KR20010083139A - 에어로트리신 유사체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

에어로트리신 유사체, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20010083139A
KR20010083139A KR1020017000975A KR20017000975A KR20010083139A KR 20010083139 A KR20010083139 A KR 20010083139A KR 1020017000975 A KR1020017000975 A KR 1020017000975A KR 20017000975 A KR20017000975 A KR 20017000975A KR 20010083139 A KR20010083139 A KR 20010083139A
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야스다유리
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프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 에어로트리신, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하기 화학식 I의 에어로트리신 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제의 제조를 위한 상기 에어로트리신 뿐만 아니라 하기 화학식 I의 에어로트리신을 제조하기 위한 방법 및 중간물에 관한 것이다:
화학식 I
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다.

Description

에어로트리신 유사체, 이의 제조 방법 및 용도{AEROTHRICIN ANALOGS, THEIR PREPARATION AND USE}
아졸 항진균제는 현재 전신성 사상균병(絲狀菌病)의 치료를 위해서 광범위하게 사용된다. 그러나, 아졸 항진균제를 장기간 예방 용도로 사용하면 이의 정진균성(靜眞菌性) 작용 때문에 아졸 내성칸디다종(Candida spp.)을 발생시키는 결과를 나타낸다. 그러므로, 살진균제는 심한 전신성 사상균병을 치료하는데 특히 중요하다. 더욱이, 현재 시판되는 항진균제는 면역이 약화된 환자중에서 나타나는 병원균중 하나인푸사리움종(Fusarium spp.)에 대해 효과적이지 못하다. 암포테리신 B는 현재 의학적으로 사용되는 가장 효과적인 살진균제이나, 이의 치료 지수(효과적인 투여량 대 독성 투여량)는 다소 좁다. LY303366(유럽 특허 제 736541 호),WF11243(유럽 특허 제 584360 호)와 같은 특정 환형 화합물이 β-1,3-글루칸 합성 효소를 억제시킴으로써 살진균성 활성을 보이는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이들은 여전히 항진균성 범위 및/또는 안정성 프로파일 면에서 몇몇 단점을 갖는다. 그러므로, 보다 우수한 안정성 프로파일 및 새로 생겨난푸사리움종과 같은 병원균을 포함한 주요한 전신성 병원균에 대한 효능이 보다 우수한 신규한 살진균제의 개발이 시급히 요구된다.
본 발명은 항진균 활성을 갖는 신규한 환형 화합물(이후로 에어로트리신(aerothricin)으로 지칭한다), 의학적 치료법에서의 에어로트리신의 용도, 에어로트리신을 함유하는 약학 조성물 뿐만 아니라 에어로트리신의 제조 방법 및 중간물에 관한 것이다.
도 1은 에어로트리신 1의 UV 스펙트럼을 도시한다.
도 2는 에어로트리신 1의 IR 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 에어로트리신 1의1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 에어로트리신 1의13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 에어로트리신 2의 UV 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 에어로트리신 2의 IR 스펙트럼을 도시한다.
도 7은 에어로트리신 2의1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 8은 에어로트리신 2의13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 9는 화학식 IX의 IR 스펙트럼을 도시한다.
도 10은 화학식 IX의1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 11은 화학식 IX의13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
특히, 본 발명은 하기 화학식 I로 나타나는 신규한 에어로트리신 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
상기 식에서,
R1은 구아니디노, 트리-저급 알킬암모니오, -N(R10)-R11, -N(R15)-CO-R14, -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13, -NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13,,, 또는이고,
R10및 R11은 각각 독립적으로 수소; 1 또는 2개의 아미노로 치환된 헤테로아릴; 1개 이상의 아미노, 아미노-저급 알킬, 시아노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고,
R13은 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이고,
R14는 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급 알킬이고,
R15는 수소, 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고;
R2는 수소, 하이드록시설포닐, 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고, 이때 저급 알킬 및 저급 알케닐은 아실, 카바모일, 아미노, 모노-저급 알킬아미노 또는 디-저급 알킬아미노로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고;
R3은 수소, 하이드록시, 니트로, 아미노, 아실아미노, (저급 알킬카바모일)아미노, 카복실, 저급 알콕시, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고, 이때 저급 알킬, 저급 알케닐 및 저급 알키닐은 하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고;
R4는 저급 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 불소 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시 또는 알케닐옥시이고;
R5는 -CONH2, -CN 또는 -CH2NH2이고;
X는 단일 결합이거나, 또는 1개 이상의 헤테로원자를 함유하거나 함유하지 않고/않거나 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 비페닐 또는 터페닐기이고;
Y는 단일 결합, -CH2-, -CH(저급 알킬)-, -CONH- 또는 -CON(저급 알킬)-이고;
Z는 -O-, -NH- 또는 -N(저급 알킬)-이고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 2 내지 5의 정수이나;
단 -Y-(CH2)m-X-R4가 비치환된 알킬 또는 아르알킬인 경우, R1은 아미노가 아니고, R2및 R3은 수소 이외의 것이며, R5는 -CONH2가 아니고, Z는 동시에 -O- 또는 -NH-가아니어야 한다.
또한, 본 발명은 화학식 I의 에어로트리신 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제 제조를 위한 상기 에어로트리신의 용도 뿐만 아니라 화학식 I의 에어로트리신 제조를 위한 방법 및 중간물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 병균성 미생물에 의해서 일어나는 감염성 질환을 예방적으로 및/또는 치료적으로 처치하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 "알킬"은 달리 언급되지 않으면, 탄소수 1 내지 6, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4로 구성된 기를 의미하는데 사용된다.
용어 "알킬"은 탄소수 1 내지 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 16의 분지쇄 또는 직쇄 일가 포화 지방족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 용어 "저급 알킬"은 탄소수 1 내지 6, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 분지쇄 또는 직쇄 일가 알킬 라디칼을 지칭한다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, i-부틸, 3급-부틸 등과 같은 상기 라디칼로 추가로 예시된다.
용어 "알케닐"은 알킬렌쇄내에 1개 이상의 이중 결합을 함유하는 알킬기를 지칭한다.
용어 "알키닐"은 알킬렌쇄내에 1개 이상의 삼중 결합을 함유하는 알킬기를 지칭한다.
용어 "알콕시"는 -O-R'기(이때, R'은 알킬이다)를 지칭한다. 용어 "저급 알콕시"는 -O-R'기(이때, R'은 저급 알킬이다)를 지칭한다.
용어 "알케닐옥시"는 알킬렌쇄내에 1개 이상의 이중 결합을 함유하는 알콕시기를 지칭한다.
용어 "아실"은 -C(O)-R'기(이때, R'은 저급 알킬이다)를 지칭한다. 용어 "아실아미노"는 이미노 라디칼, 즉 -NH-에 부착된 아실기를 지칭한다.
용어 "모노-저급 알킬아미노"는 이미노 라디칼, 즉 -NH-에 부착된 아실기를 지칭한다. 용어 "디-저급 알킬아미노"는 질소 원자에 부착된 2개의 독립적으로 선택된 저급 알킬기, 즉 -N(-저급 알킬)-저급 알킬을 지칭한다. 용어 "트리-저급 알킬암모니오"는 3개의 독립적으로 선택된 C1-3-알킬기를 함유하는 3급 저급 알킬암모니오를 의미한다.
용어 "저급 알콕시카보닐"은 -C(O)OR'기(이때, R'은 저급 알킬이다)를 지칭한다.
