35 (anfänglicher

pH-Wert = 7,32).

(f) Bei der Hochdruckflüssigchromatographie beträgt die Verweilzeit (K¹) 11,52 Minuten, und zwar unter folgenden Bedingungen:

Säule: 4 χ 300 mm

Packung: Silicagel/C_1g ' · ·

Lösungsmittel: AmmoniumacetatAcetonitril:Wasser (1:2:97) Strömungsgeschwindigkeit: 3 ml/min Druck: 175 bar

Detektor: UV-Licht mit veränderlicher Wellenlänge von

230 nm

Sensitivität: 0 bis 0,4 A.U.F.S.

Herstellungsbeispiel 13

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912A Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 12 beschrieben vor,, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912A verwendet.

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Herstellungsbeispiel 14

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912A Kern geht man wie im HerStellungsbeispiel 12 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Aculeacin A verwendet.

Herstellungsbeispiel 15

Herstellung von A-30912B Kern .

A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor B

Unter Anwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man A. utahensis, und zwar unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit A-30912 Faktor B in Form einer Lösung in einer geringen Menge Methanol.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor B wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

B. Isolierung von A-30912B Kern

Die nach obigem Abschnitt A-erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der hierbei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht'Säulenvolumina an. deionisiertein Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch vorhandene restliche Ferrnentationsbrälhe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser

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wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und die äcylierte Teilmenge wirksam, dann enthält diese Fraktion A-30912B Kern. Das den A-30912B Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden' rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912B Kern durch Umkehrphasen-Flüssig-

chromatographie . "

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912B Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird beim Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mittels einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) überwacht. ' ^:

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Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912B Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912B Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 16

Zur Herstellung und Reinigung A-30912B Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 15 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912B verwendet.

Herstellungsbeispiel 17 Herstellung von A-30912D Kern

A. Deacylierung von A-30912 Faktor D

Unter Verwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man A. utahensis mit einem Produktionsmedium I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung von A-30912 Faktor D in einer kleinen Menge Methanol.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor D wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden der Aktivität äußert.

B. Isolierung von A-30912D Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAIOM High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der hierbei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu

_ 57 _

22 6 03 3

acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch vorhandene restliche Fermentationsbrühe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida.albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-30912D Kern. Das den A-30912D Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912D Kern durch Umkehrphasen-Flüssig-

keitschromatographie

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912D Kern wird -in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 4 0 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-1.8 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, so daß sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit .einer optischen

-⁵⁸ - 2-2 6 03 3

Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden diejenigen Fraktionen vereinigt, die den A-30912D Kern enthalten, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912D Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 18

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912D Kern geht man

wie im Herstellungsbeispiel 17 beschrieben vor, wobei man als

Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912D verwendet.

Herstellungsbeispiel 19

Herstellung von A-30912H Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor H

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach 48-stündiger Bebrütung der Kultur löst man A-30912 Faktor H in einer geringen Menge Methanol und gibt die Lösung zum Fermentationsmedium.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor H wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

_ 59 _ 226033

B. Isolierung von A-30912H Kern

Die nach obigem Abschnitt Ä erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat leitet man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High'Porous Polymer/ HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der dabei anfallende Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7>5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Sodann wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion werden.zwei Teilmengen entnommen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die aeylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-30912H Kern. Das den A-30912H Kern enthaltende Eluat wird auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912H Kern durch Umkehrphasen-Flüssigchromatographie

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912H Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die S.äule ist Teil einer Chroraatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16--18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck

-⁶⁰ - 22 6 03 3

von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Herstellungsbeispiel 20

Zur Herstellung und Reinigung von A-3 0912H Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 19 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912H verwendet.

Herstellungsbeispiel 21

Herstellung von S31794/F-1 Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum S31794/F-1«

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung des Antibiotikums S31794/F-1 in einer kleinen Menge'Methanol.

Die Deacylierung von S31794/F-1 wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zu Beendigung der Deacylierung laufen, was sich anhand eines Verschwindens der Aktivität äußert.

-ei - 22 6 03 3

B. Isolierung von S31794/F-1 Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das angefallene klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION hochporöses Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der dabei anfallende Abstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das anfallende Waschwasser wird verworfen. Die Säule wird hierauf mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion werden zwei Teilmengen entnommen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält die· jeweilige Fraktion S31794/F-1 Kern. Das den S31794/F-1 Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum gewünschten rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von S31794/F-1 Kern durch Umkehrphasen-Flüssig-

chromatographie '

Der nach obigem Abschnitt B erhaltene rohe S31794/F-1 Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule Chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer

-62 _ 22 6 03 3

Chromate»spac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck von 6₇3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nrti unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die den S31794/F-1 Kern enthaltenden Fraktionen vereinigt, unter Vakuum eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum reinen S31794/F-1 Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 22 Herstellung von Tetrahydro-A-30912A

A-30912 Faktor A wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor A mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912A.

Herstellu η gsbeispiel 23

Herstellung yen Tetrahydro-A-3091 2B ..

A-30912 Fakor B. wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindicxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor B mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange,·bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden),. Das Reaktionsgemisch wird

- es- 2 2 60 3 3

filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912B.

Herstellung, sbeispiel 24 • Herstellung von .Tetrahydro-Ä-30912D

A-30912 Faktor D wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man _t Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, land mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor D mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912D.

Herstellungsbeispiel 25

Herstellung von Tetrahydro-A-30912H

A-30912 Faktor H wird in Ethanol gelöst. Sodann, reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor H mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912H.

- 64 - 22 6 03 3

Beispiele

Die Herstellung verschiedener Alkanoyl- und Alkenoylderivate durch Acylierung eines entsprechenden Kerns erfolgt entweder überdie modifizierte .Schotten-Baumann-Reaktion unter Verwendung eines Säurechlorids als Acylierungsmittel (Methode A) oder über die aktive Estermethode unter Einsatz von 2,4,5-Trichlorphenylester als Acylierungsmittel (Methode B). Die allgemeinen Verfahren zur Durchführung der Acylierungsreaktionen gemäß Methode A oder gemäß Methode B werden im folgenden näher beschrieben.

Methode A (modifizierte Schotten-Baumann-Reaktion)

Diese Methode besteht¹ in einer Umsetzung eines entsprechenden Kerns mit dem Alkansäurechlorid oder dem Alkensäurechlorid, das der gewünschten Acylseitenkette entspricht.

