DD155177A5 - Verfahren zur herstellung von derivaten cyclischer peptidkerne - Google Patents

Abstract

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate von cyclischen Peptidkernen zu schaffen, die sich durch eine besondere Wirksamkeit, vor allem eine besondere antifungale Wirksamkeit, auszeichnen. Diese Aufgabe wird im Prinzip dadurch geloest, dass man geeignete cyclische Peptidkerne einfach acyliert und hierdurch in die gewuenschten Derivate cyclischer Peptidkerne ueberfuehrt. Die neuen Verbindungen hemmen das Wachstum pathogener Pilze und eignen sich daher zur Bekaempfung des Wachstums von Pilzen auf entsprechenden Flaechen (als Antiseptikum) oder zur Behandlung von durch Pilze hervorgerufenen Infektionen.

Description

Aktenzeichen: · X-5564A

Anmelder:

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V. St. A.

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung von Derivaten cyclischer

Peptidkerne

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer semisynthetischer antifungal wirksamer Verbindungen, die man durch Acylierung cyclischer Peptidkerne erhält, welche durch enzymatische, Deacylierung eines entsprechenden cyclischen Peptidantibiotikums hergestellt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Das oben erwähnte cyclische Peptidantibiotikum ist eine antifungal wirksame Verbindung der allgemeinen Formel I

V Ή I H—»^-

Ha_v " "^Λ" ^H /J-H H NL^ /CH₃

* a 0=· / · \

R OH Il · ί I -u

0 H ""

12 3 4

worin R, R , R , R und R die später angegebenen Bedeutungen

haben.

Werden im folgenden Formeln für cyclische Peptide, wie die obige Formel I, angegeben, dann ist dabei vorausgesetzt, daß die Aminosäuren in L-Konfiguration vorliegen.

Die Faktoren A, B, D und H des Antibiotikums A-30912 sind cyclische Peptidantibiotika der obigen allgemeinen Formel I, worin R für Linoleyl /eis,eis CH₃ (CH₂') ₄-CH=CHCH₂CH=CH-(CEL·) _?- CO₁₁/ steht.

1-3 A-30912 Faktor A hat die Struktur der Formel I, worin R , R

4 2

und R insgesamt OH bedeuten und R für H steht.

22 6 03 2

A-30912 Faktor B hat die Struktur der Formel I, worin R und

2 3 4

R jeweils H sind und R sowie R jeweils OH bedeuten.

12

A-30912 Faktor D hat die Struktur der Formel I, worin R , R ,

3 4

R und R insgesamt H sind.'

A-30912 Faktor H hat die Struktur der Formel I, worin R und R⁴ beide OH sind, R² für H steht und R³ für CH₃O steht.

Das Antibiotikum S 31794/F-1 ist ein antifungal wirksames cyclisches Peptid der Formel I, worin R Myristoyl bedeutet, R¹, R³ und R⁴ für OH stehen und R² für -CO-NH₂ steht.

Jeder Faktor ist aus dem A-30912-Komplex isoliert, der die anderen Faktoren enthält, welche willkürlich als Faktoren B, C, D, E, F und G bezeichnet werden. Der A-30912-Komplex und die einzelnen Faktoren A bis G gehen aus ÜS-PS 4 024 24 5 hervor. Das Antibiotikum A-30912 Faktor A ist identisch mit dem Antobiotikum A-22802, das in US-PS 4 024 246 beschrieben ist. Der Faktor A ist ferner auch identisch mit dem Antibiotikum Echinocandin B (siehe HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974) und CH-PS 568 386) und dem Antibiotikum SL 7810/F (siehe Tetrahedron Letters 4147 (1976) und BE-PS 834 289)„

Das Antibiotikum A-30912 Faktor A wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans NRRL 8112, (c) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (d) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 oder (e) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Auch der Faktor B hat sich als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum Echinocandin C /siehe HeIv. Chim. Acta 62 , 1252 (1979|/ und dem Antibiotikum SL 7810/F-II /siehe BE-PS 834 289>/· Das Antibiotikum A-30912 Faktor B wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter ₍Verwendung eines von meh-

-4-226032

reren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus nidulans var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039'. oder (d) Aspergillus nidulans var- roseus NRRL 11440.

Weiter hat sich auch der Faktor D als identisch erwiesen mit dem Antibiotikum Echinocandin D /siehe HeIv. Chim.. Acta 62, 1252 (1979]_/ und dem Antibiotikum SL 7810/F-III (siehe BE-PS 834 289). Das Antibiotikum A-30912 Faktor D wird hergestellt durch submerse aerobe Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113, (b) Aspergillus niduians var. echinulatus A-32204, NRRL 3860, (c) Aspergillus rugulosus NRRL 8039 {siehe BE-PS 834 289) oder (d) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440.

Der Faktor H ist ein später aufgefundener antibiotisch wirksamer Faktor von A-30912 und geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Karl H. Michel mit dem Titel "ANTIBIOTIC A-30912 FACTOR H", Serial No. 117 739 vom 1c Februar 1980 hervor, bei der es sich um eine continuation-in-part-Anmeldung mit der Serial No. 46,875 vom ·8. Juni 1979 (zwischenzeitlich fallengelassen) handelt, und die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit in die vorliegende Anmeldung eingeführt. .

Das Antibiotikum A-30912 Faktor H wird hergestellt durch Fermentation unter Verwendung eines von mehreren verschiedenen Mikroorganismen, nämlich (a) Aspergillus rugulosus NRRL 8113 oder (b) Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440. Eine Subkultur von A. nidulans var. roseus ist in der Kulturen-Sammlung des Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of'Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 11440

- 5 - 2 2 6 0 3 2

für die Öffentlichkeit zugänglich ist. Verwendet man einen Stamm von A. nidulans var. roseus NRRL 11440 zur Erzeugung irgendeines der Faktoren von A-30912, dann erhält man einen Komplex an Faktoren, der vorliegend einfach als A-42355 Antibiotikum-Komplex bezeichnet wird. Das Antibiotikum A-30912 Faktor A ist der überwiegende Faktor des A-4 2355 Antibiotikum-Komplexes, während die Faktoren B, D und H die in geringerer Menge vorhandenen Faktoren sind. Die später folgenden Herstellungsbeispiele 2 bis 7 erläutern die Herstellung des A-42355 Komplexes und die Isolierung . und Reinigung der einzelnen A-30912 Faktoren aus diesem Komplex.

Im Antibiotikummolekül der allgemeinen Formel I ist die Linoleylseitenkette (R) an der cc-Aminogruppe des Ornithinrests gebunden. Überraschenderweise wurde dabei gefunden, daß sich die Linoleylseitenkette vom Kern enzymatisch abspalten läßt, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird. Das für diese Deacylierungsreaktion verwendete Enzym wird durch einen Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae, vorzugsweise durch den Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder eine Variante hiervon, gebildet. Zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung gibt man den jeweiligen Faktor des Antibiotikums A-30912 zu einer Kultur des Mikroorganismus und bebrütet die Kultur mit dem Substrat solange, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierbei erhaltene cyclische Kern wird in bekannter Weise von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Im Gegensatz zu den Faktoren A, B, D und H des Antibiotikums A-30912 ist der cyclische Kern, der keine Linoleylseitenkette mehr enthält, praktisch nicht antifungal wirksam.

In DE-OS 26 28 96 5 und US-PS 4 173 6 29 wird das Antibiotikum S31794/F-1 beschrieben, welches durch Acrophialophora

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limonispora nov. spec. Dreyfuss et Müller NRRL 8095 gebildet wird. Dieses Antibiotikum S31794/F-1 weist folgende charakteristische Eigenschaften auf: Schmelzpunkt 178. bis 180⁰C (Zersetzung) (amorph) oder 181 bis 183°C (Zersetzung) (kristallin) , /oC/r; =-24° (c = 0,5, CH-OH) oder +37° (c=0,5, Pyridin)

— — D j

(kristallin), UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 194 nm

(E?^% = 807), 225 nm (Schulter) E?^% = 132), 276 nm 1cm 1cm

(e}^% = 12,8), 284 nm (Schulter) e]^% = 10,5); ¹³C~NMR-Spektrum

in Deuteromethanol (190 mg in 1,5 ml Deuterornethanol, Tetramethylsilan als interner Standard) mit folgenden Eigenschaften (kristallin):

ppm	ppm	ppm
176,2	75,5	51,2
175,0	74,0	39,7
173,7	71 ,0	38,8
172,6	70,5	36,6
172,0	69,7	34,8
171,8	68,0	32,8
171,7	62,2	30,6
168,6	58,3	26,7
157,7	57,0	23,5
132,5	56,2	• 19,7
129,0	55,4	14,3
115,9	52,9	11,1
76,6

und (nach Trocknung des kristallinen Materials über eine Zeitdauer von 2 Stunden in einem Hochvakuum bei 100⁰C etwa folgende Elementaranalyse: 55,5-56,5 % Kohlenstoff, 7,5-7,7 % Wasserstoff, 10,5-10,8 % Stickstoff und 25,5-26,0 % Sauerstoff, ist löslich in Methanol, Ethanol, Pyridin, Dimethylsulfoxid,

22 6 03 2

schwachlöslich in Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Diethylether, Benzol und Hexan, und ist antifungal wirksam, und zwar insbesondere gegenüber Candida albicans.

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird hergestellt durch submerse aerobe Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095, wie dies aus den später folgenden Herstellungsbeispielen 8 und 9 hervorgeht. Auch dieser Mikroorganismus ist in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Culture Collection, North Central Region, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt worden und bildet einen Teil der Sammlung, von der er unter der Nummer NRRL 8095 für die Öffentlichkeit zugänglich ist.

Das Antibiotikum S31794/F-1 ist antifungal wirksam= und. warinsbesondere gegenüber Stämmen von Candida, "wie Candida albicans. Herstellung und Isolierung dieses Antibiotikums können durch Bioautographie unter Verwendung einer Spezies von Candida, wie Candida albicans, überwacht werden.

Im Molekül des Antibiotikums S31794/F-1 der Formel I, worin R , R und R insgesamt OH sind und R für -CO-NH₀ steht, ist die Myristoylseitenkette (R) an die cc-Aminogruppe des Dihydroxyornithinrestes des cyclischen Peptidkerns gebunden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß diese Myristoylseitenkette vom Kern enzymatisch abgespalten werden kann, ohne daß hierdurch der chemische Aufbau des Kerns beeinträchtigt wird. Das zur Bewerkstelligung dieser Deacylierung verwendete Enzym wird von einem Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceäe, vorzugsweise dem Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052 oder einer Varianten hiervon, gebildet. Zur Durchführung dieser Deacylierung gibt man das Antibiotikum S31794/F-1 zu einer Kultur des Mikroorganis-

- s - 22 6 03 2

mus und läßt die Kultur solange auf das Substrat einwirken, bis die Deacylierung praktisch beendet ist. Der hierdurch erhaltene cyclische Kern wird von der Fermentationsbrühe in bekannter Weise abgetrennt. Im Gegensatz zu dem Antibiotikum S31794/F-1 weist der cyclische Kern, der keine Myristoylseitenkette mehr enthält, praktisch keine antifungale Wirksamkeit auf.

Die durch die oben beschriebenen enzymatischen Deacylierungen der Antibiotika der allgemeinen Formel I erhaltenen cyclischen Peptidkerne entsprechen folgender allgemeiner Formel II

II

2 2 6 0 3 2

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin

13-4 2

R , R und R insgesamt OH .bedeuten und R für H steht,

stellt den Kern von A-30912 Faktor A dar und wird der Einfachheit halber im folgenden als A-30912A Kern bezeichnet. Der A-30912A Kern hat eine empirische Formel von ^C34^Hc-j^N7°-i 5 und ein Molekulargewicht von 797,83.

Die Verbindung aus der allgemeinen Formel II, worin R und

2 3 4

R jeweils H bedeuten und R sowie R beide OH sind, ist der Kern von A-3 0912 Faktor B und wird im folgenden als A-3Q912B Kern bezeichnet. Der A-3 09.12B Kern hat die empirische Formel C^₄H₅₁N₇O₁₄ und weist ein Molekulargewicht von 781,81 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin

12 3 4

R , R , R . und R jeweils H sind, ist der Kern von A-30912 Faktor D und wird der Einfachheit halber im folgenden als A-30912D Kern bezeichnet. Der A-30912D Kern hat eine empirische Formel von C^₄Hc₁N₇O und weist eii» Molekulargewicht von 749,83 auf.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R¹ und R⁴ jeweils OH sind, R für H steht und R³ für CH₃O-steht, ist der Kern von A-30912 Faktor H und wird im folgenden einfach als A-30912H Kern bezeichnet.

Die Verbindung aus der obigen allgemeinen Formel II, worin R , R³ und R jeweils OH sind und R für -CO-NH₉ steht, ist der Kern des Antibiotikums S3179 4/F—1 und wird einfach als S31794/F-1 Kern bezeichnet. Der S31794/F-1 Kern hat eine empirische Formel von C,rHr_?Nn0₁₍. und weist ein Molekulargewicht von 84 0,8-7 auf.

Durch" Abspaltung der Seitenkettengruppe erhält man eine freie primäre oC-Aminogruppe im Ornithinrest des cyclischen Peptids,

- ίο - 22 6 03 2

Die dabei erhaltenen Kerne können dabei selbstverständlich entweder die Form eines freien Amins oder eines Säureadditionssalzes haben. Es kann sich dabei um irgendwelche geeigneten Säureadditionssalze handeln, wobei die Säureadditionssalze nicht toxischer und pharmazeutisch unbedenklicher Säuren jedoch bevorzugt sind.

Das Verfahren zur Herstellung des jeweiligen Kerns aus dem entsprechenden Antibiotikum durch Fermentation unter Verwendung von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 geht aus der amerikanischen Patentanmeldung von Bernard J. Abbott und David S. Fukuda mit dem Titel "A PRXESS FOR THE PREPARATION OF CYCTJC PEPTIDE NUCLEI" und mit dem internen Aktenzeichen X-5399A hervor, und die Offenbarung dieser Anmeldung wird hierdurch vor] iegend eingeführt.

Kulturen typischer Spezies von Actinoplanaceae sind in der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory hinterlegt worden und bilden einen Teil der dortigen Sammlung, von der sie unter den im folgenden angegebenen Nummern für die Öffentlichkeit zugänglich sind. _t

Actinoplanes utahensis . NRRL 12052

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp. NRRL 1206 5 Streptosporangiurn roseum

var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit irgendeines bestimmten Stammes eines Mikroorganismus aus der Familie der Actinoplanaceae zur Durchführung der erfindungsgemäßen Deacylierung wird durch folgendes Verfahren ermittelt. Ein geeignetes Wachstumsmedium wird mit dem -Mikroorganismus beimpft. Die Kultur wird dann zwei oder drei Tage bei etwa 28°C auf einem Rotations-

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schüttler bebrütet. Sodann versetzt man die Kultur mit einem der Substratantibiotika. Der pH-Wert des Fermentationsmediuras wird auf etwa pH 6,5 gehalten. Die Kultur wird bezüglich ihrer Aktivität unter Verwendung von Candida albicans durch Bioautographie überwacht. Eine Abnahme der antibiotischen'Wirksamkeit ist ein Zeichen dafür, daß der Mikroorganismus das zur Deacylierung geeignete jeweilige Enzym bildet. Diese Tatsache muß jedoch sichtbar gemacht werden, wozu man sich folgender Methoden bedienen kann: (1) Analyse durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bezüglich der Gegenwart des intakten Kerns oder (2) Reacylierung mit einer entsprechenden Seitenkette, beispielsweise Linoleyl, Stearoyl, Palmitoyl oder Myristoyl, zur Wiederherstellung der ursprünglichen Wirksamkeit.

Es ist bekannt, daß andere antibiotisch wirksame Substanzen den gleichen Kern enthalten wie das Antibiotikum A-30912 Faktor A.Diese Antibiotika unterscheiden sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor A darin, daß sie anstelle der Linoley!gruppe (R) in der allgemeinen Formel I andere Acylgruppen enthalten. Beispiele für solche Antibiotika sind (a) Tetrahydro-A-30912 Faktor A (Tetrahydro-SL 7810/F, Tetrahydroechinocandin B gemäß BE-PS 834 289 und HeIv. Chim. Acta 57, 2459 (1974)), das der allgemeinen Formel I entspricht, falls R Stearoyl ist, oder (b) Aculaecin A, das ein Bestandteil des Aculaecin-Komplexes ist (hergestellt durch Fermentation mittels Aspergillus aculeatus NRRL 8075) gemäß üS-PS 3 978 210« Wie aus der BE-PS 859 067 hervorgeht, enthält das Aculaecin A eine Palmitoylseitenkette anstelle von Linoleyl. Tetrahydro-A-3091 2 Faktor A läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor A herstellen durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck. Sowohl Tetrahydro-A-3 0912 Faktor A als auch Aculaecin A können als Substrate für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.

-η- 22 6 03 2

Es ist weiter bekannt, daß auch eine andere antibiotische Substanz den gleichen Kern wie das Antibiotikum A-30912 Faktor B.enthält. Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor B lediglich darin, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und bei ihr handelt es sich um Tetrahydro-A-30912 Faktor B (Tetrahydro-SL 7810/F-II,' Tetrahydroechinocandin C) gemäß HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979). Tetrahydro-A-30912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I, falls R für Stearoyl steht« Tetrahydro-A-3 0912 Faktor B läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor B durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-30912 Faktor B kann als Träger anstelle des Antibiotikums A-30912 Faktor B für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden,

Ferner ist bekannt, daß auch eine weitere antibiotische Substanz den gleichen Kern enthält wie das Antibiotikum A-30912 Faktor D. Diese Substanz unterscheidet sich vom Antibiotikum A-30912 Faktor D dadurch, daß sie anstelle der Linoleylgruppe (R) in der allgemeinen Formel I eine andere Acylgruppe enthält, und hierbei handelt es sich um Tetrahydro-A-30912 Faktor D (Tetrahydro-SL 7810/F-III, Tetrahydroechinocandin D) gemäß HeIv. Chim. Acta 62, 1252 (1979). Tetrahydro-A-3 0912 Faktor B entspricht der allgemeinen Formel I, falls R für Stearoyl steht. Tetrahydro-A-3 0912 Faktor D läßt sich aus dem Antibiotikum A-30912 Faktor D durch .katalytische Hydrierung unter Verwendung von Platindioxid in Ethanol unter positivem Druck herstellen. Tetrahydro-A-3 0912 kann als Substrat anstelle des Antibiotikums A-3 0912 Faktor D für die enzymatische Deacylierung nach dem vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden. .

22 6 03 2

Beim Antibiotikum A-30912 Faktor H ist die im Dihydroxyornithinrest des Peptidkerns vorhandene 5-Hydroxylgruppe methyliert, während beim Antibiotikum A-30912 Faktor A diese 5-Hydroxylgruppe unsubstituiert ist. Der Faktor H läßt sich demnach synthetisieren, indem man den Faktor A in für die Herstellung eines aliphatischen Ethers aus einem Alkohol üblicherweise methyliert. Der Faktor A kann selbstverständlich auch mit anderen niederen Alkylgruppen alkyliert werden, wodurch man zu Alkyloxyhomologen des Moleküls des Faktors H gelangt. Die Alkyloxyhomologen des Faktors H, die sich synthetisch aus dem Faktor A herstellen lassen, sind als Homologe des Antibiotikums A-30912 Faktor H bekannt. Die Verbindung aus der obigen all-

14 2

gemeinen Formel II, worin R und R jeweils OH sind, R für H steht und R für C„-C_fi Alkyloxy steht, werden vorliegend als A-30912H Kerne bezeichnet.

