DE69936783T2

DE69936783T2 - Aerothricin analoge, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69936783T2
Application number: DE69936783T
Authority: DE
Inventors: Masahiro Chigasaki-shi AOKI; Masami Fujisawa-shi KOHCHI; Kazunao Yokohama-shi MASUBUCHI; Eisaku Okamoto 1189-4 Kamakura-shi MIZUGUCHI; Takeshi Chigasaki-shi MURATA; Hiroaki Ohkuma; Takehiro Fujisawa-shi OKADA; Masahiro Chigasaki-shi Sakaitani; Nobuo Chigasaki-shi SHIMMA; Takahide Kamakura-shi WATANABE; Mieko Yokohama-shi YANAGISAWA; Yuri Ushiku-shi YASUDA
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-07-23
Also published as: JP2002525263A; ATE369378T1; EP1100816A1; EP1100816B1; AU754285B2; PE20000934A1; CO5080794A1; JP3628258B2; CN1311794A; AU5163099A; CA2335394A1; TR200100214T2; US6489440B1; BR9912367A; WO2000005251A1; CA2335394C; KR20010083139A; DE69936783D1; MA26663A1; AR020615A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyclische Verbindungen mit antifungaler Aktivität (im Folgenden als Aerothricine bezeichnet), die Verwendung von Aerothricinen in der medizinischen Therapie, pharmazeutische Zusammensetzungen, die Aerothricine enthalten, wie auch Verfahren und Zwischenprodukte zur Herstellung von Aerothricinen.
Azolantipilzmittel werden derzeit weithin zur Behandlung systemischer Mykosen verwendet. Jedoch führte die langzeitige prophylaktische Verwendung von Azolantipilzmitteln aufgrund ihrer fungistatischen Wirkung zu der Erzeugung von azolresistenten Caridida spp.. Daher sind fungizide Mittel zur Behandlung schwerer systemischer Mykosen besonders wichtig. Weiterhin sind die derzeit verfügbaren Antipilzmittel nicht wirksam gegen Fusarium spp., welches eines der aufkommenden Pathogene bei Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem ist. Amphotericin B ist ein in hohem Maße wirksames fungizides Mittel, das derzeit in der Klinik verwendet wird, aber sein therapeutischer Index (wirksame Dosis im Vergleich zu toxischer Dosis) ist sehr eng. Von gewissen cyclischen Verbindungen wie z.B. LY303366 ( EP 736 541 ), WF11243 ( EP 584 360 ) ist bekannt, dass diese durch Inhibition der β-1,3-Glucansynthase fungizide Aktivität zeigen. Jedoch weisen sie immer noch einige Nachteile in Bezug auf das antifungale Spektrum und/oder das Sicherheitsprofil auf. Somit ist die Entwicklung neuer fungizider Mittel mit besserem Sicherheitsprofil und Wirksamkeit gegenüber den bedeutenden systemischen Pathogenen einschließlich neu aufkommender Pathogene wie Fusarium spp. dringend erforderlich.
Die WO 96/30399 offenbart Peptidverbindungen mit der folgenden Formel
wobei R¹ Alkyl oder Aralkyl ist; R² Amino(nieder)alkyl oder geschütztes Amino(nieder)alkyl ist, R³ Hydroxy, geschütztes Hydroxy, Amino oder geschütztes Amino ist, R⁴ Hydroxy ist, oder R³ und R⁴ miteinander verknüpft sind, um -Z- zu bilden (wobei -Z- -O- oder -NH- ist), und R⁵ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe ist, R⁶ Hydroxy ist, oder R⁵ und R⁶ miteinander verknüpft sind, um eine Bindung zu bilden, unter dem Vorbehalt, dass wenn R³ Hydroxy, geschütztes Hydroxy, Amino oder geschütztes Amino ist und R⁴ Hydroxy ist, dann R⁵ und R⁶ miteinander verknüpft sind, um eine Bindung zu bilden, sowie ein pharmazeutisch verträgliches Salz von diesen, welche als ein Medikament nützlich sind.

PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, Bd. 1997, Nr. 11, 28. Nov. 1997 & JP 09/176189 betreffen ebenfalls das oben erwähnte WF11243.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Aerothricine, die durch die Formel (I)
dargestellt werden, wobei
R¹ Guanidino, Triniederalkylammonio, -N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³,
oder
ist;
R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff; Heteroaryl, das mit einem oder zwei Amino substituiert ist; niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Aminoniederalkyl, Cyano, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten;
R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist;
R¹⁴ ein niederes Alkyl ist, das substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten;
R¹⁵ Wasserstoff, niederes Alkyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten;
R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl, niederes Alkyl oder niederes Alkenyl ist, wobei niederes Alkyl und niederes Alkenyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Acyl, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino;
R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino, Acylamino, (Niederalkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy, Niederalkoxycarbonyl, niederes Alkyl, niederes Alkenyl oder niederes Alkinyl ist, wobei niederes Alkyl, niederes Alkenyl und niederes Alkinyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl;
R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy ist, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en);
R⁵ -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂ ist;
X eine Einfachbindung oder eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl substituiert ist;
Y eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(Niederalkyl)-, -CONH- oder -CON(Niederalkyl)- ist;
Z -O-, -NH- oder -N(Niederalkyl)- ist;
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und
n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist;
unter dem Vorbehalt, dass, wenn -Y-(CH₂)_m-X-R⁴ unsubstituiertes Alkyl oder Aralkyl ist, dann gleichzeitig R¹ nicht Amino ist, R² und R³ nicht Wasserstoff sind, R⁵ nicht -CONH₂ ist und Z nicht -O- oder -NH- ist;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Aerothricin mit der Formel (I) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung solcher Aerothricine zur Herstellung von Medikamenten, wie auch Verfahren und Zwischenprodukte für die Herstellung der Aerothricine mit der Formel (I).
In dieser Beschreibung wird der Ausdruck „nieder" verwendet, um eine Gruppe zu bedeuten, die aus 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) besteht, sofern nichts Anderes angegeben ist.
Der Ausdruck „Alkyl" bezieht sich auf einen verzweigten oder geradkettigen einwertigen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest von einem bis zu zwanzig Kohlenstoff atomen, vorzugsweise einem bis sechzehn Kohlenstoffatomen. Der Ausdruck „niederes Alkyl" bezieht sich auf einen verzweigten oder geradkettigen einwertigen Alkylrest von einem bis zu sechs Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einem bis vier Kohlenstoffatomen. Dieser Ausdruck wird weiter erläutert durch solche Reste wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, i-Butyl, tert-Butyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Alkenyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die eine oder mehrere Doppelbindung(en) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Alkinyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die eine oder mehrere Dreifachbindung(en) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Alkoxy" bezieht sich auf die Gruppe -O-R', wobei R' ein Alkyl ist. Der Ausdruck „niederes Alkoxy" bezieht sich auf die Gruppe -O-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „Alkenyloxy" bezieht sich auf eine Alkoxygruppe, welche eine oder mehrere Doppelbindung(en) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Acyl" bezieht sich auf die Gruppe -C(O)-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist. Der Ausdruck „Acylamino" bezieht sich auf eine Acylgruppe, die an einem Iminorest, d.h. -NH-, befestigt ist.
Der Ausdruck „Mononiederalkylamino" bezieht sich auf eine niedere Alkylgruppe, die an einem Iminorest, d.h. -NH-, befestigt ist. Der Ausdruck „Diniederalkylamino" bezieht sich auf zwei unabhängig ausgewählte niedere Alkylgruppen, die an einem Stickstoffatom befestigt sind, d.h. -N(-Niederalkyl)-Niederalkyl. Der Ausdruck „Triniederalkylammonio" bedeutet Triniederalkylammonio, das drei unabhängig ausgewählte C_1-3-Alkylgruppen enthält.
Der Ausdruck „Niederalkoxycarbonyl" bezieht sich auf die Gruppe -C(O)OR', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „(Niederalkylcarbamoyl)amino" bezieht sich auf die Gruppe -NHCONH-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „Halogenatom" bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Ausdruck „Aryl" bezieht sich auf einen einwertigen carbocyclischen aromatischen Rest (d.h. Phenyl) oder zwei kondensierte carbocyclische Ringe (z.B. Naphthyl), gegebenenfalls unabhängig mono-, di- oder trisubstituiert mit niederem Alkyl, Trifluormethyl, Halogen und dergleichen.
Der Ausdruck „Stickstoff enthaltender Heterozyklus" bezieht sich auf einen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen einwertigen cyclischen Rest, der wenigstens ein Stickstoffatom enthält.
Der Ausdruck „Heteroaryl" bezieht sich auf einen aromatischen einwertigen mono- oder polycarbocyclischen Rest, der wenigstens ein Heteroatom, d.h. Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff, enthält. Beispiele für Heteroarylreste mit einem oder mehreren Stickstoffatomen sind Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Triazinyl und Imidazolyl.
Der Ausdruck „Cycloalkyl" bezieht sich auf einen einwertigen carbocyclischen Rest mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträgliche Salze" beinhaltet Salze der Aerothricine mit der Formel (I) mit anorganischen oder organischen Säuren wie z.B. Salzsaure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und dergleichen, welche für lebende Organismen nicht toxisch sind.
Jeder Substituent der Formel (I) oben wird im Folgenden detaillierter erläutert.
Bei der Definition von R¹ bedeutet der Ausdruck „Triniederalkylammonio" vorzugsweise Trimethylammonio und Triethylammonio.
Bei der Definition von R¹⁰ und R¹¹ bedeutet der Ausdruck „Heteroaryl" vorzugsweise 2-Pyridyl, 2-Pyrazinyl, 2-Pyrimidinyl, 2-Pyridazinyl, 2-Triazinyl, 2-Imidazolyl und dergleichen, insbesondere 2-Pyridyl und 2-Imidazolyl, am meisten bevorzugt 2-Pyridyl. Der Ausdruck „niederes Alkyl" bedeutet vorzugsweise eine Alkylkette, die aus 1 bis 6 Kohlenstoffatomen besteht, wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec-Butyl, n-Pentyl, Neopentyl, tert-Pentyl und n-Hexyl; insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl oder n-Butyl, am meisten bevorzugt Methyl, Ethyl oder n-Propyl. Der Ausdruck „Stickstoff enthaltende Heterozyklen" bedeutet vorzugsweise Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, insbesondere Piperazinyl und Morpholino, am meisten bevorzugt Piperazinyl. Der Ausdruck „Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe" bedeutet vorzugsweise 4-Aminophenyl, 4-Amidinophenyl, 4-Guanidinophenyl und dergleichen.
Bei der Definition von R¹³ bedeutet der Ausdruck „ein Rest, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist" vorzugsweise Wasserstoff oder niederes Alkyl, welches substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Guanidino, Methylthio, Mercapto, Carbamoyl, Carboxy, Phenyl, Hydroxyphenyl, Aminophenyl, Imidazolyl oder Indolyl und dergleichen. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹³ ist niederes Alkyl, das mit Amino oder Guanidino substituiert ist, wie z.B. Aminomethyl, 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 4-Guanidinobutyl.
Bei der Definition von R¹⁴ bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl" dasselbe wie für R¹⁰ und R¹¹ definiert. Vorzugsweise bedeutet er eine Alkylkette, welche aus 2 bis 5 Kohlenstoffatomen besteht, wie z.B. Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Der Ausdruck „Stickstoff enthaltende Heterozyklen" bedeutet dasselbe wie für R¹⁰ und R¹¹ definiert. Vorzugsweise bedeutet er Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, insbesondere Piperazinyl und Morpholino. Der Ausdruck „Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe" bedeutet vorzugsweise 4-Aminophenyl, 4-Amidinophenyl, 4-Guanidinophenyl und dergleichen. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹⁴ ist 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 2-Guanidinoethyl, 3- Guanidinopropyl, 2-Piperazinoethyl, 2-Morpholinoethyl, 4-Aminophenethyl und dergleichen.
Bei der Definition von R¹⁵ sind die Ausdrücke „niederes Alkyl", „Stickstoffenthaltende Heterozyklen" und „Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe" dieselben wie für R¹⁴ definiert. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹⁵ ist 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 2-Guanidinoethyl, 3-Guanidinopropyl, 2-Piperazinoethyl, 2-Morpholinoethyl, 4-Aminophenethyl und dergleichen.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ wie oben definiert sind] sind Amino, 5-Aminopyrid-2-ylamino, Methylamino, Ethylamino, Propylamino, (2-Aminoethyl)amino, (3-Aminopropyl)amino, [3-[(3-Aminopropyl)amino]propyl]amino, (2-Piperazinylethyl)amino, (2-Morpholinoethyl)amino, N,N-Dimethylamino, N,N-Diethylamino, N,N-Dipropylamino, N,N-Ethylmethylamino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopropyl)amino, N,N-Bis(4-aminobutyl)amino, N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-morpholinoethyl)amino, N,N-Bis(2-guanidinoethyl)amino, N,N-Bis(3-guanidinopropyl)amino, N,N-Bis(2-pyridin-2-ylethyl)amino, N,N-Bis(imidazol-2-ylmethyl)amino, N-(2-Aminoethyl)-N-(3-aminopropyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2-piperazinylethyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2-pyridin-2-ylethyl)amino und dergleichen. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Amino, 5-Aminopyrid-2-ylamino, N,N-Dimethylamino, (2-Aminoethyl)amino, (3-Aminopropyl)amino, [3-[(3-Aminopropyl)amino]propyl]amino, (2-Piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopropyl)amino, N,N-Bis(4-aminobutyl)amino, N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-guanidinoethyl)amino, N,N-Bis(3-guanidinopropyl)amino, N-(2-Aminoethyl)-N-(3-aminopropyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2-piperazinylethyl)amino und dergleichen. Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind (3-Aminopropyl)amino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopropyl)amino und N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino.
Bei der Definition von -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ bedeutet die Gruppe -CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰ und R¹¹ Wasserstoff sind; R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist] vorzugsweise Sarcosyl, Glycyl, Alanyl, Ornitinyl, Lysyl, Valyl, Leucyl, Isoleucyl, Tryptophyl, Phenylalanyl, Methionyl, Seryl, Tyrosyl, Threonyl, Cysteinyl, Asparaginyl, Glutaminyl, Aspartyl, Glutamyl, Arginyl, Histidyl, 2,3-Diaminopropionyl, 2,4-Diaminobutyryl, 2-Amino-4-triazol-1-ylbutyryl und dergleichen.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ sind Acylaminogruppen, die von basischen Aminosäuren abgeleitet sind. Beispiele für solche Acylaminogruppen sind Onitinylamino, Lysylamino, Arginylamino, Histidylamino, 3-Aminoprolylamino, 2,3-Diaminopropionylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, 2-Amino-4-triazol-1-yl-butyrylamino, [3-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]propionyl]amino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,3-diaminopropionyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,5-diaminovaleryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino und dergleichen; besonders bevorzugt Ornitinylamino, Lysylamino, Arginylamino, Histidylamino, 2,3-Diaminopropionylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, [3-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]propionyl]amino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,3-diaminopropionyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,5-diaminovaleryl)amino und N-(3-aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino, am meisten bevorzugt Ornitinylamino, Lysylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,5-diaminovaleryl)amino und N-(3-Aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino.
Bei der Definition von R¹ ist eine bevorzugte Ausführungsform von
Bis[2-(ornitylamino)ethyl]amino, Bis-[3-(ornitylamino)propyl]amino, [2-(Lysylamino)ethyl]amino, Bis-[3-(lysylamino)propyl]amino und dergleichen.
Bei der Definition von R¹ ist eine bevorzugte Ausführungsform von
N-Ornityl-N-[2-(ornitylamino)ethyl]amino, N-Ornityl-N-[3-(ornitylamino)propyl]amino, N-Ornityl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino, N-Ornityl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino, N-Lysyl-N-[2-(ornitylamino)ethyl]amino, N-Lysyl-N-[3-(ornitylamino)propyl]amino, N-Lysyl-N-[2-(lysylamino)ethyl]amino, N-Lysyl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino und dergleichen.
Bei der Definition von R¹ ist eine bevorzugte Ausführungsform von
Prolylamino, 3-Aminoprolylamino, 4-Aminoprolylamino, N-(3-Aminopropyl)-N-prolylamino, (2-Aminoethyl)prolylamino und dergleichen.
Der Ausdruck „-NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³" [wobei R¹³ wie oben definiert ist] bedeutet vorzugsweise Ornityl-ornitylamino, Lysyl-ornitylamino, Ornityl-lysylamino, Lysyl-lysylamino und dergleichen.
Bei dem Ausdruck „-N(R¹⁵)-CO-R¹⁴" [wobei R¹⁴ und R¹⁵ wie oben definiert sind] sind der Ausdruck „Stickstoff enthaltender Heterzyklus" und der Ausdruck „Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe" wie oben definiert.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴ sind 3-Aminopropionylamino, 3-Guanidinopropionylamino, 3-Piperazinylpropionylamino, (3-Pyridin-3-ylpropionyl)amino, [3-(4-Aminophenyl)propionyl]amino, N-(3-Aminopropionyl)-N-(3-aminopropyl)amino und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹, wobei R¹⁰ und R¹¹ wie oben definiert sind. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, wobei R¹⁰ R¹¹, R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, wobei R¹⁴ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹
, wobei R¹⁰ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹ -NHCOCH(R¹³)- NHCOCH(NH₂)-R¹³, wobei R¹³ wie oben definiert ist. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹ Triniederalkylammonio. Unter noch einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R¹ Amino oder Guanidino.
Bei der Definition von R² bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino" vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Oxoniederalkyl, Carboxyniederalkyl, Carbamoylniederalkyl, Aminoniederalkyl und dergleichen, insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, 2-Oxopropyl, Carboxymethyl, Carbamoylmethyl, 3-Aminopropyl und dergleichen.
Der Ausdruck „niederes Alkenyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino", bedeutet vorzugsweise Allyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl und dergleichen, insbesondere Allyl.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl oder niederes Alkyl wie z.B. Methyl oder Ethyl.
Bei der Definition von R³ bedeutet der Ausdruck „Acylamino" vorzugsweise Niederalkylcarbonylamino wie z.B. Acetylamino, Propionylamino oder Isobutyrylamino, oder eine Acylaminogruppe, die von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist, wie z.B. Sarcosylamino, Glycylamino, Alanylamino, Ornitylamino, Lysylamino, Prolylamino, Valylamino, Leucylamino, Isoleucylamino, Tryptophylamino, Phenylalanylamino, Methionylamino, Serylamino, Tyrosylamino, Threonylamino, Cysteinylamino, Asparaginylamino, Glutamylamino, Aspartylamino, Glutamylamino, Arginylamino, Histidylamino und dergleichen; vorzugsweise Sarcosylamino, Glycylamino, Alanylamino, Lysylamino, Prolylamino und dergleichen.
Der Ausdruck „(Niederalkylcarbamoyl)amino" bedeutet vorzugsweise Methylcarbamoylamino, Ethylcarbamoylamino, Propylcarbamoylamino, Butylcarbamoylamino und dergleichen, insbesondere Methylcarbamoylamino oder Ethylcarbamoylamino.
Der Ausdruck „niederes Alkoxy" bedeutet vorzugsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy und dergleichen, insbesondere Methoxy und Ethoxy.
Der Ausdruck „Niederalkoxycarbonyl" bedeutet vorzugsweise Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Butoxycarbonyl und dergleichen, insbesondere Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl.
Der Ausdruck „niederes Alkyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Aminomethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Methylaminomethyl, 2-(Methylamino)ethyl, 3-(Methylamino)propyl, Dimethylaminomethyl, 2-(Dimethylamino)ethyl, 3-(Dimethylamino)propyl, 2-(Methoxycarbonyl)ethyl, 2-(Carbamoyl)ethyl und dergleichen.
Der Ausdruck „niederes Alkenyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Vinyl, 2-(Methoxycarbonyl)vinyl, 2-(Carbamoyl)vinyl und dergleichen.
Der Ausdruck „niederes Alkinyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Ethinyl, Propinyl, Hydroxypropinyl, Aminopropinyl, Diethylaminopropinyl und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino oder Acylamino. Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt ist R³ (Niederalkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy oder Niederalkoxycarbonyl.
Bei der Definition von R⁴ bedeutet der Ausdruck „Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy" vorzugsweise eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe, die 3 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, wie z.B. Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Oct-4-enyl, Oct-6-enyl, Nonanyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Propoxy, Butoxy, Pentyloxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Oct-4-enyloxy, Oct-6-enyloxy, Nonanyloxy, Non-5-enyloxy, Decyloxy und dergleichen.
Der Ausdruck „niederes Alkyl" bedeutet vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, insbesondere Methyl oder Ethyl.
Der Ausdruck „Aryl" bedeutet eine Arylgruppe, welche gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Trifluormethyl oder einem Halogenatom(en), wie z.B. Phenyl, Naphtyl, 3-Fluorphenyl, 3-Bromphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Fluorphenyl, 4-Bromphenyl, 4-Chlorphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 4-Trifluormethylphenyl.
Der Ausdruck „Cycloalkyl" bedeutet vorzugsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Adamantyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en)," bedeutet vorzugsweise 5-Methylhexyl, 1-Methyltridecyl, 2-Ethylbutoxy, 4-Methylpentyloxy, 2-Propylpentyloxy, 2-Ethylhexyloxy, 3,7-Dimethyloctyloxy, 2-Phenylethoxy, 2-(4-Fluorphenyl)ethoxy, 2-(4-Chlorphenyl)ethoxy, 2-(3-Fluorphenyl)ethoxy, 2-(4-Trifluorphenyl)ethoxy, 3-Phenylpropoxy, 2-Naphtylethoxy, 3-Naphtylpropoxy, 2-Cyclopropylethoxy, 2-Cyclobutylethoxy, 2-Cyclopentylethoxy, 3-Cyclopentylpropoxy, 2-Cyclohexylethoxy, 3-Cyclohexylpropoxy, 3,3-Diphenylpropoky, 3,3,3-Trifluorpropoxy, 4,4,4-Trifluorbutoxy, 5,5,5-Trifluorpentyloxy und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R⁴ Alkyl oder Alkoxy, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en).
Bevorzugte Ausführungsformen von R⁵ sind -CONH₂- oder -CH₂NH₂.
Bei der Definition von X bedeutet der Ausdruck „Heteroatom" vorzugsweise Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff.
Der Ausdruck „Aryl, Biphenyl oder Terphenyl, das gegebenenfalls eines oder mehrere Heteroatom(e) enthält," bedeutet vorzugsweise
und dergleichen, welche weiter durch ein Halogenatom(e) oder niederes Alkyl substituiert sein können. Die Linien mit offenem Ende in den Formeln oben zeigen die bevorzugte Verknüpfung in der entsprechenden Position an.
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform von X ist eine Einfachbindung,
oder
welche weiter mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl, vorzugsweise Methyl, substituiert sein können.
Bei der Definition von Y bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl" vorzugsweise eine Alkylgruppe, die aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen besteht, z.B. Methyl, Ethyl oder Propyl. Die bevorzugte Ausführungsform von Y ist eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(CH₃)-, -CONH- oder -CON(CH₃)-, insbesondere eine Einfachbindung, -CH(CH₃)- oder -CONH-.
Bei der Definition von Z bedeutet der Ausdruck „-N(niederes Alkyl)" vorzugsweise eine N-Alkylgruppe, welche aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen besteht, z.B. N-Methyl, N-Ethyl oder N-Propyl. Eine bevorzugte Ausführungsform von Z ist -O-; eine weitere bevorzugte Ausführungsform von Z ist -NH-.
m ist eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise 0 bis 2.
Bevorzugte Aerothricine gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Aerothricine 2 und 4 bis 131, wie sie in der folgenden Tabelle 1 als Beispiele dargestellt werden. Tabelle 1
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Besonders bevorzugt sind die Aerothricine, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 2, 4 bis 32, 63, 96-99, 101 bis 131. Ebenfalls besonders bevorzugt sind die Aerothricine, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 14, 15, 21, 26-29, 63, 98, 99, 101-131.
Aerothricine, die durch die Formel (I) dargestellt werden, können nach den folgenden Verfahren erzeugt werden.
Prozess A
Aerothricine mit der Formel (II) können erzeugt werden, indem ein Mikroorganismus, der zu Deuteromycotina gehört, der in der Lage ist, die Aerothricine 1, 2 und 3 [Aerothricin 3 (= WF 11243) wird in Referenzbeispiel 1 beschrieben] zu erzeugen, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen oder einem festen Medium kultiviert wird und die Aerothricine 1, 2 und 3 aus der Kultur isoliert werden.
[wobei R³ Wasserstoff oder Hydroxy ist, Y -CH(CH₃)- oder -CH₂- ist]
Prozess B
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ Amino ist; Y -CONH-, -CON(niederes Alkyl)-, -CH₂- oder eine Einfachbindung ist; Z -NH- oder -N(niederes Alkyl)- ist; R², R³, R⁴, R⁵, X und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Kondensation einer Verbindung mit der Formel (III),
[wobei R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist; R², R³ und R⁵ wie oben definiert sind]
mit einer Verbindung mit der Formel (IV),
[wobei R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist; R⁸ Wasserstoff oder niederes Alkyl ist; R⁴, X, Y und m wie oben definiert sind]
unter Verwendung eines Carboxyaktivierungsmittels zur Peptidsynthese, gefolgt von der selektiven Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁷ des resultierenden linearen Peptids, der anschließenden Cyclisierung mit einem Carboxyaktivierungsmittel zur Peptidsynthese und der Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁶.
Prozess C
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R³ eine Nitrogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Nitrierung von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R³ Wasserstoff ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind].
Prozess D
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R³ eine Aminogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Reduktion der Nitrogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R³ eine Nitrogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind].
Prozess E
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R³ Acylamino oder (Niederalkylcarbamoyl)amino ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Acylierung der Aminogruppe von Aerothrcinen mit der Formel (I) [wobei R³ eine Aminogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Säurechlorid, Säureanhydrid, Carbonsäure/Kondensationsmittel oder Niederalkylcarbamoylchlorid, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe.
Prozess F
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ (3-Aminopropyl)amino, (2-Cyanoethyl)amino, 3-Amino-2-(aminomethyl)propyl]amino oder -N(R¹⁵)-COCH[NH(CH₂)₃(NH₂]-R¹³ ist [wobei R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch das Umsetzen der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe oder -N(R¹⁵)-COCH(NH₂)-R¹³ ist [wobei R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Acrylonitril, Ethoxymethylenmalononitril oder (1-Ethoxyethyliden)malononitril, gefolgt von der Reduktion der resultierenden Nitrilgruppe(n) zu einer Aminogruppe(n) und wenn nötig der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess G
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem Stickstoff enthaltenden Hetero zyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe] oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils ein niederes Alkyl sind, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Aminoniederalkyl, Guanidino, einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe; R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die reduktive Alkylierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R¹ Amino, (2-Cyanoethyl)amino oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder (2-Cyanoethyl)amino sind; R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Aldehyd mit der Formel (V), R⁹-CHO (V)[wobei R⁹ Wasserstoff, niederes Alkyl ist, welches weiter substituiert sein kann mit einem oder mehreren geschützten Amino, einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine geschützte Aminogruppe enthält/enthalten],
gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe(n) oder der Reduktion einer Cyanogruppe.
Prozess H
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ ist [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder Heteroaryl, das substituiert ist mit einer oder zwei Aminogruppe(n)]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch das Umsetzen der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einer Verbindung mit der Formel (VI), R¹²-Q (VI) [wobei R¹² ein Stickstoff enthaltendes Heteroaryl ist, welches weiter mit einer geschützten Amino- oder Nitrogruppe substituiert sein kann, Q ein Halogenatom wie z.B. Chlor oder Brom ist],
gefolgt wenn nötig von der Entfernung einer Aminoschutzgruppe oder der Reduktion einer Nitrogruppe.
Prozess I-1
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹
, -NHCO-CH(NH²)-R¹³ [wobei R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist] oder -NHCO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ wie oben definiert ist]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind], können hergestellt werden durch die Acylierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der obigen Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einer Säure mit der Formel (VII) oder (VII'),
[wobei R¹³ ein Rest ist, der abgeleitet ist von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren, deren funktionelle Gruppe geeignet geschützt ist, R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist],
oder einer Säure mit der Formel (VIII) HO(O=)C-R¹⁴ (VIII)[wobei R¹⁴ niederes Alkyl mit einer oder mehreren geschützten Aminogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine geschützte Aminogruppe, ist];
gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess I-2
Aerothricine mit der Formel (I), wobei R¹
[wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³, R¹⁵ und m wie oben definiert sind] oder
[wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³, R¹⁵ und m wie oben definiert sind]
ist, können hergestellt werden durch die Acylierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I), wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ beide ein niederes Alkyl sind, das substituiert ist mit einer Aminogruppe] oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁵ ein niederes Alkyl ist, das mit einer Aminogruppe substituiert ist; R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie in Anspruch 1 definiert sind, unter dem Vorbehalt, dass die Aminogruppe(n), die in R¹⁰, R¹¹ und R¹³ vorliegt(en), geschützt ist/sind], mit einer Säure mit der Formel (VII) HO(O=)C-CH(NH-R⁷)-R¹³ (VII)[wobei R¹³ ein Rest ist, der abgeleitet ist von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren, deren funktionelle Gruppe geeignet geschützt ist, R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist];
gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess J
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰ und R¹¹ Wasserstoff sind, R¹³ wie oben definiert ist und R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem Stickstoffenthaltenden Heterzyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe],
[wobei R¹⁰ Wasserstoff ist und R¹⁵ niederes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem Stickstoff enthaltenden Heterzyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe, ist] oder -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁵ niederes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem Stickstoff enthaltenden Heterzyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), enthaltend eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe, ist, R¹⁴ wie oben definiert ist]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Mono-N-alkylierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind], wie bei Prozess F beschrieben wird, gefolgt von der Acylierung mit einer entsprechenden Verbindung mit der Formel (VII), (VII') oder (VIII), wie bei dem Prozess I beschrieben wird, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess K