용어 "(저급 알킬카바모일)아미노"는 -NHCONH-R'기(이때, R'은 저급 알킬이다)를 지칭한다.
용어 "할로겐 원자(들)"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 지칭한다.
용어 "아릴"은 독립적으로 저급 알킬, 트리플루오로메틸, 할로겐 등으로 일치환, 이치환 또는 삼치환되거나 치환되지 않은 일가 탄소환 방향족인 라디칼(예컨대, 페닐) 또는 2개의 축합된 탄소환 고리(예컨대, 나프틸)를 지칭한다.
용어 "질소-함유 헤테로사이클(들)"은 1개 이상의 질소 원자를 함유하는 포화되거나, 불포화되거나 또는 방향족 일가 환형 라디칼을 지칭한다.
용어 "헤테로아릴"은 헤테로원자, 즉 질소, 황 또는 산소를 1개 이상 함유하는 방향족 일가 일탄소환 라디칼 또는 다중탄소환 라디칼을 지칭한다. 1개 이상의 질소 원자를 갖는 헤테로아릴 잔기의 예로는 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 트리아지닐 및 이미다졸릴이 있다.
용어 "사이클로알킬"은 탄소수 3 내지 10, 바람직하게는 탄소수 3 내지 6의 일가 탄소환 라디칼을 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 살아있는 생물체에 비독성인 염화수소산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산, 시트르산, 포름산, 말레산, 아세트산, 삼불화아세트산, 숙신산, 타르타르산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 무기산 또는 유기산을 갖는 화학식 I의 에어로트리신 염을 포함한다.
상기 화학식 I의 치환기 각각을 이후에 보다 자세히 설명한다.
R1의 정의에서, 용어 "트리-저급 알킬암모니오"는 바람직하게는 트리메틸암모니오 및 트리에틸암모니오를 의미한다.
R10및 R11의 정의에서, 용어 "헤테로아릴"은 바람직하게는 2-피리딜, 2-피라지닐, 2-피리미디닐, 2-피리다지닐, 2-트리아지닐, 2-이미다졸릴 등, 보다 바람직하게는 2-피리딜 및 2-이미다졸릴, 가장 바람직하게는 2-피리딜을 의미한다. 용어 "저급 알킬"은 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 2급-부틸, n-펜틸, 네오펜틸, 3급-펜틸 및 n-헥실; 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필 또는 n-부틸, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 n-프로필과 같은 탄소수 1 내지 6으로 구성된 알킬쇄를 의미한다. 용어 "질소-함유 헤테로사이클(들)"은 바람직하게는 모르폴리노, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피리디닐, 피라지닐 등, 보다 바람직하게는 피페라지닐 및 모르폴리노, 가장 바람직하게는 피페라지닐을 의미한다. 용어 "아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)"은 바람직하게는 4-아미노페닐, 4-아미디노페닐, 4-구아니디노페닐 등을 의미한다.
R13의 정의에서, 용어 "천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기"는 바람직하게는 수소 또는 하이드록시, 아미노, 구아니디노, 메틸티오, 머캅토, 카바모일, 카복시, 페닐, 하이드록시페닐, 아미노페닐, 이미다졸릴 또는 인돌릴 등으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 저급 알킬을 의미한다. R13의 바람직한 양태는 아미노메틸, 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 4-구아니디노부틸과 같은 아미노 또는 구아니디노로 치환된 저급 알킬이다.
R14의 정의에서, 용어 "저급 알킬"은 R10및 R11에 대해 정의된 바와 동일한 의미이다. 바람직하게는, 이는 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸과 같은 탄소수 2 내지 5로 구성된 알킬쇄를 의미한다. 용어 "질소-함유 헤테로사이클(들)"은 R10및 R11에 대해 정의된 바와 동일한 의미이다. 바람직하게는, 이는 모르폴리노, 피페라지닐, N-메틸피페라지닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피리디닐, 피라지닐 등, 보다 바람직하게는 피페라지닐 및 모르폴리노를 의미한다. 용어 "아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)"은 바람직하게는 4-아미노페닐, 4-아미디노페닐, 4-구아니디노페닐 등을 의미한다. R14의 바람직한 양태는 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 2-구아니디노에틸, 3-구아니디노프로필, 2-피페라지노에틸, 2-모르폴리노에틸, 4-아미노페네틸 등이다.
R15의 정의에서, 용어 "저급 아킬", "질소-함유 헤테로사이클(들)" 및 "아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)"은 R14에 대해 정의된 바와 동일하다. R15의 바람직한 양태는 2-아미노에틸, 3-아미노프로필, 4-아미노부틸, 2-구아니디노에틸, 3-구아니디노프로필, 2-피페라지노에틸, 2-모르폴리노에틸, 4-아미노페네틸 등이다.
-N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 상기 정의된 바와 같다)의 바람직한 양태는 아미노, 5-아미노피리드-2-일아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 프롤릴아미노, (2-아미노에틸)아미노, (3-아미노프로필)아미노, [3-[(3-아미노프로필)아미노]프로필]아미노, (2-피페라지닐에틸)아미노, (2-모르폴리노에틸)아미노, N,N-디메틸아미노, N,N-디에틸아미노, N,N-디프롤릴아미노, N,N-에틸메틸아미노, N,N-비스(2-아미노에틸)아미노, N,N-비스(3-아미노프로필)아미노, N,N-비스(4-아미노부틸)아미노, N,N-비스(2-피페라지닐에틸)아미노, N,N-비스(2-모르폴리노에틸)아미노, N,N-비스(2-구아니디노에틸)아미노, N,N-비스(3-구아니디노프로필)아미노, N,N-비스(2-피리딘-2-일에틸)아미노, N,N-비스(이미다졸-2-일메틸)아미노, N-(2-아미노에틸)-N-(3-아미노프로필)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2-피페라지닐에틸)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2-피리딘-2-일에틸)아미노 등이다. 보다 바람직한 양태는 아미노, 5-아미노피리드-2-일아미노, N,N-디메틸아미노, (2-아미노에틸)아미노, (3-아미노프로필)아미노, [3-[(3-아미노프로필)아미노]프로필]아미노, (2-피페라지닐에틸)아미노, N,N-비스(2-아미노에틸)아미노, N,N-비스(3-아미노프로필)아미노, N,N-비스(4-아미노부틸)아미노, N,N-비스(2-피페라지닐에틸)아미노, N,N-비스(2-구아니디노에틸)아미노, N,N-비스(3-구아니디노프로필)아미노, N-(2-아미노에틸)-N-(3-아미노프로필)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2-피페라지닐에틸)아미노 등이다. 가장 바람직한 양태는 (3-아미노프로필)아미노, N,N-비스(2-아미노에틸)아미노, N,N-비스(3-아미노프로필)아미노 및 N,N-비스(2-피페라지닐에틸)아미노이다.
-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13의 정의에서, -CO-CH[N(R10)R11]-R13기(이때, R10및 R11은 수소이고, R13은 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이다)는 바람직하게는 사코실, 글리실, 알라닐, 오르니티닐, 라이실, 발릴, 루이실, 이소루이실, 트립토필, 페닐알라닐, 메티오닐, 세릴, 티로실, 트레오닐, 시스테닐, 아스파라기닐, 글루타미닐, 아스파틸, 글루타밀, 아르기닐, 히스티딜, 2,3-디아미노프로피오닐, 2,4-디아미노부티릴, 2-아미노-4-트리아졸-1-일부티릴 등이다.