Die Linoleylseitenkette von A-30912 Faktor H oder von Homologen von A-3 0912 Faktor H können selbstverständlich in üblicher Weise hydriert werden, wodurch man zu Tetrahydro-A-30912 Faktor H oder dem entsprechenden Tetrahydroderivat der Alkyloxyhomologen (R=Stearoyl) gelangt. Wahlweise kann man "die Tetrahydroderivate auch herstellen, indem man zuerst das Antibiotikum A-30912 Faktor A zu Tetrahydro-A-30912 Faktor A hydriert und daraus dann das jeweils gewünschte Alkyloxyderivat bildet.

Die Antibiotika A-30912 Faktor H, Tetrahydro-A-30912 Faktor H, C₂-C- Alkyloxyhomologe des Faktors H oder Tetrahydroderivate von C„-Cg Alkyloxyhomologendes Faktors H lassen sich selbstverständlich ebenfalls als Substrate für die enzymatische Deacylierung unter Anwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren einsetzen.

- ₁₄ - 22 6 03 2

Aufgabe der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,'ein Verfahren zur .Herstellung neuer Derivate von cyclischen Peptxdkernen zu schaffen, die sich durch eine besondere Wirksamkeit, vor allem eine besondere antifungale Wirksamkeit, auszeichnen»

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird erfindungsgemäß nun dadurch gelöst, daß man cyclische Peptidkerne der oben erwähnten allgemeinen Formel II einfach acyliert und hierdurch in Derivate cyclischer Peptidkerne der folgenden allgemeinen Formel III überführt .

III

226032

worin R für H oder OH steht,

2 3 4

wobei R für H steht und R sowie R jeweils H oder

jeweils OH sind, falls R für H steht, oder

wobei R² für H steht, R³ für OH oder C_n-C, Alkoxy

4 2

steht und R für OH steht, oder wobei R für -CO-NH₀

3 4 steht und R sowie R jeweils für OH stehen, falls R¹ für OH steht,

bedeutet

R einen Rest der folgenden allgemeinen Formeln

J-,

(a) -C-OO_n-(V)_n

(b) -0-(W)_n-(A¹J_n-I- Jj-(A) _fR° _odter

β.

Ϊ _/^X

(c) -C—(w) 1—

^m V".

22 6 03 2

steht, wobei A ein zweiwertiger Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel, SuIfinyl oder Sulfonyl ist, A einen zweiwertigen Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel, SuIfinyl, Sulfonyl oder -NH- bedeutet, χ Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C₃ Alkyl, Hydroxy, C₁-C₃ Alkoxy, Mercapto, C₁-C₃ Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C- Alkylcarbamyl darstellt, X Chlor, Brom oder Iod ist, R Wasserstoff, C₁-C₁₈ Alkyl oder C₂-G₁₈ Alkenyl bedeutet, W für C₁-C₁₀ Alkylen oder C₃-C₁₀ Alkenylen steht und die Indices m, η und ρ für 0 oder 1 stehen, wobei η jedoch 0 bedeuten muß, falls m für 0 steht, mit den Maßgaben, daß die Summe der Kohlenstoff atome in den Gruppen R und W größer als 4 sein muß und nicht mehr als 21 betragen darf, daß A und A nicht SuIfinyl'oder Sulfonyl sein können, falls X Mercapto bedeutet, und daß, falls die Substituenten A und A SuIfinyl oder Sulfonyl bedeuten, diese jeweils im gleichen Oxidationszustand vorliegen müssen.

Eine bevorzugte Untergruppe von Derivaten cyclischer Peptidkerne der allgemeinen Formel III sind diejenigen Verbindungen, bei denen der Rest R den oben angegeben Rest (a) bedeutet, worin m und η für 0 stehen, ρ für 1 steht und R⁶ C₅-C₁₈ Alkyl oder C-Cg Alkenyl bedeutet.

Im substituierten Ring des Restes R können die

"1 6

-C-W-A -Funktion und die -AR -Funktion am Benzolring selbstverständlich in ortho-, meta-, oder para-Stellung zueinander angeordnet sein. Die para-Orientierung wird hierbei bevorzugt. Der.Substituent X kann sich an jeder verfügbaren Stellung des Benzolrings befinden, die nicht durch die erwähnten beiden Funktionen besetzt ist.

22 6 03 2

Unter Alkyl oder Alkenyl werden sowohl gerade als auch verzweigte Kohlenwasserstoffketten verstanden. Unter Alkenyl ist ein ungesättigter Kohlenwasserstoffrest zu verstehen, der eine, zwei oder drei Doppelbindungen enthält, die eis- oder transKonfiguration haben können.

Beispiele für als Substituent R erfindungsgemäß bevorzugte Cc-C.Q Alkylreste sind folgende:

(a) -(CH₀) ,CH,, worin n¹ für 4 bis 17 steht, und

A Ti ό

CH,

(b) -(CH₀) CH(CH₉) CH,, worin r und s unabhängig voneinander

0 bis 15 bedeuten, mit der Maßgabe, daß r + s nicht größer als 15 und nicht kleiner als 2 sein kann.

Beispiele für .als Substituent R erfindungsgemäß bevorzugte C^^-C₁n-Alkenylreste sind folgende:

(a) - (CH₀) ,-CH=CH- (CH₀) ,,-CH,, worin t für 1 bis 15 steht und n¹' für 0 bis 15 steht, mit der Maßgabe, daß t + n¹' nicht größer als 15 und nicht kleiner als 2 sein kann, und

(b) -(CH₀) -CH=CH-(CH₀) -CH=CH-(CH₀) -CH,, worin ν und ζ unab-•hängig voneinander 0 bis 12 bedeuten und y für 0 bis 13 steht, mit der Maßgabe, daß ν + y + ζ nicht größer als 13 sein darf.

Beispiele für als Gruppen W erfindungsgemäß bevorzugte C-C₁₀ Alkylenreste sind folgende

(a)" -(CH₀) ,,,-, worin n¹¹¹ für 1 bis 10 steht,

(b) Methylen oder Ethylen und ·

CH

ι J - ·

(c) -(CH₀) ,-CH(CH₉) ,,-, worin r' und s¹ unabhängig voneinander 0 bis 8 bedeuten, mit der Maßgabe, daß r¹ + s' nicht größer als 8 und nicht kleiner als 1 sein können.

J'

22 6 03 2

Beispiele für als Gruppen W erfindungsgemäß bevorzugte C₀-C_1n Alkenylreste sind folgende

(a)-(CH₀). ,-CH=CH-(CH₀) ,-, worin t' und v¹ unabhängig voneinander 0 bis 8 sind, mit der Maßgabe, daß t¹ + v¹ nicht größer als 8 sein darf, und

(b) - (CH ) ,-CH=CH-(CH₀) ,-CH=CH-(CH₀) ,-, worin x¹ und z¹ unabhängig voneinander 0 bis 5 sind und y¹ für 1 bis 5 steht, mit der Maßgabe, daß x¹ + y¹ + z¹ nicht größer als 10 sein darf.

Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines cyclischen Peptidkerns der allgemeinen Formel III

0=9 Ή ΌΗ

- 19 - 22 6 03

worin R für H oder OH steht,

2 3 4

wobei R für H steht und R sowie R jeweils H oder

jeweils OH sind, falls R für H steht,

2 3

wobei R für H steht, R für OH oder C₁-C, Alkoxy

4 2

steht und R für OH steht, oder wobei R für -CO-NH₀

3 4 steht und R sowie R jeweils für OH stehen, falls

R¹ für OH steht,

R einen Rest der folgenden allgemeinen Formeln bedeutet

_{IV (a)} ^.(w)^)^ J— (A)_pR^s IV (b) -ö-(W)_m-(A¹)_n-4- +-(Α) _pR

iv (Ο -IU(W)

_1n

wobei A ein zweiwertiger Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel, SuIfinyl oder Sulfonyl ist, Ä einen zweiwertigen Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel, SuIfinyl, Sulfonyl oder -NH-bedeutet, χ Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C- Alkyl", Hydroxy, C₁-C₃ Alkoxy, Mercapto, C₁-C- Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C- Alkylcarbamyl darstellt, X Chlor, Brom oder Iod ist, R

2 2 6 0 3 2

Wasserstoff, C₁-C₁₈ Alkyl oder C„-C..g Alkenyl bedeutet, W für C₁-C₁₀ Alkylen oder C--C. _n Alkenylen steht und die Indices m, η und ρ für 0 oder 1 stehen, wobei η jedoch 0 bedeuten muß, falls m für 0 steht, mit den Maßgaben, daß die Summe der Kohlenstoffatome in den Gruppen R und W größer als 4 sein muß und nicht mehr

als 21 betragen darf, daß A und A nicht Sulfinyl oder Sulfonyl sein können, falls X Mercapto bedeutet, und daß, falls die Substituenten A und A Sulfinyl oder Sulfonyl bedeuten, diese jeweils im gleichen Oxidationszustand vorliegen müssen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel IEI hemmen das Wachstum pathogener Pilze, wie sich anhand üblicher biologischer Testverfahren zeigen läßt. Diese Verbindungen eignen sich daher zur Bekämpfung des Wachstums von Pilzen auf entsprechenden Flächen (als Antiseptikum) oder zur Behandlung von durch Pilze hervorgerufenen Infektionen. Die antifungale Wirksamkeit dieser Verbindungen ist gegenüber Candida albicans in vitro durch die sogenannte Agar-Scheibendiffusionsmethode oder die sogenannte Agar-Röhrchenverdünnungsmethode bestimmt .worden oder in vivo durch Untersuchungen von mit Candida albicans infizierten Mäusen ermittelt worden. Die vorliegenden Verbindungen eignen sich daher insbesondere zur Behandlung von Infektionen, die durch Stämme von Candida albicans (candidosis) verursacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel III haben sich im Agar-Scheibendiffusionsversuch ferner auch als wirksam erwiesen gegenüber Trichophyton mentagrophytes, nämlich einem dermatophytischen Organismus. Ferner haben sich diese Verbindungen in vitro bei Agar-Scheibendiffusionsversuchen als wirksam erwiesen gegenüber Saccharomyces pastorianus und Neurospora crassa. Bestimmte der vorliegenden Verbindungen (Beispiel 6, Tabelle IX) ergeben bei. oraler Verabreichung an Mäuse stark erhöhte Blutspiegel.

13

Verabreicht man die Verbindung der Formel III, worin R , R und

4 2 5

R jeweils OH bedeuten, R für H steht und R für p-(n-Octyloxy)-benzoyl steht, in einer Tagesdosis von 100 mg/kg über eine Zeit-

- 21 - 22 6 03 2

dauer von 5 Tagen intravenös an Hunde, dann lassen sich keinerleit Anzeichen einer Toxizität feststellen, obwohl die SGPT-Spiegel'erhöht sind.

Die Derivate von cyclischen Peptidkernen der oben erwähnten allgemeinen Formel III werden hergestellt, indem man einen entsprechenden Kern an der alpha-Aminogruppe von Ornithin mit der jeweiligen Seitenkette in zur Bildung einer Amidbindung üblicherweise acyliert. Diese Acylierung läßt sich im allgemeinen erreichen, indem man den Kern mit einem aktivierten Derivat einer substituierten Verbindung der allgemeinen Formel IV (a), (b) öder (c), die der gewünschten Acylseitenkettengruppe R entspricht, umsetzt, nämlich mit folgenden Verbindungen IV (a), (b) oder (c):

IV (a) HO-O-(W)-(A¹) -4- -W-(A)₀R⁶

IV (b). H0-tt-(W)_m-(A¹)_n~4~ 4-(A)_pR⁶

\X oder

IV (C) HO-C-(W)_n, U 4— (A)_nR⁶

V .

worin A, A , W, m, η, ρ und R die bereits oben angegebenen Bedeutungen haben.

-22- 22 6 03 2

Unter einem aktivierten Derivat wird ein Derivat verstanden, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels gegenüber einer Kupplung mit der primären Aminogruppe reaktionsfähig macht/ so daß die Amidbindung entsteht, die die Seitenkette mit dem Kern verbindet. Beispiele für geeignete aktivierte Derivate dieser Art, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden für ihren Einsatz als Acylierungsmittel für primäre Amine sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte hierzu geeignete aktivierte Derivate sind: (a) Säurehalogenide, wie Säurechloride, (b) Säureanhydride, wie Alkoxyameisensäureanhydrid oder Aryloxyameisensäureanhydrid, oder (c) aktivierte Ester, wie 2,4,5-Trichlorphenylester, N-Hydroxybenztriazolester oder N-Hydroxysuccinimidester. Zu anderen Methoden für eine Aktivierung der Carboxylfunktion gehören eine Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyldiimid, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid, wodurch man zu einem reaktionsfähigen Zwischenprodukt gelangt, das infolge Instabilität nicht isoliert wird. Die Umsetzung mit dem primären Amin wird hierbei im Reaktionsgemisch durchgeführt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden vorzugsweise nach der Methode unter Verwendung eines aktiven Esters hergestellt. Als Acylierungsmittel am meisten bevorzugt wird hierzu der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten Seitenkette (Formel IV). Zu diesem Zweck setzt man einen Überschuß des aktiven Esters mit dem Kern bei Raumtemperatur in einem nicht reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel um, wie Dimethylformamid (DMF). Die Umsetzungszeit ist nicht kritisch, wobei jedoch Umsetzungszeiten von etwa 24 bis 120 Stunden bevorzugt sind. Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand chromatographisch gereinigt, beispielsweise unter Verwendung von Silicagel

22 6 03 2

und eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/ Volumen) als Eluiermittelsystem oder durch Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mittels SilicagelC. _g-Umkehrphasenharz als stationäre Phase und Verwendung eines Gemisches aus Wasser, Methanol und Acetonitril als Lösungsmittel sy stern.

Die 2,4,5-Trichlorphenylester lassen sich herstellen, indem man einfach die Seitenkettensäure (Formel IV) mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, behandelt. Andere zur Herstellung der aktiven Ester geeignete Methoden sind dem Fachmann geläufig.

Die substituierten Säuren der allgemeinen Formel IV und die aktivierten Derivate hiervon sind entweder bekannt oder in bekannter Weise herstellbar. Die Benzoesäuren, Phenylalkylcarbonsäuren, Phenylalkeny!carbonsäuren, Phenoxyalky!carbonsäuren, Phenoxyalkeny!carbonsäuren, Phenylthioalkylcarbonsäuren, Phenylthioalkenylcarbonsäuren, Phenylsulfinylalkylcarbonsäuren, Phenylsulfinylalkenylcarbonsäuren, Phenylsulf onylalkylcarbonsäuren, Phenylsulfonylalkenylcarbonsäuren, Pyridiny!carbonsäuren, Pyridinylalkylcarbonsäuren oder Pyridinylalkeny!carbonsäuren der allgemeinen Formel IV lassen sich nach ähnlichen Verfahren herstellen. Die Herstellung dieser Verbindungen wird anhand der Herstellung der Benzoesäureuntergruppe im folgenden erläutert.

Zur Herstellung der Alkoxybenzoesäuren oder Alkenyloxybenzoesäuren geht man am besten von einer entsprechenden Hydroxybenzoesäure aus, indem man ein geeignetes Alkyl- oder Alkenylhalogenid mit dem Dinatriumsalz der entsprechenden Hydroxybenzoesäure umsetzt. Die (Alkylthio)benzoesäuren oder die (Alkenylthio)benzoesäuren können hergestellt werden, indem man das in entsprechender Weise substituierte (S-(4~Carbomethoxyphenyl)dimethylthiocarbamat der allgemeinen Formel C₆H₃XS(CO)N(CH₃)₂ mit wässrigem Natriumhydroxid bei

22 6 03 2

65 bis 85°C umsetzt, dann das entsprechende Alkyl- oder Alkenylbromid zugibt und schließlich weitere 2 bis 4 Stunden erwärmt. Die substituierten S-(4-Carbomethoxyphenyl)dimethylthiocarbamate lassen sich aus den entsprechenden Hydroxybenzoesäuren nach dem in J. Org. Chem. 31, 3980 (1966) beschriebenen Verfahren.herstellen.

Möchte man eine Verbindung der allgemeinen Formel III herstellen, worin A für SuIfinyl oder Sulfonyl steht, dann kann man hier zur Acylierung des Kerns das entsprechende Sulfoxid- oder Sulfonderivat der (Alkenylthio)-- oder (Alkylthio)benzoesäure (von IV) verwenden. Die hierzu geeigneten Sulfoxide oder Sulfone lassen sich durch Oxidation des entsprechenden Thioethers unter Verwendung hierzu üblicher Oxidationsmittel herstellen, wie m-Chlorperbenzoesäure, t-Butylhypochlorit, Natrxummetaperiodad oder Wasserstoffperoxid. Falls der Thioether eine Doppelbindung enthält, dann sollen zur Vermeidung einer Epoxidation dieser Doppelbindung sehr milde Bedingungen angewandt werden. Bei Anwendung äquimolarer'" Mengen der Reaktionspartner erhält man als Produkt ein Sulfoxid (A = SuIfinyl), das sich durch Einsatz eines weiteren Mols des Oxidationsmittels ohne weiteres zum Sulfon (A = Sulfonyl) oxidieren läßt. Die bei den vorliegenden Verfahren als Ausgangsmaterialien verwendeten Hydroxybenzoesäuren und substituierten Derivate hiervon sind entweder bekannt oder, in bekannter Weise herstellbar.

Bei systematischer Anwendung kann die Dosis der jeweils zu verabreichenden Verbindung aus der allgemeinen Formel III schwanken in Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Verbindung, der Stärke und Art der Infektion und dem physikalischen Zustand des jeweiligen Empfängers. Bei einer entsprechenden Therapie sollte man mit niedrigen Dosen beginnen und die Dosis dann 'bis zur Erzielung der gewünschten antifungalen Wirkung

erhöhen. Die vorliegenden. Verbindungen lassen sich intravenös od.er,.intramuskulär durch Injektion in Form einer sterilen wässrigen Lösung oder

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Suspension verabreichen, die gewünschtenfalls verschiedene herkömmliche pharmazeutisch unbedenkliche Konservierungsmittel, Puffermittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel enthalten kann. Zur Herstellung isotonischer Lösungen können auch andere Zusätze verwendet werden, wie Kochsalz oder Glucose. Das jeweils anzuwendende Mengenverhältnis und die jeweilige Art solcher Zusätze sind dem Fachmann geläufig.

Bestimmte Verbindungen aus der allgemeinen Formel III ergeben nach oraler Verabreichung stark erhöhte Blutspiegel (Beispiel

1, Tabelle IX) und können systemisch oral verabreicht werden. Zur oralen Anwendung können diese Verbindungen in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Hilfsstoffen in Form von Kapseln, Tabletten oder Pulvern eingesetzt werden. Art und Menge, in der solche Träger oder Hilfsstoffe zur Anwendung gelangen, sind dem Fachmann bekannt.

Zur Behandlung vaginaler candida-Infektionen können die Verbindungen der allgemeinen Formel III in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsmitteln verwendet, werden, wie sie für intravaginale Anwendungen üblich sind. Auch solche intravaginal verabreichbare Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.

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Herstellungsbeispiel 1

Fermentation von Actinoplanes utahensis NRRL 12052

Es wird eine Stammkultur von.Actinoplanes utahensis NRRL 12052 hergestellt und auf einer Agar-Schräge gehalten. Das zur Bildung der Schräge verwendete Medium wird aus folgenden Medien ausgewählt.