Der Kern wird in einem Gemisch aus 0,1-molarem KHPOT^--PUffer, pH 7,5 (5 bis 10 ml) und Aceton oder Methanol (5 bis 10 ml) gelöst. Die Lösung des Kerns wird unter Kühlen in einem Eisbad oder bei Raumtemperatur langsam (über eine Zeitdauer von etwa 30 Minuten) mit einer Lösung des Alkansäurechlorids oder Alkensäurechlorids in Aceton (2 bis ml) versetzt. Nach jeweiliger Zugabe des Säurechlorids . kann man den pH-Wert des Reaktionsgemisches gewünschtenfalls auf 7,5 bis 8,0 einstellen. Diese Maßnahme ist jedoch nicht wesentlich. Das Reaktionsgemisch wird dann in einem Eisbad oder bei Raumtemperatur 1,5 bis 3,0 Stunden gerührt. Mit zunehmendem Fortgang der Reaktion entsteht ein Niederschlag, der vorwiegend aus der freien Alkansäureform oder Alkensäureform zusammengesetzt ist. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktiongemisch zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert. Den erhaltenen Nieder-:

- 65 - 2 2 6 0 3 3

schlag und die überstehende wässrige Flüssigkeit behandelt man dann nach einem der folgenden Reinigungsverfahren.

Verfahren (a)

Der Niederschlag wird einmal, zweimal oder dreimal mit zwei bis drei Volumina Methanol oder einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:1) gewaschen. Die Waschflüssigkei- \. ten aus Methanol oder einer Mischung aus Methanol und Wasser werden zentrifugiert, und die überstehenden methanolischen Flüssigkeiten werden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt, die nach der ersten Zentrifugierung des Reaktionsgemisches anfällt. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden dann zur Entfernung des organischen Lösungsmittels unter Vakuum eingeengt. Das dabei erhaltene wässrige Konzentrat wird mit einem gleichen Volumen Methanol vereinigt, worauf man die erhaltene Lösung der Reihe nach wie oben bei der Methode (a) angegeben mit Chloroform und Ethylacetat extrahiert.

Verfahren (b)

Der Niederschlag wird sofort verworfen und die überstehende Flüssigkeit bei pH 5,0 bis 7,0 einmal oder zweimal mit Diethylether (gleiches Volumen) extrahiert, um hierdurch die nichtumgesetzte Alkansäure oder Alkensäure zu entfernen. Der Diethyletherextrakt wird verworfen. Die extrahierte überstehende Flüssigkeit wird zur Entfernung des organischen Lösungsmittels unter Vakuum eingeengt. Das erhaltene wässrige Konzentrat wird mit einem gleichen Volumen Methanol vereinigt, worauf man die erhaltene Lösung der Reihe nach nach der oben beschriebenen Methode (a) mit Chloroform und Ethylacetat extrahiert.

- 66 - 2 2 6 0 3 3

Nach Extraktion mit.Chloroform und anschließender Extraktion mit Ethylacetat gemäß obigem Verfahren (a) oder (b) werden alle Lösungsmittelextraktphasen vereinigt und zur Trockne eingedampft, wodurch man zum rohen Alkanoylderivat oder Alkenoylderivat von A-30912A Kern gelangt.

Das jeweilige rohe Derivat wird hierauf durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt gereinigt:

Die Probe wird in Methanol (5 bis 6 ml) gelöst und die Lösung in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Länge 80 cm, Innendurchmesser 1,5 cm) eingespritzt, die mit LP-1/C18-Harz (s. Beispiel 25) gefüllt ist, wobei man die Säule mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril eluiert. Die Elution wird unter einem Druck von 70 bis 105 bar mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 bis 12 ml/h unter Verwendung einer LD-C-Duplex-Pumpe (Milton-Roy) durchgeführt. Der Säulenabstrom wird mittels eines ISCO-UA-5-Detektors bei 280 nm verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zum gereinigten Alkanoylderivat oder Alkenoylderivat des jeweiligen Kerns gelangt. Das gereinigte Produkt wird dünnschichtchromatographisch (TLC) unter Verwendung von Umkehrphasen-C., _o -Platten (Whatman KC₁₀) und

Io Io

eines Lösungsmittelsystems aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2) analysiert. Nach entsprechender Entwicklung werden die Platten zur Detektion des gewünschten Produkts unter UV-Licht betrachtet. Die erhaltenen Produkte werden ferner auch durch Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysiert.

- 67 - 2 2 6 03 3

Methode B (aktive Estermethode)

Eine Lösung aus einem geeigneten Kern und dem 2,4,5-Trichlorphenylalkanoat oder 2,4,5-Trichlorphenylalkenoat in Dimethylformamid (DMF) (10 bis 20 ml) wird 6 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird hierauf unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zum rohen Alkanoylderivat oder Alkenoylderivat des jeweiligen Kerns gelangt. Das Rohprodukt wird dann durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie oben bei der Methode A beschrieben gereinigt. Das gereinigte Produkt wird nach den oben bei der Methode A beschriebenen Methoden analysiert.

Beispiele1-16

Aus der folgenden Tabelle I geht die Herstellung verschiedener Alkanoylderivate und Alkenoylderivate durch Acylierung von A-30912A Kern hervor, wozu man . zu Beispielen von Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gelangt. Die in dieser Tabelle enthaltenen Derivate werden entweder durch die modifizierte Schotten-Baumann-Reaktion unter Verwendung eines Säurechlorids als Acylierungsmittel (Methode A) oder durch die aktive Estermethode unter Verwendung von 2,4,5-Trichlorphenylester als Aclyierungsmittel (Methode B) hergestellt.

22 6 03 3

QJ

σι ο

O >

+J

•Η Φ

to

ι—Ι

Tabelle I (Forts.)