-N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13의 바람직한 양태는 염기성 아미노산으로부터 유도된 아실아미노기이다. 상기 아실아미노기의 예로는 오르니티닐아미노, 라이실아미노, 아르기닐아미노, 히스티딜아미노, 3-아미노프롤릴아미노, 2,3-디아미노프로피오닐아미노, 2,4-디아미노부티릴아미노, 2-아미노-4-트리아졸-1-일부티릴아미노, [3-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]프로피오닐]아미노, [4-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]부티릴]아미노, [5-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,3-디아미노프로피오닐)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,4-디아미노부티릴)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,5-디아미노발레릴)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,6-디아미노헥사노일)아미노 등; 보다 바람직하게는 오르니티닐아미노, 라이실아미노, 아르기닐아미노, 히스티디닐아미노, 2,3-디아미노프로피오닐아미노, 2,4-디아미노부티릴아미노, [3-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]프로피오닐]아미노, [4-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]부티릴]아미노, [5-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,3-디아미노프로피오닐)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,4-디아미노부티릴)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,5-디아미노발레릴)아미노 및 N-(3-아미노프로필)-N-(2,6-디아미노헥사노일아미노), 가장 바람직하게는 오르니티닐아미노, 라이실아미노, 2,4-디아미노부틸릴아미노, [4-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]부티릴]아미노, [5-아미노-2-[비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,4-디아미노부티릴)아미노, N-(3-아미노프로필)-N-(2,5-디아미노발레릴)아미노 및 N-(3-아미노프로필)-N-(2,6-디아미노헥사노일)아미노가 있다.
R1의 정의에서,의 바람직한 양태는 비스[2-(오르니틸아미노)에틸]아미노, 비스-[3-(오르니틸아미노)프로필]아미노, [2-(라이실아미노)에틸]아미노, 비스-[3-(라이실아미노)프로필]아미노 등이다.
R1의 정의에서,의 바람직한 양태는 N-오르니틸-N-[2-(오르니틸아미노)에틸]-아미노, N-오르니틸-N-[3-(오르니틸아미노)프로필]-아미노, N-오르니틸-N-[3-(라이실아미노)프로필]아미노, N-오르니틸-N-[3-(라이실아미노)프로필]-아미노, N-라이실-N-[2-(오르니틸아미노)에틸]아미노, N-라이실-N-[3-(오르니틸아미노)프로필]-아미노, N-라이실-N-[2-(라이실아미노)에틸]아미노, N-라이실-N-[3-(라이실아미노)프로필]아미노 등이다.
R1의 정의에서,의 바람직한 양태는 프롤릴아미노, 3-아미노프롤릴아미노, 4-아미노프롤릴아미노, N-(3-아미노프로필)-N-프롤릴아미노, (2-아미노에틸)프롤릴아미노 등이다.
용어 "-NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13(이때, R13은 상기 정의된 바와 같다)" 바람직하게는 오르니틸-오르니틸아미노, 라이실-오르니틸아미노, 오르니틸-라이실아미노, 라이실-라이실아미노 등을 의미한다.
용어 "-N(R15)-CO-R14(이때, R14및 R15는 상기 정의된 바와 같다)", 용어 "질소-함유 헤테로사이클(들)" 및 용어 "아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)"은 상기 정의된 바와 같다.
-N(R15)-CO-R14의 바람직한 양태는 3-아미노프로피오닐아미노, 3-구아니디노프로피오닐아미노, 3-피페라지닐프로피오닐아미노, (3-피리딘-3-일프로피오닐)아미노, [3-(4-아미노페닐)프로피오닐]아미노, N-(3-아미노프로피오닐)-N-(3-아미노프로필)아미노 등이다.
바람직한 양태에서, R1은 -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 상기 정의된 바와 같다)이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10, R11, R13및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은 -N(R15)-CO-R14(이때, R14및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은(이때, R10및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은 -NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13(이때, R13은 상기 정의된 바와 같다)이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은 트리-저급 알킬암모니오이다. 또다른 바람직한 양태에서, R1은 아미노 또는 구아니디노이다.
R2의 정의에서, 용어 "아실, 카복시, 카바모일, 아미노, 모노-저급 알킬아미노 또는 디-저급 알킬아미노로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬"은 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 부틸, 옥소-저급 알킬, 카복시-저급 알킬, 카바모일-저급 알킬, 아미노-저급 알킬 등, 보다 바람직하게는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, 2-옥소프로필, 카복시메틸, 카바모일메틸, 3-아미노프로필 등을 의미한다.
용어 "아실, 카복시, 카바모일, 아미노, 모노-저급 알킬아미노 또는 디-저급 알킬아미노로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알케닐"은 바람직하게는 알릴, 2-부테닐, 3-부테닐 등, 보다 바람직하게는 알릴을 의미한다.
보다 바람직한 양태에서, R2는 수소, 하이드록시설포닐 또는 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬이다.
R3의 정의에서, 용어 "아실아미노"는 바람직하게는 아세틸아미노, 프로피오닐아미노 또는 이소부티릴아미노와 같은 저급 알킬카보닐아미노, 또는 사코실아미노, 글리실아미노, 알라닐아미노, 오르니틸아미노, 라이실아미노, 프롤릴아미노, 발릴아미노, 루이실아미노, 이소루이실아미노, 트립토필아미노, 페닐알라닐아미노, 메티오닐아미노, 세릴아미노, 티로실아미노, 트레오닐아미노, 시스테닐아미노, 아스파라기닐아미노, 글루타밀아미노, 아스파틸아미노, 글루타밀아미노, 아르기닐아미노, 히스티딜아미노 등과 같은 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 아실아미노기; 바람직하게는 사코실아미노, 글리실아미노, 알라닐아미노, 라이실아미노, 프롤릴아미노 등이다.
용어 "(저급-알킬카바모일)아미노"는 바람직하게는 메틸카바모일아미노, 에틸카바모일아미노, 프로필카바모일아미노, 부틸카바모일아미노 등, 보다 바람직하게는 메틸카바모일아미노 또는 에틸카바모일아미노를 의미한다.
용어 "저급 알콕시"는 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등, 보다 바람직하게는 메톡시 및 에톡시를 의미한다.
용어 "저급 알콕시카보닐"은 바람직하게는 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡시카보닐 등, 보다 바람직하게는 메톡시카보닐 및 에톡시카보닐을 의미한다.
용어 "하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 저급 알킬"은 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 아미노메틸, 아미노에틸, 아미노프로필, 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 메틸아미노메틸, 2-(메틸아미노)에틸, 3-(메틸아미노)프로필, 디메틸아미노메틸, 2-(디메틸아미노)에틸, 3-(디메틸아미노)프로필, 2-(메톡시카보닐)에틸, 2-(카바모일)에틸 등을 의미한다.
용어 "하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 저급 알케닐"은 바람직하게는 비닐, 2-(메톡시카보닐)비닐, 2-(카바모일)비닐 등을 의미한다.
용어 "하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 저급 알키닐"은 바람직하게는 에티닐, 프로피닐, 하이드록시프로피닐, 아미노프로피닐, 디에틸아미노프로피닐 등을 의미한다.
바람직한 양태에서, R3은 수소, 하이드록시, 니트로, 아미노 또는 아실아미노이다. 또다른 바람직한 양태에서, R3은 (저급 알킬카바모일)아미노, 카복실, 저급 알콕시 또는 저급 알콕시카보닐이다.