MEDIUM A	Bestandteile	q-	Mengen
Babyhafermehl		60,0 g
Hefe	·. 2,5 g
K2HPO4	1,0 g
Czapek-Mineralgrundmischung*	5,0 ml
Agar	25,0 g
Deionisiertes Wasser	s. auf 1 Liter

Der pH-Wert vor der Behandlung im Autoklav beträgt etwa 5,9, Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf pH 7,2 eingestellt«, Nach der Behandlung im Autoklav liegt der pH-Wert bei etwa 6,7

* Die Czapek-Mineralgrundmischung weist folgende Zusammensetzung auf

Bestandteile ; Mengen

FeSO₄-7H₂O (gelöst in 2 ml

konz. HCl) 2g

• KCl 100 g

MgSO₄-7H₂O 100 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

- 27 - 2 2 6 0 3 2

5,0	g	g	g
0,5	g	ml
3,0	g	g
0,5	g	1 Liter
12,5	g
5,0	g
5,0	g
2,5	g
0,25
1,0
2,0
20,0
auf

MEDIUM B

Bestandteile Mengen

Kartoffeldextrin

Hefeextrakt

Enzymhydrolysat von Casein* Rinderextrakt

Dextrose

Maisstärke

Fleischpepton

Portweinmelasse

MgSO₄-7H₂O

CaCO₃

Czapek-Mineralgrundmischung Agar

Deionisiertes Wasser q.s,

* N-Z-AmineA von Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Die Schräge wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 beimpft und die beimpfte Schräge bei 30⁰C etwa 8 bis 10 Tage bebrütet. Mit etwa der Hälfte des Schrägenwachstums beimpft, man dann ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung

Bestandteile ' Mengen

Babyhafermehl 20,0 g

Saccharose ' 20,0 g

Hefe 2,5 g

Getrocknete Destillationsschlempe* 5,0g

K₃HPO₄ . . 1,0g

Czapek-Mineralgrundmischung . . · 5,0 ml

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

- 28 - 2 2 6 0 3 2

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 6,8.

* National Destillers Products Co., 99 Park Ave., New York, N.Y.

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben bei 3O⁰C etwa 72 Stunden auf einem Rotatxonsschüttler bebrütet, der unter einer Geschwindigkeit von 250 Upm und unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser rotiert.

Das so erhaltene bebrütete vegetative Medium läßt sich direkt zur Beimpfung eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwenden. Wahlweise und vorzugsweise wird dieses vegetative Medium jedoch bis zu einem späteren Gebrauch aufgehoben, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Für eine derartige Lagerung wird die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen hergestellt;

In jede Ampulle gibt man 2 ml des bebrüteten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung (siehe W. A. Dailey und C. E. Higgens "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen", Cryobiol 10, 364 bis 367 (1973). Die so hergestellten Suspensionen werden dann in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine aufbewahrte Suspension (1 ml) des obigen vegetativen Mediums verwendet man dann zum Beimpfen von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe (das die oben bereits beschriebene Zusammensetzung hat)„ Das beimpfte vegetative Medium der ersten Stufe wird dann wie oben beschrieben bebrütet,

2 2 6 0 3 2

Zur Herstellung eines größeren Volumens an Inokulurn verwendet rran 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zum Inokulieren von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe , das die gleiche Zusammensetzung hat wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben 48 Stunden bei 3 0⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die unter einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser mit 250 Upm rotiert.

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten vegetativen Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 Liter eines sterilen Produktionsmediums mit einer der folgenden Zusammensetzungen:

MEDIUM I Bestandteile

Erdnußmehl Lösliches Fleischpepton Saccharose KH₂PO₄ K₂HPO₄

MgSO₄-7H₂O

Leitungswasser q.s

Der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6,9 nach Sterilisation durch Behandlung im Autoklav bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 45 Minuten bei einem Druck von etwa 1,1 bis 1,3 bar.

Mengen	(c/1)
10,0
5,0
20,0
0,5
1,2
0,25
auf 1	Liter

MEDIUM II

22 6 03 2

Bestandteile . Mengen (g/l)

Saccharose 30,0

Pepton ' 5,0

K₉HPO₄ 1,0

KCl 0,5

MgSO₄-7H₂O 0,5

FeSO₄'7H₂O 0,002 Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert wird mit Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt, und nach Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert etwa 7,0=

Bestandteile

Glucose NH₄Cl Na₂SO₄ ZnCl₂

MnCl₂-4H₂O CuCl₂-2H₂O CaCO₃ KH₂PO₄* Leitungswasser

MEDIUM III	Mengen (g/l)
	20,0
	; 3,0
	2,0
	0,019
	0,304
	0,062
	0,035
	0,005
	6,0
	0,67
	er. s. auf 1 Liter

* Getrennt sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen

zugesetzt

Der pH-Wert am Ende beträgt etwa 6,6.

22 6 03 2

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank bei einer Temperatur von etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 42 Stunden fermentieren. Hierbei wird das Fermentationsmedium mit herkömmlichen Rührernunter einer Geschwindigkeit von etwa 200 Upm gerührt und mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von über 30 % der Luftsättigung bei atmosphärischem Druck belüftet.

Herstellungsbeispiel 2 Herstellung des A-42355 AntibiotikumTKomplexes A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 wird auf einer Agar-Schräge aus einem Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt und gehalten.

Bestandteile Mengen

Glucose Hefeextrakt CaCO₃

Pflanzensaft* Agar**

Deionisiertes Wasser

(anfänglicher pH=6,1)

* V-8 Juice, Campbell Soup Co., Camden, N.J. ** Meer Corp.

Die Schräge wird mit Aspergillus nidulans var. roseus NRRL 11440 beimpft, und die beimpfte Schräge wird etwa 7 Tage bei 25⁰C bebrütet. Die reife Kultur wird mit Wasser bedeckt und

5	g	1 Liter
2	g
3	g
200	ml
20	g
q.s. auf

- 32 - 22 6 03 2

mit einer sterilen Schlaufe zum Ablösen der Sporen abgekratzt, Die so erhaltene Suspension wird mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser aufgenommen.

Ein ml der so erhaltenen Suspension wird zum Inokulieren von 55 ml vegetativen Mediums in einem 250-ml-Kolben verwendet. Das vegetative Medium hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Saccharose Portweinmelasse Maisquellwasser Malzextrakt K₂HPO₄

Enzymhydrolysat. von Casein* Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,5 bis 6,7)

* N-Z-Case, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N.J.

Das inokulierte vegetative Medium wird bei 25°C 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 250 Upm inkubiert. Nach 24 Stunden wird das Medium 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit in einer Mischvorrichtung (Waring) homogenisiert und dann die übrigen 24 Stunden inkubiert. Stattdessen kann man das inokulierte vegetative Medium aber auch 48 Stunden inkubieren und anschließend 15 Minuten bei geringer Geschwindigkeit homogenisieren.

Dieses inkubierte vegetative Medium kann zum Beimpfen von Schüttelkolbenfermentationskulturmedium oder zum Inokulieren eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden. Stattdessen kann man es auch für eine spätere Verwendung aufheben, indem man es in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff

25	g
36	g
6	g
10	g
2	g
10	g
1100	ml

22 6 03 2

hält. Für eine derartige Aufbewahrung wird die Kultur in einer Mehrzahl kleiner Ampullen folgendermaßen zubereitet.

Die vegetativen Kulturen werden mit gleichen Volumina einer Suspendierlösung der folgenden Zusammensetzung vermischt:

Bestandteile . Mengen

Glycerin 20 ml

Lactose 10 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 100 ml

Die Suspensionen werden auf kleine sterile Schraubverschlußhülsen (4 ml pro Hülse) verteilt. Die so erhaltenen Hülsen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Eine in dieser Weise zubereitete und aufbewahrte Suspension läßt sich dann zum Inokulieren von Agar-Schrägen oder flüssigen Saat-Medien verwenden. Die Schrägen werden bei 25⁰C im Licht 7 Tage inkubiert.

B. Tankfermentation

Zur Herstellung eines größeren Volumens an inokulum verwendet man 10 ml der inkubierten vegetativen Kultur der ersten Stufe zum Inokulieren von 400 ml eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben 24 Stunden bei 25°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von etwa 5 cm bei 250 Upm rotiert.

- 34 - 2 2 6 0 3 2

Mit dem in obiger Weise hergestellten inkubierten Medium der zweiten Stufe (800 ml) beimpft man dann 100 1 steriles Produktionsmedium mit einer der folgenden Zusammensetzungen:

MEDIUM IV Bestandteile . .· Mengen

ZnSO₄-7H₂O Lösliches Fleischpepton* Sojabohnenmehl Tapiocadextrin** Portweinmelasse Enzymhydrolysat von Casein*** Na₂HPO₄

MgSO₄-7H₂O FeSO₄"7H₂O Baumwollsaatöl

Antischaummittel****

Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,8 bis 7,0)

* O.M. Peptone, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

** Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, 111.

*** N-Z-AmireA, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N. J- **** P2000, Dow Corning, Midland, Michigan

0,00455	g/i
30,5	g/l
15,5	g/i
2,0	g/i
10,5	g/i
8,5	g/i
4,5	g/i
5,5	g/i
0,1	g/i
40,0	ml
1,0 1000,0	ml ml

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MEDIUM V Bestandteile Mengen

Glucose 2,5 %

Stärke 1,0%

Lösliches Fleischpepton* 1,0 %

Portweinmelasse 1,0 %

CaCO₃ 0,2 %

MgSO₄'7H₂O 0,05 %

Enzymhydrolysat von Casein** 0,4 %

Antischaummittel*** 0,02 % Leitungswasser q.s. auf Volumen

* O.M. Peptone ** N-Z-AmineA *** Antifoam "A", Dow.Corning

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem Fermentationstank von 165 1 Fassungsvermögen bei einer Temperatur von 25⁰C etwa 7 Tage fermentieren. Das Fermentationsmedxum wird dabei mit steriler Luft unter Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von über etwa 50 % der Luftsättigung belüftet.

C. Vegetatives Medium der dritten Stufe

Immer dann, wenn die Fermentation in größeren Tanks als für 100 1 Fermentationen durchgeführt wird, ist zu empfehlen, daß zum Beimpfen größerer Tanks eine vegetative Kultur der dritten Stufe verwendet wird. Ein bevorzugtes vegetatives Medium der dritten Stufe hat folgende Zusammensetzung:

25	g
25	g
6	g
10	g
10	g
2	g
1000	ml

- ₃₆ _ 2 2 6 0 3 2

Bestandteile Mengen

Saccharose Portweinmelasse Maisquellwasser Enzymhydrolysat von Casein* Malzextrakt K₂HPO₄

Leitungswasser

(anfänglicher pH=6,1) *N-Z-Case

H e r s t e 1 Iu ngsbeispiel 3

Abtrennung des A-42355 Antibiotikum-Komplexes

Die nach dem im Beispiel 22 beschrieben Verfahren unter Verwendung des Produktionsmediums V erhaltene Gesamtfermentationsmaische (4127 1), wird eine Stunde gründlich mit Methanol (4280 1) verrührt und dann unter Verwendung einer Filterhilfe auf Basis von Diatomeenerde (Hyflo Supercel von Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird mittels 5 normaler Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Das angesäuerte Filtrat wird zweimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter Vakuum auf ein Volumen von 20 1 eingeengt» Das erhaltene Konzentrat wird zu 200 1 Diethylether gegeben _r wodurch der A-42355 Komplex ausfällt. Durch Abfiltrieren des angefallenen Niederschlags gelangt man zu 2775 g des A-42355 Komplexes in Form eines grauweißen Pulvers.

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Isolierung und Identifizierung der Faktoren von Ä-30912

Herstellungsbeispiel 4 Isolierung von A-30912 Faktor.A

Zu diesem Zweck löst man zuerst 1 g des in den Herstellungsbeispielen 2 und 3 beschrieben A-42355 Antibiotikum-Komplexes in 7 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Die erhaltene Lösung wird filtriert und auf eine 35 cm lange Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,7 cm (Michel-Miller High Performance Low Pressure (HPLPLC) Chromatography Column, Ace Glass Incorporated, Vineland, N.J. 08360) aufgegeben, die man über eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems · mit dem gemäß Herstellungsbeispiel 10 hergestellten LP-1/C.g-Siliciagel-Umkehrphasenharζ (10 bis 20 Micron) füllt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlännnfüllverfahren in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) bepackt. Das Lösungsmittel wird mittels einer F.M.I.-Pumpe mit ventilloser Kolbenausführung " (maximale Strömungsgeschwindigkeit 19,5 ml/min) durch die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 9 ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar bewegt, wobei man jede Minute eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

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Herstellungsbeispiel 5 Isolierung von A-30912 Faktor B

Zur Auftrennung von A-42355 Komplex geht man wie im Herstellungsbeispiel 3 beschrieben vor, mit der Ausnahme, daß man die konzentrierten Chloroformextrakte (285 1) über eine Silicagelsäule (150 1 Grace-Silicagel, Sorte 62) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 l/min chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform (200 1) gewaschen, mit Acetonitril (500 1) eluiert und dann kontinuierlich mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l/min eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 aufgefangen und einzeln bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit analysiert. Hierzu verwendet man Papierscheiben auf Agar-Platten, die mit Candida albicans beimpft sind. Die Fraktionen 77 bis 103 (1365 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt.Die konzentrierte Lösung (4,5 1) enthält einen Niederschlag, durch dessen Abfiltrieren man zu 119 g A-4 23 55 Komplex mit angereichertem Faktor B gelangt. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird wieder in einem entsprechenden Volumen Methanol.gelöst. Die Methanollösung wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der den Faktor B enthaltende Komplex des Antibiotikums ausfällt. Dieser Niederschlag wird ebenfalls abfiltriert und getrocknet, wodurch man weitere 24 g A-42355.Komplex mit angereichertem Faktor B in Form eines grauen Pulvers erhält.

Der in obiger Weise hergestellte A-42355 Komplex mit angereichertem Faktor B (1,0 g) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe über ein Ventilsystem auf eine Silicagelsäule (Länge 33 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule wird über eine Schlaufe mit einem Ventilsystem mit LP-l/C.~-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron), hergestellt nach dem Herstellungsbeispiel

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10, in einer Mischung aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Zum Füllen der Säule wird das im Herstellungsbeispiel 11 beschriebene Aufschlämmfüllverfahren verwendet. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min unter einem Druck von etwa 7 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt. Jede Minute wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 15 verfolgt. Die Fraktionen 102 bis 110 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst und die Lösung wird lyophilisiert, wodurch man zu 22 mg A-30912 Faktor B gelangt.

Herstellungsbeispiele

Isolierung von A-30912 Faktor D

Konzentrierte Chloroformextrakte von zwei nach dem Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen Fermentationsversuchen (3800 1 und 4007 1) werden vereinigt und auf einer Silicagelsäule (Grace, Sorte 62) chromatographiert. Die Säule wird mit Chloroform gewaschen und dann zuerst mit Acetonitril und anschließend mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (98:2) eluiert. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 200 1 gesammelt und bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit durch Verwendung von. Papierscheiben auf mit Candida albicans angeimpftem Agar analysiert. Die aktiven Fraktionen (850 1) werden vereinigt und unter Vakuum eingeengt. Die eingeengte Lösung (O₇7 1) wird zu Diethylether (10 Volumina) gegeben, wodurch der an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex ausfällt. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch man 32 g des an Faktor D angereicherten A-42355 Komplexes in Form eines grauen Pulvers erhält.

- 40 - 2 2 6 0 3 2'

Der obige, an Faktor D angereicherte A-42355 Komplex (1,0 g) wird in 5 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst. Die Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Länge 30 cm, Innendurchmesser 3,7 cm, Michel-Miller-Säule) gegeben. Die Säule ist mit LP-l/C. g-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) gefüllt, das nach dem Herstellungsbeispiel 10 hergestellt worden ist. Zum Füllen der Säule bedient man sich des beim Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Aufschlämmfüllverfahrens unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1). Das Lösungsmittel Wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min unter einem Druck von etwa 3,1 bar mittels einer F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt. Alle 2 Minuten wird eine Fraktion aufgefangen. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Model UA-5) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt. Die Fraktionen 96 bis 108 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Dieses Öl wird in einem kleinen Volumen tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren der Lösung gelangt man zu 89 mg A-3 0912 Faktor D.

Herstellungsbeispiel 7

Isolierung von A-30912 Faktor H

Der nach den Herstellungsbeispielen 2 und 3 erhaltene A-42355 Antibiotikum-Komplex (5,0 g) wird in 35 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Glassäule mit 42 cm Länge und 3,7 cm Innendurchmesser (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird nach dem im Herstellungsbeispiel 11 beschriebenen Verfahren

22 6 03 2

mit LP-IZC₁g-Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) in einem Gemisch aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gefüllt. Die Herstellung des verwendeten Silicagel-Umkehrphasenharzes ist im Herstellungsbeispiel 10 beschrieben. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 13 ml/min unter einem Druck von etwa 8,4 bar mit einer F.M.I.-Pumpe mit einer yentillosen Kolbenausführung durch die Säule geführt, wobei man alle 2 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 rim nach der im Herstellungsbeispiel 19, Abschnitt C, beschriebenen Methode überwacht. Die Fraktionen 112 bis 132 werden mit den Fraktionen 106 bis 117 aus einer zweiten ähnlichen Reinigung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden unter Vakuum zu einem Öl eingeengt., Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 173 mg rohem A-30912 Faktor H.

Das rohe A-30912 Faktor H (150 mg) wird in 8 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Acetonitril (7:2:1) gelöst, und die erhaltene Lösung wird filtriert und wie oben beschrieben in eine Glassäule mit einer Länge von 32 cm und einem Innendurchmesser von 2,0 cm eingeführt. Das Lösungsmittel wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 mm/min unter einem Druck von etwa 5,6 bar durch die Säule geführt, wobei man alle 3 Minuten eine Fraktion auffängt. Die Elution des Antibiotikums wird bei 280 nm verfolgt. Die Fraktionen 17 und 18 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das öl wird in einem kleinen Volumen tert-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu 29 mg A-30912 Faktor H.

Indentifizierung der Faktoren von A-30912

Die einzelnen Faktoren von A-30912 lassen sich durch Dünnschichtchromatpgraphie (TLC) identifizieren. Die dabei für die Faktoren A bis G des Antibiotikums A-30912 unter Verwendung von Silicagel

- ·⁴² - 2 2 6 0 3 2

(Merck, Darmstadt) in einem Lösungsmittelsystem aus Benzol und Methanol (7:3) und durch Bioautographie mit Candida albicans erhaltenen R -Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

Tabelle	VII	.,.-Werte
A-30912 Faktoren	R	X. 0,35
A		0,45
B		0,-54
C		0,59
D		0,27
E		0,18
F		0,13
G

Die ungefähren R -Werte der Faktoren A, B, C, D und H von A-30912 in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, die man durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel* (Merck,Darmstadt, Silicagel-Platten Nr. 60, 20x20 cm) und Bioautographie mit Candida albicans erhält, können der folgenden Tabelle VIII entnommen werden.

	Tabelle VIII	Lösungsmittelsysteme:	a	I	Lösungsmittelsysteme	C	d
A-3091		0,28		b	0,28	0,43
	2 Faktoren R£-Werte -	0,39		0,14	0,42	0,47
Faktor		0,46		0,21	0,51	0,58
Faktor	A	0,50	0,31	0,57	0,61
Faktor	B	0,42	0,38	0,36	0,53
Faktor	C	0,27
Faktor	D
	H

a: Ethylacetat:Methanol (3:2)

b: Ethylacetat:Methanol (7:3)

c: Acetonitril:Wasser (95:5)

d: Ethylacetat:Ethanol Essigsäure (40:60:0,25)

OJ I

roro σ> σ ω

ND

22 6 03 2

Die Faktoren A, B, D und H von A-30912 lassen sich ferner auch durch analytische Hochleistungsniederdruckflüssigkeitschromatographie unter folgenden Bedingungen identifizieren.