Beispiel No.	R5	Acylie rungs-	[2}5"	10"	B'	150	tit Gewicht d.Acylie-	Reak tions	h.	HPLC-Elu±ermittel (V:V:V) .	ProdnTc-l-	R (a)	M+(b)
1.	CH3(CH2>10-	ι- Gewici • des		7" (d) A	150	(mg) rungsmit- .. ir0! s (πντ) ·	zeit	h.	H0Q:CH3OH:CH3CN	Gewicht	0.72	979
2.	CH3(CH2J11-	methode Kems	5" (C) A	2>7~		—WS,, j. _r \ 11 r j ; 170	18		2:1:2	86	0.62	993
3.'	trans-CH-, (CK	B	B	B	340	160	18	h	2:1:2	70
	ό CII=CM(CH2) 7-	B	(g) 300			h.			0.50	1033
4.	CiS-CH3(CH2)	300	300	18	h.	1:2:2	274	0.52
	CH=CH(CH2)_-		1000	1.5		1:2:2	108	0.33	1033
5.	^TT / /^ TT \ mm	300	260	18	h.	1:4.5:4.5	266		—
6.	cis-CH-(CH0)	(g) 250			h.			0.35
	-CH=CH ("CH2J4		260	18		1:2:2	167	0.37	1084
7.	cis-CH-(CH0)	300	VLOOO	2	h	1:2:2	111
	CH=CH(CH0)--					0.35	1061
8.	trans-CH3(CH	273	16	1:2:2	251
	CH=CH(CH2)_-		1061

Beispiel No.

Tabelle I (Forts.)

Acylie- Gewicht Gewicht Beakrungsdes : d.Acylie- /tions-

methode. Kerns (mg) rungsmit- zeit ¹ " : teKrdng) H P LC -Eluiermittel

(V:V:V)

H₀OiCH-OHjCH-CN Gewicht (a) _M+(b)

i3J ^jR_fM

Produkt

cis-CH,(CH₀) _- CH=CH(CH₂)g-

trans, trans-CH->(CH₂J₄CH=CHCH₂-CH=CH(CH₀)₇-

eis,eis,cis-CH.,-

300

273

1:2:2

300

225

1:2:2

R_f

262 0.38 1061

212

0.41 1059

	CH2CH=CH(CH2)7-	A	210	1000	1.5	h.	1:2:2	.5	150	•	75	1058"	1
12. 13.	CH3(CH2J17- CH3(CH2J18-	B (e) A	300 (f) 300	285 ^1000	16 1.5	h h:	1:4.5:4 1:4:6		243 84	0. 0.	17 13	1077 1091
14.	cis-CH,(CH-)--			1				.5
	ό c. I CH=CH(CH2J9-	B	300	294	16	h.	1:4.5:4	261	0.	22	1089	V. C C

Beispiel No.

. . Tabelle I (Forts.)

Gewicht

Acylie- Gewicht d.Acylie- Reakrungsdes rungsmit?- tions-

methode Kerns(mg) tels(mg) ., zeit

(V:V:V)

Produkt

H_o0:CH,0H:CH,CN

(d) (f) A

CiS-CH-(CH.,)-CH=CH(CH₂J₁₁-B

228

300

1.5 h;

16 h:

(mcr)

1j4:6

1:2:7

55 0.00 1119

228 0.12

(a) R_f-Werte durch Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie auf Whatman-KC^-Platten, Fluoreszenzindikator/ Lösungsmittelsystem 1:2:2 H₂OrCH₃OH:CH₃CN

(b} M erhalten durch FDMS. Die Verbindung nimmt Na auf,was durch das Stammmassenxon bestimmt wird. Die Ergebnisse beziehen sich auf M + Na .

(c) Bei 4-1O⁰C, in einem Gemisch aus Puffer und Aceton.

(d) Umgebungstemperatur, in einem Gemisch aus Puffer und Aceton.

(e) Umgebungstemperatur, in einem Gemisch aus Puffer und Methanol.

(f) Reinigungsmethode a.

(g) Reinigungsmethode b. . ; (h) Aus um · eine Masseneinheit.

- 72 - 2 2 6 0 3 3

Beispiel 17

n-Tridecanoylderivat von Ä-30912A Kern

Im folgenden wird die Herstellung von Verbindungen aus der allgemeinen Formel III nach der sogenannten Methode über einen aktiven Ester in größerem Maßstab beschrieben. Im einzelnen wird hiernach eine Verbindung der Formel IV

5 hergestellt, worin R für CH₃(CH₂)..- steht.

A. Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat

Eine Lösung von n-Tridecansäure (Sigma Chemical Co.) (12,5g, 2,4,5-Trichlorphenol (11,5 g) und Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid (12,0 g) in Methylenchlorid (650 ml) wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (22 g) gelangt. Dieses Material wird dann säulenchromatographisch über Silicagel (Woelm) unter Verwendung von Toluol als Eluiermittel gereinigt. Die einzelnen Fraktionen werden äünnschichtchromatographisch unter Verwendung eines kurzwelligen UV-Lichtes zur Detektion verfolgt. Die das gereinigte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft.

B. Acylierung von A-30912A Kern mit 2,4,5-Trichlorphenyl-ntridecanoat .

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (6,0 g) und A-30912A Kern (4,5 g) in Dimethylformamid (DMF) (600 ml) wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch anschliesendes Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum gelangt man zu einem Rückstand (12 g). Der Rückstand wird 45 Minuten mit Methylenchlorid (500 ml) aufgeschlämmt, und das

73 - 22 6 03 3

Gemisch wird dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Die zurückbleibenden Feststoffe werden mit Methanol (50 0 ml) extrahiert, worauf man den Methanolextrakt filtriert und das Filtrat unter Vakuum eindampft. Auf diese Weise gelangt man zu einem Rohprodukt (5,0 g).