R4의 정의에서, 용어 "알킬, 알케닐, 알콕시 또는 알케닐옥시"는 바람직하게는 탄소수 3 내지 16의 알킬, 알케닐, 알콕시 또는 알케닐옥시기를 의미하며, 예를 들면 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 옥트-4-에닐, 옥트-6-에닐, 노나닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시, 헵틸옥시, 옥틸옥시, 옥트-4-에닐옥시, 옥트-6-에닐옥시, 노나닐옥시, 논-5-에닐옥시, 데실옥시 등을 의미한다.
용어 "저급 알킬"은 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 보다 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 의미한다.
용어 "아릴"은 저급 알킬, 트리플루오로메틸 또는 할로겐 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수있는 아릴기를 의미하는데, 예를 들면 페닐, 나프틸, 3-플루오로페닐, 3-브로모페닐, 3-클로로페닐, 4-플루오로페닐, 4-브로모페닐, 4-클로로페닐, 3-메틸페닐, 4-메틸페닐, 4-트리플루오로메티페닐을 의미한다.
용어 "사이클로알킬"은 바람직하게는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 아다만틸 등을 의미한다.
용어 "저급 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 불소 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시 또는 알케닐옥시"는 바람직하게는 5-메틸헥실, 1-메틸트리데실, 2-에틸부톡시, 4-메틸펜틸옥시, 2-프로필펜틸옥시, 2-에틸헥실옥시, 3,7-디메틸옥틸옥시, 2-페닐에톡시, 2-(4-플루오로페닐)에톡시, 2-(4-클로로페닐)에톡시, 2-(3-플루오로페닐)에톡시, 2-(4-트리플루오로페닐)에톡시, 3-페닐프로폭시, 2-나프틸에톡시, 3-나프틸프로폭시, 2-사이클로프로필에톡시, 2-사이클로부틸에톡시, 2-사이클로펜틸에톡시, 3-사이클로펜틸프로폭시, 2-사이클로헥실에톡시, 3-사이클로헥실프로폭시, 3,3-디페닐프로폭시, 3,3,3-트리플루오로프로폭시, 4,4,4-트리플루오로부톡시, 5,5,5-트리플루오로펜틸옥시 등을 의미한다.
바람직한 양태에서, R4는 저급 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 불소 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 알킬 또는 알콕시이다.
R5의 바람직한 양태는 -CONH2또는 -CH2NH2이다.
X의 정의에서, 용어 "헤테로원자"는 바람직하게는 질소, 황 및 산소를 의미한다.
용어 "1개 이상의 헤테로원자를 함유하거나 함유하지 않은 아릴, 비페닐 또는 트리페닐"은 바람직하게는
또는등을 의미하나, 이는 할로겐 원자 (들), 또는 저급 알킬로 추가로 치환될 수 있다. 상기 화학식에서의 개방 말단선은 상응하는 위치에 있는 바람직한 연결기를 지시한다.
X의 가장 바람직한 양태는 단일 결합,,또는이며, 이는 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬, 바람직하게는 메틸로 추가로 치환될 수 있다.
Y의 정의에서, 용어 "저급 알킬"은 바람직하게는 탄소수 1 내지 3으로 구성된 알킬기를 의미하며, 예를 들면 메틸, 에틸 또는 프로필이다. Y의 바람직한 양태는 단일 결합, -CH2-, -CH(CH3)-, -CONH- 또는 -CON(CH3)-, 보다 바람직하게는 단일 결합, -CH(CH3)- 또는 -CONH-이다.
Z의 정의에서, 용어 "-N(저급 알킬)-"은 바람직하게는 탄소수 1 내지 3으로 구성된 N-알킬기를 의미하며, 예를 들면 N-메틸, N-에틸 또는 N-프로필이다. Z의 바람직한 양태는 -O-이고; Z의 또다른 바람직한 양태는 -NH-이다.
m은 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 0 내지 2이다.
본 발명에 따른 바람직한 에어로트리신은 하기 표 1에 예시된 바와 같이 에어로트리신 2 및 4 내지 131이다.
특히 바람직한 것은 에어로트리신 2, 4 내지 32, 63, 96 내지 99, 101 내지 131로 구성된 군에서 선택된 에어로트리신이다. 또한 특히 바람직한 것은 에어로트리신 14, 15, 21, 26 내지 29, 63, 98, 99, 101 내지 131로 구성된 군에서 선택된 에어로트리신이다.
화학식 I로 나타나는 에어로트리신은 하기 방법에 따라서 제조될 수 있다.
방법 A
하기 화학식 II의 에어로트리신은 에어로트리신 1, 2 및 3[에어로트리신 3(=WF11243)이 참고예 1에 기술되어 있다]을 생성할 수 있는듀테로미코티나(Deuteromycotina)에 속하는 미생물을 수성 또는 고형 배지에서 호기성 조건하에서 배양하고 배양물로부터 에어로트리신 1, 2 및 3을 단리함으로써 제조할 수 있다:
[상기 식에서,
R3은 수소 또는 하이드록시이고,
Y는 -CH(CH3)- 또는 -CH2-이다]
방법 B
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노이고; Y는 -CONH-, -CON(저급 알킬)-, -CH2- 또는 단일 결합이고; Z는 -NH- 또는 -N(저급 알킬)-이고; R2, R3, R4, R5, X 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 펩티드 합성을 위한 카복시 활성제를 사용하여 하기 화학식 III의 화합물을 하기 화학식 IV의 화합물로 축합시키고, 이어서 생성된 선형 펩티드의 아미노 보호기 R7을 선택적으로 제거하고, 펩티드 합성을 위한 카복시 활성제를 사용하여 연속적으로 환화시키고, 아미노 보호기 R6을 제거하여 제조할 수 있다:
[상기 식에서,
R6은 아미노 보호기이고,
R2, R3및 R5는 상기 정의된 바와 같고,
R7은 아미노 보호기이고,
R8은 수소 또는 저급 알킬이고,
R4, X, Y 및 m은 상기 정의된 바와 같다]
방법 C
화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 니트로기이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 수소이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 질화시킴으로써 제조할 수 있다.
방법 D
화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 아미노이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 니트로기이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 니트로기를 환원시킴으로써 제조할 수 있다.