Säule: Packung:

Lösungsmittel: Probenvolumen: Probengröße: Säulentemperatur:

Strömungsgeschwindigkeit:

Druck: Detektor:

Pumpe: Injektion:

Glas, 0,8 χ 15,0 cm Nucleosil 10-C₁₈ (Machery-Nagel

and Company),

nach dem im Beispiel 8 beschriebenen

Aufschlämmungsverfahren abgepackt Methanol:Wasser:Acetonitril (7:2:1) 8 mcl 8 meg

Umgebung

1,8 ml/min etwa 14 bar

UV bei 222 nm (ISCO Model 18 00 Variable Wavelength UV-Visible Absorbance Monitor) LDC Duplex-Minipumpe Schlaufeninjektion

Die unter diesen Bedingungen ermittelten ungefähren Verweilzeiten für die Faktoren A, B, D und H von A-3 0912 gehen aus folgender Tabelle IX hervor:

	Tabelle IX
A-30912 Faktoren	Verweilzeit
	(Sekunden)
A B H D	792 870 990 1140

- 45 - 2 2 6 0 3 2

Herstellungsbeispiel 8

Herstellung von Antibiotikum S31794/F-1

Das Antibiotikum S31794/F-1 wird durch submerse Züchtung von Acrophialophora limonispora NRRL 8095 unter Rühren, Schütteln und/oder Belüften bei einem pH-Wert von 3 bis 8, vorzugsweise einem pH-Wert von 5 bis 7, und bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C/ vorzugsweise einer Temperatur von 18 bis 27°C, über eine Zeitdauer von 48 bis 360 Stunden, vorzugsweise eine Zeitdauer von 120 bis 288 Stunden, hergestellt.

Zur Isolierung des Antibiotikums S31794/F-1 wird die Kulturbrühe (90 1) mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Isopropanol (4:1, 90 1) behandelt und das Ganze dann 30 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und unter Vakuum bei etwa 40⁰C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit einer 10-fachen Menge Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (95:5 bis 60:40) chromatographiert. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und mit einer 10 0-fachen Menge Silicagel (Sephadex LH-20) mit Methanol chromatographiert. Die aus der Sephadex-Säule kommenden Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und erneut mit einer 100-fachen Menge Silicagel (0,05 bis 0,2 mm) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform, Methanol und Wasser (71:25:4) chromatographiert. Die eluierten Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu rohem Antibiotikum S31794/F-1 gelangt. Dieses Produkt wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst und mit Diethylether ausgefällt, wodurch man S31794/F-1 in Form eines weißen amorphen Pulvers erhält, das nach Trocknen unter. Hochvakuum bei 25 bis 30⁰C bei 178 bis 180⁰C unter Zersetzung schmilzt. Durch Umkristallisation aus einer 10-fachen Menge eines Gemisches aus Ethylacetat," Methanol und Wasser (80:12:8) . gelangt man zu kristallinem S31794/F-1, das nach Trocknen unter

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Hochvakuum bei 20⁰C bei 181 bis 183°C unter Zersetzung schmilzt.

Herstellungsbeispiel 9 Isolierung des Antibiotikums S31794/F-1

Das gemäß Herstellungsbeispiel 8 nach Chromatographie über Sephadex erhaltene rohe Antibiotikum S31794/F-1 wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems in eine Silicagelsäule (Michel-Miller-Säule) eingeführt. Die Säule wird durch eine Schlaufe mittels eines Ventilsystems mit LP-l/Co™

I ο

Silicagel-Umkehrphasenharz (10 bis 20 Micron) (hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 10) in einem Gemisch aus Chloroform,- Methanol und Wasser (71:25:4) gefüllt. Zur Förderung des Lösungsmittels durch die Säule wird eine F.M.I.-Pumpe mit einer ventillosen Kolbenausführung verwendet. Die Elution des Antibiotikums wird unter Verwendung eines UV-Monitors bei 280 nm wie beim Herstellungsbeispiel 22 verfolgt. Die Fraktionen mit antifungaler Wirksamkeit werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wodurch man das Antibiotikum S31794/F-1 erhält. Bei einer entsprechenden dünnschichtchroiuatographischen Untersuchung unter Verwendung von Silicagel (Merck, 0,25 mm) ergeben sich für dieses Antibiotikum S317 94/F-1 folgende R^-Werte.

Lösungsmittelsystem R -Werte

Chloroform:Methanol:Wasser (71:25:4) \ 0,17 Chloroform:Methanol:konz. Essigsäure (70:29:1) 0,19 Chloroform-.Methanol (2:1) 0,27

Das Antibiotikum S31794/F-1 läßt sich ferner auch durch loddarnpf erkennen =

- 47 - 2 2 6 0 32

Herstellungsbeispiel 10 Herstellung von Silicagel/C.. „-Umkehrphasenharz

Stufe 1; Hydrolyse

Man gibt LP-1 Silicagel (1000 g von Quantum Corp., jetzt Whatman) zu einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure (1650 ml) und konzentrierter Salpetersäure (1650 ml) in einem 5-1-Rundkolben und schüttelt das Ganze-solange, bis es sauber suspendiert ist. Sodann erhitzt man das Gemisch über Nacht (16 Stunden) auf einem Dampfbad, wobei man auf den Kolben einen mit Wasser gekühlten Kühler aufsetzt.

Anschließend wird das Gemisch in einem Eisbad abgekühlt und vorsichtig unter Verwendung einer Sinterglasnutsche filtriert. Das Silicagel wird solange mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis sein pH-Wert neutral ist. Sodann wird da's Silicagel mit Aceton (4 1) gewaschen und unter Vakuum bei 100⁰C zwei Tage getrocknet.

Stufe 2: Erste Silylierung

Das nach Stufe 1 erhaltene trockne Silicagel wird in einen Rundkolben übertragen und in Toluol (3,5 1) suspendiert. Der Kolben wird zwei Stunden auf einem Dampfbad erhitzt, um das noch vorhandene restliche Wasser azeotrop zu entfernen. Sodann versetzt man das Ganze mit Octadecyltrichlorsilan (321 ml, Aldrich Chemical Company) und rührt das Reaktionsgemisch über Nacht (16 Stunden) unter langsamem mechanischem Rühren bei etwa 60⁰C. Es ist darauf zu achten, daß der Rührer nicht bis zum Boden des Kolbens reicht, damit die Silicagelteilchen nicht gemahlen werden.

_ 48 -

22 6 03 2

Im Anschluß daran läßt man das Gemisch abkühlen. Sodann wird das silanierte Silicagel gesammelt, mit Toluol (3 1) und Aceton (3 1) gewaschen und anschließend über Nacht (16 bis Stunden) an der Luft getrocknet. Das getrocknete Silicagel wird in 3,5 1 eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (1:1) in einem 5-1-Kolben suspendiert, worauf man das Ganze vorsichtig 2 Stunden bei Raumtemperatur rührt, filtriert, mit Aceton (3 1) wäscht und über Nacht an der Luft trocknet»

Stufe 3: zweite Silylierung

Das Verfahren der obigen ersten Silylierung wird unter Verwendung von 200 ml Octadecyltrichlorsilan wiederholt. Die Suspension wird 2 Stunden unter vorsichtigem Rühren bei 6 0°C unter Rückfluß gehalten. Das hierdurch erhaltene Produkt wird abfiltriert, mit Toluol (3 1) und Methanol (6 1} gewaschen und dann unter Vakuum bei 50⁰C über Nacht (16 bis 20 Stunden) getrocknet. .

Herstellungsbeispiel 11

Aufschlämmfüllverfahren für Michel-Miller-Säulen Allgemeine Angaben

Dieses Verfahren wird zum Füllen entsprechender Säulen mit Silicagel-Cj Q-Umkehrphasenharz verwendet, wie es beispielsweise nach der Methode des Herstellungsbeispiels 10 gebildet wird. . .

Für diese Aufsohlämmfülltechnik sind im allgemeinen Drücke von weniger als.etwa 14 bar und Fließgeschwindigkeiten von 5 bis 40 ml/min erforderlich. Im einzelnen richten sich diese Werte nach dem Säulenvolumen und den Säulenabmessungen. Der Druck beim Füllen soll um etwa 2 bis 3,5 bar höher sein als der bei der Trennung angewandte Druck. Dadurch wird sicher-

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gestellt, daß während der Trennung keine weitere Kompression des Adsorbens erfolgt.

Eine plötzliche Erniedrigung des Drucks kann die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial verursachen, was ein wirksames Arbeiten der Säule stark beeinträchtigen würde. Nach Abstellen der Pumpe muß daher für ein langsames Abfallen des Drucks auf den Wert Null gesorgt werden.

Die verwendeten Säulen (Ace Glass Cat. No. unbepackt) haben etwa folgende Volumina: No. 5795-04=12.ml, No. 5795-10=110 ml, No. 5795-16=300 ml, No. 5795-24=635 ml und No. 5796-34= 34 ml.

Die zum Füllen einer Glassäule erforderliche Zeit liegt je nach Säulenabmessung und Geschicklichkeit zwischen Minuten und mehreren Stunden.

Stufen

tr

1. Die Glassäule wird über eine Kupplung mit einer Vorratssäule verbunden (das Volumen der Vorratssäule soll doppelt so groß sein wie das der Säule). Beide Säulen werden mit der Vorratssäule oben in senkrechte Stellung gebracht.

2. Das Füllmaterial wird abgewogen (etwa 100 g für eine Säule von etwa 200 ml).

3. Das Füllmaterial wird mit fünf Volumina Lösungsmittel, und zwar einem Gemisch aus 70 bis 80.% Methanol und 20 bis 30 % Wasser, versetzt.

4. Es wird gut geschüttelt, bis alle Teilchen befeuchtet sind, worauf man das Ganze über Nacht oder länger stehenläßt, damit eine vollständige Tränkung der Teilchen durch Lösungsmittel gewährleistet ist. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen.

- 30 - 2 2 6 0 3 2

5. Das Harz wird mit zur Füllung der Vorratssäule ausreichendem Lösungsmittel aufgeschlämmt und dann schnell in diese gegossen. Die Säule muß dabei mit dem gleichen Lösungsmittel vorgefüllt sein, und die Vorratssäule soll vor dem Eingießen der Aufschlämmung teilweise mit Lösungsmittel gefüllt sein. Die Verwendung größerer Aufschlämmungsvolumina kann gleichfalls zu guten Ergebnissen führen, erfordert jedoch (a) einen größeren Vorratsraum oder (b) mehrere Vorratsraumfüllungen während des Einfüllvorgangs.

6. Die Vorratssäule wird mit dem Tetrafluorethylenstopfen unterhalb der Säule verschlossen (vgl. Fig. 1 von US-PS 4 131 547, Stopfen Nr. 3), worauf man die Pumpe anschließt und sofort mit dem Pumpen von Lösungsmittel durch das System bei einer Höchstfließgeschwindigkeit von 20 ml/min beginnt,wenn eine Ace Cat. No. 13265-25-Pumpe oder ein ähnliches Lösungsmittelabgabesystem verwendet wird.

7. Die obige Arbeitsweise wird solange fortgesetzt, bis die Säule vollständig mit Adsorbens gefüllt ist. Der Druck soll die Höchsttoleranz der Säule während dieses Vorgangs'nicht übersteigen (etwa 14 bar für große Säulen und etwa 21 bar für Analysensäulen). In den meisten Fällen genügen Drücke von weniger als etwa 14 bar.

8 ο Wenn der Druck Höchstwerte übersteigt, dann wird die Fließgeschwindigkeit herabgesetzt, so daß der Druck abfällt.

9. Nach Füllung der Säule mit dem Adsorbens wird die Pumpe abgestellt, der Druck auf Null fallengelassen und die Verbindung zur Vorratssäule' gelöst. Die Vorratssäule wird durch eine Vorsäule ersetzt, die mit Lösiangsmittel und einer kleinen Menge Adsorbens gefüllt wird, wonach bis zur vollständigen Füllung der Säule mit Höchstdruck gepumpt wird. Bezüglich weiterer Hinweise wird auf die allgemeine Verfahrensbeschreibung verwiesen.

2 2 6 0 3 2

Nach dem Abstellen der Pumpe muß dafür gesorgt werden, daß der Druck immer langsam abfällt, wodurch die Bildung von Rissen oder Kanälen im Füllmaterial vermieden wird.

10. Nach Aufheben des Druckes wird die Verbindung zur Vorsäule sorgfältig, gelöst. Einige mm (2 bis 4 mm) der Füllung werden mit einem kleinen Spatel vom oberen Ende der Säule entfernt. Auf das obere Ende der Säule werden ein oder zwei Filter gelegt, die gelinde auf das Füllmaterial aufgedrückt werden, worauf man den Tetrafluorethylenstopfen bis zum festen Verschluß auf die Säule aufbringt. Die Säule wird mit der Pumpe verbunden, worauf Druck angelegt wird (gewöhnlich weniger als etwa 14 bar) und durch, die Glaswandung am oberen Ende der Säule beobachtet wird, ob sich das Harz noch weiter verdichtet. Setzt sich das Füllmaterial noch weiter ab (was bei größeren Säulen der Fall sein kann), dann erscheint ein kleiner Leerraum oder eine Kanalbildung, und in diesem Fall sollte die Stufe 9 wiederholt v/erden.

Herstellungsbeispiel 12

Herstellung von A-30912A Kern

A. Deacylierung von Antobiotikum Ä-30912 Faktor A

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wird eine Fermentation unter Verwendung von A. utahensis durchgeführt, wobei man das Schrägenmedium A und das Produktionsmedium I verwendet, und das Produktionsmedium wird etwa 42 Stunden inkubiert. Das Fermentationsmedium versetzt man mit A-30912 Faktor A (340 g Rohsubstrat, das etwa 19,7 g A-30912 Faktor A enthält, und zwar gelöst in 1,5 1 Ethanol). Die Deacylierung von A-30912 Faktor A wird durch einen entsprechenden Versuch unter-Verwendung von Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch.ein Verschwinden der Aktivität gegenüber C. albicans

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- 52 äußert. B. Isolierung von A-3Q912A Kern

Die gemäß obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe (100 I)₇ welche etwa 20 g A-30912 Faktor A enthält, wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das erhaltene klare Filtrat (etwa 9.3 1) führt man mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min durch eine Säule, die 4,5 1 HP-20-Harz enthält (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche Filterbrühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) (35 1) mit einer Geschwindigkeit von 200 bis 300 ml/min eluiert.

Die Eluierung .wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Von jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans» Zeigt die unbehandelte Teilmenge keine Wirksamkeit, während die acylierte Teilmenge wirksam ist, dann enthält diese Fraktion A-30912A Kern. Das den A-30912A Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt, und durch Lyophilisieren dieses Konzentrats gelangt man zu etwa 97 g rohem Kern.

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C. Reinigung von A-30912A Kern durch Umkehrphasen-Flüssigkeits-

chromatographie . .

Der nach obiger Stufe C erhaltene A-30912A Kern (25 g) wird in 300 ml eines Gemisches aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mittels einer 4 1 fassenden Säule aus rostfreiem Stahl (8 cm χ 80 cm) chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 ,bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird unter einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar und unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model .' UA-5, Instrumention Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ· 6) bei 280 nm verfolgt. Jede Minute werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 500 ml aufgefangen.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912A Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zu 2,6 g des gewünschten Kerns gelangt. Bis zur vollständigen chromatographischen Trennung ist eine Lösungsmittelmenge von 7 bis 8 1 erforderlich.

D. Eigenschaften vom A-3 0912A Kern

(a) Empirische Formel: C₃₄H^ N₇O₅.

(b) Molekulargewicht: 79 7,83.

(c) Weißer amorpher Feststoff, der in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Methanol löslich ist,

22 6 03 2

sich in Chloroform, Toluol und Diethylether jedoch nicht löst.

(d) IR-Absorptionsspektrum (KBr-Scheiben) mit folgenden Absorptionsraaxima:

3340 breit (OH, H-gebunden); 2970, 2930 und 2890 (CH-Streckung, aliphatische CH-, CH^, CH Gruppen) 1660 und 1625 (mehrere Carbonyle C=O) ,-1510-1550; 1430-1 450 (CH Bewe- < gung); 1310-1340; 1230-1260; 1080; 835, 650 breit und 550 breit cm

(e) Die elektrometrische Titration in 66%-igem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren

Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 7,35 "(anfänglicher • a

pH-Kert = 7,32).

(f) Bei der Hochdruckflüssigchromatographie beträgt die Verweilzeit (K¹) 11,52 Minuten, und zwar unter folgenden Bedingungen:

Säule: 4 χ 300 mm Packung: Silicagel/C, ₈

Lösungsmittel: Ammoniumacetat Acetonitril:Wasser (1:2:97) Strömungsgeschwindigkeit: 3 ml/min • Druck: 175 bar

Detektors UV-Licht mit veränderlicher Wellenlänge von

230 nm ' '

Sensitivität: 0 bis 0,4 A.U.F.S.

Herstellungsbeispiel 13

Zur Herstellung und Reinigung von A-3 0912A Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 12 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912A verwendet.

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- 55 Herstellungsbeispiel 14

Zur Herstellung und Reinigung von A-3 0912A Kern geht man wie .im Herstellungsbeispiel 12 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Aculeacin A verwendet.

Herstellungsbeispiel 15 Herstellung von A-3 0912B Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor B

Unter Anwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man-Α, utahensis, und .zwar unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit A-30912 Faktor B in Form einer Lösung in einer geringen Menge Methanol.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor B wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

B. Isolierung von A-30912B Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der hierbei erhaltene Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch vorhandene restliche Fermentationsbrühe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser

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wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und.die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält diese Fraktion A-30912B Kern. Das den A-3 0912B Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912B Kern durch Umkehrphasen-Flüssigkeits-

chromatographie

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912B Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 4 0 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91 160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird beim Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 6 0 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mittels einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) überwacht.

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Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die Fraktionen, die den A-30912B Kern enthalten, vereinigt, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912B Kern gelangt-

Herstellungsbeispiel 16

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912B Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 15 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912B verwendet.

Herstellungsbeispi el 17

Herstellung von A-3 0912D Kern A. Deacylierung von A-30912 Faktor D

Unter Verwendung des im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens fermentiert man A- utahensis mit einem Produktionsmedium I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung von A-30912 Faktor D in einer kleinen Menge Methanol»

Die Deacylierung von A-30912 Faktor D wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation solange laufen, bis die Deacylierung beendet ist, was sich durch ein Verschwinden der Aktivität äußert. .

B. Isolierung von A-30912D Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt "ist. Der hierbei erhaltene Säulenabs'trÖm wird verworfen. Dia Säule wird dann mit bis zu

22 6 03 2

acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um noch vorhandene restliche Fermentationsbrühe zu entfernen. Das dabei anfallende Waschwasser wird verworfen. Hierauf wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Eluierung der Säule wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion entnimmt man zwei Teilmengen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das dabei erhaltene Produkt und die andere (nicht behandelte) Teilmenge untersucht man dann bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge nicht wirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-3 0912D Kern. Das den A--30912D Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum entsprechenden rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912D Kern durch Umkehrphasen-Flüssigkeits-

keitschromatographie \

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912D Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 4 0 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, so daß sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 6 0 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 28 0 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model U A-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit .einer optischen

-59- 22 6 03 2

Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden diejenigen Fraktionen vereinigt, die den A-30912D Kern enthalten, unter Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wodurch man zum gereinigten A-30912D Kern gelangt.

Herstellungsbeispiel 18

Zur Herstellung und Reinigung von A-30912D Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 17 beschrieben vor, wobei man als

Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912D verwendet.

Herstellungsbeispiel 19

Herstellung von A-30912H Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum A-30912 Faktor H

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediums I. Nach 48-stündiger Bebrütung der Kultur löst man A-30912 Faktor H in einer geringen Menge Methanol und gibt die Lösung zum Fermentationsmedium.

Die Deacylierung von A-30912 Faktor H wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans oder Neurospora crassa verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich durch ein Verschwinden an Aktivität äußert.

-60- 226032

B. Isolierung von A-30912H Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen. Das klare Filtrat leitet man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist. Der dabei anfallende Säulenabstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das Waschwasser wird verworfen. Sodann wird die Säule mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt:

Jeder eluierten Fraktion werden zwei Teilmengen entnommen..Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Wirksamkeit gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält eine solche Fraktion A-30912H Kern. Das den Α-30912Ή Kern enthaltende Eluat wird auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von A-30912H Kern durch Umkehrphasen-Flüssigkeits-

chromatographie ·

Der nach obigem Abschnitt C erhaltene rohe A-30912H Kern wird in einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron (MC/B Manufacturing Chemists, Inc. Ε/Μ, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck

2 2 6 0 3 2

von etwa 6,3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 6 0 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ 6) verfolgt.