Das obige Rohprodukt wird wie folgt durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt:

Eine Probe des Rohprodukts (1 g) wird in Methanol ( 5 ml) gelöst, und die Lösung wird in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Länge 80 cm, Innendurchmesser 2,5 cm) eingespritzt, die mit LP-1/C.g-Harz (s. Herstellungsbeispiel 11) gefüllt ist. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (3:3:4) eluiert. Die Elution wird bei einem Druck von 70 bis 105 bar unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 11 bis 12 ml/min mittels einer LDC-Duplex-Pumpe (Milton-Roy) durchgeführt. Der Abstrom wird durch einen UV-Detektor (ISCO-UA-5) bei 280 nm überwacht. Alle zwei Minuten werden entsprechende Fraktionen (21 bis 24 ml) aufgefangen. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Auf diese Weise gelangt man zu 550 mg Produkt.Das obige chromatographische Verfahren wird viermal mit Proben von jeweils einem Gramm an Rohprodukt wiederholt, wodurch man folgende zusätzliche gereinigte Proben erhält: 620 mg, 520 mg, 670 mg und 490 mg. Die Gesamtmenge an gereinigtem Titelprodukt beträgt 2,8 g. Nach den oben beschriebenen. Verfahren setzt man dann 4,0 g A-30912A Kern mit 2,3,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat um, wodurch man zu 2,6 g gereinigtem Titelprodukt gelangt. Die bei beiden Herstellungen erhaltenen Produkte werden vereinigt (5,4 g). Durch FDMS-Analyse ergibt sich ein. Massenion (M_ + Na ) von 1016. (Das theoretische Massenion M +Na beträgt 1016.) In einer entsprechenden analytischen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (C_1R Micro Bondapakf Waters Co.) unter Verwendung eines Eluier-

22 6 033

mittelsystems aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2) ist lediglich ein Maximum zu sehen.

Beispiel 18

n-Tridecanoylderivat von A-30912B Kern

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (hergestellt gemäß Stufe A von Beispiel 17) (3,3 mMol) und A-30912B Kern (s. Herstellungsbeispiele 15 und 16) (1 mMol) in Dimethylformamid (DMF) (200 ml) wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach Entfernung des Lösungsmittels unter vakuum erhaltene Rückstand wird 45 Minuten mit Methylenchlorid (300 ml) aufgeschlämmt, und das Gemisch wird dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Die zurückbleibenden Feststoffe werden mit Methanol (300 ml) extrahiert, und durch anschließendes Filtrieren des Methanolextrakts und Eindampfen unter Vakuum gelangt man zu einem Rohprodukt.

Das obige Rohprodukt wird durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeistchromatographie wie folgt gereinigt:

Eine Probe des Rohprodukts (1 g) wird in Methanol ( 5 ml) gelöst, und die Lösung wird in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Länge 80 cm, Innendurchmesser 2,5 cm) eingespritzt, die mit LP-1/C_1fi-Harz (s. Herstellungsbeispiel 11) gefüllt ist. Die Säule wird mit einem Lösungsmittel system aus Wasser, Methanol und Acetonitril (3:3:4) eluiert. Die Elution wird bei einem Druc. von 70 bis 105 bar unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 11 bis 12 ml/min mittels einer LDC-Duplex-Pumpe (Milton-Roy) durchgeführt. Der Abstrom wird durch einen UV-Detektor (ISCCHüA-5) bei 280 nm überwacht. Alle zwei Minuten werden entsprechende Fraktionen (21 bis 24 ml) aufgefangen. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum einge-dampf tjj wodurch man zum Titelprodukt gelangt. Das gereinigte Produkt wird dünn-

22 6 033

schichtchromatographisch (TLC) unter Verwendung von Umkehrphasen-C. ο-Platten (Whatman KC₁₈) und eines Lösungsmittelsystems aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2,. Volumen/Volumen) analysiert. Nach entsprechender Entwicklung werden die Platten zur Detektion des gewünschten Produkts unter UV-Licht betrachtet.

Beispiel 19

Das in Beispiel 18 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man in Stufe A eine entsprechende Alkansäure oder Alkensäure verwendet und in Stufe B einen entsprechenden Alkansäure- oder Alkensäure-2,4,5-trichlorphenylester einsetzt, wodurch man zu folgenden Derivaten von A-30912B Kern gelangt.

Alkanoyl- und Alkenoylderivate von A-30912B Kern

OH

22 6 033

R⁵

CH₃(CH₂J₁₀-CH₃(CH₂)₁₂-CH₃(CH₂)₁₃-CH₃(CH₂)₁₄-CH₃(CH₂)₁₅-CH₃(CH₂),.-CH₃(CH₂)₁₈-CH₃(CH₂)₁₉-

cis-CH,(CH₉).,CH=CH(CH₉)_-

trans-CH₃(CH₂)₅~CH=CH (CH₂) _1QCH=CH

• trans-CH., (CH₀) , _nCH=CH ClS-CH₃(CH₀)_?CH=CH tran£-CH₃(CH₂)₇CH=CH CJs-CH₀(CH₂)₅CH=CH (CH₂)_gtrans-CH-(CH₀)_CCH=CH(CH-)_o~ Cis-CH. (CH₀)^CH=CH (CH₀).-trans_-CH (CH₉) -CH=CH(CH₉) .-CJS-CH₃(CH₂)_?CH=CH(CH₂)_ιχ-trans-CH₃

trans, trans-CH-, (CH₉) .CH=CHCH₉CH=CH (CH₉) „-eis,eis,CiS-CH₃CH₂CH=CHCH₂CK=CHCH₂CH=CH (CH₃) γ

- 77 - 22 6 03 3

Beispiel 20

ή-Tridecanoylderivat von A-30912D Kern

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (hergestellt gemäß Stufe A von Beispiel 17) (3/3 mMoL) und A-30912D Kern (s..Herstellungsbeispiele 17 und 18 ) (1 mMol) in Dimethylformamid (DMF) (200 ml) wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird 45 Minuten mit Methylenchlorid (300 ml) aufgeschlämmt, und das Gemisch wird dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Die zurückbleibenden Feststoffe werden mit Methanol (300 rnl) extrahiert, und durch anschließendes Filtrieren des Methanolextrakts und Eindampfen unter Vakuum gelangt man zu einem Rohprodukt.

Das obige Rohprodukt wird wie in Beispiel 18 beschrieben durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt.

Beispiel 21

Das in Beispiel 20 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man in Stufe A eine entsprechende Alkansäure oder Alkensäure verwendet und in Stufe B einen entsprechenden Alkansäure- oder Alkensäure-2,4,5-trichlorphenylester einsetzt, wodurch man zu folgenden Derivaten von A-30912D Kern gelangt.