방법 E
화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 아실아미노 또는 (알킬카바모일)아미노이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 아미노이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 아미노기를 산 염화물, 산 무수화물, 카복실산/축합제 또는 저급 알킬카바모일 염화물을 사용하여 아실화시키고, 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 F
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 (3-아미노프로필)아미노, (2-시아노에틸)아미노, 3-아미노-2-(아미노메티)프로필)아미노 또는 -N(R15)-COCH[NH(CH2)3NH2]-R13(이때, R13및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이다]을 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노기 또는 -N(R15)-COCH[NH(CH2)3NH2]-R13(이때, R13및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]의 아미노기를 아크릴로니트릴, 에톡시메틸렌말로노니트릴 또는 (1-에톡시에틸리덴)말로노니트릴과 반응시키고, 이어서 생성된 니트릴기를 아미노기로 환원시키고, 필요한 경우 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 G
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 수소, 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다) 또는 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10및 R11은 각각 1개 이상의 아미노, 아미노-저급 알킬, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고; R13및 R15는 상기 정의된 바와 같다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노, (2-시아노에틸)아미노 또는 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 (2-시아노에틸)아미노이고; R13및 R15는 상기 정의된 바와같다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]의 아미노기를 하기 화학식 V의 알데히드로 환원 알킬화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하거나 또는 시아노기를 환원시킴으로써 제조할 수 있다:
R9-CH0
[상기 식에서,
R9는 수소; 1개 이상의 보호 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 보호 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 추가로 치환될 수 있는 저급 알킬이다]
방법 H
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 수소 및 1 또는 2개의 아미노기로 치환된 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 아미노기를 하기 화학식 VI의 화합물로 환원시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하거나 또는 니트로기를 환원시킴으로써 제조할 수 있다:
R12-Q
[상기 식에서,
R12는 보호 아미노기 또는 니트로기로 추가로 치환될 수 있는 질소-함유 헤테로아릴이고,
Q는 클로로 또는 브로모와 같은 할로겐 원자이다]
방법 I-1
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은, -NHCO-CH(NH2)-R13(이때, R13은 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이다) 또는 -NHCO-R14(이때, R14는 상기 정의된 바와 같다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 아미노기를 하기 화학식 VII 또는 VIIa의 산 또는 하기 화학식 VIII의 산으로 아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다:
HO(O=)C-CH(NH-R7)-R13
HO(O=)C-R14
[상기 식에서,
R13은 작용기가 적합하게 보호된 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이고,
R7은 아미노 보호기이고,
R14는 1개 이상의 보호 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클 또는 보호 아미노기를 갖는 페닐기를 갖는 저급 알킬이다]
방법 I-2
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은(이때, R10, R11, R13, R15및 m은 상기 정의된 바와 같다), 또는(이때, R10, R11, R13, R15및 m은 상기 정의된 바와 같다)이다]을 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 둘다 아미노기로 치환된 저급 알킬이다) 또는 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R15는 아미노기로 치환된 저급 알킬이다)이고; R10, R11및 R13은 제 1 항에 정의된 바와 같으나, 단 R10, R11및 R13에 존재하는 아미노기는 보호된다]의 아미노기를 하기 화학식 VII의 산으로 아실화시키고, 이어서 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다:
화학식 VII
HO(O=)C-CH(NH-R7)-R13
[상기 식에서,
R13은 작용기가 적합하게 보호된 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이고,
R7은 아미노 보호기이다]
방법 J
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10및 R11은 수소이고, R13은 상기 정의된 바와 같고, R15는 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다),(이때, R10은 수소이고, R15는 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다), 또는 -N(R15)-CO-R14(이때, R15는 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고, R14는 상기 정의된 바와 같다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 아미노기를 방법 F에 기술된 바대로 모노 N-알킬화시키고, 방법 I에 기술된 바대로 화학식 VII, VIIa 또는 VIII의 상응하는 화합물로 아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 K
화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 구아니디노기, -N(R10)-R11-(이때, R10및R11은 각각 독립적으로 구아니디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급 알킬로부터 선택된다), -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10, R11및 R13은 상기 정의된 바와 같고, R15는 1개 이상의 구아니디노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다) 또는 -N(R15)-CO-R14(이때, R14는 1개 이상의 구아니디노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급 알킬이다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노기이고; -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 아미노기 및 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급 알킬로 구성된 군에서 선택된다), -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10, R11및 R13은 상기 정의된 바와 같고 R15는 1개 이상의 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클, 또는 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다), 또는 -NHCO-R14(이때, R14는 1개 이상의 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클 또는 아미노기를 갖는 페닐기이다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]을 활성화된 아미딘 유도체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
방법 L
화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 아실, 카복시, 카바모일, 하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노 또는 디-저급 알킬아미노로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 수소이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 페놀계 하이드록실기를 알킬화제로 O-알킬화함으로써 제조할 수 있다.
방법 M
화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 카복시, 저급 알콕시카복시, 저급 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고; R2는 수소이고; R1, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2및 R3은 수소이고; R1, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 요오드화제로 요오드화시키고, 이어서 화학식 I의 생성된 요오드 유도체(이때, R3은 요오드이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)를 일산화탄소, 메틸 아크릴레이트 등과 팔라듐(0) 촉매 커플링시키고, 필요한 경우 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 N
화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CN이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CONH2이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 카바모일기를 탈수시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 O
화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CH2NH2이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CONH2또는 -CN이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 카바모일 또는 시아노기를 환원제로 환원시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 P
화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 하이드록시설포닐이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)을 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 수소이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다)의 티로신 잔기를 하이드록시설폰화시키고, 이어서 보호기(들)를 제거함으로써 제조할 수 있다.
방법 Q
화학식 I의 에어로트리신[이때, -Y-(CH2)m-X-R4가 n-트리데카닐 또는 1-메티트리데카닐이고, R5는 -CONH2이고, Z는 산소 원자이고, R1, R2및 R3은 상기 정의된 바와 같다]을 반응식 1에 요약된 방법에 의해서 화학식 IX의 선형 펩티드로부터 제조할 수 있다.
상기 화학식 III의 화합물(이때, R2, R3및 R5는 상기 정의된 바와 같고, R6은 아미노 보호기이며, 단 R5가 -CONH2인 경우, R2또는 R3은 수소 이외의 것이다), 이의 염은 신규하고 본 발명의 대상물이다. 더욱이, 반응식 1에 제시된 화학식 IX, X 및 XII의 선형 펩티드 및 이의 임의의 염은 신규하며 또한 본 발명의 대상물이다.
방법 A 내지 Q는 하기에 보다 상세히 예시될 수 있다:
방법 A
본 발명에 사용된 미생물은 에어로트리신 1, 2 및 3을 생산할 수 있는듀테로미코티나에 속하는 돌연변이체 및 변형체를 포함한 임의의 균주일 수 있다. 일본 가고시마현에서 수집된 낙엽으로부터 단리되고,듀테로미코티나에 것으로 확인된 균주 NR 7379가 특히 바람직하다.
균주 NR 7379의 배양적 특징 및 형태적 특징이 하기와 같다:
1. 배양적 특징
옥수수 가루 아가(corn meal agar; CMA): 광범위하게 성장하지는 않았다. 집락은 25℃에서 14일 후 접종원으로부터의 직경이 11㎜(4.5㎜ 직경 아가 플라크)에 도달하였다. 이들은 평면이고 옅은 크림 황색이였다. 후면은 옅은 크림 황색이였다. 무색이고도 점액질인 분비물이 존재하였다.
미우라의 배지(Miura's medium; LCA): 광범위하게 성장하지는 않았다. 집락은 25℃에서 14일 후 접종원으로부터의 직경이 11㎜에 도달하였다. 이들은 평면이고 옅은 크림 황색이였다. 후면은 옅은 크림 황색이였다. 분비물은 존재하지 않았다.
맥아 추출물 아가(malt extract agar; MEA): 광범위하게 성장하지는 않았다. 집락은 농포(膿疱)형이고 25℃에서 14일 후 접종원으로부터의 직경이 18㎜가 되었다. 집락의 색은 담황색이 도는 갈색이였다. 후면도 동일한 색이였다. 분비물은 무색이였고 점액질이였다.
감자-덱스트로스 아가(potato-dextrose agar; PDA): 광범위하게 성장하지는 않았다. 집락은 농포형이고 25℃에서 14일 후 접종원으로부터의 직경이 18㎜가 되었다. 집락의 색 및 감촉은 MEA 상의 집락의 색 및 감촉과 유사하였다. 분비물은 무색이였고 점액질이였다.