Herstellungsbeispiel 20

Zur Herstellung und Reinigung von A-3 0-912H Kern geht man wie im Herstellungsbeispiel 19 beschrieben vor, wobei man als Substrat jedoch Tetrahydro-A-30912H verwendet.

Herstellungsbeispiel 21

Herstellung von S31794/F-1 Kern

A. Deacylierung von Antibiotikum S31794/F-1 "

Nach dem im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren fermentiert man A. utahensis unter Verwendung des Produktionsmediuras I. Nach etwa 48-stündiger Bebrütung der Kultur versetzt man das Fermentationsmedium mit einer Lösung des Antibiotikums S31794/F-1 in einer kleinen Menge Methanol.

Die Deacylierung von S31794/F-1 wird durch einen Papierscheibenversuch gegenüber Candida albicans verfolgt. Man läßt die Fermentation bis zur Beendigung der Deacylierung laufen, was sich anhand eines Verschwindens der Aktivität äußert.

- 62 - 2 2 6 0 3 2

B. Isolierung von S31794/F-1 Kern

Die nach obigem Abschnitt A erhaltene Gesamtfermentationsbrühe wird filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen* Das angefallene klare Filtrat führt man durch eine Säule, die mit HP-20-Harz (DIAION High Porous Polymer, HP-Serie, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) gefüllt ist» Der dabei anfallende Abstrom wird verworfen. Die Säule wird dann mit bis zu acht Säulenvolumina an deionisiertem Wasser bei pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Das anfallende Waschwasser wird verworfen. Die Säule wird hierauf mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (7:3) eluiert. Die Elution wird nach folgendem Verfahren verfolgt;

Jeder eluierten Fraktion werden zwei Teilmengen entnommen. Eine Teilmenge wird auf ein kleines Volumen eingeengt, und mit einem Säurechlorid, wie Myristoylchlorid, behandelt. Das hierdurch erhaltene Produkt und die andere (unbehandelte.) Teilmenge untersucht man bezüglich der jeweiligen Aktivität gegenüber Candida albicans. Ist die unbehandelte Teilmenge unwirksam und die acylierte Teilmenge wirksam, dann enthält die jeweilige Fraktion S31794/F-1 Kern. Das den S3i794/F-I Kern enthaltende Eluat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum gewünschten rohen Kern gelangt.

C. Reinigung von S31 794/F-1 Kern durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie

Der nach obigem Abschnitt B erhaltene rohe S3179 4/F-1 Kern wird in einem Qemisch aus Wasser, Acetonitril, Essigsäure und Pyridin (96:2:1:1) gelöst. Die Lösung wird mit einer Säule chromatographiert, die mit Lichroprep RP-18, Teilchengröße 25 bis 40 Micron {MC/B Manufacturing Chemists, Inc. E/M, Cincinnati, OH) gefüllt ist. Die Säule ist Teil einer

22 6 03 2

Chroinatospac Prep 100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einem Druck von 6/3 bis 7 bar unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches betrieben, wodurch sich eine Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/min ergibt. Die Auftrennung wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Monitors (ISCO Absorptionsmonitor Model UA-5, Instrumentation Specialties Co., 4700 Superior Ave., Lincoln, Nebraska 68504) mit einer optischen Einheit (ISCO Typ-6) verfolgt.

Auf Basis der Absorption bei 280 nm werden die den S31794/F-1 Kern enthaltenden Fraktionen vereinigt, unter Vakuum eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zum reinen S31794/F-1 Kern gelangt.

Herstellun g s beispiel 22

Herstellung von Tetrahydro-A-30912A

A-30912 Faktor A wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor A mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-3 0912A.

Herstellungsbeispiel 23

Herstellung von Teträhydro-Ä-3 0912B

A-30912 Fakor B wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor B mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange,·bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden)- Das Reaktionsgemisch wird

22 6 03 2

filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen .Menge tert.-Butanol gelöst, und 'durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30 912B.

Herstellungsbeispiel 24

Herstellung von .Tetrahydro-A-30912D

A-30912 Faktor D wird in Ethanol gelöst. Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor D mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst, und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro~A-3091.2D.

Herstellungsbeispiel 25

Herstellung von Tetrahydro-A-30912H

A-30912 Faktor H wird in Ethanol gelöst« Sodann reduziert man Platindioxid in absolutem Ethanol zu elementarem Platin, und mit diesem Platin reduziert man dann A-30912 Faktor H mittels Wasserstoff unter positivem Druck solange, bis die Reaktion beendet ist (etwa 2 bis 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch, wird filtriert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge tert.-Butanol gelöst,-und durch Lyophilisieren dieser Lösung gelangt man zu Tetrahydro-A-30912H.

22 6 03 2

- 65 Herstellungsbeispiel 26

Die später folgenden Tabellen I bis VII zeigen die Herstellung verschiedener Säuren aus der allgemeinen Formel IV, wie sie in den Tabellen im einzelnen angegeben sind. Nämlich der angeführten verschiedenen Alkoxybenzoesäuren, (Alkylthio)benzoesäuren, Alkoxyphenylessigsäuren, Alkoxyphenylpropionsäuren, Alkoxyzimtsäuren, Alkoxyphenoxyessigsäuren und Alkoxynicotinsäuren.

Aus der Tabelle I geht die Herstellung entsprechender Alkoxybenzoesäuren und aus der Tabelle II die Herstellung entsprechender (Alkylthio)benzoesäuren hervor, die jeweils unter die eingangs erwähnte allgemeine Formel IV fallen.

Die obigen Säuren werden nach den im folgenden näher beschriebenen Verfahren hergestellt.

Die Herstellung der in Tabelle I angeführten Alkoxybenzoesäuren wird wie folgt durchgeführt:

Man ,löst p-Hydroxybenzoesäure in 10%-igem wässrigem Natriumhydroxid (zwei Äquivalente) und gibt die erhaltene Lösung dann zu Dimethylsulfoxid (DMSO) (200 ml). Sodann versetzt man die Lösung bei 65 bis 80⁰C mit dem jeweiligen Alkylbromid (ein Äquivalent). Die erhaltene Lösung wird 2 Stunden gerührt, dann in ein großes Volumen (600 ml).Wasser gegossen und schließlich .mit Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Die hierbei aus der Lösung ausfallende Alkoxybenzoesäure wird.abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert.

Zur Herstellung der in der Tabelle II angegebenen (Alkylthio)-benzoesäuren geht man wie folgt vor:

- 66 - 22 6 03 2

Man versetzt eine Suspension von Natriumhydrid (ein Äquivalent, 50%ige Dispersion in Mineralöl) in Dimethylformamid (100 ml auf 50 mMol) unter Kühlen auf 0⁰C langsam mit p-Hydroxy-· methylbenzoat (ein Äquivalent). Das Reaktionsgemisch wird dann unter Stickstoffatmosphäre solange geruht, bis die Entwicklung von Wasserstoff aufhört. Das auf diese Weise erhaltene 4-Carbomethoxynatriumphenolat wird in einem Guß zu N,N-Dimethylthiocarbamoylchlorid /(CH₃)₂N(CS)Cl? (ein Äquivalent) gegeben. Die erhaltene Suspension wird 1 bis 3 Stunden auf 7O⁰C erwärmt und dann in eine wässrige Lösung (1%ig) von Kaliumhydroxid (großer Überschuß) gegeben. Hierauf wird die Suspension zweimal mit einem Gemisch aus Toluol und Hexan (4:1, Volumen/Volumen) extrahiert. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat werden die organischen Extrakte filtriert und unter Vakuum zu einem öl eingedampft. Das Öl wird chromatographisch über Silicagel unter Verwendung von 2 % Methanol in Methylenchlorid gereinigt, wodurch man zu O-(4-Carbomethoxyphenyl)-dimethylthiocarbamat /P-CH₃CO₂C₆H₄O(CS)N(CH₃)₂7 (F= 97 bis 102⁰C) gelangt. Das erhaltene Produkt wird unter Stickstoffatmosphäre 30 bis 60 Minuten auf 220⁰C erhitzt, wodurch man zu S-(4-Carbomethoxyphenyl)dimethylthiocarbamat /p-CH_CO„C_cH.-S (CO)N (CH_)p/ gelangt, das aus Methanol umkristallisiert wird. Eine Lösung von S-(4-Carbomethoxyphenyl)dimethylthiocarbamat in Dimethylsulfoxid wird zu zwei Äquivalenten Natriumhydroxid (10%ige wässrige Lösung) gegeben= Das Gemisch wird auf 6 5 bis 85⁰C erwärmt und mit dem Alkylbromid (ein Äquivalent) versetzt. Nach weiterem 2- bis 4-stündigem Erwärmen wird das Gemisch in ein großes Volumen Wasser gegossen. Der nach entsprechender Ansäuerung ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert. Die hierbei erhaltene (Alkylthio)benzoesäure wird aus Methanol' umkristallisiert.

Alkylbromid

Tabelle I Herstellung von Alkoxybenzoesäuren

Alkoxybenzoesäure Gewicht an

Formel Gewicht p-Hydroxybenzoesäure Formel

CH₃(CH₂)_?Br 9.65 g

CH₃(CH₂)_gBr 11.05 g

CII₃(CH₂) ₁₃Br 13.85 g

6.9 g 6.9 g 6.9 g

—*

CH₃(CH₂)

CH₃(CH₂)₉Ο-βζ

Gewicht

6.18 g

6,79 g

—*

/^e-^C02^{H 6}·¹⁸

Tabelle I (Forts.) Herstellung von Alkoxybenzoesäuren

Alkylbromid

Formel Gewicht

Gewicht an p-Hydroxybenzoesäure Alkoxybenzoesäure

Formel

Gewicht

CH₃(CH₂)₇Br

9.1 g.

6.4 g. CH₃ (CH₂) ₇0-

6.69 8

CH₃(CH₂)_gBr

10,8 g

6.4 g •-^CO H CH (CH ) 0-»( )·

10.2 g

CH₃ (CH₂) _nBr 11.7 g

6.4 CH (CH₂) 0-<

β ==9

10.9 g

CH₃(CH₂)₁₃Br 13.0 g

6.4 g

₂) ₃

7.3 g

ro σ> ο co ro

Tabelle II Herstellung von Alkylthiobenzoesäuren

Alkylbromid

Gewicht an S-(4-Carbomethoxyphenyl)-Alkylthiobenzoessure

Formel Gewicht dimethylthiocarbarcat Formel

Gewicht

CH₃(CH₂)_?Br 386 mg

478 mg CH (CH ) S-«( N-CO₉H 405 mg

—^#

CH₃(CH₂)₉Br 1.77 g

(CH₂J_nBr 1.99 g

CH (CH ) Br 2.22 g

1.91 g

1.99 g

1.91 g CH₃(CH₂) S-»( )*-C0₂H 1.34 g

₃(CH₂) S»( )*-C0₂

(CH₂)

(CH₂)

1.8 g

2.3 g

cn ο ω

Tabelle III Herstellung von Alkoxyphenylessigsauren

Alkyl brom ic!	Gewicht	Gewicht an	Alkoxyphenylessi gsäure	Gewicht	g	I O
Formel	3.86 g	Hydroxyphenyl essigsäure	Formel ,	2.56	g
CH3(CH2)7Br	4.98 g	3.04 g.	ΓΗ fPW \ Pi—<& β—PTT ΡΓ\ Vt 3 2 7 \ / ^n2UU2U	3.70	g	ro
CH3 (CH2) nBr	3.86 g	3.04 g	ρττ /ptl Λ Π «a * PIT ΡΠ U ©==8	3.72	g	cn
CH3(CH2)7Br	4.98 g	3.04 g.		2.72	g	O
CH3 (CH2) 1;LBr	3,56 g	3.04 g	OtT / /~tT_T \ Ο—·& Λ 3 2 n N=,/	1.87		ω
CH3(CH2)yBr		3.04 g	ft *^ CH3(CH2X7O-*/ )·			ro
			HO C-CH /

. Alkylbromid

Fönr.al

Gewicht

(CH₂)₃Br 2.74 g

CH₃(CH₂)₄Br 3.02 g

CH₁(CiL)₁-Br 3.3Og CH₃(CH₂)₆Br 3.58 g

CH- (CIU)₇Br 5.79 g CH₃(Cai₂)₁₁Br

7.47 g

Tabelle IV Herstellung von Alkoxyphenylpropansäuren

Gewicht an ^Hydroxyphenylpropan-

3.32 g 3.32 g 3.32 g 3.32 g 4.98 g 4.98 g.

Alkoxyphenylpropansäure

Formel

(CH₂

CH

(CH₂)₅Ο-·( )·-(CH₂)₂-CO₂H 9 ———ν

Gewicht

2.97	8	ι	ro
2.80	8	I	cn O ω
3.53	8
2.90	8
4.65	8
4.01	8

Alkylbrotnid

Tabelle V Herstellung von Alkoxyzimtsäuren

Gewicht an ,

Formel Gewicht p-Hydroxyzimtsäure Alkoxyzimtsäure

Formel

Gewicht

CH₃(CH₂)₅Br 3.30 g

3.23 g CH (CH ) O-e( N-CH=CH-CO H

2.04 g

CH₃(CH₂)_?Br 3.86 g 3.28 g

^e-CH=CH-CO₂H 2.75 g

ft

CH₃(CH₂J₉Br . 4.42 g

3.28 g.

CH₃ (CH₂)₉0-e

^e-CH=CH-CO₂H 1.48 g

cn ο ω to

Tabelle VI Herstellung von Alkoxyphenoxyessigsäuren

Alkylbromid Alkoxyphenoxyessigsäure

Gewicht an

Formel Gewicht 'p-Hydroxyphenoxyessi gsäure Forir.el Gewicht

*—*

/*—*\ CH₃(CII₂)₇Br 3.86 g 2.36 g CH₃(CH₂)_?-O-·^ ^e-OCH₂CO₂H 3.4

CH₃(CH₂)₉Br 4.42g 2.36g CH₃(CH₂)₉"0-·ζ ^e-OCH₂CO₂H 3.8

Tabelle VII Herstellung von Alkoxynicotinsäuren

Alkylbromid	Gewicht	Gewicht an	Aikoxynicotinsäure	Gewicht
Forir.el	3.86 g 4.98 g	6-Hydroxynicotinsäure	Formel ,	3.6 g 2.4 g
CH3(CH2)7Br CH3 (CI^)11Br	2.78 g 2.78 g	CH3(CH2)7-O-®^ /®-CO2H CH, (CH0).. .-CHi/ %-C0oH J 2 11 \ / I

22 5 03 2

Herstellungsbeispiel 27

Die 2,4,5-Trichlorphenylester von Säuren aus der allgemeinen Formel IV unter Einschluß der Alkoxybenzoesäuren und der (Alkylthio)benzoesäuren werden nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt. Aus der folgenden Tabelle VIII geht die Herstellung der 2,4,5-Trichlorphenylester einer Anzahl an Säuren aus der allgemeinen Formel IV unter Einschluß der Alkoxybenzoesäuren gemäß Tabelle I und der (Alkythio)benzoesäuren gemäß Tabelle II hervor. Die in der Tabelle VIII angeführten Verbindungen werden nach dem gleichen allgemeinen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt:

Man löst die jeweilige Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)-benzoesäure .(1 Mol), 2,4,5-Trichlorphenol (1,1 Mol) und N/N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1 Mol) in Methylenchlorid. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser umkristallisiert, Das angefallene Produkt wird unter Vakuum getrocknet.

Tabelle VIII _ Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenylestern

Säure der Formel IV _{Gewicht an 2j4)5}__Tri.

Formel Gewicht (g) chi orphenyl ester (g)

CH (CH ) O-a( N-CO H 6.18 5.32

*—β CH₃(CH₂).0-·^ /·~⁰⁰2^{Π 6}·^{79 1}^⁹³

CH₃(CH₂)_ιχθ-^β\ /®-CO₂H* 3.06 2.20

CH₃ (CH₂) -j^O-V ^e-CO₂H 6.90 5.91

a—® CH₃ (CH₂) ₇S-e^ /0-CO₂H 6. A3 7,98

to®

CH₃ (CH₂) _χι5-\ /-CO₂H 1.8 2.5

CH₃(CH₂)₁₃S-·^ /«-CO₂H 2.3 2,8

* im Handel erhältlich

Tabelle VIII (Forts.) Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenylestern

Säure von Formel IV _{Gewicht &n} 2^

Formel Gewicht (g) chlorphenylester (g)

CH (CH ) -O-e( % 3.75 4.72

O=OCOH

CH-(CH )-0-·( y 4.17 5.7

^Ne=t-CO₂H

CH (CH ),,-Ο-/ Ν 4.59 5.0

^{J l lL} \=_e^CO₂H ClI^(CH )-0-·( ;© 5.01 8.6 - ,

CH₃(CH₂)₇-0-e^ ^e-CH₂CO₂H 2.12 1.91 . ^

CH, (CH₀) ,,-0-·^ N-CH-CO₀H 3.2 . 2.36 °

^{3 2 λ1} \=β ^{2 2} CO

CH₃(CH₂)₇-0-ö^ /^e . ²·^{64 2}·⁸⁶

»==β_χ

CH CO H

S 2

Tabelle VIII (Forts.) Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenylestern

Säure von Formel IV _r . , . „ . _c _

Gewicht an 2,4,5-Tn

Formel Gewicht (g) chlorphenylester (g)

CH„ (CH₀)„-0-ö( \-(CH₉)„-C0„H 2.8

β==β

.©—ο

CH„(CH ) -O-®^ \ 2.0 1.65

^{J X} S-S-CH₂CO₂H

CII₃ (CH₂) ₇-0-·ζ y 1.8 1.73

HO CCH

2 S

3.98

CH (CH ).-0-®( \-(CH_o),-CO„H 2.36 2.82

^{J z} ^ β==β

(CH₂)₅-0-©( /»-(CH₂)₂-CO₂H 3.4 4.11

CH₃(CH₂)₇-0-·\ /•-(CH₂)₂-CO₂H 2.78 . 4.3

CH₃(CH₂)₉-0-β_χ ^e-CH=CH-CO₂H 1.45 0.826

CH-₃ (CH₂) ₆-&-·\ /"-(CH₂) ₂-CO₂H 2.73 2.01

. Tabelle VIII (Forts.) Herstellung von 2,4,5-Trichiorphenylestern Säure von Formel IV

Gewicht an 2,4,5-Tri-

Formel Gewicht (g) chi orphenyl ester (g)

CH-CCH₀),,-0-·^ %-(CH )_o-C0_oH 3.34 4.86

CH₃ (CII₂) g-0-·^ S-CO₂H 2.22 2.6

·; >-(CH_o)_1n-C0_oH 2.65 3.06

N / J. J.U ^

CH-(CH₀) _c-0-e( . >-CH=CHC0_oH 2.0 2.84 >j

3 2 5 %__./ 2 ^d

CH (CH ) -0-/ S-CH=CHCO₀H 2.75 ^/ 3.7

CH„ (CH₀) -O-ef S-O-CH₀CO₀H 2.8 2.7 , _k.

J L I \ / JL JL V^s*)

β Ii ο f^*

CH (CH )Q-C-V S-OCH CO H 3.08 2.4 cn

CH (CH ) -O-·^ %-C0_oH 2.5 2.6 ^ω

β—· f«O

CH₃ (CH₂) J_-1-O-*^ ^e-CO₂H 2.0 2.6

im Handel erhältlich

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Beispiel 1 Herstellung von Derivaten von Ä-30912A

Die folgende Tabelle IX zeigt die Herstellung entsprechender Derivate von A-30912A Kern aus den in Tabelle VIII angegebenen 2,4,5-Trichlorphenylestern. Die in Tabelle IX angeführten Derivate von A-3 0912A Kern werden nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt.