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R¹ eine Guanidinogruppe, -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederem Alkyl, substituiert mit Guanidino oder einer Phenylgruppe(n), die eine Guanidinogruppe enthält/enthalten], -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie oben definiert sind und R¹⁵ ein niederes Alkyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder mehreren Guanidinogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Guanidinogruppe enthält/enthalten] oder -N(R¹⁵)CO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ ein niederes Alkyl ist, das substituiert ist mit einer oder mehreren Guanidinogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Guanidinogruppe ent hält/enthalten; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch das Umsetzen von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe; -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederem Alkyl, das substituiert ist mit einer Aminogruppe(n) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten], -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie oben definiert sind und R¹⁵ ein niederes Alkyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder mehreren Aminogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten]; oder -NHCO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ ein niederes Alkyl ist, das mit einer oder mehreren Aminogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten, substituiert ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem aktivierten Amidinderivat.
Prozess L
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R² ein niederes Alkyl oder ein niederes Alkenyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die O-Alkylierung der phenolischen Hydroxylgruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R² Wasserstoff ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Alkylierungsmittel.
Prozess M
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R³ Carboxyl, Niederalkoxycarbonyl, niederes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl; R² Wasserstoff ist; R¹, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Iodierung von Aerothricinen mit der obigen Formel (I) [wobei R² und R³ Wasserstoff sind; und R¹, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Iodierungsmittel, gefolgt von einer mit Palladium(0) katalysierten Kopplung des resultierenden Iodderivats mit der Formel (I) [wobei R³ ein Iod ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Kohlenmonoxid, Methylacrylat und dergleichen, und wenn nötig durch die Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess N
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R⁵ -CN ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Dehydratisierung der Carbamoylgruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R⁵ -CONH₂ ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Dehydratisierungsmittel, und wenn nötig durch die Entfernung der Aminoschutzgruppe(n).
Prozess O
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R⁵ -CH₂NH₂ ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Reduktion der Carbamoyl- oder Cyanogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I) [wobei R⁵ -CONH₂ oder -CN ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Reduktionsmittel und wenn nötig durch die Entfernung der Aminoschutzgruppe(n).
Prozess P
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei R² Hydroxysulfonyl ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Hydroxysulfonierung des Tyrosinrestes von Aerothricinen mit der obigen Formel (I) [wobei R² Wasserstoff ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind], gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Prozess Q
Aerothricine mit der Formel (I) [wobei -Y-(CH₂)_m-X-R⁴ n-Tridecanyl oder 1-Methyltridecanyl ist, R⁵ -CONH₂ ist, Z ein Sauerstoffatom ist und R¹, R² und R³ wie oben definiert sind] können hergestellt werden aus dem linearen Peptid mit der Formel (IX) durch das Verfahren, das in Schema 1 skizziert wird.
Die Verbindungen mit der obigen Formel (III), wobei R², R³ und R⁵ wie oben definiert sind und R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist, unter dem Vorbehalt, dass wenn R⁵ -CONH₂ ist, dann R² oder R³ von Wasserstoff verschieden sind, und Salze von diesen sind neu und sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Weiterhin sind die linearen Peptide mit den Formeln (IX), (X) und (XII), die in Schema 1 gezeigt sind, und gegebenenfalls Salze von diesen neu und sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Schema 1
Die Prozesses A bis Q können detaillierter wie folgt veranschaulicht werden:
Prozess A
Der Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Stamm, einschließlich Mutanten und Varianten, sein, der zu Deuteromycotina gehört, der in der Lage ist, die Aerothricine 1, 2 und 3 zu erzeugen. Besonders bevorzugt ist der Stamm NR 7379, welcher aus abgefallenen Blättern, die in Kagoshima pref. in Japan gesammelt wurden, isoliert wurde und als ein Stamm, der zu Deuteromycotina gehört, identifiziert wurde.
Die die Kultur betreffenden und morphologischen Charakteristika des Stammes NR 7379 sind wie folgt:
1. Die Kultur betreffende Charakteristika
Maismehlagar (CMA): Das Wachstum war nicht weitgehend. Die Kolonien erreichten ausgehend von dem Inokulum (4,5 mm Durchm. Agarstopfen) nach 14 Tagen bei 25°C 11 mm im Durchmesser. Sie waren flach und blass cremegelb. Die Rückseite war blass cremegelb. Farblose und schleimige Exudate waren vorhanden.
Miura's Medium (LCA): Das Wachstum war nicht weitgehend. Die Kolonien erreichten ausgehend von dem Inokulum nach 14 Tagen bei 25°C 11 mm im Durchmesser. Sie waren flach und blass cremegelb. Die Rückseite war blass cremegelb. Exudate fehlten.
Malzextraktagar (MEA): Das Wachstum war nicht weitgehend. Die Kolonien waren pustelförmig und erreichten ausgehend von dem Inokulum nach 14 Tagen bei 25°C einen Durchmesser von 18 mm. Die Farbe der Kolonien war leicht gelblich braun. Die Rückseite hatte dieselbe Farbe. Die Exudate waren farblos und schleimig.
Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA): Das Wachstum war nicht weitgehend. Die Kolonien waren pustelförmig und erreichten ausgehend von dem Inokulum nach 14 Tagen bei 25°C 14 mm im Durchmesser. Die Farbe und Textur der Kolonien waren ähnlich zu denen auf MEA. Die Exudate waren farblos und schleimig.
Ein Keimen wurde auf CMA, LCA, MEA und PDA zwischen 5°C und 30°C beobachtet.
2. Morphologische Charakteristika
Die Myzelien waren teilweise untergetaucht, teilweise an der Oberfläche, verzweigt, septiert und blassbraun bis cremegelb. Konidiophoren wurden von dem untergetauchten Myzel gebildet. Sie waren glasartig, septiert, verzweigt, unregelmäßig. Konidiogene Zellen befanden sich auf einzelnen Konidiophoren oder unregelmäßigen Hyphen. Sie waren enteroblastisch, phialidisch, terminal oder subterminal. Terminale oder subterminale Phialide waren in der Länge und Gestalt variabel. Sie waren zylindrisch bis lageniform, und ihre Länge und Breite betrugen bis zu 5,5 bis 10 μm bzw. 2,5 bis 5,5 μm. Unregelmäßige fadenförmige Konidiophoren mit lateralen konidiogenen Zellen unmittelbar unterhalb der Septen wurden oft gebildet. Die Konidien waren einzellig, glasartig, glatt, kugelig bis kreisförmig (subglobose), 2,0 bis 5,5 μm in der Länge und 2,0 bis 5,0 μm in der Breite.
Auf der Grundlage dieser verschiedenen die Kultur betreffenden und morphologischen Charakteristika gehörte der vorliegende Stamm zu Deuteromycotina, bezeichnet als Deuteromycotina NR 7379.
Der Stamm, der als Deuteromycotina NR 7379 bezeichnet wurde, wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan im Namen von Nippon Roche K. K. aus 6-1, Shiba 2-chome, Minato-ku Tokyo, 105 Japan am 16. Juni 1998 unter dem Budapester Vertrag wie folgt hinterlegt: Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391).
Die Kultivierung nach dem Verfahren, das von der vorliegenden Erfindung bereit gestellt wird, kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, welches gebräuchliche Nährstoffe enthält, die von den Mikroorganismen, die kultiviert werden, verwendbar sind. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerol, Molassen, Dextrin und Mischungen von diesen erwähnt werden. Stickstoffquellen sind beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Hefeextrakt, Maisquellwasser (corn steep liquor), Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen von diesen. Darüber hinaus können zu dem Kulturmedium andere organische oder anorganische Substanzen zur Förderung des Wachstums des Mikroorganismus und zum Erhöhen der Produktion von Aerothricin 1 zugegeben werden. Beispiele für solche Substanzen sind anorganische Salze wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und dergleichen.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einem flüssigen Medium durch Tauchfermentation, oder in einem festen Medium durch statische Fermentation durchgeführt. Eine Temperatur von 20°C bis 30°C, mit einer optimalen Temperatur von 27°C, ist zur Kultivierung geeignet. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9 durchgeführt. Die Kultivierungsdauer hängt von den Bedingungen ab, unter welchen die Kultivierung durchgeführt wird. Im Allgemeinen ist es ausreichend, die Kultivierung für 20 bis 360 h durchzuführen.
Zum Ernten der angestrebten Aerothricine 1, 2 und 3 aus den Kulturen können Trennmethoden, welche gewöhnlich eingesetzt werden, um Metaboliten, die von Mikroben erzeugt wurden, aus ihren Kulturen zu isolieren, passend verwendet werden. Beispielsweise wird Aerothricin 1, welches eine mit Methanol extrahierbare amphotere Substanz ist, vorteilhaft durch die folgenden Prozeduren gewonnen.
Das heißt, der gesamte Feststoff der Kultur, der durch Fermentation im festen Zustand erhalten wurde, wird mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, um das vorgeschlagene Produkt zu gewinnen. Die Lösungsmittel, welche verwendet werden können, um die angestrebte Verbindung aus dem gesamten Feststoff der Kultur zu extrahieren, beinhalten wasserlösliche organische Lösungsmittel oder wasserhaltige Lösungen wasserlöslicher organischer Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und wasserhaltige Alkohole.
Zur Entfernung von Salzen, wasserlöslichen Substanzen usw. aus dem resultierenden Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelverteilung zwischen Wasser und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie z.B. n-Butanol, Ethylacetat usw. angewendet. Zur Entfernung von färbenden Substanzen, fettlöslichen Substanzen oder derglei chen aus dem Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelreinigung durch Methanol, Ethanol, eine Mischung von Acetonitril - 0,1% wässrige Trifluoressigsäure usw. angewendet.
Zur vollständigen Reinigung der Aerothricine wird vorteilhaft eine Säulenchromatographie verwendet. Träger, die bei einer solchen Säulenchromatographie verwendet werden können, sind solche wie YMC-GEL ODS (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) oder Preparative C18 (Waters Millipore Corporation). Als ein Elutionsmittel wird ein Lösungsmittelsystem angewendet, das aus einer Mischung von wässriger Trifluoressigsäure und geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol, Acetonitril usw. besteht. Die so gereinigte Eluatfraktion, welche jede Komponente enthält, kann einer Konzentrierung oder einem Gefriertrocknen unterzogen werden, um die Aerothricine 1, 2 und 3 zu pulverisieren.
Die Aerothricine 1, 2 und 3 wurden als ein Trifluoressigsäuresalz isoliert, aber die freien Aerothricine 1, 2 und 3 können durch die folgende Prozedur hergestellt werden. Die Aerothricin 1-, 2- und 3-Trifluoressigsäuresalze werden nämlich in Wasser gelöst, zu welchem ein Äquivalent Natriumhydroxid zugegeben wurde, und die Mischung wird einer Sephadex LH-20-Säulenchromatographie unterzogen, gefolgt von einer Flution mit einem wasserhaltigen Alkohol wie z.B. Methanol-Wasser usw., um dadurch die Aerothricine 1, 2 bzw. 3 (freie Form) zu erhalten.
Prozess B
Die Ausgangsverbindung mit der Formel (III) kann aus Aerothricinen mit der Formel (I) [welche die Aerothricine 1 bis 3 wie auch jene, die aus den Aerothricinen 1 bis 3 durch Verwendung eines Prozesses, der ausgewählt ist aus den Prozessen C bis Q, umgewandelt wurde, beinhaltet] durch ein Verfahren, das ähnlich ist zu dem, welches in der WO 96/30399 beschrieben wird, hergestellt werden. Dieses Verfahren umfasst die alkalische Hydrolyse des Lactonrings, gefolgt von der enzymatischen Spaltung der Fettsäurekette. Die bevorzugten Aminoschutzgruppen für R⁶ in der Formel (III) und R⁸ in der Formel (IV) sind tert-Butoxycarbonyl (Boc) bzw. 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc).
Die Ausgangsverbindung mit der Formel (III) kann ebenfalls aus dem linearen Peptid mit der Formel (IX), welches durch Fermentation von Deuteromycotina erhalten wird, durch eine herkömmliche Peptidsynthese, welche im Folgenden erwähnt wird, hergestellt werden.
Die Ausgangsverbindung mit der Formel (IV) [wobei Y -CONH- ist; R⁴, R⁸ und X wie oben definiert sind] kann hergestellt werden durch die Kondensation der Verbindung mit der Formel (XIV)
[wobei R⁷ eine Aminoschutzgruppe wie z.B. eine Fmoc-Gruppe ist und R⁸ wie oben definiert ist]
mit einer Verbindung mit der Formel (XV), R⁸NH-(CH₂)_m X-R⁴ (XV)[wobei R⁴, R⁸, X und m wie oben definiert sind],
gefolgt von der Entfernung der tert-Butylgruppe. Die Verbindung mit der Formel (XIV) ist im Handel erhältlich.
Die Ausgangsverbindungen mit der Formel (XV) [wobei X eine Einfachbindung, eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl substituiert ist] sind im Handel erhältlich oder können durch Verfahren hergestellt werden, die ähnlich sind zu denen, die in der EP 736 541 und Schema 2 beschrieben werden: z.B. LiAlH₄-Reduktion des Carboxyamids, das aus den Carbonsäurezwischenprodukten in Schema 2, das im Folgenden erwähnt wird, hergestellt wurde, gefolgt von dem Schutz der Aminogruppe mit Fmoc-Chlorid und dergleichen.
Die repräsentativen Verbindungen mit der Formel (IV) [wobei Y -CONH- oder -CON(niederes Alkyl)- ist; R⁴, R⁷, R⁸ und X wie oben definiert sind] sind
und dergleichen.
Die Ausgangsverbindung mit der Formel (IV) [wobei Y eine Einfachbindung oder -CH₂- ist; R⁴, R⁸ und X wie oben definiert sind] kann hergestellt werden durch Michael-Addition von (R)-(+)-N-Benzyl-1-phenylethylamin zu einer Verbindung mit der Formel (XVI),
[wobei R⁴, X und m wie oben definiert sind]
in der Gegenwart einer starken Base wie z.B. LDA [cf. Tetrahedron Asymmetry, 2 (3), 183 (1991)], gefolgt von i) N-Debenzylierung durch katalytische Hydrierung, ii) Schutz des resultierenden primären Amins mit Fmoc-Chlorid und dergleichen und iii) Entfernung der tert-Butylgruppe.
Die Ausgangsverbindungen mit der Formel (XVI) können durch das Verfahren hergestellt werden, das in dem folgenden Schema 2 skizziert ist.
Schema 2
Die Verbindungen mit der Formel (XVI), wobei m 4 ist, können hergestellt werden durch Wiederholen der Schritte 1 bis 3 in Schema 2 vor der letzten Wittig-Reaktion.
Die repräsentativen Verbindungen mit der Formel (IV) [wobei Y eine Einfachbindung oder -CR₂- ist; R⁴, R⁷ und X wie oben definiert sind] sind:
Die Bildungsreaktion der ersten Peptidbindung wie auch die Cyclisierung des resultierenden linearen Peptids können durch ein Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidchemie bekannt ist [cf. The practice of Peptide Synthesis, M. Bodansky und A. Bodansky/2. Ausg., 1994 (Springer-Verlag)]. Das bevorzugte Kondensationsmittel ist BOP-HOBt, PyBOP^TM-HOBt, PyBroP^TM-HOBt und dergleichen [Kopplungsreagenzien: im Handel erhältlich (cf. The Combinatorial Chemistry Catalog, Feb., 1997; Novabiochem.)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Pyridin, N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Base wie z.B. Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und dergleichen bei einer Temperatur zwischen -20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C, durchgeführt werden.
Prozess C
Die Nitrierung der Aerothricine mit der Formel (I) kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten bekannt ist; typischerweise durch Natriumnitrit/Essigsäure, Tetranitromethan/Pyridin und dergleichen.
Die Reaktion kann bei einer Temperatur zwischen -20° und 0°C, vorzugsweise bei 0°C, durchgeführt werden.
Prozess D
Die Reduktion der Nitrogruppe(n) kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten bekannt ist; typischerweise durch katalytische Hydrierung unter Verwendung eines Katalysators wie z.B. Palladium-C, Platinoxid und dergleichen.
Die Reaktion kann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Essigsäure und dergleichen durchgeführt werden.
Prozesse E und I
Die N-Acylierung einer Aminogruppe, die in R¹ oder R³ der Formel (I) vorliegt, kann durchgeführt werden mit Säureanhydrid oder Carbamoylchlorid durch ein Verfahren, das den Fachleuten bekannt ist, oder mit Carbonsäure unter Verwendung von Kondensationsmitteln wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, BOP, HBTU, TNTU, PyBroP^TM, PyBOP^TM TBTU, TSTU, HOBt und dergleichen oder der Kombination von zwei von diesen.
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Pyridin, N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Base wie z.B. Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und dergleichen bei einer Temperatur zwischen -20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C, durchgeführt werden.
Die Entfernung der Aminoschutzgruppe, wenn eine N-geschützte Aminosäure für die Kondensationsreaktion verwendet wird, kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten bekannt ist, z.B. die Behandlung mit Trifluoressigsäure für die Boc-Gruppe oder Piperidin für die Fmoc-Gruppe.
Prozess F
Die N-Monoalkylierung einer Aminogruppe, die in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durchgeführt werden, indem Acrylonitril, Ethoxymethylenmalononitril oder (1-Ethoxyethyliden)malononitril gemäß dem Verfahren verwendet werden, das in Organic Synthesis col. Vol. III, Seite 93 beschrieben wird, gefolgt von der Reduktion der resultierenden Nitrilgruppe durch katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natriumborhydrid/Cobaltchlorid, Boran-Methylsulidkomplex und dergleichen [cf. J. Med. Chem., 37, 222 (1994)].
Prozess G
Die N-Alkylierung der primären oder sekundären Aminogruppe, die in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durch die herkömmliche reduktive Alkylierung mit Aldehydderivaten mit der Formel (V) unter Verwendung eines Reduktionsmittels wie z.B. Natriumcyanobor hydrid in der Gegenwart oder Abwesenheit einer schwachen Säure wie z.B. Essigsäure durchgeführt werden.
Die Reaktion kann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Essigsäure und dergleichen durchgeführt werden.
Prozess H
Beispiele für die Verbindung (R¹²-Q) mit der Formel (VI) für die Substitutionsreaktion sind 2-Brom-5-nitropyridin, 2-Chlorpyrimidin, Chlorpyrazin und dergleichen.
Die Substitutionsreaktion kann bei einer Temperatur zwischen -20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C, in einem Lösungsmittel wie z.B. Acetonitril, N,N-Dimethylformamid und dergleichen in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Säurefängers wie z.B. Kaliumcarbonat, Triethylamin, Diisopropylethylamin und dergleichen durchgeführt werden.
Prozess J
Die erste Mono-N-alkylierung einer Aminogruppe, die in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durch das Verfahren durchgeführt werden, das in Prozess F beschrieben wird. Die anschließende N-Acylierung kann durch das Verfahren durchgeführt werden, das in Prozess E und I beschrieben wird.
Prozess K
Die Umwandlung einer Aminogruppe, die in R¹ der Formel (I) vorliegt, in eine Guanidinogruppe kann durch ein aktiviertes Amidinderivat wie z.B. 3,5-Dimethyl-1H-pyrazol-1-carboxamidin, Formamidinsulfonsäure, Benztriazol-1-carboxamidiniumtosylat und dergleichen durchgeführt werden.
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Wasser, N,N-Dimethylformamid und dergleichen bei einer Temperatur zwischen 0°C und -50°C, vorzugsweise bei 20°C bis -30°C, durchgeführt werden.
Prozess L
Die O-Alkylierung einer Hydroxygruppe des Tyrosinrestes in der Formel (I) kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten bekannt ist, in der Gegenwart eines Säurefängers wie z.B. Natriumcarbonat, Diisopropylethylamin und dergleichen [Can. J. Chem., 36, 1521 (1958)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Aceton, N,N-Dimethylformamid und dergleichen bei einer Temperatur zwischen 0°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C, durchgeführt werden.
Prozess M
Die Iodierung an der ortho-Position der Phenolgruppe in einem Tyrosinrest kann durch die Behandlung von Aerothricinen mit der Formel (I), wobei R² Wasserstoff ist, mit Iodmonochlorid oder Natriumiodid/wässriges Natriumhypochlorit in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Die mit Palladium(0) katalysierte Kopplungsreaktion mit Kohlenmonoxid, Methylacrylat und dergleichen kann durchgeführt werden, indem ein Palladium(0)-Katalysator wie z.B. Pd(OAc)₂, Pd(OAc)₂(dppp)₂ in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, N,N-Dimethylformamid, Acetonitril und dergleichen in der Gegenwart einer Base wie z.B. Triethylamin bei einer Temperatur zwischen 20°C und +100°C, vorzugsweise bei 20°C bis +70°C, verwendet wird [Bioorg. Med. Chem. Lett., 7 (22), 2879 (1997)].
Prozess N
Die Dehydratisierung der Carbamoylgruppe (R⁵) der Formel (I) kann durch das Burgess-Reagenz [erhältlich bei Aldrich], Cyanurchlorid, Oxalylchlorid und dergleichen durchgeführt werden [cf. J. Med. Chem., 37, 222 (1994)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Prozess O
Die Reduktion der Carbamoylgruppe oder Cyanogruppe (R⁵) der Formel (I) kann durch Natriumborhydrid/Cobaltchlorid, Boran-Methylsulfid-Komplex und dergleichen durchgeführt werden [cf. J. Med. Chem., 37, 222 (1994)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Prozess P
Die Hydroxysulfonierung des Tyrosinrestes der Formel (I) kann durch den Schwefeltrioxid-DMF-Komplex, Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex oder Schwefeltrioxid-Triethylamin-Komplex in einem Lösungsmittel wie z.B. N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon,1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran und dergleichen bei einer Temperatur zwischen -30 bis +70°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt werden [cf. J. Chem. Soc. Perkin Trans, (6) 1739 (1990)].
Prozess Q
Die Reaktionen, die an diesem Prozess beteiligt sind, können durch Verfahren durchgeführt werden, die ähnlich sind zu denen, die in den Prozessen B-O beschrieben werden.
Das Ausgangsmaterial, ein lineares Peptid mit der Formel (IX), kann erhalten werden, indem ein Mikroorganismus, der zu Deuteromycotina gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen oder einem festen Medium kultiviert wird und ein lineares Peptid mit der Formel (IX) aus der Kultur isoliert wird.
Der Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann irgendein Stamm, einschließlich Mutanten und Varianten, sein, der zu Deuteromycotina gehört, der in der Lage ist, ein lineares Peptid mit der Formel (IX) zu erzeugen. Besonders bevorzugt ist der Stamm NR 7379, welcher aus abgefallenen Blättern, die in Kagoshima pref. in Japan gesammelt wurden, isoliert wurde und als ein Stamm, der zu Deuteromycotina gehört, identifiziert wurde.
Der Stamm, der als Deuteromycotina NR 7379 bezeichnet wurde, wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan am 16. Juni 1998 unter dem Budapester Vertrag wie folgt hinterlegt: Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391).
Die Kultivierung nach dem Verfahren, das von der vorliegenden Erfindung bereit gestellt wird, kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, welches gebräuchliche Nährstoffe enthält, die von den Mikroorganismen, die kultiviert werden, verwendbar sind. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerol, Molassen, Dextrin und Mischungen von diesen erwähnt werden. Stickstoffquellen sind beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen von diesen. Darüber hinaus können zu dem Kulturmedium andere organische oder anorganische Substanzen zur Förderung des Wachstums des Mikroorganismus und zum Erhöhen der Produktion eines linearen Peptids mit der Formel (IX) zugegeben werden. Beispiele für solche Substanzen sind anorganische Salze wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und dergleichen.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einem flüssigen Medium durch Tauchfermentation oder in einem festen Medium durch statische Fermentation durchgeführt. Eine Temperatur von 20°C bis 30°C, mit einer optimalen Temperatur von 27°C, ist zur Kultivierung geeignet. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9 durchgeführt. Die Kultivierungsdauer hängt von den Bedingungen ab, unter welchen die Kultivierung durchgeführt wird. Im Allgemeinen ist es ausreichend, die Kultivierung für 120 bis 672 h durchzuführen.
Zum Ernten des angestrebten linearen Peptids mit der Formel (IX) aus den Kulturen können Trennmethoden, welche gewöhnlich eingesetzt werden, um Metaboliten, die von Mikroben erzeugt wurden, aus ihren Kulturen zu isolieren, passend verwendet werden. Beispielsweise wird ein lineares Peptid mit der Formel (IX), welches eine mit Methanol extrahierbare amphotere Substanz ist, vorteilhaft durch die folgenden Prozeduren gewonnen.
Das heißt, die kultivierte Nährlösung, die durch Flüssigfermentation erhalten wurde, wird mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, um das vorgeschlagene Produkt zu gewinnen. Die Lösungsmittel, welche verwendet werden können, um die angestrebte Verbindung aus der kultivierten Nährlösung zu extrahieren, beinhalten wasserlösliche organische Lösungsmittel oder wasserhaltige Lösungen wasserlöslicher organischer Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und wasserhaltige Alkohole oder ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel wie z.B. n-BuOH.
Zur Entfernung von Salzen, wasserlöslichen Substanzen usw. aus dem resultierenden Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelverteilung zwischen Wasser und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie z.B. n-Butanol, Ethylacetat usw. angewendet. Zur Entfernung von färbenden Substanzen, fettlöslichen Substanzen oder dergleichen aus dem Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelreinigung durch Methanol, Ethanol, eine Mischung von Acetonitril - 0,1% wässrige Trifluoressigsäure usw. angewendet.
Zur vollständigen Reinigung eines linearen Peptids mit der Formel (IX) wird vorteilhaft eine Säulenchromatographie verwendet. Träger, die bei einer solchen Säulenchromatographie verwendet werden können, sind solche wie Capcel Pak C18 UG80 (Shiseido Co. LTD, Japan). Als ein Elutionsmittel wird ein Lösungsmittelsystem angewendet, das aus einer Mischung von wässriger Trifluoressigsäure und geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol, Acetonitril usw. besteht. Die so gereinigte Eluatfraktion, welche ein lineares Peptid mit der Formel (IX) enthält, kann einer Konzentrierung oder einem Gefriertrocknen unterzogen werden, um ein lineares Peptid mit der Formel (IX) zu pulverisieren.
Ein lineares Peptid mit der Formel (IX) wurde als ein Trifluoressigsäuresalz isoliert, aber das freie lineare Peptid mit der Formel (IX) kann durch die folgende Prozedur hergestellt werden. Das Trifluoressigsäuresalz des linearen Peptids mit der Formel (IX) wird nämlich in Wasser gelöst, zu welchem ein Äquivalent Natriumhydroxid zugegeben wurde, und die Mischung wird einer Sephadex LH-20-Säulenchromatographie unterzogen, gefolgt von einer Flution mit einem wasserhaltigen Alkohol wie z.B. Methanol-Wasser usw., um dadurch ein lineares Peptid mit der Formel (IX) zu erhalten.
Das lineare Peptid mit der Formel (IX), das von der vorliegenden Erfindung bereit gestellt wird, zeigt keinerlei fungizide Aktivität gegenüber verschiedenen Pilzen, kann jedoch ein Schlüsselintermediat sein, um ein wirksames antifungales Mittel wie z.B. Aerothricine zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Säureadditionssalze der Aerothricine. Das Säureadditionssalz kann nach einem normalen Verlauf der Isolation als Trifluoressigsäuresalz erhalten werden. Das so erhaltene Salz kann in Wasser gelöst werden und durch eine Anionenaustauschersäule geleitet werden, welche das gewünschte Anion trägt. Das Eluat, welches das gewünschte Salz enthält, kann konzentriert werden, um das Salz als ein festes Produkt zu gewinnen.
Die Aerothricine mit der Formel (I) können mit Hilfe des Vorliegens der tertiären Stickstoffatome in ein entsprechendes Salz umgewandelt werden.
Das Säureadditionssalz der Aerothricine mit der Formel (I) kann durch Behandlung der freien Base der Aerothricine mit wenigstens einer stöchiometrischen Menge einer geeigneten Säure wie z.B. Mineralsäuren, z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen, und organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen, erhalten werden. Typischerweise wird die freie Base in einem inerten organischen Lösungsmittel wie z.B. Ethanol, Methanol und dergleichen gelöst und die Säure in einem ähnlichen Lösungsmittel zugegeben. Die Temperatur wird bei ca. 40°C gehalten. Das resultierende Salz fällt spontan aus oder kann mit einem weniger polaren Lösungsmittel aus der Lösung gebracht werden.
Die Säureadditionssalze der Aerothricine mit der Formel (I) können durch Behandlung mit wenigstens einer stöchiometrischen Menge einer geeigneten Base wie z.B. Natrium- oder Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Ammoniak und dergleichen in die entsprechende freie Base umgewandelt werden.
Aerothricine, die von der vorliegenden Erfindung bereit gestellt werden, zeigen eine breite fungizide Aktivität gegenüber verschiedenen Pilzen und können als Mittel zur Behandlung und Prophylaxe von Pilzinfektionskrankheiten verwendet werden. Die antifungale Aktivität in vitro und in vivo (siehe Tabellen 2 und 3) wie auch die Toxizität für Hepatozyten (siehe Tabelle 4) von repräsentativen Aerothricinen mit der Formel (I) werden wie folgt gezeigt:
1. Antifungale Aktivitäten in vitro
Die antifungalen Aktivitäten in vitro der repräsentativen Aerothricine der vorliegenden Untersuchung wurden ausgewertet, indem die 50% inhibitorische Konzentration (IC₅₀) bestimmt wurde, welche berechnet wurde als die niedrigste Konzentration eines antifungalen Mittels, um das Wachstum des Pilzes im Vergleich mit dem Arzneimittel-freien Kontrollwachstum spektrophotometrisch auf 20% Trübung zu inhibieren.