22 6

Alkanoyl- und Alkenoylderivate von A-30912D_Kern

CH₃

VI _Ώ5

CH₃(CH₂) CH₃(CH₂)

) -> 2~ CH₃(CH₂)₁₄-CH₃(CH₂)₁₅-CH₃(CH₂)₁₇-CH₃(CH₂)₁₈-CH₃(CH₂)₁₉-

^ (CH₂) ₂ Q CiS-CH-(CH₀)-CH=CH(CH₀)

22 6 033

trans_-CH₃ (CH₂) ₅-CH=CH ₂ CiS₁-CH₃ (CH₂ )_1QCH=CH (CH₂) ₄-

trans_-CH₃ (CH₂) _1QCH=CH

CiS-CH₃ (CH₂) ,,CH=CH (CH₂) ₇~

trans_-CH₃ (CH₂) ₇CH=CH

cis_-CH₃ (CH₂) ₅CH=CH _{2 Q} trans-CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)_gcis-CH-, (CH₀)^CH=CH(CH₀) _Q-trans-CH,(CH-)-CH=CH(CH₀)_Q-

ci_s_-CH₃ (CH₂) ₇CH=CH

trans-CH,(CH₉)₇CH=CH(CH₀),,-trans,trans-CH_o(CH₀).CH=CHCH₀Ch=CH(CH₀)_- eis , eis,CiS-CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)_-

Beispiel 22

n-Tridecanoylderivate von A-30912H Kern

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (hergestellt gemäß Stufe A von Beispiel 17) (3,3 mMol) und A-30912H Kern (s. Herstellungsbeispiele .19 und 21 ) (1 mMol) in Dimethylformamid (DMF) (200 ml) wird 16 Stunden bei. Raumtemperatur gerührt. Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird 45 Minuten mit Methylenchlorid (300 ml) aufgeschlämmt, und das Gemisch wird dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Die zurückbleibenden Feststoffe werden mit Methanol (300 ml) extrahiert, und durch anschließendes Filtrieren des Methanolextrakts und Eindampfen unter Vakuum gelangt man zn einem Rohprodukt.

22 6 03

Das obige Rohprodukt wird wie in Beispiel 18 beschrieben durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt.

Beispiel 23

Das in Beispiel 22 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man in Stufe A eine entsprechende Alkansäure oder Alkensäure verwendet und in Stufe B einen entsprechenden Alkansäure- oder Alkensäure-2 ,4,5-trichlorphenylester einsetzt, wodurch man zu folgenden Derivaten von A-30912H Kern gelangt.

Alkanoyl- und Alkenoylderivate von A-30912K Kern

CH₃

.CH₃

VII

22 6 033

R⁵

CH₃(CH₂J₁₀-CH₃(CH₂J₁₂-CH₃(CH₂J₁₃-CH₃(CH₂J₁₄-CH₃(CH₂J₁₅-CH₃(CH₂J₁₇-

CH₃(CH₂)_ig-CH₃(CH₂) on ClS_--CH₃ (CH₂) ₅CH=CH (CK₂) ₇-trans-CH (CH₉).-CH=CH(CH₉)--CiS_--CH₃ (CH₂) _1QCH=CH (CH₂) ₄-trans_-CH₃ (CH₂) _1QCH=CH cis-CH-, (CH₉) .,CH=CH(CH₉) _- trans_-CH₃ (CH₂) _?CH=CH (CH₂) CiS-CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)_g trans_-CH₃ (CH₂) ₅CH=CH (CH₂) _g CiS-CH, (CH₉ ) -,CH=CH (CH₉ ) _Q-trans-CH₃(CH₂)_?CH=CH₂ CiS-CH₀(CH₉)^CH=CH(CH₉),, txan£-CH₃(CH₂J₇CH=CH trans,trans-CH₃

eis,eis,CiS-CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)

2 2 6 .0 3 3

Beispiel 24

Im folgenden wird die Herstellung des N-n-Tridecanoylderivats von A-30912H Kern aus A-30912A Kern erläutert.

Nach dem im Beispiel 17 beschriebenen Verfahren behandelt man A-30912A Kern mit 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat. Das hierdurch erhaltene Derivat wird dann methyliert, indem man eine Probe hiervon (20 mg) mit 3 % HCl-Methanol (Q,06 ml) in Dimethylformamid (1.ml) behandelt. Die Lösung läßt man dann unter Rühren 16 Stunden stehen, worauf das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt wird. Der erhaltene Rückstand wird durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Silicagel

C,_o-Harz gereinigt

Io

Beispiel· 25 n-Tridecanoylderivat von S31794/F-1 Kern

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-tridecanoat (hergestellt gemäß Stufe A von Beispiel 17) (3,3 mMol) und S31794/F-1 Kern (s. .Herstellungsbeispiel 12) (-j in Dimethylformamid (DMF) (200 ml) wird 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der nach Entfernung des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird 45 Minuten mit Methylen» Chlorid (300 ml) aufgeschlämmt, und das Gemisch wird dann filtriert= Das Filtrat wird verworfen. Die zurückbleibenden Feststoffe werden mit Methanol (300 ml) extrahiert, und durch anschließendes Filtrieren des Methanolextrakts und Eindampfen unter Vakuum gelangt man zu einem Rohprodukt.

Das obige Rohprodukt wird wie in Beispiel 18 beschriebendurch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt.

- 83 - 2 2 6 0 3 3

Beispiel 26

Das in Beispiel 25 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man in Stufe A eine entsprechende Alkansäure oder Alkensäure verwendet und in Stufe B einen entsprechenden Alkansäure- oder Alkensäure-2,4,5-trichlorphenylester einsetzt, wodurch man zu folgenden Derivaten von S31794./F-1 Kern gelangt.