Eine Lösung von A-30912A Kern in Dimethylformamid (DMF) (10 bis 50 rnl) wird mit dem 2,4,5-Trichlorphenylester der jeweiligen Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)benzoesäure (Molverhältnis 1:2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer 100 ml-Silicagelsäule (Woelm, 70 bis 150 ml) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluierinittel chromatographiert. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen, werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zum gewünschten Produkt gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt analysieren:

Bei den Beispielen für die entsprechenden Alkoxyverbindungen und den Beispielen für die C.^-C. . Alkylthioverbindungen löst man die jeweilige Verbindung in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/

- 81 - 2 2 6 0 3 2

Volumen). Die erhaltene Lösung (1 mg/ml) gibt man hierauf in eine Säule aus rostfreienm Stahl (Länge etwa 30 cm, Durchmesser etwa 6,5 mm), die mit C₁₈ Micro-Bondapak-Harz (Waters Associates, Milford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/Volumen) eluiert. Bei den Cg und C₁₀ Alkylthioverbindungen wird als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2, Volumen/Volumen) verwendet. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 105 bar mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von 5 mm/min durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom-UV-Detektor bei 230 nm verfolgt.

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

Tabelle IX

Herstellung von Derivaten von A-30912A Kern der Formel III

von Formel V

.e—·

e-C0-

——θ

O β

»-C0-

.©—

)₁₃°-^β( /0-CO

•—β CH„ (ClI,) S-V /β-CO-

CH (CH ) S-©( )e-C0-β==« _/β—β_χ

CII₃ (CH₂) _lxS-«( )*-CO-

—β

CH (CH ) S-#( S-CO-

Tabelle IX (Forts.)"

A-30912A

HPLC

Ausgegaster Kern (mg) Produkt (mg) M⁺ZNa?"¹" Retention (cm)

·. .β—CH-Cn—CO

430 460 490 514 446 474 500 530 483

400 400 400 400 400 400 400 400 400

103 82 162 159 266 228 293 266 190

1052

1080

1107

0.95

1.55

3.50

1135 6.6

1068 2.45

1096 5.15

1124 2.5

1152 4.1

1083 11.2

Tabelle IX (Forts.)

₅ Ausgangsester A-30912A ₊ _₊ HPLC ;.

R von Formel V (mg) Kern (mg) Produkt(mg) M /Na/ Retention (cm)

CH₃ (CH₂) ₇Q-·^ /β 800 800 920 1052 1.6

CH₃(CH₂)_QO-·^ " ^e 800 800 740 1080 3.4

>„,O-*f % 800 800 .780 1108 8.8

CH₃(Cil₂)₇O-·^ /9-CH₀CO- 444 400 284 1066, 2.2 2

800	800	650	1136	23.7
444	400	284	1066,	2.2
1000	400	178	1123	8.5

CH₃ (CH₂) ₇O-·^ /® ² 886 400 282 1066 1.5 N3

' ⁹TlI₉- η _c _ ' ^⁰

ClI₃ (CH₂)₁₂_O-·^ /· ² 500 400 262 1123 5.2 ⁰^

R" von Formel V

sCO-

,(CH₂)₇0-·

==9

CII₃ (CH₂) ₅0-·( *

< >-(CH) -CO-

Tabelle IX (Forts.)

Ausgangsester A-3C912A _w HPLC

(mg) Kern (mg) Produkt(mg) M⁺/Na/⁺ Retention (cm)

400	230
400	245
400	230

1066

1064

4.4

1024 1.2

2.4

CH₃(CH₂)gO-

a-CH=CH-CO-

_β—O

(CH₂) ₇0-·(^ ^e-CII=CH-CO-

400

400

301

98

1050

1078

3.2

9.5

(CH₂)₇0-β(^

400

260

1082

1.8

(CII₂) ₉0-·(

/Ν—·_Ν CH (CH ) 0-β( S-CO-

400

400

280

352

1110

1053

2.7

1.0

CT) O CO

R von Formel V

(CH₂)

e-CO-

Tabelle IX (Forts.)

Ausgangsester Ä-30912Ä (mg)" Kern(mg)

487

HPLC

₊ _₊ HPLC Produkt (mg) M /Na/' Retention (cm)

270

1109

2.1

(CH₂) ~οζ S-CO-

8=©

800

460

1036

3.6

CH (CH ) -S-®_x Ni-CO-

CH (CH ) 0-ffl( /®-(CH ) -CO-

CH₃(CH₂)₄O-

.θ

CH,(CH ) Ο-β( ^{λ 5}

-CO-

(CII₂) ₆0-

GIL (CH₂)₇Ο-

922 802

831 858

®-(CH₂) ₂-CO- 888 »-(CH₂)₂-CO- 914

145 320 245 303 191 335

1083 1024 1038 1052. 1066 1081

1.0 1.0 1.2 2.6 2.1 1;2

;®-(CH ) -CO- ΙΟ3Ο

360

1136

3.0

* In diesem Fall wird handelsübliches p-(n-0ctyl)benzoylchlorid verwendet, wobei man das Säure •chlorid mit dem Kern in Pyridin bei Raumtemperatur unter Stickstoff über eine Zeitdauer von 24 Stunden umsetzt. '

- 87 - 22 6 03 2

Beispiel 2 Herstellung von Derivaten von A-3 0912B

Die Derivate von A-30912B Kern werden im allgemeinen aus den im Herstellungsbeispiel 27 beschriebenen 2,4,5-Trichlorphenylestern nach folgendem allgemeinen Verfahren .hergestellt.

Eine Lösung von A-30912B Kern in Dimethylformamid (DMF) (10, bis 50 ml) wird mit dem 2,4,5-Trichlorphenylester der jeweiligen Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)benzoesäure (Molverhältnis 1:2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer 100 ml-Silicagelsäule (Woelm, 70 bis 150 ml) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluiermittel chromatographiert. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenen Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zum gewünschten Produkt gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt analysieren:

Bei den Beispielen für die entsprechenden Alkoxyverbindungen und den Beispielen für die C.--C₁₄ Alkylthioverbindungen löst man die jeweilige Verbindung in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/ Volumen). Die erhaltene Lösung (1 mg/ml) gibt man hierauf in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Lange etwa 30 cm, Durch-

22 6 03 2

messer etwa 6,5 mm), die mit C.g Micro-Bondapak-Harz (Waters Associates, Milford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/Volumen) eluiert. Bei den Cn und C₁₀ Alkylthioverbindungen wird als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2, Volumen/Volumen) verwendet. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 105 bar mit einer Fließge-schwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von 5 mm/min durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom-UV-Detektor bei 23 0 nm verfolgt.

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

Unter Befolgung des obigen allgemeinen Verfahrens werden folgende Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gebildet,

12 3 4

worin R und R jeweils H sind, R sowie R jeweils OH be-

5 &

deuten und R folgende Bedeutungen hat:

p_~ (n-Gctylthio) benzoyl p-(n-Decylthio)benzoyl p-(n-Dodecylthio)benzoyl p-(n-T.etradecylthio) benzoyl p_-(n-Octyl) benzoyl* 3-[p-(n-Hexyloxy)phenyl]propanoyl 3-[£-(n-Octyloxy)phenyl]propanoyl 3-[p~(n-Dodecyloxy)phenyl]propanoyl p- (n-H.exyloxy) cinnamoyl p-(n-Octyloxy)cinnamoyl fp- (n-Octyloxy)phenyl]acetyl [ρ-(n-Dodecyloxy)phenyl]acetyl 3-[p~(n-Pentyloxy)phenyl]propanoyl 3-[p-(n-Heptyloxy)phenyl]propanoyl

2 2 6 03 2

ρ- (π-Octyloxy)phenoxyacetyl ρ- (n-Dacyloxy)phenoxyacetyl 6-(n-Octyloxy)nicotindyl 6-(n-Dodecyloxy)nicotinoyl

* Diese Verbindung wird am besten nach -der Säurechlorid- methode hergestellt, indem man beispielsweise p-(n-Octyl) benzoylchlorid mit dem entsprechenden Kern in Pyridin bei * Raumtemperatur unter Stickstoff über-eine Zeitdauer von 24 Stunden umsetzt.

Beispiel 3 Herstellung von Derivaten von A-30912D

Die Derivate von A-30912D Kern vferden im allgemeinen aus den im Herstellungsbeispiel 27 beschriebenen 2,4,5-Trichlorphenyl~ estern nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt.

Eine Lösung von A-30912D Kern in Dimethylformamid (DMF) (10 bis 50 ml) wird mit dem 2,4,5-Trichlorphenylester der jeweiligen Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)benzoesäure (Molverhältnis 1:2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer 100 ml-Silicagelsäule (Woelm, 70 bis 150 ml) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluiermittel chromatographiert. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchroinatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2,

22 6 03 2

Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das .gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zum gewünschten Produkt gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatbgraphie wie folgt analysieren:

Bei den Beispielen für die entsprechenden Alkoxyverbindungen und den Beispielen für die C₁₇-C₁₄ Alkylthioverbindungen löst man die jeweilige Verbindung in einem Lösungsmittelgerrrisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/ Volumen). Die erhaltene Lösung (1 mg/ml) gibt man hierauf in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Länge etwa 30 cm, Durchmesser etwa 6,5 mm), die mit C₁O Micro-Bondapak-Harz (Waters Associates, MiIford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit einem Lösungsmittelsystem aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/Volumen) eluiert. Bei den Cp und C_1n Alkylthioverbindungen wird als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2, Volumen/Volumen) verwendet. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 105 bar mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von 5 mm/min durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom-UV-Detektor bei 23 0 nm verfolgt.

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

Unter Befolgung des obigen allgemeinen Verfahrens werden folgende Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gebildet,

12 3 4 5

worin R , R , R und R immer H sind und R folgende Bedeutungen hat:

22 6 03 2

ρ-(n-Octylthio)benzoyl ρ-(n-Decylthio)benzoyl ρ-(n-Dodecylthio)benzoyl p-(n-Tetradecylthio)benzoyl p-(n-Octy1)benzoyl* 3- [p- (n-H.exyloxy) phenyl]propanoyl 3-[p-(n-Octyloxy)phenyl]propanoyl 3-[p-(n-Dodecyloxy)phenyl]propanoyl p- (n-Hexyloxy) cinnamoyl p-(n-Octyloxy)cinnamoyl [p-(n-Octyloxy)phenyl]acetyl tp-(n-Dodecyloxy)phenyl]acetyl 3- [p- (n-Pentyloxy)phenyl]propanoyl 3- [p_- (n-Heptyloxy) phenyl] prcpanoyl p-(n-Octyloxy)phenoxyacetyl p- (n_-Decyloxy) phenoxyacetyl 6-(n-Octyloxy)nicotinoyl 6-r (n-Dodecyloxy) nicotinoyl

* Diese Verbindung wird am besten nach der Säurechloridmethode hergestellt, indem man beispielsweise p-(n-Octyl)-benzoylchlorid mit dem entsprechenden Kern in Pyridin bei Raumtemperatur unter Stickstoff über eine Zeitdauer von Stunden umsetzt.

Beispiel Herstellung von Derivaten von A-30912H

Die Derivate von A-30912H Kern oder die Alkyloxyhomologen hiervon werden im allgemeinen aus den im Herstellungsbeispiel 27 beschriebenen 2,4,5-Trichlorphenylestern nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt.

- ⁹² - 226032

Eine Lösung von A-30912H Kern in Dimethylformamid (DMF) (10 bis 50 ml) wird mit dem 2,4,5-Trichlorphenylester der jeweiligen Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)benzoesäure (Molverhältnis 1:2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand wird in einem Gemisch-aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer 100 ml-Silicagelsäule (Woelm, 70 bis 150 ml) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluiermittel chromatographiert. Die^ einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zum gewünschten Produkt gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt analysierent,

Bei den Beispielen für die entsprechenden Azoxyverbindungen und den Beispielen für die C₁2~^C14 ^Alkylthioverbindungen löst man die jeweilige Verbindung in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/ Volumen). Die erhaltene Lösung (1 mg/ml) gibt, man hierauf in eine Säule aus rostfreiem Stahl (Länge etwa 30 cm, Durchmesser etwa 6,5 mm), die mit C₁₈ Micro-Bondapak-Harz (Waters Associates, MiIford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit.einem Lösungsmittelsysten aus.Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/Volumen) eluiert. Bei den C„ und C₁₀ Alkylthioverbindungen wird als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2, Volumen/Volumen) verwendet. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 105 bar mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von.5 mm/miri durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom~UV-Detektor bei 230 nm. verfolgt.

- 93 - 2 2 6 0 3 2

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

.Unter Befolgung des obigen allgemeinen Verfahrens werden folgende Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gebildet,

2 "3

worin R und R jeweils OH sind, R für H steht, R für C.-Cg Alkyloxy steht und R folgende Bedeutungen hat:

p-(n-Octylthio)benzoyl p-(n-Decylthio)benzoyl p-(n-Dodecylthio)benzoyl p-(n-Tetradecylthio)benzoyl p-(n-Octyl)benzoyl* 3·* [p- (n_-Hexyloxy) phenyl] propanoyl 3-[p-(n-Octyloxy)phenyl]propanoyl 3-[p-(n-Codecyloxy)phenyl]propanoyl p_- (n-Hexyloxy) cinnamoyl p-(n-Octyloxy)cinnamoyl [p- (n-Octyloxy)phenyl]acstyl [p- (n_-Podecyloxy) phenyl] acetyl 3-[ρ-(n-Pentyloxy)phenyl]propanoyl 3-[ρ-(n-Heptyloxy)phenyl]propanoyl ρ-(n-Octyloxy)phenoxyacetyl ρ- (ri-Decyloxy)phenoxyacetyl 6-(n-Octyloxy)nicotinoyl 6-(n-Dodecyloxy)nicotinoyl

* Diese Verbindung wird am besten nach der Säurechloridmethode hergestellt, indem man beispielsweise p-(n-Ocytl)-benzoylchlorid mit dem entsprechenden Kern in Pyridin bei Raumtemperatur unter Stickstoff über eine Zeitdauer von 24 Stunden umsetzt.

- 94 - 2 2 6 0 3 2

Beispiel 5 Herstellung von Derivaten von S31794/F-1

Die Derivate von S31794/F-1 Kern werden im allgemeinen aus den im Herstellungsbeispiel 27 beschriebenen 2,4,5-Trichlorphenylestern nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt.

Eine Lösung von S3179 4/F-1 Kern in Dimethylformamid (DMF) (10 bis 50 ml) wird mit dem 2,4,5-Trichlorphenylester der jeweiligen Alkoxybenzoesäure oder (Alkylthio)benzoesäure (Molverhältnis 1:2) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 18 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird jeweils zweimal mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der Rückstand, wird in einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol {3:2, Volumen/Volumen) gelöst und die Lösung mit einer 100 ml-Silicagelsäule (Woelm,70 bis 150 ml) unter Verwendung des obigen Lösungsmittelsystems als Eluiermittel chromatographiert. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch über Silicagel (Merck) unter Anwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem verfolgt.. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zum gewünschten Produkt gelangt. Dieses Produkt läßt sich durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt analysierent

Die jeweilige Verbindung wird in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/Volumen) gelöst. Die erhaltene Lösung (1mg/r;.'; gibt man hierauf in eine Säure aus rostfreiem Stahl {Lange etwa 30 cm, Durch

- 95 - 22 6 03 2

messer etwa 5,6 mm), die mit C₁ „ Micro-Bondapak-Harz (Waters Associates, MiIford, Mass.) gefüllt ist, wobei man diese Säule mit einem Lösungsmittelsystem, beispielsweise einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Acetonitril (1:2:2, Volumen/ Volumen) oder aus Wasser, Methanol und Acetonitril (2:1:2, Volumen/Volumen) eluiert. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 105 bar mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min unter Verwendung einer Waters-6 00A-Pumpe (Waters Associates, Inc.) und Anwendung einer Kartengeschwindigkeit von 5 mm/min durchgeführt. Das Eluiermittel wird mit einem Varian Vari-Chrom-UV-Detektor bei 23 0 rim verfolgt.

Die Produkte lassen sich ferner auch durch sogenannte Felddesorptionsmassenspektrometrie (FDMS) analysieren.

Unter Befolgung des obigen allgemeinen Verfahrens werden folgende Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gebildet,

worin R¹, R und R jeweils OH sind, R für -CO-NH₀ steht

und R folgende Bedeutungen hat:

p- (n-Octylthio)benzoyl

p-(n-^Decylthio)benzoyl

p- (n_-^Dodecylthio) benzoyl

p_- (n-^Tetradecylthio) benzoyl

p-(n-Octyl)benzoyl*

3-[p-(n-Eexyloxy)phenyl]propanoyl

3-[p-(n-Octyloxy)phenyl]propanoyl

3-[p-(n-Dodecyloxy)phenyl]propanoyl

p-(n-Hexyloxy)cinnamoyl

p-(n-Octyloxy)cinnamoyl

[p_- (n-Octyloxy) phenyl] acetyl

[ρ-(η-Dodecyloxy)phenyl]acetyl

3-[ρ-(η-Pentyloxy)phenyl]propanoyl

3- [p- (n_-Kep ty loxy) phenyl] propanoyl

ρ-(n-Cctyloxy)phenoxyacety1 ρ-(n-Decyloxy)phenoxyacety1 6-(n-Octyloxy)nicotinoyl 6-(n-Codecyloxy)nicotinoyl

22 6 03 2

* Diese Verbindung wird am besten nach der Säurechloridmethode hergestellt, indem man beispielsweise p-(n-Octyl)-benzoylchlorid mit dem entsprechenden Kern in Pyridin bei Raumtemperatur unter Stickstoff über eine Zeitdauer von 24 Stunden umsetzt.

Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung von Verbindungen aus der allgemeinen Formel III. Die nach den im folgenden näher beschriebenen Verfahren hergestellten Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel III, worin

R für p-(n-Octyloxy)benzoyl steht.

Herstellungsbe'i spiel. 28 Herstellung von p-(n-Ocytloxy)benzoesäure

Eine Lösung von p-Hydroxybenzoesäure (19,2 g, 150 mMol) in 10%igem wässrigem Natriumhydroxid (120 ml) wird zu vorher auf 80⁰C erhitztem Dimethylsulfoxid (480 ml) gegeben„ Die Lösung wird hierauf tropfenweise mit n-Octylbromid (23,95 g,150 mMol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann in Eiswasser (1200 ml) gegossen.- Nach Zusatz von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (30 ml) läßt man das erhaltene Gemisch bis zur vollständigen Ausfällung stehen. Der angefallene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und aus einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser umkristallisier.t. F. = 97 bis 99°C.

22 6 032

Analyse für C₁₅H₃₂O₃:

berechnet: C 71,97, H 8,86 gefunden: C 71,72, H 9,10.

Herstellungsbeispiel 29

Herstellung des 2,4,5-Trichlorpheny!esters von p-(n-Octyloxy)benzoesäure

Wan löst p-(n-Octyloxy)benzoesäure (6,18 g, 24,7 mMol), 2,4,5-Trichlorphenol (5,39 g, 27,2 mMol) und N/N'-Dicyclohexylcarbodiimid (4,94 g, 24,7 mMol) 'in Methylenchlorid (200 ml). Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird zu einem öl eingedampft, welches man aus einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser umkristallisiert. Auf diese Weise gelangt man zum 2,4,5-Trichlorphenylester von p-(n-Octyloxy)benzoesäure.

NMR Analyse: S.= 4,02 (2H, t, J = 3Hz), έ>=7,0 (1H, d,

J = 4Hz), 7,23 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, J = 4Hz). .