Die IC₅₀-Werte wurden durch die Nährlösungs-Mikroverdünnungsprozedur, die auf dem anerkannten NCCLS-Standard basiert, bestimmt, mit den folgenden kleineren Modifikationen (National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1997) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts. Approved standard. Document M27-A). Hefe-Stickstoff-Base (YNB; Difco Lab.), ergänzt mit 1% Glucose und 0,25% K₂HPO₄, wurde als Testmedium für Hefe verwendet, dasselbe Medium verfestigt mit 0,2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (BRL) wurde für filamentöse Pilze verwendet. Die Größe des Inokulums war 1-3 × 10⁴ Zellen/ml, und die Inkubation wurde für 1-2 Tage bei 35°C durchgeführt. Tabelle 2: Antifungale Aktivität in vitro, IC₅₀ (μg/ml)

	Candida albicans	Aspergillus fumigatus	Fusarium solani
	CY1002	CF1003	CF1088
Aerothricin 1	0,03	0,06	0,21
Aerothricin 5	0,03	0,07	0,19
Aerothricin 12	0,09	0,10	2,20
Aerothricin 31	0,07	0,49	0,70
Aerothricin 36	0,08	0,05	1,00
Aerothricin 39	0,09	0,17	0,70
Aerothricin 41	0,08	0,03	2,40
Aerothricin 43	0,05	0,04	0,70
Aerothricin 45	0,07	0,08	2,30
Aerothricin 46	0,09	0,08	1,80
Aerothricin 47	0,09	0,11	1,40
Aerothricin 53	0,11	0,09	2,30
Aerothricin 54	0,15	0,17	0,74
Aerothricin 55	0,04	0,04	0,39
Aerothricin 57	0,14	0,05	1,30
Aerothricin 75	0,15	0,10	1,40
Aerothricin 77	0,13	0,10	0,67
Aerothricin 95	0,14	0,10	0,74

2. Antifungale Wirksamkeit in vivo

Die antifungale Wirksamkeit in vivo der Aerothricine der vorliegenden Erfindung ist in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Mäuse eines konventionellen immunkompetenten Mäusestamms, Crj: CD-1 (ICR), wurden für experimentelle Infektionsmodelle der systemischen Candidiase verwendet. 4 Wochen alte Crj: CD-1 (ICR)-Mäuse wurden für eine systemi sche Candidiase verwendet, indem Candida albicans, 5 × 10⁶ Konidien/Maus, über die Schwanzvene injiziert wurden. Die Behandlungen wurden am ersten Tag zweimal (0,4 h nach der Infektion) und einmal täglich an den folgenden 2 Tagen für eine systemische Candidiase verabreicht (b.i.d. × 1 Tag, gefolgt von q.d. × 2 Tage), intravenös (i.v.). Werte der 50% effektiven Dosis (ED₅₀) wurden aus der Anzahl Überlebender bei jeder Dosis am Tag 14 berechnet. Tabelle 3: Antifungale Aktivität in vivo gegenüber systemischer Candidiase bei Mäusen, ED₅₀ (mg/kg) am Tag 14

Aerothricin 5	0,3
Aerothricin 16	0,3
Aerothricin 18	0,6
Aerothricin 36	0,6
Aerothricin 41	0,3
Aerothricin 42	0,6
Aerothricin 45	0,3
Aerothricin 46	0,4
Aerothricin 50	<0,3
Aerothricin 55	<0,3
Aerothricin 65	0,6

3. Hepatotoxizitätstest in vitro

Die Maushepatozyten wurden durch einen Kollagenaseverdau isoliert und in Mikrotestplatten kultiviert. Die Hepatozytenmonolayers wurden den Testaerothricinen in dem Kultursystem für 1 Tag ausgesetzt. Nach der Kultivierungsperiode wurden die Hepatozyten unter einem Mikroskop beobachtet und morphologisch ausgewertet. Der Grad der morphologischen Veränderung (Degeneration) der Hepatozyten durch die Testaerothricine wurde mit WF11243 und LY303366 verglichen. Tabelle 4: Zytotoxizität für Hepatozyte (μg/ml)

Aerothricin 14	>100
Aerothricin 15	>100
Aerothricin 21	>100
Aerothricin 34	>100
Aerothricin 38	>100
Aerothricin 45	>100
Aerothricin 47	>100
Aerothricin 48	>100
Aerothricin 53	>100
Aerothricin 65	>100
Aerothricin 67	>100
Aerothricin 72	>100
Aerothricin 81	>100
WF11243	100
(= Aerothricin 3)
LY303366	10

Die Verabreichung von 5 mg/kg und 30 mg/kg Aerothricin 1 an Mäuse für 4 Wochen zeigte keine akute Toxizität.
Daher zeigen die neuen Aerothricine mit der Formel (I) wie auch pharmazeutisch vertragliche Salze von diesen gegenüber verschiedenen Pilzinfektionen, einschließlich Aspergillose, bei Mäusen über einen weiten Bereich von Dosierungen eine starke antifungale Aktivität und sind als Antipilzmittel nützlich. Darüber hinaus sind die Aerothricine, die von dieser Erfindung bereit gestellt werden, viel weniger zytotoxisch für Hepatozyten als die bekannten cyclischen Peptidderivate (WF11243 und LY303366).
Die Aerothricine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nützlich sein, um Infektionen mit Pneumocystis carinii bei Patienten mit beeintrachtigtem Immunsystem zu hemmen oder zu lindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die neuen Aerothricine mit der Formel (I) wie auch pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen enthalten.
Die neuen Aerothricine mit der Formel (I) wie auch pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen sind in hohem Maße aktive fungizide Mittel. Sie sind aktiv gegenüber einer Vielzahl von Pilzspezies einschließlich Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Mucor spp. und Absidia spp..
Somit sind die Aerothricine der vorliegenden Erfindung nützlich für die topische und systemische Behandlung von Mykosen bei Tieren wie auch bei Menschen. Beispielsweise sind sie nützlich beim Behandeln topischer und mukosaler Pilzinfektionen, die durch Candida spp., Trichophyton spp. und Microsporum spp. hervorgerufen werden. Sie können ebenfalls bei der Behandlung systemischer Pilzinfektionen verwendet werden, die beispielsweise durch Candida spp., Aspergillus spp. oder Fusarium spp. hervorgerufen werden.
Zur klinischen Anwendung können die neuen Aerothricine mit der Formel (I) wie auch pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen allein verabreicht werden; diese werden aber im Allgemeinen in pharmazeutischer Beimischung verabreicht werden, die wie für die bestimmte Anwendung und den gewünschten Zweck geeignet formuliert wird, indem Träger, Bindemittel, Gleitmittel, Desintegrationsmittel, Beschichtungsmaterial, Emulgator, Suspensionsmittel, Lösungsmittel, Stabilisator, Absorptionsverstärker und/oder Salbengrundstoff beigemischt werden. Die Beimischung kann zur oralen, Injektions-, nasalen, rektalen oder topischen Verabreichung verwendet werden.
Pharmazeutische Formulierungen von Aerothricinen zur oralen Verabreichung können Granalie, Tablette, Dragee, Kapsel, Pille, Suspension oder Emulsion sein. Zur parenteralen Injektion, z.B. intravenös, intramuskulär oder subkutan, können Aerothricine mit der Formel (I) in der Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, welche andere Substanzen, z.B. Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthalten kann. Diese Zusammensetzungen können ebenfalls in Einzeldosisform in Ampullen oder in Behältern für mehrere Dosen, vorzugsweise mit zugegebenen Konservierungsstoffen, prä sentiert werden. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Pulverform vorliegen, um mit einem geeigneten Vehikel vor der Verabreichung rekonstituiert zu werden. Aerothricine können ebenfalls in der Form eines Suppositoriums oder Pessars verabreicht werden, oder sie können topisch in der Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Puders aufgetragen werden.
Das tägliche Dosierungsniveau der Aerothricine mit der Formel (I) beträgt von 0,1 bis 50 mg/kg (in unterteilten Dosen), wenn diese entweder über den oralen oder parenteralen Weg verabreicht werden. So kann erwartet werden, dass Tabletten oder Kapseln mit Aerothricinen von 5 mg bis 0,5 g der aktiven Verbindung, zur Verabreichung wie geeignet einzeln oder zwei oder mehr gleichzeitig, enthalten. In jedem Fall kann die tatsächliche Dosierung von dem Arzt bestimmt werden, und sie kann entsprechend dem Alter, Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten verändert werden.
Wenn Aerothricine zur antifungalen Anwendung gedacht sind, kann jedes Verfahren der Verabreichung eingesetzt werden. Zur Behandlung mykotischer Infektionen wird gewöhnlich die orale oder intravenöse Verabreichung eingesetzt.
Wenn Aerothricine zur Bekämpfung von Pneumocystis-Infektionen eingesetzt werden sollen, ist es wünschenswert, Lunge und Bronchien direkt zu behandeln. Aus diesem Grund sind Inhalationsverfahren bevorzugt. Zur Verabreichung durch Inhalation oder nasal werden die Aerothricine der vorliegenden Erfindung geeigneterweise in der Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck stehenden Packungen oder Zerstäubern abgegeben. Das bevorzugte Abgabesystem zur Inhalation oder nasal ist ein Inhalationsaerosol mit abgemessenen Dosen, welches als ein Pulver, eine Suspension oder Lösung einer Verbindung mit der Formel (I) in geeigneten Treibmitteln wie z.B. Fluorkohlenwasserstoffen oder Kohlenwasserstoffen formuliert werden kann.
Auch wenn die Aerothricine der vorliegenden Erfindung als Tabletten, Kapseln, topische Zusammensetzungen, Insufflationspulver, Suppositorien und dergleichen eingesetzt werden können, macht die Löslichkeit der Aerothricine der vorliegenden Erfindung in Wasser und wässrigen Medien diese für eine Verwendung in injizierbaren Formulierungen und ebenfalls in flüssigen Zusammensetzungen, die für Aerosolsprays geeignet sind, verwendbar.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Aerothricinen der vorliegenden Erfindung, wobei diese nicht dazu gedacht sind, den Umfang der Erfindung darauf zu beschränken.