CMA, LCA, MEA 및 PDA상에서 5℃ 및 30℃사이에서 발아가 관찰되었다.
2. 형태학적 특징
균사체는 일부가 침지되거나, 일부가 표면에 위치하거나, 분지형이거나, 분리되었고, 담황색 내지 크림 황색이였다. 분생자는 침지된 균사체로부터 형성되었다. 이들은 유리질이거나, 분리되거나, 분지되거나, 불규칙하였다. 분생성 세포는 별개의 분생자 또는 불규칙한 균사상에 있었다. 이들은 장벽모세포성, 경자성, 말단성 또는 아말단성이였다. 말단성 또는 아말단성 경자는 길이 및 모양에 있어 생존가능하였다. 이들은 원통모양 내지 플라스크모양이였고, 이들의 길이 및 너비는 각각 5.5 내지 10㎛ 및 2.5 내지 5.5㎛ 이하였다. 격막 바로 아래에 측방향의 분생자성 세포를 갖는 불규칙한 실섬유 모양의 분생자가 종종 형성되었다. 분생자는 단일 세포성이거나, 유리질이거나, 매끄럽거나, 구형 내지 반구형이였고, 길이가 2.0 내지 5.5㎛였고, 너비는 2.0 내지 5.0㎛였다.
이들 별도의 배양적 특징 및 형태학적 특징을 기초로 하여,듀테로미코티나에 속하는 본 균주를 듀테로미코티나 NR 7379로 명명하였다.
듀테로미코티나 NR 7379로 명명된 균주를 부다페스트 조약(Budapest Treaty)하에 의거해 1998년 6월 16일자로 일본 도쿄도 105 미나토쿠 시바 2초메 6반 1고에 소재한 닛폰 로슈 가부시키가이샤(Nippon Roche K.K.) 명의로 일본 통상산업성 공업기술원(Agency of Industrial Science and Technology)의 생명공학 공업기술 연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology)에듀테로미코티나NR 7379(FERM BP-6391)로 기탁하였다.
본 발명에 의해서 제공된 방법에 따라 배양될 미생물을 사용가능한 통상적인영양분을 함유한 배양 배지내에서 배양할 수 있다. 탄소원으로 예를 들면, 포도당, 자당, 전분, 글리세롤, 당밀, 덱스트린 및 이의 혼합물이 언급될 수 있다. 질소원은 예를 들면, 콩가루, 목화씨가루, 고기 추출물, 펩톤, 건조된 효모, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 질산나트륨 및 이의 혼합물이다. 더욱이, 미생물 성장을 촉진시키거나 에어로트리신 1의 생산을 증가시키기 위해 배양 배지에 기타 유기 물질 또는 무기 물질을 첨가할 수 있다. 상기 물질의 예로는 무기 염, 예를 들면, 탄산칼슘, 염화나트륨, 인산 염등이 있다.
바람직하게는 액체 배지내에서 침지식 발효에 의하거나 또는 고형 배지내에서 정치식 발효에 의해 호기성 조건하에서 배양을 수행한다. 20 내지 30℃의 온도, 27℃의 적정 온도가 배양을 위해서 적합하다. 배양을 바람직하게는 pH 3 내지 9에서 수행한다. 배양 시간은 배양 수행시 조건에 의한다. 일반적으로, 20 내지 360시간 동안 충분히 배양한다.
배양물로부터 목적으로 하는 에어로트리신 1, 2 및 3을 수확하기 위해서, 이들의 배양물로부터 미생물에 의해 생산되는 대사물을 단리하는데 통상적으로 사용되는 분리 방법을 적당하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 메탄올 추출 양성 물질인 에어로트리신 1이 하기 방법에 의해서 유리하게 회수된다.
즉, 고형 상태 발효에 의해서 수득된 총 배양 고형물을 목적한 생성물을 회수하기 위한 적절한 용매를 사용하여 추출한다. 총 배양 고형물로부터 목적한 화합물을 추출하기 위해 사용될 수 있는 용매로는 수용성 유기 용매 또는 수용성 유기 용매의 함수(含水) 용액, 예를 들면 메탄올, 에탄올 및 함수 알콜이 포함된다.
생성된 추출물로부터 염, 수용성 물질 등을 제거하기 위해서, 물 및 n-부탄올, 에틸 아세테이트 등과 같은 수불혼화성 유기 용매사이에서의 용매 분배에 의해 생성된 것이 유리하게 사용된다. 추출물로부터 착색 물질, 지용성 물질 등을 제거하기 위해서, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴-0.1% 수성 트리플루오로아세트산 등에 의한 용매 정제에 의해 생성된 것이 사용된다.
에어로트리신을 완전히 정제하기 위해서, 칼럼 크로마토그래피를 유리하게 사용한다. 상기 칼럼 크로마토그래피에서 사용될 수 있는 담체는 예를 들면 YMC-GEL ODS(일본 소재의 야마무라 케미칼 라보래토리즈(Yamamura Chemical Laboratories)) 또는 준비용 C18(와터스 밀리포어 코포레이션(Waters Millipore Corporation))이다. 용출액으로, 수성 트리플루오로아세트산 및 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등과 같은 수용성 유기 용매의 혼합물로 구성된 용매 시스템에 의해 생성된 것을 사용한다. 각각의 성분을 함유한 정제된 용출물 분획을 농축시키거나 냉동 건조시켜 에어로트리신 1, 2 및 3을 분쇄시킬 수 있다.
에어로트리신 1, 2 및 3을 트리플루오로아세트산 염으로 단리하나, 유리(free) 에어로트리신 1, 2 및 3을 하기 방법에 의해서 제조할 수 있다. 즉, 에어로트리신 1, 2 및 3 트리플루오로아세트산 염을 물에 용해하고, 이에 1 당량의 수산화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 세파덱스(Sephadex) LH-20 칼럼 크로마토그래피에 가하고, 이어서 메탄올-물 등과 같은 함수 알콜로 용출시켜 이에 의해 에어로트리신 1, 2 및 3(유리 형태)을 각각 수득한다.
방법 B
화학식 III의 출발 물질을 국제 특허 공개 공보 제 WO 96/30399 호에 기술된 것과 유사한 방법에 의해서 화학식 I의 에어로트리신(방법 C 내지 Q로부터 선택된 방법을 사용하여 에어로트리신 1 내지 3으로부터 전환된 것 뿐만 아니라 에어로트리신 1 내지 3을 포함한다)으로부터 제조할 수 있다. 이 방법은 락톤 고리의 알칼리 가수분해 단계 및 이어서 지방산 쇄를 효소적으로 분해시키는 단계를 포함한다. 화학식 III의 R6에 대해 바람직한 아미노 보호기 및 화학식 IV의 R8에 대해 바람직한 아미노 보호기는 각각 3급 부톡시카보닐(butoxycarbonyl; Boc) 및 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl; Fmoc)이다.
화학식 III의 출발 물질은 또한 본원에서 이후로 언급되는 통상적인 펩티드 합성법에 의해서듀테로미코티나를 발효시킴으로써 수득된 화학식 IX의 선형 펩티드로부터 제조할 수 있다.
화학식 IV의 출발 물질(이때, Y는 -CONH-이고; R4, R8및 X는 상기 정의된 바와 같다)을 하기 화학식 XIV의 화합물을 하기 화학식 XV의 화합물로 축합하고, 이어서 3급-부틸기를 제거함으로써 제조할 수 있다:
[상기 식에서,
R7은 Fmoc기와 같은 아미노 보호기이고,
R4, R8, X 및 m은 상기 정의된 바와 같다]
화학식 XIV의 화합물은 시판된다.