Beispiele Acylierung von A-30912A Kern

Den A-30912A Kern (14,2 g, 17,8 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von p-(n-Ocytloxy)benzoesäure (15,32 g, 35,7 mMol) löst man in Dimethylformamid (150 ml). Die Lösung wird 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt, und der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Die Wäschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird -in einem Gemisch aus 25 % Ethylacetat und 75 % Methanol (80 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-Hochleistungs-

22 6 03 2

flüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., MiIford, Mass.) unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird stufenweise mit einem Lösungsmittelsystem aus 20 bis 40 % Methanol und Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel (Merck) und eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volmuen) analysiert. Diejenigen Fraktionen, die keinen A-30912A Kern enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum p-(n-Octyloxy)-benzoylderivat von A-30912A Kern gelangt. Die Ausbeute beträgt 7,13 g. M⁺ + 23 = 1052 (durch FDMS).

Beispiel 9 Acylierung von A-30912B Kern

Man löst A-309.12B Kern (17,8 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von p-(n-Octyloxy)benzoesäure (35,7 mMol) in Dimethylformamid (150 ml). Die Lösung wird 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt, und der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird -in einem Gemisch aus 2 5 % Ethylacetat und 75 % Methanol (80 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird stufenweise mit einem Lösungsmittelsystem aus 20 bis 40 % Methanol und Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel (Merck) und eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) analysiert. Die-

22 6 03 2

jenigen Fraktionen, die keinen A-30912B Kern enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum p-(n-Ocytloxy)-benzoylderivat von A-30912B Kern gelangt.

Beis.piel 10

Das im Beispiel 9 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines entsprechenden Alkylbromids, einer entsprechenden p-(Alkyloxy)benzoesäure und eines entsprechenden p- (Alkyloxy)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters wiederholt, wodurch man zu folgenden Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gelangt:

" R⁵

p-(n-Decyloxy)benzoyl p-(n-Dodecyloxy)benzoyl p- (n-Tetradecyloxy)benzoyl p- (n-Hexyloxy)benzoyl

Beispiel 11 Acylierung von A-3 0912D Kern

Man löst. A-30912D Kern (17,8 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von p-(n-Octyloxy)benzoesäure (35,7 mMol) in Diethylformamid (150 ml). Die Lösung wird 16 bis 20. Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter . Vakuum entfernt, und der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in einem Gemisch aus 2 5 % Ethylacetat und 75 % Metanol (80 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeistchromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Ine, Milford, Mass.) unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase gereinigt. Die

22 6 03 2

•Säure wird stufenweise mit einem Lösungsmittelsystem aus 20 bis 40 % Methanol und Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel (Merck) und eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) analysiert. Diejenigen Fraktionen, die keinen A-30912D Kern enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum p-(n-Octyloxy)~ benzoylderivat von A-30912D Kern gelangt.-

Beispiel 12

Das im Beispiel 11 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines entsprechenden Alkylbromids, einer entsprechenden p-(Alkyloxy)benzoesäure und eines entsprechenden p- (Alkyloxy)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters wiederholt, wodurch man zu folgenden Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gelangt:

_: R⁵

p-(n-Decyloxy)benzoyl p- (n-Dodecyloxy)benzoyl p-(n-Tetradecyloxy)benzoyl p- (n-Hexyloxy)benzoyl

Beispiel 13 Acylierung von A-30912H Kern

Man löst A-30912H Kern (17,8 mMol) und den 2,4,5-Trichlorphenylester von p-(n-Octyloxy)benzoesäure (35,7 mMol) in Dimethylformamid (150 ml). Die Lösung wird 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt, und der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether und zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in einem Gemisch aus 25 % Ethylacetat und 75 % Methanol (80 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeistchromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc.. MiIford. Mass.)

22 6 03 2

Verwendung von Silicagel als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird stufenweise mit einem Lösungsmittelsystem aus 20 bis 40 % Methanol und Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel (Merck) und eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) analysiert. Diejenigen Fraktionen, die keinen A-3 0912H Kern enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum p-(n-Octyloxy)-benzoylderivat von A-30912H Kern gelangt.

Beispiel 14

Das in Beispiel 13 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines entsprechenden Alkylbromids, einer entsprechenden p-(Alkyloxy)benzoesäure und eines entsprechenden p- (Alkyloxy)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters wiederholt, wodurch man zu folgenden Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gelangt:

R⁵

p- (n-Decyloxy)benzoyl p- (n-Dodecyloxy)benzoyl p- (n-Tetradecyloxy)benzoyl p-(n-Hexyloxy)benzoyl

Beispiel15

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung des p-(n-Octyloxy) benzoylderivats von A-30912H Kern aus A-30912A Kern.

Der A-30912A Kern wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit 2,4,5-Trichlorphenyl-p-(n-octyloxy)benzoat behandelt. Das hierdurch erhaltene Derivat methyliert man dann durch Behandlung einer Probe hiervon (20 mg) mit

- 102 - 22 6 03 2

3 % HCl-Methanol (0,06 ml) in Dimethylformamid (1 ml). Die Lösung wird 16 Stunden gerührt, und durch anschließendes Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck gelangt man zu einem Rückstand. Der Rückstand wird durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Silicagel/C. „-Harz gereinigt.

Beispiel 16 Acylierung von S31794/F-1 Kern

Man löst S31794/F-1 Kern (17,8 mMol) und den 2,4 , 5-Trich1orphenylester von p-(n-Octyloxy)benzoesäure (35,7 mMol) in Dimethylformamid (150 ml). Die Lösung wird 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt, und. der dabei erhaltene Rückstand wird zweimal mit Diethylether und zweimal mit Methylenchlorid gev/aschen. Die Waschflüssigkeiten werden verworfen. Der gewaschene Rückstand wird in einem Gemisch aus 25 % Ethylacetat und 75 % Methanol (80 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mittels einer Prep LC/System 500 Einheit (Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) unter Verwendung von Silicagel als stationäre Phase gereinigt. Die Säule wird stufenweise mit einem Lösungsmittelsystem aus 20 bis 40 % Methanol und Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Silicagel (Merck) und eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) analysiert. Diejenigen Fraktionen, die keinen S31794/F-1 Kern enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man zum p- (n-Octyloxy)-benzoylderivat von S31794/F-1 Kern gelangt.

- ¹⁰³ - 22 6 03 2

Beispiel 17

Das im Beispiel 16 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines entsprechenden Alkylbromids, einer entsprechenden p-(Alkyloxy(benzoesäure und eines entsprechenden p-(Alkyloxy)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters wiederholt, wodurch man zu folgenden Verbindungen aus der allgemeinen Formel III gelangt:

R⁵

p-(n-Decyloxy)benzoyl p-(n-Dodecyloxy)benzoyl p-(n-Tetradecyloxy)benzoyl p-(n-Hexybxy)benzoyl

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung von Verbindungen aus der allgemeinen Formel III, worin A Sulfonyl oder Sulfinyl ist.

Herstellungsbeispi_tel 30

Herstellung von p-(Alkylsulfonyl)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-p-(n-decylthio)benzoat (970 mg, 2 mMol) in Methylenchlorid (20 ml) wird unter Kühlen in einem Eisbad mit m-Chlorperbenzoesäure (442 mg, 2,0 mMol) versetzt. Man läßt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur kommen (15 Minuten) und wäscht es dann mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung (25 ml). Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das dabei erhaltene Produkt wird aus Acetonitril umkristallisiert, wodurch- man. zu 4 70 mg Material gelangt. Dieses Material wird nach dem oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung von m-Chlorperbenzoesäure (108 mg) in Methylenchlorid (20 ml) über eine Zeitdauer von 50 Minuten erneut oxidiert. Durch

22 6 03 2

Reinigung des dabei angefallenen Produkts in der oben beschriebenen Weise gelangt man zu 260 mg des gewünschten Esters.

Analyse für C₃₃H -O₄Cl₃S:

berechnet: C 54,61 I, H 5,38 I gefunden: C 54,90 %, H 5,45 %.

In -der oben beschriebenen Weise werden auch folgende weitere p-(Alkylsulfonyl)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester hergestellt

p-Alkylsulfonyl- Gewicht an Gewicht an Gewicht an

benzoesäure-2,4,5- verwendetem Oxidations- · Produkt trichlorphenyl- Ester mittel

ester (mg) (mg) (mg)

n-Octyl	850	451	68,8
n-Dodecyl	1260	686	400
n-Tetradecyl	1150	651	400

Beispiel 18: Acylierung von A-30912A Kern

Man stellt eine Lösung von A-3 0912A Kern (4 0 0 mg, 0,5 mMol) und p- (n-Decylsulf onyl) benzoesäure-2 , 4 , 5-trichlorphenyle'ster (260 mg, 0,514 mMol) in Dimethylformamid (50 ml) her und rührt diese Lösung 18 Stunden bei Raumtemperatur. Sodann wird das Reaktionsgemisch unter Vakuum zur Trockne eingedampft und der erhaltene Rückstand zweimal mit Diethylether und Methylerichlorid extrahiert. Der .Rückstand wird in einer minimalen Menge eines Gemisches aus Ethylace.tat und Methanol (3:2, Volumen/Volumen) gelöst, worauf man die Lösung auf eine Silicagelsäule (50 ml) gibt und mit dem gleichen Lösungsiaittelgemisch eluiert. Der Verlauf der Chromatographie wi^:rd

22 6 03 2

dünnschichtchromatographisch auf Silicagel (Merck) unter Verwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und Methanol (3:2) als Lösungsmittelsystem verfolgt. Die das gewünschte Produkt (R_f = 0,6) enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, zur Trockne eingedampft und lyophilisiert. Auf diese Weise erhält man das gewünschte p-(n-Decylsulfonyl)benzoylderivat von A-30912A Kern in einer Menge von 415 mg. Eine Feiddesorptionsmassenspektralanalyse ergibt einen Wert (M +23) von 1128. Durch analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigt sich, daß das Produkt aus einer einzigen Komponente besteht.

Nach obigem Verfahren werden folgende weitere p-(Alkylsulfonyl)benzoy!derivate von A-30912A Kern hergestellt:

Gewicht an Gewicht an Gewicht an

p-Alkylsulfonyl- verwendetem verwendetem Produkt ₊ _₊ benzoylderivate Kern (mg) Ester (mg) (mg) M /Na/

n-Octyl 400 69 83

n-Dodecyl 400 267 335 1156

n-Tetradecyl 400 281 322 1184

- 107 - 226 03 2

Herstellungsbeispiel 31

Herstellung von p-(Alkylsulfinyl)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester

Eine Lösung von 2,4,5-Trichlorphenyl-p-(n-octylthio)benzoat (2,23 g, 5 mMol) in Methylenchlorid (50 ml) wird unter Kühlen in einem Eisbad tropfenweise mit einer Lösung von m-Chlorperbenzoesäure (1,39 g, 8 mMol) in 50 ml Methylenchlorid versetzt. Die Lösung wird zuerst etwa 2 Stunden bei 5°C und dann etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird hierauf mit 2 bis 3 Tropfen einer 20%igen Natriumsulfitlösung versetzt, und dann einmal mit 10%iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einem Gemisch aus Diethylether und Petrolether (1:4) umkristallisiert, wodurch man zu 1,7 g eines Produkts gelangt, bei dem es sich um ein Gemisch aus den SuIfinyl- und den Sulfonylverbindungen handelt.

Beispiel19 Acylierung von A-30912A Kern

Nach dem in Beispiel 18 beschriebenen Verfahren wird eine Lösung von A-30912A Kern (800 mg, ImMoI) in Dimethylformamid (25 ml) mit dem gemäß Herstellungsbeispiel 32 erhaltenen Produkt (922 mg, 2 mMol) umgesetzt, wodurch man zu 952 mg eines Mischprodukts gelangt. Dieses Produkt wird über Silicagel (100 g, Korngröße 0,08 bis 0,15 mm) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Methanol (3:2) chromatographiert. Die ersten aus der Säule kommenden Fraktionen (554 mg) werden wieder über Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat und Zusatz steigender .Mengen an Methanol als

22 6 03 2

Eluiermittel chromatographiert. Die anfallenden Fraktionen werden auf Basis der Ergebnisse einer dünnschichtchromatographischen Analyse vereinigt. Durch entsprechende Elution gelangt man zum p-(n-Octylsulfonyl)benzoylderivat von A-30912A Kern (58 mg) , und zum ρ-(n-Octylsu]finyl) benzoylderivat von A-30912A Kern in einer gesamten Produktmenge von 145 mg.

Beispiel 20 Acylierung von A-30912B Kern

Der A-30912B Kern wird wie im Beispiel 18 beschrieben unter Verwendung des entsprechenden Alkylsulfonylbenzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters acyliert. Auf diese Weise gelangt man zu p-(Alkylsulfonyl)benzoylderivaten von A-30912B Kern aus der allgemeinen Formel III, worin R für p- (n-Octylsulfonyl)-benzoyl, p-(n-Decylsulfonyl)benzoyl, p-(n-Dodecylsulfonyl)~ benzoyl und p-(n-Tetradecylsulfonyl)benzoyl steht.

Bedeutet A SuIfinyl, dann werden die obigen Reaktionsbedingungen etwas modifiziert. Führt die Umsetzung zu einem Produktgemisch, nämlich sowohl zu Sulfinyl- als auch zu SuIfony!verbindungen, dann läßt sich die gewünschte SuIfinyl-Verbindung durch chromatographische Aufarbeitung des jeweiligen Produktgemisches erhalten. Ein Beispiel für ein solches Produkt ist die Verbindung aus der allgemeinen Formel III, worin R für p-(n-Octylsulfinyl)benzoyl steht.

Beispiel 21-

Acylierung von A-3 0912D Kern- .

Der A-30912D Kern wird wie im Beispiel 18 beschrieben unter Verwendung des entsprechenden Alkylsulfonylbenzoesäure-2,4,5-trichlörphenylesters acyliert» Auf diese VJeise gelangt man

2 2 6 0 3 2

zu ρ-(Alkylsulfonyl)benzoylderivaten von A-30912D Kern aus der allgemeinen Formel III, worin R für p-(n-Octylsulfonyl)-benzoyl, p-(n-Decylsulfonyl)benzoyl, p-(n-Dodecylsulfonyl)-benzoyl und p- (n-Tetradecylsulfonyl)benzoyl steht.

Bedeutet A SuIfinyl, dann werden die obigen Reaktionsbedingungen etwas modifiziert. Führt die Umsetzung zu einem Produktgemisch, nämlich sowohl zu SuIfinyl- als auch zu SuIfony!verbindungen, dann läßt sich die gewünschte SuIfinylverbindung durch chromatographische Aufarbeitung des jeweiligen Produktgemisches erhalten. Ein Beispiel für ein solches Produkt ist die Verbindung aus der allgemeinen Formel III, worin R für p-(n-Octylsulfinyl)benzoyl steht.

Beispiel 22 Acylierung von A-30912H Kern

Der A-30912H Kern wird wie im Beispiel 18 beschrieben unter Verwendung des entsprechenden Alkylsulfonylbenzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters acyliert. Auf diese Weise gelangt man zu p-(Alkylsulfonyl)benzoylderivaten von A-30912H Kern aus der allgemeinen Formel III, worin R für p-(n-Octylsulfonyl)-benzoyl, p-(n-Decylsulfonyl)benzoyl, p-(n-Dodecylsulfonyl)~ benzoyl und p-(n-Tetradecylsulfonyl)benzoyl steht.

Bedeutet A SuIfinyl, dann werden die obigen Reaktionsbedingungen etwas modifiziert. Führt die Umsetzung zu einem Produktgemisch, nämlich sowohl zu SuIfinyl- als auch zu SuIfony!verbindungen, dann läßt sich die gewünschte SuIfinylverbindung durch chromatographische Aufarbeitung des jeweiligen Produktgemisches erhalten. Ein Beispiel für ein solches Produkt ist die Verbindung aus der allgemeinen Formel III, worin

5 3

R für p-(n-Octylsulfinyl)benzoyl steht und R Methoxy bedeutet,

- no - 22 6 03 2

Beispiel 23

Herstellung von S31794/F-1 Kern

Der S31794/F-1 Kern wird wie im Beispiel 18 beschrieben unter Verwendung des entsprechenden Alkylsulfonylbenzoesäure-2,4,5-trichlorphenylesters acyliert. Auf diese Weise gelangt man zu p-(Alkylsulfonyl)benzoylderivaten von S31794/F-1 Kern aus der allgemeinen Formel III, worin R für p-(n-Octylsulfonyl)-benzoyl, p- (n-Decylsulfonyl)benzoyl, p- (n-Dodecylsulfonyl)-benzoyl und p- (n-Tetradecylsulfonyl)benzoyl steht.

Bedeutet A SuIfinyl, dann werden die obigen Reaktionsbedingungen etwas modifiziert. Führt, die Umsetzung zu einem Produktgemisch, nämlich sowohl zu SuIfinyl- als auch zu SuIfony!verbindungen, dann läßt sich die gewünschte SuIfinylverbindung durch chromatographische Aufarbeitung des jeweiligen Produktgemisches erhalten. Ein Beispiel für ein solches Produkt ist die Verbindung aus der allgemeinen Formel III, worin R für p- (n-Octylsulfinyl)benzoyl steht.

Beispiel 24

Die antifungale Wirksamkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel III läßt sich durch übliche. Scheiben-Diffusionstests und Agar-Verdünnungstests in vitro sowie durch üblicher .Untersuchungen an Mäusen in vivo ermitteln, die auf eine systemische Pilzinfektion ansprechen. Die hierbei für typische Verbindungen aus der allgemeinen Formel III (Beispiele 3 und 4) erhaltenen Ergebnisse gehen aus den später folgenden Tabellen X, XI, XII und XIII hervor.

Die Tabellen X und XI zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen von Verbindungen der Beispiele 3 und 4 in vitro durch die

22 6 03 2

sogenannte Agar-Scheibendiffusionsmethode. In Tabelle X ist die' ermittelte Wirksamkeit durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten Hemmzone des Mikroorganismus angegeben, die von der jeweils untersuchten Verbindung gebildet wird. In Tabelle XI ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz ^g pro Scheibe) angeführt, die zur Hemmung des Wachstums des jeweiligen Testorganismus erforderlich ist. Aus Tabelle XII gehen die Ergebnisse der Untersuchung des p-(n-Octyloxy)benzoylderivats von A-30912A Kern (Formel III/ worin R für p- (n-'Octyloxy)benzoyl steht) in vitro gegenüber fünf Stämmen von Candida albicans durch die Agar-Verdünnungsmethode hervor. In Tabelle XII ist die Wirksamkeit durch die minimale Hemmkonzentration (MIC) der Substanz (μg/ml) angegeben, die für eine Hemmung des jeweiligen Testorganismus erforderlich ist.

Aus Tabelle XIII gehen die Ergebnisse entsprechender in-vivo-Untersuchungen zur Ermittlung der Wirksamkeit der Verbindungen der Beispiele 1 und 18 gegenüber einer durch Candida albicans A-26 an Mäusen verursachten Infektion hervor, wobei die Wirksamkeit in Form der EDj-«-Werte angegeben ist, worunter die Dosis in mg/kg verstanden wird, die zur Heilung von 50 % der Versuchstiere benötigt wird. In Tabelle XIII sind ferner auch Werte für die geringste Wirkstoffdosis angegeben, bei der sich eine signifikante antifurigale Wirksamkeit beobachten läßt. Für diese Untersuchungen werden Gruppen aus männlichen weißen Mäusen (die pathogen frei sind) mit einem Gewicht von 18 bis 20 g verwendet, welche man intravenös mit Candida albicans A-26 infiziert. Die Tiere werden 24 Stunden vor der Infizierung über eine Zeitdauer von 8 Minuten mit Röntgenstrahlen in einer Dosis von etwa 50 Röntgen pro Minute (Gesamtdosis 400 Röntgen) behandelt, um auf diese Weise eine Immunreaktion gegenüber dem infizierenden Mikroorganismus herabzusetzen. Jeweils 0, 4 und 24 Stunden nach erfolgter Infektion gibt man jeder Gruppe an Mäusen subcutan abgestufte

- 112 - 22 6 03 2

Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung in Form einer Suspension in 33 % Polyethylenglykol-Wasser. Man ermittelt den Tag, an dem die jeweiligen Tiere verendet sind. Nach dem sogenannten Student-T-Test bestimmt man durch Vergleich des jeweiligen mittleren Todestages zwischen jeder Gruppe an infizierten behandelten Mäusen bei der jeweiligen Dosierungshöhe und an 10 infizierten unbehandelten Tieren, ob es durch die jeweilige Behandlung zu einer wesentlichen Verlängerung der Überlebenszeit gekommen ist.