Alkanoyl- und Alkenoylderivate von S31794/F-1 Kern

CH₃

ι y

;·—ο

>Ι-Η H- ν( CH₃

\ / \ ι ο=·_ν Ή oh

Au Il · · ι

OH _{0 Η}. —

H VIII

- ⁸⁴ - 2 2 6 0 3

R⁵

CH₃(CH₂)

CH₃(CH₂)₁₅-CH₃(CH₂)₁₆~ CH₃(C₂)₁₇-

CH₃(CH₂) ,λ

)₂q~ cis-CH., (CH₂) ₅CH=CH (CK₂) _ trans-CH₃(CH₂)₅"CH=CH Ci£-CK₃(CH₂)_1QCH=CH₂₄ trans-CH-. (CH₀) , _nCH=CH (CH₀) .-

————— j £. XU c, ^

(CH₂)_?CH=CH(CH₂)_?~

trans-CH₃(CH₂)₇CH=CH CiS-CH₃(CH₂)₅CH=CH

trans-CH₃(CH₂)₅CH=CH_2g Cis-CH-(CH₀)_CH-CH(CH₀)_Q-trans-CH (CH₀)-CH=CH(CH-)_Q-CH₃ (CH₂) _?CH=CH

trans-CH₃(CH₂)_?CH=CH trans,trans-CH,(CH₀).CH=CHCH₀CH=Ch(CH₀) eis,CiS-CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₉)_?- cis,cis,CiS-CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CK(CH₂) ·

-es-' 22 6 03 3

Beispiel 27

Die antifungale Wirksamkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel III läßt sich durch übliche Scheibendiffusionstests und Agar-Verdünnungstests in vitro und durch übliche Untersuchungen an Mäusen in vivo ermitteln, die gegenüber einer systemischen Pilzinfektion wirksam sind. Die bei dieser Ermittlung der antifungalen Wirksamkeit für typische Verbindungen aus der allgemeinen Formel IV (Beispiele 1 bis IS) erhaltenen Ergebnisse gehen aus den später folgenden Tabellen II, III, IV und V hervor.

Die Tabellen Ii und nizeigen die Ergebnisse einer untersuchung der Verbindungen der Beispiele 1 bis 16 durch die sogenannte Agar-Scheiben-Diffusionsmethode in vitro. In der Tabelle II ist die ermittelte Wirksamkeit durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten Hemmzone des Mikroorganismus angegeben, die von. der jeweils untersuchten Verbindung gebildet wird. In Tabelle IHist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz {\ig/ Scheibe) angegeben, die zur Hemmung des Wachstums des jeweiligen Testorganismus erforderlich is.t. Aus der Tabelle III gehen die Ergebnisse der Untersuchung des N-(n-Dodecanoyl)-p-aminobenzoylderivats von A-30912A Kern (Formel III, worin R für n-C-]2^H25 ^Btent) ^^η vitro gegen-: über fünf Stämmen von Candida albicans durch die Agar-Verdün-

f

nungsmethode hervor. In Tabelle III ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz (μΐη/ml) angegeben, die für eine Hemmung des jeweiligen Testorganismus erforderlich ist.

Aus Tabelle V ' gehen die Ergebnisse entsprechender in-vivo-Untersuchungen 2ur Ermittlung der Wirksamkeit der Verbindungen der Beispiele 1 bis 16 gegenüber einer durch

22 6 033

Candida albicans A-26 an Mäusen verursachten Infektion hervor, wobei die Wirksamkeit in Form der ED^-Werte angegeben ist, worunter die Dosis in mg/kg verstanden wird, die zur Heilung von 50 % der Versuchstiere benötigt wird. Wurden keine ED' -Werte ermittelt, dann ist als Wirksamkeit jeweils die niedrigste Dosis angeführt, bei der sich eine beachtliche antifungale Wirkung feststellen läßt. Für die entsprechenden Untersuchungen werden Gruppen aus männlichen weißen Mäusen {die pathogen frei sind) mit einem Gewicht von 18 bis 20 g verwendet, welche man intravenös mit Candida albicans A-26 infiziert. Die Tiere werden 24 Stunden vor der Infizierung über eine Zeitdauer von 8 Minuten mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von etwa 50 Röntgen pro Minute (Gesamtdosis 400 Röntgen) behandelt, um auf diese Weise eine Immunreaktion gegenüber dem infizierenden Mikroorganismus herabzusetzen. Jeweils 0, 4 und 24 Stunden nach erfolgter Infektion gibt man jeder Gruppe an Mäusen sucutanabgestufte Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung in Form einer Suspension in 33 % Polyethylenglykol-Wasser. Man ermittelt den Tag, an dem die jeweiligen Tiere verendet sind. Nach dem sogenannten Student-T-Test bestimmt man durch Vergleich des jeweiligen mittleren Todestages zwischen jeder Gruppe an infizierten behandelten Mäusen bei der jeweiligen Dosierungshöhe und an 10 infizierten unbehandelten Tieren, ob es durch die jeweilige Behandlung zu einer wesentlichen Verlängerung der Überlebenszeit gekommen ist.

Aus der später folgenden Tabelle VI gehen die Ergebnisse der Bestimmung der Absorption entsprechender Verbindungen nach oraler Verabreichung hervor. Hierzu gibt man Mäusen über eine Magensonde eine Dosis von 416 mg/kg des jeweiligen Wirkstoffes in. Form einer Suspension., in 33 % Polyethylenglykol 400-Wasser. In bestimmten Zeitabständen werden.vom Orbita-lsinus Blutproben entnommen und in folgender Weise

- 87 - 22 6 03 3

bezüglich einer antibiotischen Wirksamkeit ausgewertet:

Eine 7 mm große Scheibe, die 20 μΐ Gesamtblut enthält, wird auf Agar gelegt, der mit Aspergillus montevidensis A35137 angeimpft ist. Nach 40-stündiger Inkubation bei 30⁰C vergleicht man die Hemmzonen der Blutproben mit einem aus dem jeweiligen Wirkstoff erhaltenen Standard und ermittelt die in den Blutproben enthaltenden Wirkstoffmengen.

Tabelle II

Verbindung

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibfendiffusionstest

Größe der Hemmzone

Beispiel No

R von Formel III (mm)

(a)

Saccharomyces Neurospora Trichophyton

Candida

pastoranlus X-52 crassa 846 mentagraphytes A-23 alblcans A-26

1 2 3 4 5 6 '7 8 9 10

CH₃ (CH₂) _n-

trans-CH„ (CH₀) _CH=C11(C.H_)_-

cis-CH„ (CH₀) ,.CH=CH(CH₀) _-

₃(CH)₁₅-

Sj-CH₃ (CH₂)₁₀CH=CH(CH₂)₄-

cis-CH„(CH₀)^CH=CH(CH₀) trans-CH-(CH₀) .,CH=CH(CH₀) cis-CH, (ClI₀) ,CH=CH(CH₀) _-

trans,trans-CH 16 21 19

24

40

32*

40*

30	21
27	20
19	18
18	32

26*

(b) 60* 50*

40* 34*

1 31*

36

25 30

24

18 23 23 21

24

Tabelle II (Forts.) Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibandiffusionstest

	Verbindung	Größe	der Hemmzone	(mm)v"'	Candida	I
Beispiel No		Saccharomyces	Neurospora	Trichophyton	albicans A-26	ro vo I
11	K von Formel III	pastoranius X-52	crassa 846	nientagraphytes A-23
	eis,eis,cis-CH^(CHn)CH=CHCH„-				30
12	11J Z i. 2 2 7	16	33*	36	19
13	CH3(CH2)17-	17	18*	22*	16
14 .	CH3(CH2)18-	18	13	16	22 12
15 .	cis-CH„ (CHJ,CH=CH(CHJn-	18 19	18 15	23* 20	12*
16	. j Li ζ y ClL(CHJ9n-	12	22	20*
CiS-CH3(CII2) CH=CH(CH2)χ -

(a) Die Verbindungen werden in Form einer Suspension in Methanol in einer Konzentration von 1 mg/ml untersucht, indem man in eine solche Suspension eine 7 mm große Scheibe taucht und die Scheibe dann auf die Agar-Oberflache "legt. Inkubation: 24 bis 48 Stunden bei 25 - 37°C.

(b) Zu groß für eine Ablesung.

* Ausgeprägte meßbare Hemmzone, bei der der Organismus um die Scheibe herumgewachsen ist.

O CO CO

Tabelle III Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusionstest

	Verbindung	CH3(CH2)10-	Minimale Hemmkonzentration (ug/Scheibe)*	1.25	0.078
Beispiel No.	R .von Formel III	CH3 (CH2) n-	Candida albicans A-26 Trichophyton mentagrophytes No,	2.5; 5.0	0.039
1	trans-CH., (CH0) rCH=CH(ClL)n-	1.25	5.0	—
2	i /. J Z / CiS-CIL(ClL)n-CH=CH(ClL)7- 1 j Z _} Z /	0.625	1.25; 2.5	<0.039
3	CH3(CH)15-	—	5.0	0.039
4	CiS-CIL(CIL)1nCH=CH(ClL).- • 3 2 10 2 4	0.312; 0.625	7.20; 10.0	0.039
5	CiS-CiL(ClL)7CH=CH(CH0).,- ' j / / Δι	0.625	0.039; 0.156
6	trans-ClL (CIl0) .,CH=CiI(CH0).,	1.25; 1.25	<O.O39
7	" ' "— J Z / Z / CiS-ClL(CIL)1-CH=CH(CIL)0-	0.625; 0.625	<0.039
8	trans,trans-CHo(ClL),CH=CHCHOCH=CH(CHO	0.156	<0.039
9	0.312
10	)_- 0.156	0.039
11	' J . L 4 2 ii / cIs5cis,cIs-CH0(CH0)CH=CHCH0Ch=CHCH0CH=CH-	1.25; 0.625
	JZ ζ L	5
12	CIl3 (CH2) 17- · "	0.625; 0.156
13	CIi3 (CH2) 18-	5 .
14	CiS-ClL(ClL)7CH=CH(CH0),-- _} z / ζ y	2.5; 2.5
15
16	cis-CH„(CH0)7CH=CH(CIL) τ -

* Die Verbindungen sind in 0,01-molarer Natriumbowa-tldsung suspendiert, die einen pH-Wert von 7,5 hat

Die Verbindungen werden in einer Menge von 20 ug/Scheibe als höchster Konzentration und unter Zweifachverdünnungen bis zum Erreichen der jeweiligen Endpunkte untersucht. Inkubation: 24 Stunden bei 30⁰C.

CD-CO CO

22 6 033

Tabelle IV

In-vitro-Wirksamkeit des n-Tridecanoylderivats von A-30912A Kern gegenüber fünf Stämmen von Candida albicans.

Minimale Hemmkonzentration (ug/ml)

A26 SBH 16 SBH 31 SBH 28 SBH 29 0,312 0,625 0,625 0,625 0,625

Verbindung

Tabelle V Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26 bei Mäusen

Beispiel No.

R von Formel III

1 2 3 4 . 5 6 7 8 9

CH (CH ) -

Sj Z- Jl jL

LrCInS-ClI₀(CH₀)^CH=CH(CH,,)-,-

j JL j /LI

cis-ClI„ (CH₀),CII=CH(CH₀) _n-J Zj Z /

CH₃(CH)₁₅-

cIs-CH₀ (CH₀).._nCH=CH(CH₀) . -

j Z 10 Z Α

CiS-CH-(CH₀)' CH=CH(CH₀)₇-

traris-CH, (CH₀) -CH=CH(CH₀)

—-— 3 2 5 2

trans, trans-CH-(CH-) .CH=CHCH₀Ci;

JzA ί ί. ι

c is ,c is, c Is-CIl (CH ) CH=CHCH CH=CHCH CH=CH-

CH CH₃(CH₂)₁₈-

-CIl₃ (CH₂) ₇CH=CH (CH₂) _g-

(CH₂)₂₀-Niedrigste

cis-CH„(CH₀) CH=CH(CH₀), _Λ-

Dosierungs „_ Schema* .	> (mg/kg)**	20	wirksame .Dosis (mq/kg)	; 20
B	62	14; 22	20	i 10; 20
B	34		20
A	40		20
A	>40		20
A	9		.>5
A	18;	4.6	20	>5
A	32;		10
A	11	12.2	10	! I5
A	>40		40
A	16	18	10	; 10.0
A	>40	>40
• A	12;	I5'
A	40	10
A	>40;	10
A	>40	>40
A	>40:	40

- 93 - 22 6 033

Tabelle V (Forts.)

* Dosierungsschema: A = 40, 20, 15 und 10 mg/kg, B = 80, 40, 20 und 10 mg/kg. Die entsprechenden Dosen werden 0, 4 und 24 Stunden nach erfolgter Injektion in Form einer Suspension des jeweiligen Wirkstoffes in 30 % PEG-HpO verabreicht, Jede Wirkstoffdosis wird jeweils einer Gruppe aus 6 Mäusen gegeben. Die Kontrollgruppe (unbehandelte Tiere) besteht jeweils aus 10 Mäusen.