화학식 XV의 출발 물질(이때, X는 단일 결합, 1개 이상의 헤테로원자를 함유하거나 함유하지 않고/않거나 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 비페닐 또는 터페닐이다)은 시판되거나 또는 유럽 특허 제 736541 호 및 반응식 2에 기술된 바와 유사한 방법에 의해서 제조될 수 있는데, 예를 들면, 본원에서 이후에 언급된 반응식 2에서의 카복실산 중간물로부터 제조된 카복시아미드를 LiAlH4환원시키고, 이어서 Fmoc 염화물 등으로 아미노기를 보호함으로써 제조할 수 있다.
화학식 IV(이때, Y는 -CONH- 또는 -CON(저급 알킬)-이고; R4, R7, R8및 X는상기 정의된 바와 같다)의 대표적인 화합물은
등이다.
화학식 IV(이때, Y는 단일 결합 또는 -CH2-이고; R4, R8및 X는 상기 정의된 바와 같다)의 출발 물질은 LDA와 같은 강 염기의 존재하에서(문헌[Tetrahedron Asymmetry, 2(3), 183 (1991)] 참조) 하기 화학식 XVI의 화합물에 (R)-(+)-N-벤질-1-페닐에틸아민을 마이클(Michael) 첨가시키고, 이어서 i) 촉매성 수소화에 의한N-탈벤질화, ii) Fmoc 염화물 등으로 생성된 1급 아민의 보호화 및 iii) 3급-부틸기를 제거함으로써 제조할 수 있다:
[상기 식에서,
R4, X 및 m은 상기 정의된 바와 같다]
화학식 XVI의 출발 물질은 하기 반응식 2에 요약된 방법에 의해서 제조할 수 있다:
화학식 XVI의 화합물(이때, m은 4이다)을 마지막 윗티히(Wittig) 반응 전에반응식 2의 단계 1 내지 3을 반복하여 제조할 수 있다.
화학식 XV(이때, Y는 단일 결합 또는 -CH2-이고; R4, R7및 X는 상기 정의된 바와 같다)의 대표적인 화합물은
등이다.
생성된 선형 펩티드의 환화 뿐만 아니라 제 1 펩티드 결합 형성 반응을 펩티드 화학 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해서 수행할 수 있다(보단스키(M. Bodansky) 및 보단스키(A. Bodansky)의 문헌[The practice of Peptide Synthesis, 2판, 1994 (Springer-Verlag)]을 참조). 바람직한 축합제는 BOP-HOBt, PyBOP(등록상표)-HOBt, PyBroP(등록상표)-HOBt 등[커플링제: 시판됨(문헌[The Combinatorial Chemistry Catalog, Feb., 1997; Novabiochem.)]이다.
반응은 -20℃ 및 +50℃, 바람직하게는 0 내지 +25℃의 온도에서 트리에틸아민, 디-이소플필에틸아민, 피리미딘 등과 같은 염기의 존재 또는 부재하에서 메탄올, 에탄올, 피리딘, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
방법 C
화학식 I의 에어로트리신을 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해서 질화시킬 수 있는데, 전형적으로는 질산나트륨/아세트산, 테트라니트로메탄/피리딘 등에 의해서 질화시킬 수 있다.
반응을 -2O℃ 및 0℃, 바람직하게는 O℃의 온도에서 수행할 수 있다.
방법 D
니트로기를 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해서 환원시킬 수 있는데, 전형적으로는 팔라듐-C, 백금 산화물 등과 같은 촉매를 사용하여 촉매성 수소화에 의해서 환원시킬 수 있다.
반응을 메탄올, 에탄올, 아세트산 등과 같은 용매중에서 실온으로 수행할 수있다.
방법 E 및 I
화학식 I의 R1또는 R3에 존재하는 아미노기를 당분야의 숙련가에 공지된 방법에 의해서 산 무수물 또는 카바모일 염화물에 의해 N-아실화시키거나 또는 디사이클로헥실카보디이미드, BOP, HBTU, TNTU, PyBroP(등록상표), PyBOP(등록상표), TBTU, TSTU, HOBt 과 같은 축합제 또는 이들 2개의 조합물을 사용하여 카복실산에 의해 N-아실화시킬 수 있다.
반응은 -20℃ 및 +50℃, 바람직하게는 0 내지 +25℃의 온도에서 트리에틸아민, 디-이소프로필에틸아민, 피리딘 등과 같은 염기의 존재 또는 부재하에서 메탄올, 에탄올, 피리딘, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
축합 반응을 위한 N-보호 아미노산을 사용하는 경우, 당분야의 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들면, Boc기에 대한 트리플루오로아세트산 또는 Fmoc기에 대한 피페리딘으로 처리하여 아미노 보호기(들)를 제거할 수 있다.
방법 F
화학식 I에 존재하는 아미노기를 문헌[Organic Synthesis col. Vol. III, page 93]에 기술된 방법에 따라 아크릴로니트릴, 에톡시메틸렌-말로노니트릴 또는 (1-에톡시에틸리덴)말로노니트릴을 사용하여 N-모노알킬화시키고, 이어서 소듐 보로하이드라이드/코발트 염화물, 보란-메틸설리드 착체 등을 사용하여 촉매성 수소화 또는 환원화에 의해 생성된 니트릴기를 환원시킨다.
방법 G
화학식 I의 R1에 존재하는 제 1 아미노기 또는 제 2 아미노기를 아세트산과 같은 약산의 존재 또는 부재하에서 소듐 시아노보로하이드라이드와 같은 환원제를 사용하여 화학식 V의 알데히드 유도체를 사용한 통상적인 환원성 알킬화에 의해 N-알킬화시킬 수 있다.
반응은 실온에서 메탄올, 에탄올, 아세트산 등과 같은 용매중에서 수행된다.
방법 H
치환 반응을 위한 화학식 VI의 화합물(R12-Q)의 예는 2-브로모-5-니트로피리딘, 2-클로로피리미딘, 클로로피라진 등이다.
치환 반응은 -20℃ 및 +50℃, 바람직하게는 0 내지 +25℃의 온도에서 탄산칼륨, 트리에틸아민, 디-이소프로필에틸아민 등과 같은 산 소거제의 존재 또는 부재하에서 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
방법 J
화학식 I의 R1에 존재하는 아미노기는 방법 F에 기술된 방법에 의해서 제 1 모노-N-알킬화된다. 방법 E 및 I에 기술된 방법에 의해서 연속적으로 N-아실화시킬 수 있다.
방법 K
화학식 I의 R1에 존재하는 아미노기를 3,5-디메틸-1H-피라졸-1-카복스아미딘, 포름아미디설폰산, 벤즈트리아졸-1-카복스아미디늄 토실레이트 등과 같은 활성 화된 아미딘 유도체에 의해 전환시킬 수 있다.
반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 온도에서 메탄올, 에탄올, 물, N,N-디메틸포름아미드 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
방법 L
화학식 I의 티로신 잔기의 하이드록시기를 당분야의 숙련가에 공지된 방법에 의해서 탄산나트륨, 디이소프로필에틸아민 등과 같은 산 소거제의 존재하에서 O-알킬화시킨다(문헌[Can. J. Chem., 36, 1521 (1958)]).