Aus der später folgenden Tabelle XIV gehen die Ergebnisse der Bestimmung der Absorption der Verbindungen der Beispiele 1 und 18 nach oraler Verabreichung hervor. Hierzu gibt man Mäusen über eine Magensonde eine Dosis von 416 mg/kg des jeweiligen Wirkstoffes, der in 33 % Polyethylenglykol-400-Wasser suspendiert ist. In bestimmten Zeitabständen werden vom Orbitalsinus Blutproben entnommen und in folgender Weise bezüglich einer antibiotischen Wirksamkeit ausgewertet.

Eine 7 mm große Scheibe, die 20 μΐ Gesamtblut enthält, wird auf Agar gelegt, der mit Aspergillus montevidensis A35137 angeimpft ist. Nach 40-stündiger Inkubation bei 30⁰C vergleicht man die Hemmzonen der Blutproben mit einem aus dem jeweiligen Wirkstoff erhaltenen Standard und ermittelt die in den Blutproben enthaltenen Wirkstoff mengen,,

Tabelle X

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusigastest Verbindung - Größe der Hemmzone (nimr '

5 , Saccharomyces . Neurospora Trichophyton Candida

R ,von Formel V pastoranius X-52 crassa 846 menLagraphytes A-23 albicans A-26

(CH₉) O-e^ N-CO- 18 23* — 28

CH₃( CH₂ )₁₁O-\ /»-CO- 13 — -- 18

CH (CH ) Ο-·( N-CO- 13 .24* — 19

^{4 z Vä} \==9 . -

_/e—β_χ

CH₃(CH₂)₁₃S-·^ ^e-CO- 20 15 19* 19

/·—V CH₀ (CH₀ )„SO«-*C N-CO- · 16 31 32 55

^{J l y l} \—β

CH₃ (CH₂) _nS0₂-·^ N-CO- — 37 26 . 48

• β

CII₃ (CH₂) ₁₃S0₂-*( ^ )e-CO- 23 29 , 23 . 30

Die Verbindungen werden in Form einer Suspension in Methanol untersucht. Die Verbindungen werden .in,einer Konzentration von 1 mg/ml untersucht, indem man eine 7 mm große Scheibe in die Suspension taucht und diese Scheibe dann auf die Agar-Oberflache gibt

* Inkubation: 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37°C

Meßbare Hemmzone., bei der der Organismus um die Scheibe herumgewachsen ist.

Tabelle XI

Antif-ungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusionstest Verbindung ' Minimale Hemmkonzentration (^g/Scheibe)*

R von Formel V

Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

CH₃(CH₂)₇Ö-·^ /S-CO- 0.156 <0.039

©—β CH., (CH )gO-<^ /»-CO- 0.156 <0.078

CH (CH ) 0-e( S-CO- 2.5 <0.039 '

ζ®—®_χ.; . .

CH (CH ) 0-β( S-CO- 0.625 . <O.O78

CH (CH₂)_?S-®^ /β-CO- . 0.312 <0.039

©=a ®—s

0Η_ο(ΰΗ_ο)_η8-β^ S-CO- 0.156 0,039

^{3 2 9} \=V·

Tabelle XI (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusionstest Verbindung Minimale Hemmkonzentration (pg/Scheibe)*

R von Formel V

CH₃ (CH₂)

up ₁₃ ^s-<]_==e>-^co-

CH₃(CH₂)₇SO₂-»( /«-CO-

CH (CH ) SO -·( \»-CO-

CH₃ (CH₂)

(CH₂)₁₃SO₂-·^

Λ β

CH (CH ) 0-*( )·

Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Nr.6

2.5 20.0 20

2.5

0.625

0.625 10

IO CD O CO ND

Verbindung Γ

RJ von Formel V

CH3(CH2)9O-*( ^

©—§ CH3(CH2) τ,Ο-©^

CH3 (CH2) O-< ©==e

CH3 (CH2) 5O-< ^

/ I

I

>-co-

Tabelle XI (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusionstest

Minimale Hemmkonzentration (yg/Scheibe)*

Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes^^r·" 2.5 >40

2.5 >40

2.5 0.312 -

CH₃ (CII₂) ₇ (SO)-®^ ^s-CO- 5 1.25

®——Q _/e—©_x

CH₀ (CH₀),-·ί V-CO- 0.625 0.156

^{3 2 7} \=t^/

(CH₂)^0-»( )«-(CH₂)₂-CO- 20 -1,25

σ ωto

Tabelle XI (Forts.)

Antifungale Wirksamkeit im Agar-Scheiben&iffusionstest Verbindung ' Minimale Herninkonzentration (pg/Scheibe)*

R von Formel V Candida albicans A-26 Trychophyton mentagrophytes Mr.6

^ ~y₂-CO- 0.625 0.156

.·—·

CH₃(CH₂)₇O-<^ ^*-(CH₂)₂-CO- 0.078 0.156

CH₃ (ClI₂) _uO-<^ /·-(CH₂) ₂-CO- 0.312 0.156

CH3(CH₂) -·ζ )e-(CH ) -CO- 1.25 40 -

CH₃ (CH₂) 5°~·\ ^-CH=CH-CO- 1.25 0.156

_/·—β_χ CH (CH ) Ο-·( ^e-CH=CII-CO- 0.156 0.156 ^

f—^CH CO- · _OT

CH.(CH_)₇0-·; > ^Δ 5 80

^{J l} ' \=« O

Tabelle XI (Forts.)

Anti fungale Wirksamkeit im Agar-Scheibendiffusionstest Verbind η Minimale Hemmkonzentration (yg/Scheibe)¹

R von Formel V Candida albicans A-26 Trvchophyton mentagrophytes Nr.6

CH₃(GH₂)_1χΟ-®^ ^e-CH₂CO- 0.312 0.625

a=®

CH₃ (CH₂) ₄0-®(^ ^9-(CH₂)₂-CO-T 5 0.156

CH (CH₉),Ο-®( /9-(CH₉) -CO- 0.625 0.156

^{J l} ° · β=β ^Ζ ι

CH (CH ) Ο-©( N-O-CH-CO- 0.312 80 . . 5ο

CII (CH₉) 0-»( /Q-O-CH CO- 0.156 <0,156

^{ό 1}^ β==β . ^

CH₃(CH₂) (>-·(_ )®-CO- 80 2.5 . J₀

(^a) Die Verbindun9sn sind in 0,01-molarer Natriumboratlösung suspendiert, die einen pH- O

Wert von 7,5 hat. Die Verbindungen v/erden in einer Menge von 20 ug/Scheibe als (^

höchster Konzentration und unter Zweifachverdünnung bis zum Erreichen der je- .

weil igen Endpunkte untersucht. Inkubation: 24 Stunden bei 3O⁰C.

Meßbare Hemmzone₅ bei der der Organismus um die Scheibe herumgewachsen ist.

Tabelle XII

in-vi.tro-Wirksamkeit von Derivaten vom A-30912A Kern gegenüber fünf Stämmen von Candida albicans

Verbindung Minimale Hemmkonzentration fog/ml)

R von Fprmel V A-26 SBH16 SBH31 SBH28 SBH29

. (CH₀) „Ο-·( \-CO- 0.312 0.312 0.312 0.312 0.312

(CH )S-·^ ^-CO- 0.625 0.625 0.625 0.625 0.625

_[(CH„)₁ S-«( V-CO- 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

CD O CO

Tabelle XIII Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida Albicans A-26 bei Mäusen

Verbindung

R⁵ von Formel V

ED₅₀ (mg/kg)

Niedrigste wirksame Dosis(mg/kg)

CH₃ (CH₂) _?O-

13 22.2

10 <12.5

(CH₂) _gO-

CH₃(CH₂)_nO-< >-C0-

< 5 3.9

⁵ 2.5

CH (CIl ) 0-*( VCO-

(CH₂) ₇S-<^

57-4

10

28

20

Tabelle XIII (Forts.) Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-2-6 bei Mäusen

Verbindung ,,. , . . . .

Nieorigste wirk-

R⁵ von Formel V ^ED _sn (mg/kg) same Dos is(mg/kg)

Λ ·.

CH₃(CH₂)₁₁S-e(^ ^t-CO- 2 <1.25

CH₃(CH₂)₁₃S-»( ^e-CO- 20 2.5

Λ β.

CH, (CH₉)-SO₉-*^ \-C0- 57

CH (ClL) SO₉-·( N-CO- 57 -- "μ CH₃ (CH₂) J₁SO₂-^ ^e-CO- 53 20

CH₃ (CH₂ )₁₃ ^S0 ₂-^e( /"CO- 11 5 Ν3

CJ) O CO

Tabelle XIII (Forts.) Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans Ar26 bei Mäusen

, ^bindung. _Μ Niedrigste wirk-

R von Formel V ^ED ₅₀ (^g/kg) _sanie Dosis (mg/kg)

CH3	(CH2	)7<	/'
CH3	(CH2	)g<	.-.^CO-
CH3	(CH2	1 "	©—o^CO-
CH3	(CH2	1 '	^e-CO-
CH3	(CH2	)5(	^s ©^
CH3	(CH2	V
(SO)-

>5O 40

>50 >40

>50 ·

>50 >40 · -

20

56.6 >40 ^⁰

' ro σ>

ο co ro

Tabelle XIII (Forts.) Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26" bei Mäusen

_- Verbindung ^ Niedrigste wirk-

R von Formel V ^ED ₅₀ Ong/kg) same Dosis(mg/kg)

CH₃(CH₂)₇-·ζ ^e-CO- 30 AO

_{3 2}3°-®\ /·~^^Η2^2~^α0~ ^{>40 40}

/*—*\ CH₃ (ClI₂) ₅Ο-·^ /e-(cH₂)₂-CO- .9.2 5

·==β · I

CH₃(CH₂)₇Ο-·ζ ^e-(CH₂)₂-CO- 4.5 ω

(CH₂) _ηΟ-»( )·- (CH₂) ₂-CO- 4.5

CH (CH ) -·( N-(CH ) -CO- >40 20

cn ο ω

Tabelle XIII (Forts.) Therapeutische Wirksamkeit gegenüber Candida albicans A-26 bei Mäusen

Verbindung . f	AA	ED50 (mg/kg)	Niedrigste wirk
R"1 von Formal V	21.8	samste Dos is(mg/kg)
CH3(CH2)5O-<^ /®-CH=CH-CO-	3.75	5
CU3(CH2)70-·^ /S-CH=CH-CO-		5
^—%cn ?co-	>40
CH3(CH2)70-·( )·	8.4	10
CH (CH9) ,-.O-/ S-CH9CO-	10

CH₃ (CH₂) ₇0-·^ /9-0-CH₂-CO- .16.8 10

CIi₃(CH₂)_lf0-<J₉ 7.4 20

* Dosierungsschema: 40, 20, 15 und 10 mg/kg. Die entsprechenden Dosen v/erden 0, 4 und ^ 24 Stunden nach erfolgter Injektion in Forn; einer Suspension des jeweiligen Wirkstoffes in 30 % PE6-H_?0 verabreicht. Jede ·Wirkstoffdosis wird jeweils einer Gruppe O aus 6 Mäusen gegeben. Die Kontroll gruppe (unbehandelte Tiere) besteht jeweils aus CO 10 Mäusen, JS3

** Gemessen anhand oer Zunahme der Überlebenszeit der behandelten Tiere gegenüber des Kontrollen und berechnet nach oer Methode von Reed V. Mueuch, American J

Hygiene 493 (1938).

Tabelle XIV Blutspiegel nach oraler Verabreichung an Mäuse

Verbindung während einer Zeitdauer von 4 Stunden

R von Formel.V. ermittelte höchste Blutspiegel (Mg/ml)

CII (CH )₇0-·( S-CO- 23

ft —-β.

CH (CH ) Ο-β⁷ /»-CO- <0.1

ft—β

CK (CH ) Ο-·( S-CO- 5

* «—β

_/β—*_ΝCH₃(CH₂)₁₃Ο-·( )e-CO- 5 ,

Φ ."*""ffl

•—θ I^

_{3 2 7}S-e^ )e-CO- <O.l . . . · ,

β ——β

/^β—*\ CH₃ (CH₂) ₉S-·^ S-CO- 5

Λ β.

CH_ (CH₀) _{Λ Λ} S-«e %-CO- 30 f°

CH_ (CH₀)-_S-< N-CO- 230 _Ä

^{3 2 13} \—(/ O

Die jeweilige Verbindung wird in einer Dosis von 4.16 mg/kg mittels einer Magensonde ^ω

in Form einer'Suspension des jeweiligen Wirkstoffs in 33 % PEG. 400-H₂O verabreicht. K)

Zur Bestimmung der anitfungalen Wirksamkeit wird Aspergillus monteviaensis A-35137 verwendet.

Claims (19)

1. - 126 - 22 6 03 2

   Erfindungsansprüche

   1. Verfahren zur Herstellung eines Derivats eines cyc lischen Peptidkerns der allgemeinen Formel III

   XV > ϊ .

   >=0

   worin R für H oder OH steht,

   2 3 4

   wobei R für H steht und R sowie R jeweils H oder jeweils OH sind, falls R für H steht,

   2 3

   wobei R für H steht, R für OH oder C₁-C^. Alkyloxy

   4 2

   • steht und R für OH steht, oder wobei R für -CO-NH-

   3 4 ^

   steht und R sowie R jeweils für OH stehen, falls

   R¹ für OH steht,

   R einen Rest der folgenden allgemeinen Formeln

   bedeutet

   - 127 - 22 6 03 2

   IV (a)

   IV Cb) -U-(^-(A¹),,-!- J-(A) _pR^£

   IV (c)

   wobei A ein zweiwertiger Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefei, SuIfinyl oder Sulfonyl ist, A einen zweiwertigen Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel _f SuIfinyl, Sulfonyl oder -NH-bedeutet, X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, C₁-C., Alkyl, Hydroxy, C₁-C- Alkoxy, Mercapto, C₁-C- Alkylthio, Carbamyl oder

   1 6

   C₁-C.. Alkylcarbamyl darstellt, X Chlor, Brom oder Iod ist, R Wasserstoff, C.-C.g Alkyl oder C₃-C₁₈ Alkenyl bedeutet, W für C₁-C₁₀ Alkylen oder ^c ₂~^C10 Alkenylen steht und die Indices m, η und ρ für 0 oder 1 stehen, wobei η jedoch 0 bedeuten muß, falls m für 0 steht, mit den Maßgaben, daß die Summe der Kohlenstoffatom in den Gruppen R und W größer als 4 sein muß und nicht mehr als 21 betragen darf, daß A und A nicht SuIfinyl oder Sulfonyl sein können·, falls X Mercapto bedeutet, und daß, falls die Substituenten A und A SuIfinyl oder Sulfonyl bedeuten, diese jeweils im gleichen Oxidationszustand vorliegen müssen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen cyclischen Peptidkern der allgemeinen Formel II

   _₁₂₈_ 226032

   CH₃ ^H0

   II

   12 3 4

   worin R , R , R und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einem aktivierten Derivat der substituierten Verbindung der allgemeinen Formel IV (a), (b) oder (c) _f die der gewünsch-

   5 5

   ten Acylseitenkettengruppe (R ) entspricht, 'worin R die oben angegebene Bedeutung hat, acyliert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 ,,. dadurch gekennzeichnet, daß der Substituents eine substituierte Benzoy!gruppe der allgemeinen Formel ist

   ° /ν

   -C-+ -iJ-A-R'

   NX^

   worin A einen zweiwertigen Rest aus der Gruppe Sauerstoff, Schwefel, SuIfinyl'oder Sulfonyl bedeutet, X Wasserstoff, Chlor, Brom, Iod, Nitro, ^c ₁~^c ₃ Alkyl, Hydroxy, C- C

   Alkoxy, Mercapto, C₁-C, Alkylthio, Carbamyl oder C₁-C, Alkyl-

   carbamyl bedeutet und R für C^-C „ Alkyl oder C^-C „ Alkenyl s-teht. ' \

   . _ 22 6 03 2
3. 3. Verfahren nach Punkt. 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A Sauerstoff bedeutet.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet,

   daß X steht.

   daß X Wasserstoff ist und R für geradkettiges C₅-C₁₃ Alkyl
5. 5. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für ρ-(n-Octyloxy)benzoyl, p-(n-Decyloxy)benzoyl, p-(n-Dodecyloxy)benzoyl, p-(n-Tetradecyloxy)benzoyl oder p-(n-Hexyloxy)benzoyl steht.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A Schwefel ist.
7. 7. Verfahren nach ' Punkt 6, dadurch gekennzeichnet, daß X Wasserstoff ist und R für geradkettiges C^-C ~ Alkyl steht.
8. 8. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für p-(n-Octylthio)benzoyl, p- (n-Decylthio)benzoyl, p-(n-Dodecylthio)benzoyl oder p-(n-Tetradecylthio)benzoyl steht.
9. 9. Verfahren nach Punkt . 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A Sulfonyl ist.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß X Wasserstoff ist und R .-für geradkettiges C_1t--C_1ft Alkyl steht.
11. 11. Verfahren nach Punkt . 2, dadurch gekennzeichnet, daß R für p- (n-Octylsulfonyl)benzoyl, p- (n-Decylsulf onyl·) -. benzoyl, p-(n-Dodecylsulfonyl)benzoyl oder p-(n-Tetradecylsulfonyl)benzoyl steht.

    22 6 03 2
12. 12. Verfahren nach Punkt λ, dadurch gekennzeichnet, daß R für die Formel (a) steht, X Wasserstoff bedeutet und m, η und ρ jeweils 0 sind.
13. 13. Verfahren nach Punkt 12, dadurch gekennzeichnet, daß R für ρ-(n-Octyl)benzoyl steht.
14. 14. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für die Formel (a) steht, :
    stoff bedeutet und η für 0 steht.

    daß R für die Formel (a) steht, X Wasserstoff ist, A Sauer-
15. 15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß R für 3-/ρ-(n-Hexyloxy)phenyl7propanoyl_f 3-/p~(n-Octyloxy) phenyl/propanoyl, 3-Vp- (n-Dodecyloxy)phenyl/propanoyl, p- (n-Hexyloxy) cinnamoyl, p- (n-Octyloxy) cinnamoyl, /p- (n-Octyl·= oxy)phenyl7acetyl, /p-(n-Dodecyloxy)phenyl7acetyl, 3-/p~(n-~ Pentyloxy)phenyl7propanoyl oder 3-/p-(n-Heptyloxy)phenyl7-propanoyl steht„'
16. 16. Verfahren nach Punkt - 1, dadurch gekennzeichnet,-

    daß R für die Formel (a) steht, X Wasserstoff ist und sowohl

    1
    A als auch A Sauerstoff sind.
17. 17.. Verfahren nach Punkt ^ 16_r dadurch gekennzeichnet, daß R für ρ- (n-Oct]
    phenoxyacetyl steht

    daß R für ρ-(n-Octyloxy)phenoxyacetyl oder p-(n-Decyloxy)-
18. 18. Verfahren nach Punkt . 1, dadurch gekennzeichnet, daß R die Formel (c) hat.
19. 19. Verfahren nach Punkt . 18, dadurch gekennzeichnet,

    daß R für 6-(n-Octyloxy)nicotinoyl, 6-(n-Dodecyloxy)nicotinoyl oder p-(n~Decyloxy)cinnamoyl steht.