In den folgenden Beispielen wurden die Produkte durch HPLC analysiert und gereinigt, indem eine Umkehrphasensäule, die aus den unten aufgelisteten ausgewählt wurde, verwendet wurde. Das gemischte Lösungsmittel bestand aus 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril, wobei das passende Verhältnis in jedem Arbeitsbeispiel beschrieben wird. HPLC-Säulen:

Säule A:	CAPCELL PAK C18, UG-120, 4,6 × 250 mm
Säule B:	CAPCELL PAK C18, UG-120, 10 × 250 mm
Säule C:	CAPCELL PAK C18, UG-80, 20 × 250 mm
Säule D:	CAPCELL PAK C18, SG-120, 4,6 × 250 mm
Säule E:	CAPCELL PAK C18, SG-120, 10 × 250 mm
Säule F:	TSK GEL ODS-80Ts, 20 × 250 mm

In den folgenden Arbeitsbeispielen wurden die Aerothricine, sofern nichts anderes angegeben ist, als Trifluoressigsäuresalze erhalten.
Referenzbeispiel 1
Herstellung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure
a) Herstellung von 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl
Zu einer gerührten Lösung von 4-Brom-4'-hydroxybiphenyl (5,05 g, 20,2 mmol) in DMF (100 ml) wurden K₂CO₃ (4,20 g, 30,4 mmol) und 1-Bromheptan (4,14 ml, 26,4 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 80°C erwärmt. Nachdem sie bei 80°C für 20 h gerührt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Mischung wurde mit Et₂O (250 ml) verdünnt, und dann wurde die Lösung mit gesätt. Kochsalzlösung (brine) (150 ml × 2) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde aus CH₂Cl₂-Petrolether umkristallisiert, was 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl (6,21 g, 88%) als einen weißen Feststoff ergab; FAB-MS: m/z 347 [MH⁺].
b) Herstellung von 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl
Zu einer kalten (0°C) gerührten Lösung von 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl (6,21 g, 17,9 mmol) in THF (120 ml) wurde n-BuLi (1,66 M Lösung in Hexan, 32,3 ml, 53,6 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei 0°C für 20 min gerührt worden war, wurde DMF (4,85 ml, 62,6 mmol) bei -78°C zugegeben. Die Mischung wurde bei -78°C für zusätzliche 20 min gerührt und dann mit gesätt. wässrigem NH₄Cl abgeschreckt. Die Mischung wurde mit EtOAc (220 ml) verdünnt und dann nacheinander mit gesätt. wässrigem NH₄Cl (125 ml) und gesätt. Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 1:20) gereinigt, was 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl (2,21 g, 42%) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
c) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester
Zu einer gerührten Lösung von 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl (2,21 g, 7,46 mmol) in Benzol (40 ml) wurde Ph₃P=CHCOOEt (5,19 g, 14,9 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 60°C erwärmt. Nachdem sie bei 60°C für 3 h gerührt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (CH₂Cl₂/Hexan, 1:2) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester (2,66 g, 97%) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
FAB-MS: m/z 367 [MH⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,25-1,55 (m, 8H), 1,35 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,81 (quint, J = 6,6 Hz, 2H), 4,00 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 6,46 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 6,94-7,00 (m, 2H), 7,50-7,60 (m, 6H), 7,72 (d, J = 16,0 Hz, 1H).
d) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester
Zu einer gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester (2,65 g, 7,23 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) wurde Palladium auf Aktivkohle (Pd ca. 10 Gew.-%, 1,07 g) zugegeben, und dann wurde die Mischung unter eine H₂-Atmosphäre gesetzt. Nachdem sie für 2 h gerührt worden war, wurde die Mischung durch ein Kissen aus Celite filtriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und in vacuo konzentriert, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester (roh, 2,74 g) ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,25 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 1,29-1,56 (m, 8H), 1,75-1,86 (m, 2H), 2,65 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,98 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,14 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 6,93-6,98 (m, 2H), 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,43-7,52 (m, 4H).
e) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol
Zu einer kalten (0°C) gerührten Suspension von LiAlH₄ (0,47 g, 12,4 mmol) in THF (20 ml) wurde eine Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester (roh, 2,74 g) in THF (30 ml) zugegeben. Nachdem sie für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung mit H₂O bei 0°C abgeschreckt. Die Mischung wurde durch ein Kissen aus Celite filtriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 2:3) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol (2,27 g, 96% für 2 Schritte) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
EI-MS: m/z 326 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21-1,55 (m, 8H), 1,81 (quint, J = 6,6 Hz, 2H), 1,86-2,00 (m, 2H), 2,75 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,71 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 6,92-7,00 (m, 2H), 7,25 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,44-7,55 (m, 4H).
f) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd
Zu einer kalten (0°C) gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol (2,26 g, 6,92 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) wurden Molekularsiebe 4A-Pulver (5,17 g) und PCC (5,25 g, 24,4 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Et₂O (20 ml) zu der Mischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf eine kurze Kieselgelsäule überführt und mit CH₂Cl₂ eluiert. Das Eluat wurde in vacuo konzentriert, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd (roh, 2,45 g) ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
g) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert-butylester
Zu einer gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd (roh, 2,45 g) in Benzol (150 ml) wurde Ph₃P=CHCOOt-Bu (5,21 g, 13,8 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 60°C erwärmt. Nachdem sie für 30 min bei 60°C gerührt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 1:30) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert-butylester (1,95 g, 67% für 2 Schritte) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
EI-MS: m/z 422 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,21-1,51 (m, 8H), 1,49 (s, 9H), 1,74-1,87 (m, 2H), 2,47-2,58 (m, 2H), 2,79 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 5,81 (d.t., J = 1,5 Hz, 15,5 Hz, 1H), 6,87-7,01 (m, 3H), 7,23 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,44-7,53 (m, 4H).
h) Herstellung von (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester
Zu einer kalten (0°C) gerührten Suspension von (R)-N-Benzyl-1-phenylethylaminhydrochlorid (3,28 g, 13,2 mmol) in THF (40 ml) wurde n-BuLi (1,61 M Lösung in Hexan, 15,0 ml, 24,2 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 25 min bei 0°C gerührt worden war, wurde eine Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert-butylester (1,94 g, 4,38 mmol) in THF (30 ml) bei -78°C zugegeben. Nachdem die Mischung für zusätzliche 20 min bei -78°C gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung mit gesätt. wässrigem NH₄Cl abgeschreckt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit gesätt. wässrigem NH₄Cl (200 ml) verdünnt und dann mit CH₂Cl₂ (200 ml × 2) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc(Hexan, 1:40) gereinigt, was (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (2,83 g, quant.) als ein farbloses 01 ergab.
EI-MS: m/z 633 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,91 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,24-1,55 (m, 13H), 1,38 (s, 9H), 1,57-2,04 (m, 6H), 2,52-2,69 (m, 1H), 2,97-3,10 (m, 1H), 3,37-3,49 (m, 1H), 3,55 (ABq, J = 15,0 Hz, 1H), 3,85 (ABq, J = 15,0 Hz, 1H), 3,88 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,16 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,21-7,53 (m, 16H).
i) Herstellung von (R)-3-Amino-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (2,82 g, 4,45 mmol) in EtOAc (50 ml) wurden AcOH (2,5 ml) und Pd(OH)₂ auf Kohlenstoff (Pd(OH)₂ ca. 20 Gew.-%, 1,07 g) zugegeben, und dann wurde die Mischung unter eine H₂-Atmosphäre gesetzt. Nachdem sie für 15 h gerührt worden war, wurde die Mischung durch ein Kissen aus Celite filtriert und mit MeOH gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und in vacuo konzentriert, was (R)-3-Amino-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (roh, 3,14 g) ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
j) Herstellung von (R)-3 -(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansure-tert-butylester
Zu einer gerührten Suspension von (R)-3-Amino-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (roh, 3,14 g) in 50% wässrigem 1,4-Dioxan (40 ml) wurden Na₂CO₃ (1,19 g, 11,2 mmol) und FmocCl (1,28 g, 4,95 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 1 h gerührt worden war, wurde die Mischung mit gesätt. Kochsalzlösung (100 ml) verdünnt und mit CH₂Cl₂ (100 ml × 3) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert, was (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (roh, 3,34 g) ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
FAB-MS: m/z 668 [M⁺ + Li],
¹H-NMR: δ 0,81 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,15-1,44 (m, 8H), 1,35 (s, 9H), 1,62-1,93 (m, 4H), 2,29-2,68 (m, 4H), 3,84-4,02 (m, 1H), 3,88 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,13 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 4,25-4,41 (m, 2H), 5,27 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,06-7,42 (m, 10H), 7,51 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,66 (d, J = 7,6 Hz, 2H).
k) Herstellung von (R)-3-(9-Fluorenylmethyloxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert-butylester (roh, 3,34 g) in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde tropfenweise TFA (20 ml) zugegeben. Nachdem sie für 1 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (MeOH/CH₂Cl₂, 1:20) gereinigt, was (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure (2,07 g, 77% in 3 Schritten) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
FAB-MS: m/z 606 [MH⁺],
¹H-NMR: δ 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,21-1,51 (m, 8H), 1,64-2,04 (m, 2H), 1,78 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,27-2,78 (m, 4H), 3,91-4,07 (m, 1H), 3,96 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,20 (t, J = 6,6 Hz, 1 H), 4,34-4,56 (m, 2H), 5,09-5,28 (m, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,10-7,49 (m, 10H), 7,57 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,73 (d, J = 7,3 Hz, 2H).
Die Ausgangsverbindungen mit der Formel (IV) [wobei Y eine Einfachbindung oder -CH₂-ist], die in Prozess B verwendet wurden, wurden nach einem Verfahren hergestellt, das zu dem oben beschriebenen ähnlich war.
Referenzbeispiel 2
Herstellung von (S)-3-(9H-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure

a) Zu einer Lösung von (S)-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)bernsteinsäure (150 mg, 0,36 mmol), BOP-Reagens (162 mg, 0,36 mmol) und HOBT-Hydrat (56 mg, 0,36 mmol) in N,N-Dimethylformamid (0,2 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (64 μl, 0,36 mmol) zugegeben. Nachdem für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde 1-Aminoundecan (79 μl, 0,37 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt und mit Et₂O extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch Kieselgelsäulenchromatographie (unter Verwendung von n-Hexan:Ethylacetat = 3:1 als einem Elutionsmittel) ergab (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure-tert-butylester (169 mg, 82% Ausbeute) als einen farblosen amorphen Feststoff. FAB-MS (m/z): 565 [MH⁺], ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0,88 (3H, t, J = 7 Hz), 1,24 (16H, m), 1,45 (11H, m), 2,58 (1H, dd, J₁ = 17 Hz, J₂ = 7 Hz), 2,91 (1H, dd, J₁ = 17 Hz, J₂ = 4 Hz), 3,23 (2H, q, J = 7 Hz), 4,22 (1H, t, J = 7 Hz), 4,42-4,45 (3H, m), 5,94 (1H, breites d, J = 8 Hz), 6,43 (1H, breites s), 7,31 (2H, t, J = 7 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7 Hz), 7,58 (2H, d, J = 7 Hz), 7,77 (2H, d, J = 7 Hz).
b) Eine Lösung von (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure-tert-butylester (113 mg, 0,2 mmol) in TFA (2 ml) wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt. Nach Abschluss der Reaktion wurde TFA durch Verdampfung in vacuo entfernt. Die Reinigung des Rückstands durch Kiesegel säulenchromatographie (unter Verwendung von Dichlormethan:Methanol = 9:1 als einem Elutionsmittel) ergab (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure (101 mg, 99% Ausbeute) als einen farblosen amorphen Feststoff. FAB-MS (m/z): 507 [MH⁺], ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0,87 (3H, t, J = 7 Hz), 1,23 (16H, m), 1,46 (2H, m), 2,62-2,80 (1H, m), 2,90-3,05 (1H, m), 3,21 (2H, m), 4,20 (1H, t, J = 7 Hz), 4,44 (2H, d, J = 6 Hz), 4,53 (1H, breites s), 5,98 (1H, m), 6,52 (1H, breites s), 7,30 (2H, t, J = 7 Hz), 7,40 (2H, t, J = 7 Hz), 7,56 (2H, d, J = 7 Hz), 7,76 (2H, d, J = 7 Hz).

Die Ausgangsverbindungen mit der allgemeinen Formel (IV) [wobei Y -CONH- oder -CON(CH₃)- ist], die in dem Prozess B verwendet wurden, wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Referenzbeispiel 3
Herstellung von N-Boc-Aerothricin 3 (Verbindung A)
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (10,0 g, 6,07 mmol) in MeOH (1500 ml) wurden nacheinander Triethylamin (2,54 ml, 18,2 mmol), Di-tert-butyldicarbonat (13,9 ml, 60,7 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 18 h gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in MeOH (ca. 10 ml) gelöst, und die Lösung wurde zu dem Diethylether (1500 ml) zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde filtriert und mit Diethylether gewaschen, was 9,9 g N-Boc-Aerothricin 3 (Verbindung A) als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab, welcher zur weiteren strukturellen Modifikation in den Arbeitsbeispielen, die nachstehend beschrieben werden, ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Beispiel 4
Herstellung der Aerothricine 1, 2 und 3
a) Feststofffermentation
Eine 0,1 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 2% Glucose, 1% Kartoffelstärke, 1,5% Glycerol, 1% Toast-Soja (Nissin Seiyu), 0,35% Hefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Polypepton (Nihon Seiyaku), 0,3% NaCl, 0,5% CaCO₃, 0,005% ZnSO₄·7H₂O, 0,0005% CuSO₄·5H₂O und 0,0005% MnSO₄·4H₂O bestand. Der pH des Mediums wurde nicht eingestellt. Die Impfkultur wurde auf einem Rotationsschüttler bei 27°C für 7 Tage bei 220 Upm inkubiert. 2 ml der Impfkultur wurden in einen 3 Liter-Erlenmeyerkolben überführt, welcher ein festes Medium enthielt, das aus 200 g gepresster Gerste, 0,12 g Hefeextrakt (Difco), 0,06 g Natriumtartarat, 0,06 g KH₂PO₄ und 120 ml Wasser bestand. Die Fermentation wurde bei 27°C im Ruhezustand durchgeführt. Die Produktion erreichte das Maximum nach ca. 240 h der Fermentation, und die Kultur wurde der Isolationsprozedur für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
Zu dem erhaltenen kultivierten Feststoff (10 kg) wurde Methanol (40 L) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Abtrennungsfiltration folgte, um Methanolextrakt zu erhalten (39 L). Der so erhaltene Methanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, und zu dem Rückstand (64,8 g) wurden Ethylacetat (1 L) und Wasser (1 L) zugegeben; und die Mischung wurde gerührt, worauf die Entfernung der Ethylacetatschicht folgte.
Weiterhin wurde die wässrige Schicht in ähnlicher Weise zweimal mit Ethylacetat (1 L) gewaschen. Die verbleibende wässrige Schicht wurde dreimal mit n-Butanol (1 L) extrahiert. Die so erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, und der Rückstand (28,5 g) wurde in einer Mischung (250 ml) von Acetonitril-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (1:1) gelöst. Nach Entfernung der unlöslichen Materialien durch Zentrifugation wurde die so erhaltene Lösung unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit verdampft, und zu dem Rückstand wurde Methanol (300 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Abtrennungsfiltration folgte, um die Methanollösung (280 ml) zu erhalten. Die so erhaltenen in Methanol löslichen Materialien (9,3 g) wurden dann einer Säulenchromatographie auf einem Umkehrphasen-Kieselgel C18 (1 L) unterzogen. Die Säule wurde schrittweise unter Verwendung einer Mischung von Methanol-0,1% wässrige Trifluoressigsäure (2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 und 8:2) eluiert. Die Aerothricine 1, 2 und 3, die in dieser Reihenfolge mit Methanol-0,1% wässrige Trifluoressigsäure (7:3) eluierten, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um ein weißes pulverförmiges Aerothricin 3-Trifluoressigsäuresalz (731 mg) bzw. ein Aerothricin 1-Trifluoressigsäuresalz (747 mg) zu erhalten. Die Fraktionen, welche Aerothricin 2 enthielten, wurden unter vermindertem Druck konzentriert und weiter durch HPLC unter den folgenden Bedingungen gereinigt: Säule: Capcell Pak C18 (i.d. 30 × 250 mm, Shiseido Co., LTD.); mobile Phase: Acetonitril-0,1% wässrige Trifluoressigsäure (45:55); Fliessgeschwindigkeit: 40 ml/min; Detektion: UV 220 nm. Die geeigneten Eluate, die unter den obigen Bedingungen erhalten wurden, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um ein weißes pulverförmiges Aerothricin 2-Trifluoressigsäuresalz (42 mg) zu erhalten.
b) Fermentation im Kolben
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 1% Glucose, 1% Hafermehl, 4% Tomatenpaste, 0,5% Maisquellwasser (Ando kasei), 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4H₂O, 0,0001% CaCl₂, 0,0002% ZnSO₄·7H₂O, 0,00002% (NH₄)6MoO₂·4H₂O und 0,00006% H₃BO₃ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfkultur wurde auf einem Rotationsschüttler bei 27°C für 3 Tage bei 220 Upm inkubiert. 2 ml der ersten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Mediums enthielten, und auf einem Rotationsschüttler unter denselben Bedingungen für 3 Tage inkubiert. 2 ml der zweiten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, die 100 ml eines Mediums enthielten, das aus 8,5% Glycerol, 1% Pektin aus Zitrusfrüchten, 0,4% Erdnusspulver, 0,4% Casein aus Milch, vitaminfrei, 0,4% Tomatenpaste, 0,4% Maisquellwasser (Ando kasei), 0,2% Glycin und 0,2% KH₂PO₄ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Steri lisation auf 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Schütteln bei 220 Upm durchgeführt. Nach 10 Tagen Kultivierung erreichte die Produktion das Maximum, und die gesamte Kultur wurde der Isolationsprozedur für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
c) Fermentation im Gefäß (jar)
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml desselben Impfmediums, wie es oben beschrieben wurde, enthielt. Der Kolben wurde bei 220 Upm für 3 Tage bei 27°C geschüttelt. 2 ml der ersten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Impfmediums enthielten, und auf einem Rotationsschüttler unter denselben Bedingungen für 3 Tage inkubiert. Sechshundert ml der zweiten Impfkultur wurden in einem 50 Liter-Gefäßfermenter inokuliert, welcher 30 Liter desselben Produktionsmediums, wie es oben beschrieben wurde, und 0,4% Disfoam (Nissan Disfoam CA-123) enthielt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Belüftung mit 30 Litern/min und Schütteln bei 400 Upm durchgeführt. Die Produktion erreichte das Maximum nach ca. 168 h der Fermentation, und die gesamte Kultur wurde der Isolationsprozedur für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
Aerothricin 1