** Gemessen anhand der Zunahme der Überlebenszeit der behandelten Tiere gegenüber den Kontrollen und berechnet nach der in American J. Hygiene 27, 493 (1938) beschriebenen Methode.

Tabelle VI Blutspiegel nach oraler Verabreichung an Mäuse

Verbindung

Beispiel No.	j^-1 von Formel III	Blutspiegel* ^g/ml)	0	10	•	U.
1	ClI3 (CH2) 10-		0.	U.
2 '	CH3 (CH2) u-		N.	19
3	trans-CH, (CH0) ,.CH=CH(CH0)--		0.
4	j Z J Ll cis-ClL (CII0) ,CLl=CH(CH0) n~ J / j Ll		97
5			18
6	CiM-ClL (CH0) CH=CH(CH0).- j L IU Z η		0
7	CiS-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-		65	2
8	trans-CH,(CH0),CH=CH(CH0),		4.	61
9	CiS-CH3(CH2)5CH=CH(CH2) -		0.
10	trans,trans-CH„(CH0),CH=CHCH	0CH=CH(CHO)_-
U	j Lh ei s ,eis, ei S-CH (CIL)CH=CHCH0	/ Ll CH=CHCH2CH=CH-	0
	(CH2)7-		54
12	CH3(CH2)17-		0
13	CH3(CH2)18-		N.
14	CiS-ClL(CH0)-CH=CH(CH0)-- J ί ι L y		0
,15	CH (CH ) -		0
16	CiS-CH-(CH0)_CH-CH(CH-) - - J Ll L 11

. * 4 Stunden nach Verabreichung des Wirkstoffes in einer Dosis von 416 mg/kg mittels einer Magensonde in Form einer Suspension des jeweiligen Wirkstoffes in 33 % PEG 400-H O.

Zur Bestimmung wird Aspergillus montevidensis A-35137 verwendet. N.U- = nicht untersucht.

Claims (12)

1. Erfindungsansprüche

   worin R für H oder OH steht, wobei, falls R für H steht,

   2 3 4

   dann R für H steht und R sowie R jeweils H oder

   jeweils OH sind,

   1 2

   wobei, falls R für OH steht, dann R für H steht, R für OH oder C₁-C- Alkyloxy steht und R für OH steht oder R für -CO-NH₂ steht und R sowie R jeweils OH sind,

   R für Cg-C . Alkyl oder Cg-C₃₄ Alkenyl steht, mit den Maßgaben, daß, falls R ,R und R jeweils

   2 5

   OH sind,_R für H steht und R Alkyl bedeutet, dann R nicht n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n-Pentadecyl oder n-Heptadecyl sein kann oder, falls R Alkenyl ist, dann R⁵ nicht cis,cis-CH₃(CH₂)^CH=CHCH₂Ch=CH(CH₂)-- sein kann,

   - ⁹⁶ - 22 6 03 3

   dadurch gekennzeichnet, daß man einen' cyclischen Peptidkern der allgemeinen Formel II

   CH3 ^H0

   II

   worin R für H oder OH steht, wobei, falls R für H steht,

   2 3 4

   dann R für H steht und R sowie R jeweils H oder jeweils OH sind,

   oder .

   1 2

   wobei, falls R für OH steht, dann R für H steht,

   R³ für OH oder C₁-C. Alkyloxy steht und R für OH

   2 3 4

   steht oder R für -CO-NH₂ steht und R sowie R jeweils

   OH sind, .

   mit einer Alkansäure oder Alkensäure acyliert.

   -97- 226033
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ für Cg-C₃₄ Alkyl steht.
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß R Alkyl der Formel CH-. (CH_) ist, worin η für 5 bis

   J dt Ii

   23 steht, mit den Maßgaben, daß η nicht 16 sein kann, oder daß, falls R¹, R³ und R⁴ jeweils OH bedeuten und R² für H steht, dann η nicht 12, 13 oder 14 sein kann.
4. 4. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ für CH₃(CH₂J₁₀-, CH₃ (CH₂) ₁ ^, CH₃ (CH₂) ^-,

   ₃₂J₁₃-, CH₃(CH₂J₁₄-, CH₃(CH₂J₁₅-,CH₃₂₁₇ CH₃(CH₂J₁₈-, CH₃(CH₂J₁₉- oder CH₃(CH₂J₂₀ steht.
5. 5. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß R Alkyl der Formel

   CH₃(CH₂J_nCH(CH₂)_m-

   ist, worin η und m jeweils unabhängig voneinander 0 bis sind, mit der Maßgabe, daß η + m nicht kleiner als 3 und nicht größer als 21 sein darf.
6. 6. Verfahren nach Punkt \, dadurch gekennzeichnet, daß R für ^C6~^C24 Alkenyl steht, das eine eis- oder transDoppelbindung enthält.
7. 7. Verfahren nach Punkt. 6, dadurch gekennzeichnet, daß R für eis- oder trans-Alkehyl der Formel

   CH (CH ) CH=CH(CH₉) - . 6 JL η ζ m

   steht, worin η und m unabhängig voneinander 0 bis 21 bedeuten, mit der Maßgabe, daß η +.m nicht kleiner als 3 und nicht größer als 21 sein darf.

   - ⁹⁸ - 22 6 03 3
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ für cis-CEL (CH₀)_CCH=CH(CH_n)_-, trans-CH_o(CH_n)_CCH=

   OZd Zl J Z d

   J₇-, CiS-CH₃(CH₂) CH=CH(CH₂)₄-,CiS-CH₃(CH₂)₇CH=CH- -, trans-CH₃ (CH₂) ₇CH=CH (CH₂) ₇-_f CiS-CH₃(CH₂)₅CH=CH-

   ₂)-, CiS-CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₉~,oder CiS-CH₃(CH₂J₇CH=CH(CH₂) - steht.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1/ dadurch gekennzeichnet, daß R für C^-C_n. Alkenyl steht, das zwei eis- oder transDoppelbindungen enthält.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß R für trans,trans-CH₃(CH₂).CH=CHCH₂CH=CH(CH₂J₇- steht,
11. 11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für C_fi-Cp. Alkenyl steht, das drei eis- oder trans-Doppelbindüngen enthält.
12. 12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ für eis, eis, cis-CH CH₂CH=CHCH₂Ch=CHCH -CH=CH(CH₂) steht.