1) Erscheinungsbild: weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1547 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₂H₁₁₈N₁₄O₂₃
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1547,8568 Berechnet für C₇₂H₁₁₉N₁₄O₂₃: 1547,8572
5) UV-Spektrum (1): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225 ± 5 (10600 sh), 270±5 (2000), 278 ± 5 (2100) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240 ± 5 (7700), 268 ± 5 (1800), 298 ± 5 (1800)
6) IR-Spektrum (KBr) (2): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^-1) sind wie folgt: 3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837
7) ¹H-NMR-Spektrum (3): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR-Spektrum (4): 100 MHz, in CD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positive: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagens, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagens, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsaure
11) Dünnschichtchromatographie (DSC):

Träger	Lösungsmittel	Rf
Kieselgel F254^*1	n-BuOH:Aceton:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0,74
	MeOH:H₂O (95:5)	0,12

^*1 E. Merck AG., Deutschland

12) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 Gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 12,1 ± 0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 1 wurde bei 120°C in 6 N HCl für 24 h erhitzt, worauf ein Unterwerfen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei nachgewiesen wurden: Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Tyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Aerothricin 2

1) Erscheinungsbild: weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1549 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₁H₁₆N₁₄O₂₄
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1549,8384 Berechnet für C₇₁H₁₁₇N₁₄O₂₄: 1549,8365
5) UV-Spektrum (5): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225 ± 5 (10200 sh), 275 ± 5 (1900), 278 ± 5 (2000) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240 ± 5 (7700), 293 ± 5 (2000)
6) IR-Spektrum (KBr) (6): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^-1) sind wie folgt: 3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837
7) ¹H-NMR-Spektrum (7): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR-Spektrum (8): 100 MHz, in CD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positive: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagens, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagens, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
11) Dünnschichtchromatographie (DSC):

Träger	Lösungsmittel	Rf
Kieselgel F254^*1	n-BuOH:Aceton:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0,29
	MeOH:H₂O (95:5)	0,15

^*1 E. Merck AG., Deutschland

12) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 Gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 9,9 ± 0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 2 wurde bei 120°C in 6 N HCl für 24 h erhitzt, worauf ein Unterwerfen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei nachgewiesen wurden: Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, 3-Hydroxytyrosml (DOPA), Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Aerothricin 3

1) Erscheinungsbild: weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1533 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₃
4) UV-Spektrum: in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225 ± 5 (11000 sh), 275 ± 5 (2000), 280 ± 5 (1900) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 243 ± 5 (7800), 295 ± 5 (1800)
5) IR-Spektrum (KBr): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^-1) sind wie folgt: 3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836
6) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
7) Farbreaktion: Positive: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagens, Molybdophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagens, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
8) Dünnschichtchromatographie (DSC):

Träger	Lösungsmittel	Rf
Kieselgel F254^*1	n-BuOH:Aceton:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0,26
	MeOH:H₂O (95:5)	0,09

^*1 E. Merck AG., Deutschland

9) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 Gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 9,1 ± 0,5
10) Aminosäureanalyse: Aerothricin 3 wurde bei 120°C in 6 N HCl für 24 h erhitzt, worauf ein Unterwerfen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei nachgewiesen wurden: Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Tyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin.

Beispiel 5
Herstellung der Verbindung (IX)
1) Fermentation im Kolben
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 1% Glucose, 1% Hafermehl, 4% Tomatenpaste, 0,5% Maisquellwasser (Ando kasei), 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4H₂O, 0,0001% CaCl₂, 0,0002% ZnSO₄·7H₂O, 0,00002% (NH₄)₆MoO₂·4H₂O und 0,00006% H₃BO₃ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfkultur wurde auf einem Rotationsschüttler bei 27°C für 4 Tage bei 220 Upm inkubiert. 2 ml der Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welche 100 ml eines Mediums enthielten, das aus 8,5% Glycerol, 1% Pektin aus Zitrusfrüchten, 2% Erdnusspulver, 0,4% Casein aus Milch, vitaminfrei, 0,4% Tomatenpaste, 0,4% Glycin und 0,2% KH₂PO₄ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Schütteln bei 220 Upm durchgeführt. Nach 14 Tagen Kultivierung erreichte die Produktion das Maximum, und die gesamte Kultur wurde der Isolationsarbeit unterzogen.
Zu der erhaltenen kultivierten gesamten Nährlösung (1,9 L) wurde n-Butanol (2 L) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Die so erhaltenen Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert; und zu dem Rückstand wurden Hexan (500 ml) und Methanol (500 ml) zugegeben, und die so erhaltene Mischung wurde gerührt, worauf eine Entfernung der Hexanschicht folgte. Nach der Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck wurde der so erhaltene Rückstand mit einer Mischung von Hexan und Ethylacetat (1:1, 200 ml, zweimal) gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Zu dem Rückstand (3,9 g) wurde Wasser (20 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Zentrifugation folgte, um die Wasserlösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde dann einer Säulenchromatographie auf Umkehrphasen-Kieselgel C18 (200 L) unterzogen. Die Säule wurde zuerst mit 0,1% wässriger Trifluoressigsäure eluiert und wurde dann schrittweise unter Verwendung einer Mischung von Methanol-0,1% wässrige Trifluoressigsäure (1:9, 3:7, 5:5, 6:4, 7:3 und 8:2) eluiert. Die Verbindung (IX), die mit Methanol-0,1% wässrige Trifluoressigsäure (7:3) eluierte, wurde vereinigt, und die Lösung wurde mit 1 N wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert, worauf eine Konzentrierung in vacuo bis zur Trockenheit folgte. Zu dem so erhaltenen Rückstand wurden Wasser (10 ml) und n-Butanol (10 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Der so erhaltene Extrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um die Verbindung (IX) (96,9 mg) als ein weißes Pulver zu erhalten. Die weitere Reinigung, um die Verbindung (IX) zur Spektroskopie zu erhalten, wurde durch HPLC unter den folgenden Bedingungen erreicht: Säule: Capcell Pak C18 UG80 (i.d. 20 × 250 mm, Shiseido Co., LTD.); mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure/Acetonitril-0,05% Trifluoressigsäure/Wasser (38:62); Fliessgeschwindigkeit: 22,86 ml/min; Detektion: UV 210 nm. Die geeigneten Eluate, die unter den obigen Bedingungen erhalten wurden, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um weißes pulverförmiges Trifluoressigsäuresalz der Verbindung (IX) zu erhalten.
c) Fermentation im Gefäß
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml desselben Impfmediums, wie es oben beschrieben wurde, enthielt. Der Kolben wurde bei 220 Upm für 4 Tage bei 27°C geschüttelt. Zwei ml der ersten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Impfmediums enthielten, und auf einem Rotationsschüttler unter denselben Bedingungen für 3 Tage inkubiert. 600 ml der zweiten Impfkultur wurden in einem 50 Liter-Gefäßfermenter inokuliert, welcher 30 Liter desselben Produktionsmediums, wie es oben beschrieben wurde, und 0,4% Disfoam (Nissan Disfoam CA-123) enthielt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Belüftung mit 30 Litern/min und Schütteln bei 400 Upm durchgeführt. Die Produktion erreichte das Maximum nach ca. 278 h der Fermentation, und die gesamte Kultur wurde der Isolationsprozedur für die Verbindung (IX) unterzogen.
Verbindung (IX)

1) Erscheinungsbild: weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1317 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₅₉H₁₀₄N₁₂O₂₁
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1317,7555 Berechnet für C₅₉H₁₀₅N₁₂O₂₁: 1317,7517
5) UV-Spektrum: in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): Ende Absorption
6) IR-Spektrum (KBr) (9): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^-1) sind wie folgt: 3450, 2928, 1665, 1520, 1450, 1225, 1135
7) ¹H-NMR-Spektrum (10): 500 MHz, in DMSO-d₆
8) ¹³C-NMR-Spektrum (11): 125 MHz, in DMSO-d₆
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positive: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagens, Molybdophosphorsäure
Negativ: Sakaguchi-Reagens, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefel saure
11) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 UG80A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure/Acetonitril : 0,05% Trifluoressigsäure/Wasser = 38:62 Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 7,7 ± 0,5

Beispiel 6
Herstellung eines N-Boc-Derivats (N(orn)-Boc-IX) des Ornitinrestes der Verbindung (IX): Die Verbindung mit der Formel (XII: R⁶ = Boc)
Zu einer Lösung der Verbindung (IX), die in dem Beispiel 5 erhalten wurde (10,4 mg, 0,0073 mmol), in Dioxan-H₂O (0,43 ml -0,5 ml) wurden Triethylamin (3 μl) und eine 0,1 M Lösung von tert-Butyl-N-succinimidylcarbonat (0,0073 μl, 0,0073 mmol) in Dioxan bei Raumtemperatur zugegeben. Nachdem sie für 1,5 h gerührt worden war, wurde die Mischung mit Essigsäure angesäuert und wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab N(orn)-Boc-IX als einen farblosen amorphen Stoff (4,8 mg, 45% Ausbeute);
HPLC (Rt) 18,0 min (Säule: Soken-ODS, 20 × 250 mm, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient 1% Essigsäure); FAB-MS [M+Na]⁺ 1440.
Beispiel 7
Herstellung eines N-Boc-Derivats (N(val)-Boc-IX) des Valinrestes der Verbindung (IX):Die Verbindung mit der Formel (X: R⁷ = Boc)
Eine Mischung von der Verbindung (IX), die in dem Beispiel 5 erhalten wurde (15,0 mg, 0,0105 mol), Di-tert-butyldicarbonat (0,073 M in Methanollösung, 0,20 ml, 0,015 mmol) und Triethylamin (7,8 μl) in MeOH (3 ml) wurde bei 0°C für 24 h gerührt. Die Mischung wurde mit n-Hexan gewaschen [und] wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch Umkehrphasen-HPLC ergab das (N(val)-Boc-IX) als einen farblosen amorphen Stoff (1,0 mg, 6% Ausbeute);
HPLC (Rt) 16,0 min (Säule: Soken-ODS, 20 × 250 mm, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient 1% Essigsäure); FAB-MS [M+H]⁺ 1418.
Beispiel 8
Herstellung von Aerothricin 33
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-7-(4-pentyloxyphenyl)heptansäure (25,5 mg, 0,048 mmol) in DMF (0,5 ml) wurden BOP-Reagens (21,3 mg, 0,048 mmol), HOBT-Hydrat (7,5 mg, 0,049 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,0095 ml, 0,055 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 1 h gerührt worden war, wurde eine Lösung von Verbindung B [ = das lineare Peptid mit der Formel (III), wobei R² und R³ Wasserstoff sind, R⁵ eine Carbamoylgruppe ist und R⁷ tert-Butoxycarbonyl ist, welches aus Aerothricin 1 oder 3 gemäß dem Verfahren hergestellt wurde, das in der WO 96/30399 beschrieben wird] (50,7 mg, 0,036 mmol) und N,N-Diiso propylethylamin (0,0095 ml, 0,055 mmol) in DMF (0,6 ml) zu der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem die Mischung für 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Piperidin (0,20 ml) zugegeben, und die Mischung wurde für zusätzliche 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Säule C, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min; Gradient: Elutionsmittel: 1% AcOH-H₂O:1% AcOH-CH₃CN = 80:20 → 2:98). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 49,5 mg des linearen Peptids C, ein Vorläufer für die Cyclisierung, als einen weißen amorphen Feststoff ergab.
Zu einer gerührten Lösung des linearen Peptids C (49,5 mg, 0,029 mmol), das oben erhalten wurde, in DMF (27 ml) wurden HOBT-Hydrat (11,3 mg, 0,074 mmol), N,N-Diisopropylethylamin (0,018 ml, 0,105 mmol) und eine Lösung von BOP-Reagens (33,1 mg, 0,075 mmol) in DMF (4 ml) zugegeben. Nachdem die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft.
Der oben erhaltene Rückstand wurde in TFA (6 ml) gelöst und bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde dann in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt sind. Die geeigneten Fraktionen wurden kombiniert, eingefroren und lyophilisiert, was 19,4 mg Aerothricin 33 als einen weißen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 12,4 min (Säule C, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min; Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 61:39); FAB-MS (m/z): 1568 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 34-38, 40-53, 64-73 und 89-95, 97-99 und 123 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das ähnlich war zu dem, das in diesem Beispiel 8 beschrieben wurde, indem die entsprechende Baueinheit, die als Formel (IV) dargestellt wird, verwendet wurde.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 34	1568	14,1	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 35	1568	13,2	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 36	1610	21,9	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 37	1638	44,1	(C) (9 ml/min; 54/46)
Aerothricin 38	1610	28,1	(C) (9 ml/min; 58/42)
Aerothricin 40	1602	16,8	(F) (10 ml/min; 57/43)
Aerothricin 41	1616	20,6	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 42	1630	16,8	(F) (10 ml/min; 62/38)
Aerothricin 43	1644	29,2	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 44	1658	35,5	(F) (10 ml/min; 50/50)
Aerothricin 45	1630	24,7	(C) (9 ml/min; 59/41)
Aerothricin 46	1664	18,7	(C) (9 ml/min; 59/41)
Aerothricin 47	1594	22,9	(C) (9 ml/min; 54/46)
Aerothricin 48	1576	24,4	(F) (10 ml/min; 58/42)
Aerothricin 49	1590	24,2	(C) (9 ml/min; 65/35)
Aerothricin 50	1604	48,9	(F) (10 ml/min; 55/45)
Aerothricin 51	1618	40,4	(F) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 52	1632	32,5	(F) (10 ml/min; 50/50)
Aerothricin 53	1646	27,0	(C) (9 ml/min; 54/46)
Aerothricin 64	1547	15,5	(B) (4 ml/min; 65/35)
Aerothricin 65	1575	15,5	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 66	1603	16,6	(C) (9 ml/min; 52/48)
Aerothricin 67	1587	19,9	(C) (9 ml/min; 59/41)
Aerothricin 68	1587	19,6	(C) (9 ml/min; 59/41)
Aerothricin 69	1589	21,8	(C) (9 ml/min; 58/42)
Aerothricin 70	1617	21,6	(C) (9 ml/min; 53/47)
Aerothricin 71	1746	30,0	(C) (9 ml/min; 64/36)
Aerothricin 72	1673	22,6	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 73	1721	20,2	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 89	1630	22,1	(F) (10 ml/min; 55/45)
Aerothricin 90	1658	24,9	(F) (10 ml/min; 50/50)
Aerothricin 91	1670	26,7	(F) (10 ml/min; 50/50)
Aerothricin 92	1642	26,0	(F) (10 ml/min; 55/45)
Aerothricin 93	1650	21,4	(F) (10 ml/min; 57/43)
Aerothricin 94	1658	30,8	(F) (10 ml/min; 52/48)
Aerothricin 95	1574	28,3	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 97	1740	44,7	(F) (10 ml/min; 57/43)
Aerothricin 98	1656	30,0	(F) (10 ml/min; 62/38)
Aerothricin 99	1644	16,9	(F) (10 ml/min; 53/47)
Aerothricin 123	1630	20,7	(F) (10 ml/min; 56/44)

* Verhältnis von 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril

Beispiel 9
Herstellung von Aerothricin 16

(a). Zu einer gerührten Lösung von Verbindung A (beschrieben in Referenzbeispiel 3) (1 g, 0,61 mmol) in Pyridin (2,5 ml) wurde Tetranitromethan (0,365 ml, 3,05 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 4 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert. Der dunkelbraune Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Lobar RP 18, 10 ml/min, 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 50:50 → 33:66 0,05% TFA). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 711 mg des rohen Nitroderivats von Verbindung A als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab.
(b). Eine Mischung des rohen Produkts, das oben erhalten wurde (12 mg, 0,0071 mmol), und von TFA (0,5 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft. Der gelbe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 8 mg von Aerothricin 16·TFA-Salz als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 15,5 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1578 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 39, 54, 55 und 77 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das ähnlich war zu dem, das in Beispiel 9 beschrieben wurde, indem die Aerothricine, die in Beispiel 8 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname m/z:	[MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 39	1577	13,2	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 54	1661	14,2	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 55	1689	27,8	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 77	1648	25,0	(C) (9 ml/min; 53/47)

Beispiel 10
Herstellung von Aerothricin 17

(a). Zu der Lösung des rohen Nitroderivats der Verbindung A, die in Beispiel 9(a) erhalten wurde (55 mg, 0,033 mmol), in MeOH (5 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem sie für 13,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, was 52 mg des rohen Aminoderivats von Aerothricin 3 als braunen amorphen Stoff ergab, welcher ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet wurde.
(b). Eine Mischung des rohen Aminoderivats von Verbindung A (beschrieben in Referenzbeispiel 3), das oben erhalten wurde (3,4 mg, 0,0021 mmol), und von TFA (0,2 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft. Der braune Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 1,3 mg von Aerothricin 17 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 12,8 min (Säule A, Fliessgeschwindigkeit: 1 min/ml, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 59:41); FAB-MS (m/z): 1548 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 29, 56 und 78 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 10 beschriebenen ähnlich war, wobei Aerothricine, die in Beispiel 9 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 29	1606	31,0	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 56	1659	15,1	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 78	1618	16,8	(C) (9 ml/min; 57/43)

Beispiel 11
Herstellung von Aerothricin 18

(a). Zu einer Lösung des rohen Aminoderivats von Verbindung A, das in Beispiel 10(a) erhalten wurde (1,7 mg, 0,001 mmol), in Methanol (0,05 ml) und Pyridin (0,025 ml) wurden nacheinander Boc-Gly-OH (18 mg, 0,10 mmol), WSCI (30 mg, 0,15 mmol) und HOBT-Hydrat (24 mg, 0,15 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 15 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel durch einen Strom von trockenem Stickstoff entfernt.
(b). Der rohe Rückstand, der oben erhalten wurde, wurde in TFA (0,1 ml) gelöst und bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde mit einem Strom von trockenem Stickstoff entfernt. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 0,54 mg von Aerothricin 18 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 8,9 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1605 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 19-23, 30, 57-62, 79 und 81 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 11 beschriebenen ähnlich war, wobei das entsprechende Acylierungsmittel und Aerothricins, die in Beispiel 10 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 19	1590	17,5	(A) (1 ml/min; 57/43)
Aerothricin 20	1619	6,0	(B) (4 ml/min; 55/45)
Aerothricin 21	1663	18,0	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 22	1605	12,5	(A) (1 ml/min; 55/45)
Aerothricin 23	1620	23,9	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 30	1676	24,6	(C) (9 ml/min; 61/39)
Aerothricin 57	1701	21,2	(C) (9 ml/min; 56/44)
Aerothricin 58	1730	23,4	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 59	1716	13,7	(C) (9 ml/min; 58/42)
Aerothricin 60	1730	16,3	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 61	1730	39,1	(C) (9 ml/min; 47/53)
Aerothricin 62	1730	15,8	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 79	1689	36,1	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 81	1675	24,4	(C) (9 ml/min; 60/40)

Beispiel 12
Herstellung von Aerothricin 12
Zu einer Lösung von Aerothricin 5 (7,5 mg, 0,0048 mmol), 37% Formalin (150 μl) und Essigsäure (50 μl) in MeOH (1,0 ml) wurde Natriumcyanoborhydrid (7,5 mg, 0,119 mmol) in MeOH (100 μl) bei Raumtemperatur zugegeben, und die Mischung wurde für 7 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt sind. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 5,4 mg von Aerothricin 12 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 7,1 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 50:50); FAB-MS (m/z): 1575 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 13, 25, 30 und 75 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 12 beschriebenen ähnlich war.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 13	1561	13,7	(B) (4 ml/min; 55/45)
Aerothricin 25	1607	23,5	(C) (4 ml/min; 55/45)
Aerothricin 30	1676	24,6	(C) (9 ml/min; 61/39)
Aerothricin 75	1631	24,2	(C) (9 ml/min; 55/45)

Beispiel 13
Herstellung von Aerothricin 111

(a). Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (500 mg, 0,326 mmol), (2-Oxoethyl)-carbaminsäure-tert-butylester (1,66 g, 10,4 mmol) und Essigsäure (5 ml) in MeOH (45 ml) wurde bei Raumtemperatur Natriumcyanoborhydrid (410 mg, 6,52 mmol) in MeOH (5 ml) zugegeben. Die Mischung wurde für 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.
(b). Eine Lösung des oben erhaltenen rohen Rückstands in TFA (20 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehr[phasen]-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 253 mg von Aerothricin 111 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt) 18,6 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1619 [M+H]⁺.

Die folgenden Aerothricine 100, 112, 114 und 115 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 13 beschriebenen ähnlich war.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 100	1730	14,8	(F) (10 ml/min; 56/44)
Aerothricin 112	1647	11,8	(F) (10 ml/min; 57/43)
Aerothricin 114	1759	23,1	(C) (10 ml/min; 60/40)
Aerothricin 115	1633	19,6	(F) (10 ml/min; 59/41)

Beispiel 14
Herstellung von Aerothricin 120
Zu einer Mischung von Aerothricin 3 (500 mg, 0,326 mmol) und Triethylamin (682 μl, 4,89 mmol) in MeOH (10 ml) wurde bei Raumtemperatur Acrylnitril (214 μl, 3,27 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde für 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehr[phasen]-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 207 mg von Aerothricin 120 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt) 27,5 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 53:47); FAB-MS (m/z): 1586 [M+H]⁺
Beispiel 15
Herstellung von Aerothricin 113
Zu einer Mischung von Aerothricin 120 (100 mg, 0,063 mmol) in MeOH (5 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem sie für 20 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen]-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 87,2 mg von Aerothricin 113 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt) 23,0 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1590 [M+H]⁺.

Aerothricin 129 wurde nach einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 14-15 beschriebenen ähnlich war, gefolgt von der Entfernung der Boc-Gruppe des Ornitinrestes mit Trifluoressigsäure. Das Ausgangsmaterial war in diesem Fall das N^δ-Boc-Derivat des (D)-Ornitinanteils von Aerothricin 106, das in einem Verfahren, das zu Beispiel 16 ähnlich war, erhalten wurde.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 129	1705	33,8	(F) (10 ml/min; 62/38)

Beispiel 16
Herstellung von Aerothricin 14
Zu einer Lösung von N-Boc-Sarcosin (123 mg, 0,65 mmol), WSC·HCl (240 mg, 1,25 mmol) und DMAP (150 mg, 1,23 mmol) in CH₃CN (10 ml) wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (100 mg, 0,065 mmol) in CH₃OH (3 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 h gerührt und dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde in n-BuOH (10 ml) gelöst und mit H₂O (5 ml × 2, eingestellter pH 3-4 mit 1 N HCl) gewaschen. Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert, und der Rückstand wurde in TFA (5 ml) bei 0°C gelöst. Nachdem die Lösung bei Raumtemperatur für 1 h gerührt worden war, wurde TFA in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, was 40,8 mg (39% Ausbeute) von Aerothricin 14 als ein weißes amorphes Pulver ergab.
HPLC (Rt): 23,1 min (Säule C, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60:40); FAB-MS (m/z): 1605 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricin 15, 21, 26-29 und 101-107, 109, 110, 118, 130 und 131 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 16 beschriebenen ähnlich war, indem die entsprechende Säure als eine Baueinheit verwendet wurde.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 15	1631	24,0	(C) (9 ml/min; 57/43)
Aerothricin 21	1663	18,0	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 26	1650	19,9	(C) (9 ml/min; 50/50)
Aerothricin 27	1676	22,5	(C) (9 ml/min; 55/45)
Aerothricin 28	1636	20,9	(C) (9 ml/min; 50/50)
Aerothricin 29	1606	31,0	(C) (9 ml/min; 60/40)
Aerothricin 101	1647	16,5	(F) (10 ml/min; 56/44)
Aerothricin 102	1661	16,3	(F) (10 ml/min; 56/44)
Aerothricin 103	1689	13,4	(F) (10 ml/min; 54/46)
Aerothricin 104	1633	22,6	(F) (10 ml/min; 58/42)
Aerothricin 105	1619	29,2	(F) (10 ml/min; 52/38)
Aerothricin 106	1647	17,3	(F) (10 ml/min; 56/44)
Aerothricin 107	1661	36,5	(F) (10 ml/min; 60/40)
Aerothricin 109	1633	26,1	(F) (10 ml/min; 58/42)
Aerothricin 110	1619	28,8	(F) (9 ml/min; 58/42)
Aerothricin 118	1685	15,2	(F) (10 ml/min; 51/49)
Aerothricin 130	1847	16,0	(F) (10 ml/min; 63/37)
Aerothricin 131	1818	21,1	(F) (10 ml/min; 63/37)

Beispiel 17
Herstellung von Aerothricin 74
Eine Mischung von Aerothricin 66 (20 mg, 0,012 mmol), 3,5-Dimethylpyrazol-l-carboxamidinnitrat (13 mg, 0,064 mmol) und Triethylamin (18 ml, 0,13 mmol) in MeOH (1 ml) wurde bei Raumtemperatur für 15 h gerührt. Nachdem das Lösungsmittel verdampft worden war, wurde der rohe Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 10,2 mg von Aerothricin 74 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt) 21,2 min (Säule C, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:46); FAB-MS (m/z): 1645 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 4 und 116 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 17 beschriebenen ähnlich war, wobei Aerothricin 3 bzw. 111 als ein Ausgangsmaterial verwendet wurden.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit Verhältnis des Elutionsmittels*);
Aerothricin 4	1576	7,6	(D) (1 ml/min; 50/50)
Aerothricin 116	1703	14,9	(F) (10 ml/min; 57/43)

Beispiel 18
Herstellung von Aerothricin 5

(a). Zu einer Lösung von Verbindung A, die in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (10 mg, 0,0061 mmol), und Kaliumcarbonat (10 mg, 0,072 mmol) in DMF (1 ml) wurde bei Raumtemperatur Methyliodid (8 μl, 0,129 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 43 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Mischung durch ein Celite-Kissen filtriert, und das Filtrat wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.
(b). Eine Lösung des oben erhaltenen rohen Rückstands in TFA (1,0 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 3,8 mg von Aerothricin 5 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 14,5 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1547 [MH⁺].

Die folgenden Aerothricine 6-10 und 76 wurden nach einem Verfahren hergestellt, das dem in Beispiel 18 beschriebenen ähnlich War, wobei das entsprechende Alkylierungsmittel verwendet wurde.

	FAB-MS	HPLC	Analytische Bedingungen
Verbindungsname	m/z: [MH⁺]	Retentionszeit (min)	(Säule) (Fliessgeschwindigkeit; Verhältnis des Elutionsmittels*)
Aerothricin 6	1561	16,0	(A) (1 ml/min; 55/45)
Aerothricin 7	1573	8,4	(A) (1 ml/min; 50/50)
Aerothricin 8	1589	26,1	(B) (4,7 ml/min; 58/42)
Aerothricin 9	1591	38,5	(B) (4 ml/min; 60/40)
Aerothricin 10	1590	6,7	(A) (1 ml/min; 53/47)
Aerothricin 76	1617	26,0	(C) (9 ml/min; 53/47)

Beispiel 19
Herstellung von Aerothricin 24

(a). Eine kalte Mischung von Verbindung A, die in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (100 mg), Natriumiodid (29,5 mg, 0,197 mmol) und Natriumhypochlorit-Lösung (250 μl) in Methanol (2 ml) wurde bei 0°C für 2 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumthiosulfat abgeschreckt, mit 1 N HCl angesäuert und mit n- Butanol extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden in vacuo verdampft. An diesem Punkt lag das Ausgangsmaterial immer noch vor. Um die Iodierungsreaktion abzuschließen, wurde derselbe experimentelle Vorgang wiederholt. Nach derselben Aufarbeitung wurde der Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, was das Iodderivat der Verbindung A als farblosen Feststoff ergab (54 mg, 50% Ausbeute).
(b). Eine Mischung von dem Iodderivat von Verbindung A, das oben erhalten wurde (23,8 mg), Methylacrylat (16 μl), Triethylamin (40 μl) und Palladiumacetat (2,1 mg) in Acetonitril (250 μl) und N,N-Dimethylformamid (750 μl) wurde bei 70°C für 28 h erwärmt. Die resultierende Mischung wurde durch eine kurze C-18-Säule geleitet, und der Rückstand wurde mit Trifluoressigsäure (1 ml) bei 0°C für 1 h behandelt. Die resultierende Mischung wurde in vacuo verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 24 als farblosen Feststoff (8,8 mg, 40% Ausbeute). HPLC (Rt): 86,3 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 58:42); FAB-MS (m/z): 1617 [MH⁺].

Beispiel 20
Herstellung von Aerothricin 96
Eine Mischung von dem Iodderivat der Verbindung A (30 mg), das in Beispiel 19(a) erhalten wurde, Kaliumacetat (6,9 mg) und Tetrakis(triphenylphoshin)palladium (4,6 mg) in entgastem Dimethylsulfoxid (2 ml) wurde unter einer Kohlenmonoxidatmosphäre bei 60°C für 20 h erwärmt. Die resultierende Mischung wurde durch eine kurze C-18-Umkehrphasensäule geleitet, und der Rückstand wurde mit Trifluoressigsäure bei 0°C für 1 h behandelt. Die resultierende Mischung wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 96 als einen farblosen Feststoff (2,3 mg, 8% Ausbeute).
HPLC (Rt): 23,2 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52,2:47,8); FAB-MS (m/z): 1677 [MH⁺].
Beispiel 21
Herstellung von Aerothricin 32

(a). Eine Mischung von der Verbindung A, die in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (20 mg), und (Methoxycarbonylsulfamoyl)triethylammoniumhydroxid (26,5 mg, 0,108 mmol) in Acetonitril (3 ml) wurde bei Raumtemperatur für 8 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N HCl angesäuert und wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde mit n-Butanol extrahiert, und die Extrakte wurden in vacuo verdampft.
(b). Das rohe Produkt wurde mit Trifluoressigsäure bei 0°C für 1 h behandelt. TFA wurde in vacuo verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 32 als einen farblosen Feststoff (2,0 mg, 10% Ausbeute). HPLC (Rt): 42,9 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1516 [MH⁺].

Beispiel 22
Herstellung von Aerothricin 31

(a). Zu einer kalten Lösung von der Verbindung A, die in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (25,7 mg), in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde Boran-Dimethylsulfid-Komplex (25 ml) bei -10°C zugegeben. Nachdem sie bei -10°C für 5 h gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung mit 2 N HCl abgeschreckt und wurde mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden in vacuo verdampft.
(b). Das rohe Produkt wurde mit Trifluoressigsäure bei 0°C für 1 h behandelt. THF wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 31 als farblosen Feststoff (3,7 mg, 15% Ausbeute). HPLC (Rt): 25,1 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 62:38); FAB-MS (m/z): 1519 [MH⁺].

Beispiel 23
Herstellung von Aerothricin 121
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (50 mg) in DMF (1 ml) und Triethylamin (0,025 ml) wurde Methyliodid (0,010 ml) zugegeben. Nachdem sie für 16 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurden zu der Mischung weiterhin Triethylamin (0,025 ml) und Methyliodid (0,05 ml) zugegeben und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Eine LCMS-Analyse der Mischung zeigte >90% Umwandlung zu der gewünschten Verbindung. Das Lösungsmittel wurde mit einem Strom von Stickstoff gespült, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 23 mg von Aerothricin 121 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 20,5 min (Säule B, Fliessgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1576 [M⁺].
Beispiel 24
Herstellung von Aerothricin 122
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (50 mg) in Pyridin (1 ml) wurde Schwefeltrioxid-N,N-Dimethylformamid-Komplex (23 mg) zugegeben. Nachdem für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel mit einem Strom von trockenem Stickstoff gespült.
Eine Lösung des oben erhaltenen rohen Rückstands in TFA (1 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde mit einem Strom von trockenem Stickstoff gespült, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 5 mg von Aerothricin 122 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 24,6 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1613 [MH⁺].
Beispiel 25
Herstellung von Aerothricin 63

(a). Zu einer gerührten Lösung von N^α-Fmoc-N^β-Boc-(S)-2,3-Diaminopropionsäure (343 mg, 0,80 mmol) in DMF (10 ml) wurden BOP-Reagens (355 mg, 0,80 mmol), HOBT-Hydrat (124 mg, 0,81 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,174 ml, 1,00 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (1,10 g, 0,67 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,174 ml, 1,00 mmol) in DMF (9,5 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem sie für eine zusätzliche 1 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung in vacuo konzentriert.
(b). Zu einer gerührten Lösung des oben erhaltenen Rückstands in DMF (20 ml) wurde Piperidin-4-carbonsäure-Polyaminharz (200-400 mesh), HL (1,50 mmol/g, 2,66 g), zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde mit Ultraschall für 6 h bestrahlt. Das Harz wurde durch Filtration durch ein Celite-Kissen entfernt, mit MeOH gewaschen, und das vereinigte Filtrat und die Waschlösung wurden eingefroren und lyophilisiert, was 1,08 g des rohen Derivats von Aerothricin 3 als einen weißen amorphen Feststoff ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
(c). Zu einer gerührten Lösung des rohen Derivats von Aerothricin 3, das oben erhalten wurde (25,6 mg, 0,015 mmol), in MeOH (1 ml) wurden (2-Oxo-ethyl)carbaminsäure-tert-butylester (roh, 207 mg), AcOH (0,1 ml) und NaBH₃CN (19,1 mg) zugegeben. Nachdem die Mischung für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit n-BuOH (4 ml) verdünnt und mit H₂O (1 ml × 2, eingestellter pH 3-4 mit 0,1 N HCl) gewaschen. Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert. Der rohe Rückstand wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.
(d). Eine Lösung des oben erhaltenen rohen Rückstands in TFA (2 ml) wurde bei 0°C für 2 h gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 8,8 mg von Aerothricin 63 als einen weißen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 24,8 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:36); FAB-MS (m/z): 1706 [MH⁺].

Beispiel 26
Herstellung von Aerothricin 127
Aerothricin 127 wurde durch dasselbe Verfahren wie das für Aerothricin 63 beschriebene durch Verwendung von N^α-Fmoc-N^δ-Boc-(D)-Ornitin hergestellt. Aerothricin 127 wurde als ein weißer amorpher Feststoff erhalten.
HPLC (Rt): 23,9 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:36); FAB-MS (m/z): 1734 [MH⁺].
Beispiel 27
Herstellung von Aerothricin 124

(a). Zu einer gerührten Lösung von Boc-D-Orn(Boc)-OH (46 mg, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) wurden BOP-Reagens (62 mg, 0,14 mmol), HOBT-Hydrat (22 mg, 0,144 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (24 μl, 0,138 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 120 (100 mg, 0,063 mmol) und N-Diisopropylethylamin (24 μl, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) zu der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem für 18 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in TFA (4 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei 0°C für 30 min gerührt. Nach der Entfernung von TFA mit einem Strom von trockenem Stickstoff wurde der Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 48,6 mg des Nitrilderivats als einen weißen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 20,2 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1700 [M+H]⁺.
(b). Zu einer Mischung des oben erhaltenen Nitrilderivats (48,6 mg, 0,0286 mmol) in Dioxan (1 ml) und Wasser (1 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (10 mg) zugegeben, und die Mischung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre für 14 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 26,5 mg von Aerothricin 124 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 18,2 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60:40); FAB-MS (m/z): 1704 [M+H]⁺.

Beispiel 28
Herstellung von Aerothricin 125

(a). Zu einer Lösung von Aerothricin 3-Mono-TFA-Salz (natürliches Produkt: 50 mg) in DMF (1 ml) und Triethylamin (0,126 ml) wurde 2-Brom-5-nitropyridin (185 mg) zugegeben. Nachdem für 25 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel mit einem Strom von trockenem Stickstoff gespült. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 25 mg des 5-Nitropyrid-2-ylderivats von Aerothricin 3 als einen leicht gelben amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 29,9 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 47:53); FAB-MS (m/z): 1655 [M+H]⁺.
(b). Das 5-Nitropyrid-2-ylderivat von Aerothricin 3, das oben erhalten wurde (10 mg), wurde in Dioxan-H₂O (1 ml-5 ml) gelöst. 5% Palladium auf Holzkohle (20 mg) wurde zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem für 3 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, ergaben eine Filtration durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) und eine Verdampfung des Lösungsmittels 14 mg des rohen Produkts, welches durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 2,5 mg von Aerothricin 125 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 18,7 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1625 [M+H]⁺.

Beispiel 29
Herstellung von Aerothricin 128

(a). Zu einer gerührten Lösung von Fmoc-D-Orn(Boc)-OH (389 mg, 0,86 mmol) in DMF (10 ml) wurden BOP-Reagens (378 mg, 0,85 mmol), HOBT-Hydrat (131 mg, 0,86 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (171 μl, 0,98 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 40 min gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (1,08 g, 0,66 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (171 μl, 0,98 mmol) in DMF (10 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem sie für 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Piperidin (4 ml) zugegeben, und die Mischung wurde für eine zusätzliche 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit n-BuOH (50 ml) verdünnt und mit H₂O (25 ml × 2, eingestellter pH 3 mit 1 N HCl) gewaschen. Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert.
(b). Zu einer gerührten Lösung von Boc-D-Orn(Boc)-OH (9,6 mg, 0,029 mmol) in DMF (1 ml) wurden BOP-Reagens (13,3 mg, 0,030 mmol), HOBT-Hydrat (4,6 mg, 0,030 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (4,8 μl, 0,028 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 30 min gerührt worden war, wurde eine Lösung des rohen Rückstands (31,9 mg), der oben erhalten wurde, und N,N-Diisopropylethylamin (4,8 μl, 0,028 mmol) in DMF (1 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem sie für 4 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert.
(c). Der oben erhaltene rohe Rückstand wurde in TFA (1,5 ml) gelöst und bei 0°C für 1 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in vacuo konzentriert, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehr[phasen]-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 16,6 mg von Aerothricin 128 als einen weißen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 27,23 min (Säule F, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:35); FAB-MS (m/z): 1762 [MH⁺].

Beispiel 30
Herstellung von Aerothricin 106 aus der Verbindung (IX)

(a). Eine Mischung von Fmoc-Tyr(Bu^t) (21 mg, 0,0457 mmol), HOBt-Monohydrat (6,6 mg, 0,0431 mmol), BOP-Reagens (18,8 mg, 0,0424 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 20 μl) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung von N(orn)-Boc-IX (19,3 mg, 0,0131 mmol), das in Beispiel 6 erhalten wurde, und DIEA (10 μl) in DMF (1 ml) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 h wurde die resultierende Mischung für 1 h mit Piperidin (0,375 ml) behandelt und wurde dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Reagenzien zu entfernen. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das gewünschte lineare Peptid A als einen weißen Feststoff (16,6 mg). HPLC (Rt) 19 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel H₂O : CH₃CN = Gradient, 1% AcOH).
(b). Eine Mischung von Fmoc-D-Ala-Monohydrat (1,2 mg, 0,034 mmol), HOBt-Monohydrat (4,7 mg, 0,031 mmol), BOP-Reagens (13,6 mg, 0,031 mmol) und DIEA (8 μl) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung des oben erhaltenen linearen Peptids A (16,6 mg, 0,0098 mmol) und DIEA (6 μl) in DMF (1 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, und der aktivierte Ester wurde zugegeben, bis fast alles Ausgangsmaterial aufgebraucht war. Die resultierende Mischung wurde in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Reagenzien zu entfernen. Das rohe Produkt wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das gewünschte lineare Peptid B als einen weißen Feststoff (6,1 mg). HPLC (Rt) 19 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient, 1% AcOH).
(c). Eine Mischung von Boc-D-Orn(Bu^t) (5,7 mg, 0,017 mmol), HOBt-Monohydrat (2,3 mg, 0,015 mmol), BOP-Reagens (5,4 mg, 0,012 mmol) und DIEA (6 μl) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung des linearen Peptids B (6,1 mg, 0,0033 mmol) und DIEA (3 μm) in DMF (1 ml) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2 h wurde die resultierende Mischung für 1 h mit Piperidin (0,375 ml) behandelt und wurde in vacuo konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das lineare Peptid C als einen weißen Feststoff (4,1 mg). HPLC (Rt) 16,7 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fliessgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel H₂O: CH₃CN = Gradient, 1% AcOH).
(d). Das lineare Peptid C wurde mit 0,01 N Hydrochlorid angesäuert und wurde mit n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde in vacuo konzentriert. Der Extrakt wurde in DMF (2 ml) gelöst. Dann wurden HOBt-Monohydrat (0,1 M in DMF, 60 μl), BOP-Reagens (0,1 M in DMF, 60 μl) und DIEA (2 μl) zu der Mischung zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 h wurde die resultierende Mischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab Aerothricin 106 als einen weißen Feststoff (2,2 mg, 9% von N(orn)-Boc-IX).

Die analytischen Daten werden in der Tabelle von Beispiel 16 beschrieben.
Beispiel A
Injizierbare Lösungen, die jeweils die folgenden Bestandteile enthielten, wurden in der an sich üblichen Weise hergestellt:

Aerothricin 45 20 mg

Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 7,6 mg

Natriumdiphosphatdihydrat 2,0 mg

Ethylalkohol 150 mg

Destilliertes Wasser, entionisiert, steril 850 mg

Gesamt 1029,6 mg

Claims

Aerothricine, die durch die Formel (I) dargestellt werden,
wobei R¹ Guanidino, Triniederalkylammonio, -N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH²)-R¹³,
R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff; Heteroaryl, das mit einem oder zwei Amino substituiert ist; niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Aminoniederalkyl, Cyano, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten; R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist; R¹⁴ ein niederes Alkyl ist, das substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten; R¹⁵ Wasserstoff, niederes Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält/enthalten, ist; R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl, niederes Alkyl oder niederes Alkenyl ist, wobei niederes Alkyl und niederes Alkenyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Acyl, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino; R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino, Acylamino, (Niederalkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy, Niederalkoxycarbonyl, niederes Alkyl, niederes Alkenyl oder niederes Alkinyl ist, wobei niederes Alkyl, niederes Alkenyl und niederes Alkinyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl; R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy ist, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en); R⁵ -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂ ist; X eine Einfachbindung oder eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl substituiert ist; Y eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(Niederalkyl)-, -CONH- oder -CON(Niederalkyl)- ist; Z -O-, -NH- oder -N(Niederalkyl)- ist; m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist; unter dem Vorbehalt, dass, wenn -Y-(CH₂)_m-X-R⁴ unsubstituiertes Alkyl oder Aralkyl ist, dann gleichzeitig R¹ nicht Amino ist, R² und R³ nicht Wasserstoff sind, R⁵ nicht -CONH₂ ist und Z nicht -O- oder -NH- ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen, wobei Nieder- bzw. niederes eine Gruppe von 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en) bedeutet.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ ist, wobei R¹⁰ und R¹¹ wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹ -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist, wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁵ wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹ -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³ ist, wobei R¹³ wie in Anspruch 1 definiert ist.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁵ und n wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁵ und n wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹ -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴ ist, wobei R¹⁴ und R¹⁵ wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹
ist, wobei R¹⁰ und R¹⁵ wie in Anspruch 1 definiert sind.
Aerothricine nach Anspruch 1, wobei R¹ Amino oder Guanidino ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl oder niederes Alkyl ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino oder Acylamino ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei R³ (Niederalkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy oder niederes Alkoxycarbonyl ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei R⁵ -CONH₂ oder -CH₂NH₂ ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei X eine Einfachbindung oder eine der folgenden Gruppen ist:

welche weiter durch ein Halogenatom(e) oder niederes Alkyl substituiert sein können.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei X eine Einfachbindung, Phenyl, Biphenyl oder Naphtyl ist, welche weiter mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl substituiert sein können.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei R⁴ Alkyl oder Alkoxy ist, welche gegebenenfalls mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en) substituiert sein können.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, wobei Y -CH(CH₃)-, -CON(CH₃)-, -CONH-, -CH₂- oder eine Einfachbindung ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei Z -NH- ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei Z -O- ist.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 2, 4 bis 32, 63, 96-99, 101 bis 131.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 14, 15, 21, 26 bis 29, 63, 98, 99 und 101 bis 131.
Aerothricine nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Verbindungen, welche durch die Formel (III) dargestellt werden,
wobei R², R³ und R⁵ wie in Anspruch 1 definiert sind und R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist; unter dem Vorbehalt, dass, wenn R⁵ -CONH₂ ist, dann R² oder R³ von Wasserstoffverschieden sind; sowie deren Salze.
Eine Verbindung, welche durch die Formel (IX) dargestellt wird,
sowie deren Salze.
Eine Verbindung, welche durch die Formel (X) dargestellt wird,
wobei Reine Aminoschutzgruppe ist, sowie deren Salze.
Verbindungen, welche durch die Formel (XII) dargestellt werden,
wobei R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist, sowie deren Salze.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Verwendung einer Verbindung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert ist, zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Mykosen.
Eine biologisch reine Kultur von Deuteromycotina NR7379 (FERN BP-6391).
Die Verwendung einer Verbindung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 definiert ist, zur Herstellung von Medikamenten zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch pathologische Mikroorganismen verursacht werden.
Ein Verfahren zur Herstellung der Aerothricine, die in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 beschrieben werden, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Kultivieren eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Deuteromycotina gehört, und das Isolieren von Aerothricin 1, 2 und/oder einem linearen Peptid mit der Formel (IX), wie in Anspruch 25 definiert, aus der Kulturnährlösung; oder (b) die Kondensation einer Verbindung mit der Formel (III),
wobei R², R³ und R⁵ wie in Anspruch 1 definiert sind und R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist, mit einer Verbindung mit der Formel (IV),
wobei R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist, R⁸ Wasserstoff oder niederes Alkyl ist; und R⁴, X, Y und m wie in Anspruch 1 definiert sind; gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁷, der nachfolgenden Cyclisierung und der Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁶, oder (c) die Nitrierung von Aerothricinen mit der Formel (I),
wobei R³ ein Wasserstoffatom ist und R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind; oder (d) die Reduktion der Nitrogruppe von Aerothricinen mit der obigen Formel (I), wobei R³ eine Nitrogruppe ist und R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind; oder (e) die Acylierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der obigen Formel (I), wobei R³ eine Aminogruppe ist und R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgrupppe; oder (f) die Cyanoethylierung oder 2,2-Dicyanoethylenierung der Aminogruppe von Aerothricinen mit der Formel (I), wobei R¹ eine Aminogruppe oder -N(R¹⁵)-COCH-(NH₂)-R¹³ ist und R¹³, R¹⁵, R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt von der Reduktion der Cyanogruppe(n) und wenn nötig von der Entfernung der Schutzgruppe(n); oder (g) die reduktive Alkylierung der Aminogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ Amino, (2-Cyanoethyl)amino oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist, wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder (2-Cyanoethyl)amino, und R¹³, R¹⁵, R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind, mit einem Aldehyd mit der Formel (V), R⁹-CHO (V)wobei R⁹ Wasserstoff, niederes Alkyl, welches weiter substituiert sein kann mit einem oder mehreren geschützten Amino, einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine geschützte Aminogruppe enthält/enthalten, ist; gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe(n) oder der Reduktion einer Cyanogruppe, oder (h) die Arylierung der Aminogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ eine Aminogruppe ist und R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einer Verbindung mit der Formel (VI), R¹²-Q (VI)wobei R¹² ein Stickstoff enthaltendes Heteroaryl ist, welches weiter mit einer geschützten Amino- oder Nitrogruppe substituiert sein kann, und Q ein Halogenatom wie z.B. Chlor oder Brom ist, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe oder der Reduktion einer Nitrogruppe, oder (i-1) die Acylierung der Aminogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ Amino ist und R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (i-2) die Acylierung der Aminogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ beide ein niederes Alkyl, das substituiert ist mit einer Aminogruppe, sind] oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁵ ein niederes Alkyl ist, das mit einer Aminogruppe substituiert ist; R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie in Anspruch 1 definiert sind, unter dem Vorbehalt, dass die Aminogruppe(n), die in R¹⁰, R¹¹ und R¹³ vorliegt(en), geschützt ist/sind] ist, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (j) die Mono-N-Alkylierung der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ Amino ist und R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, und die anschließende N-Acylierung, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (k) die Umwandlung der Aminogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R¹ eine Aminogruppe, -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten], -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie in Anspruch 1 definiert sind und R¹⁵ ein niederes Alkyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder mehreren Aminogruppe(n), einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten] oder -NHCO-R¹⁴ [wobei R¹⁴ ein niederes Alkyl ist, das mit einem oder mehreren Amino, einem Stickstoff enthaltenden Heterozyklus(en) oder einer Phenylgruppe(n), die eine Aminogruppe enthält/enthalten, substituiert ist] ist und R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, in eine Guanidinogruppe durch die Behandlung mit einem aktivierten Amidinderivat, oder (l) die O-Alkylierung der phenolischen Hydroxygruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R² Wasserstoff ist und R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind; oder (m) die Iodierung der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R² und R³ Wasserstoff sind und R¹, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt von einer mit Palladium(0) katalysierten Kopplung des resultierenden Iodderivats mit der Formel (I), wobei R³ ein Iod ist und R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, und wenn nötig der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (n) die Dehydratisierung der Carbamoylgruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R⁵ -CONH₂ ist und R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (o) die Reduktion der Carbamoyl- oder Cyanogruppe der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R⁵ -CONH₂ oder -CN ist und R¹, R², R³, R⁴, X, V, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt wenn nötig von der Entfernung der Aminoschutzgruppe, oder (p) die Hydroxysulfonierung des Tyrosinrestes der Aerothricine mit der obigen Formel (I), wobei R² Wasserstoff ist und R¹, R³, R⁴, R⁵, X, V, Z und m wie in Anspruch 1 definiert sind, gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe(n), oder (q) die Umwandlung des linearen Peptids mit der Formel (IX) oben zu Aerothricinen mit der obigen Formel (I) durch Peptidsynthese, gefolgt von einer Modifikation gemäß einem Verfahren, das aus den obigen Prozessen (c) bis (0) ausgewählt wird.