반응은 0 및 +50℃, 바람직하게는 0 내지 +25℃의 온도에서 메탄올, 에탄올, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드 등과 같은 용매중에서 수행할 수 있다.
방법 M
티로신 잔기내의 페닐기의 오르토 위치를 메탄올, 에탄올 등과 같은 용매중의 요오드 일염화물 또는 요오드화나트륨/수성 과염화나트륨을 사용하여 실온에서 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 수소이다)으로 처리하여 요오드화시킨다.
20℃ 내지 +100℃, 바람직하게는 20 내지 +70℃의 온도에서 트리에틸아민과 같은 염기의 존재하에서 메탄올, 에탄올, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴 등과 같은 용매중에서 Pd(OAc)2, Pd(OAc)2(dppp)2과 같은 팔라듐(0) 촉매를 사용하여일산화탄소, 메틸 아크릴레이트 등으로 팔라듐(0) 촉매 커플링 반응을 수행한다(문헌[Bioorg.Med.Chem.Lett.,7(22),2879(1997)]).
방법 N
화학식 I의 카바모일기(R5)를 버기스(Burgess) 시약[알드리치(Aldrich) 제품], 염화시안, 옥살릴 염화물 등에 의해 탈수시킬 수 있다(문헌[J. Med. Chem., 37, 222(1994)]).
반응은 실온에서 N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
방법 O
화학식 I의 카바모일 또는 시아노기(R5)를 소듐 보로하이드라이드/코발트 염화물, 보란-메틸설피드 착체 등에 의해 환원시킬 수 있다(문헌[J. Med. Chem., 37, 222(1994)] 참조).
반응은 실온에서 메탄올, 에탄올 등과 같은 용매중에서 수행될 수 있다.
방법 P
화학식 I의 티로신 잔기를 -30 내지 +70℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 1,4-디옥산, 테트라하이드로푸란 등과 같은 용매중에서 삼산화황-DMF 착체, 삼산화황-피리딘 착체 또는 삼산화황-트리에틸아민 착체에 의해 하이드록시설폰화시킨다(문헌[J. Chem. Soc. Perkin Trans, (6) 1739 (1990)] 참조).
방법 Q
이 방법에 연관된 반응을 방법 B 내지 Q에 기술된 방법과 유사한 방법에 의해서 수행할 수 있다.
출발 물질인 화학식 IX의 선형 펩티드는 수성 또는 고형 매질중 호기성 조건하에서듀테로미코티나에 속하는 미생물을 배양하고 이로부터 화학식 IX의 선형 펩티드를 단리시킴으로써 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 미생물은 화학식 IX의 선형 펩티드를 생성할 수 있는듀테로미코티나에 속하는 돌연변이체 및 변형체를 포함하는 임의의 균주일 수 있다. 일본 가고시마현에서 수집된 낙엽으로부터 단리되고,듀테로미코티나에 속하는 것으로 확인된 균주 NR 7379가 특히 바람직하다.
듀테로미코티나 NR 7379로 명명된 균주를 부다페스트 조약하에 의거해 1998년 6월 16일자로 일본 도쿄도 105 미나토쿠 시바 2초메 6반 1고에 소재한 닛폰 로슈 가부시키가이샤 명의로 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에듀테로미코티나NR 7379(FERM BP-6391)로 기탁하였다.
본 발명에 의해서 제공된 방법에 따라 배양될 미생물을 사용가능한 통상적인 영양분을 함유한 배양 배지내에서 배양할 수 있다. 탄소원으로 예를 들면, 포도당, 자당, 전분, 글리세롤, 당밀, 덱스트린 및 이의 혼합물이 언급될 수 있다. 질소원은 예를 들면, 콩가루, 목화씨가루, 고기 추출물, 펩톤, 건조된 효모, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 질산나트륨 및 이의 혼합물이다. 더욱이, 미생물의 성장을 촉진시키거나 화학식 IX의 선형 펩티드의 생산을 증가시키기 위해 배양 매질에 다른 유기 물질 또는 무기 물질을 첨가할 수 있다. 상기 물질의 예로는 무기염, 예를 들면, 탄산칼슘, 염화나트륨, 인산염 등이 있다.
바람직하게는 액체 배지내에서 침지식 발효에 의하거나 또는 고형 배지내에서 정치식 발효에 의해 호기성 조건하에서 배양을 수행한다. 20 내지 30℃의 온도, 27℃의 적정 온도가 배양을 위해서 적합하다. 배양을 바람직하게는 pH 3 내지 9에서 수행한다. 배양 시간은 배양 수행시 조건에 의한다. 일반적으로, 120 내지 672시간 동안 충분히 배양한다.
상기 배양물로부터 목적으로 하는 화학식 IX의 선형 펩티드를 수확하기 위해서, 이들의 배양물로부터 미생물에 의해 생산되는 대사물을 단리하는데 통상적으로 사용되는 분리 방법을 적절히 사용할 수 있다. 예를 들면, 메탄올 추출 양성 물질인 화학식 IX의 선형 펩티드가 하기 방법에 의해서 유리하게 회수된다.
즉, 액체 발효에 의해 수득된 배양된 육즙을 적합한 용매로 추출하여 상기 제안된 생성물을 회수한다. 배양된 육즙으로부터 목적하는 화합물을 추출하는데 사용될 수 있는 용매로는 수용성 유기 용매 또는 수용성 유기 용매의 함수 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올 및 함수 알콜, 또는 수불혼화성 유기 용매, 예를 들면 n-BuOH이 있다.
생성된 추출물로부터 염, 수용성 물질 등을 제거하기 위해서, 물 및 n-부탄올, 에틸 아세테이트 등과 같은 수불혼화성 유기 용매사이에서의 용매 분배에 의해 생성된 것이 유리하게 사용된다. 추출물로부터 착색 물질, 지용성 물질 등을 제거하기 위해서, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴-0.1% 수성 트리플루오로아세트산 등에의한 용매 정제에 의해 생성된 것이 사용된다.
화학식 IX의 선형 펩티드를 완전히 정제하기 위해서, 칼럼 크로마토그래피를 유리하게 사용한다. 상기 칼럼 크로마토그래피에서 사용될 수 있는 담체는 예를 들면 캡셀 팍(Capcel Pak) C18 UG80(일본 시세이도 캄파니 리미티드(Shiseido Co. LTD))이다. 용출액으로, 수성 트리플루오로아세트산 및 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등과 같은 수용성 유기 용매의 혼합물로 구성된 용매 시스템에 의해 생성된 것을 사용한다. 이어서, 화학식 IX의 선형 펩티드를 함유한 정제된 용출물 분획을 농축시키거나 냉동 건조시켜 화학식 IX의 선형 펩티드를 분쇄시킬 수 있다.
화학식 IX의 선형 펩티드는 트리플루오로아세트산 염으로 단리하나, 화학식 IX의 유리 선형 펩티드를 하기 방법에 의해서 제조할 수 있다. 즉, 화학식 IX의 선형 펩티드 트리플루오로아세트산 염을 물에 용해하고, 이에 1 당량의 수산화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피에 가하고, 이어서 메탄올-물 등과 같은 함수 알콜로 용출시켜 화학식 IX의 선형 펩티드를 수득한다.
본 발명에 의해 제공된 화학식 IX의 선형 펩티드는 다양한 진균에 대해 살진균 활성을 전혀 나타내지 않지만, 에어로트리신과 같은 강력한 항진균제를 생성시키는데 있어 중요한 중간물일 수 있다.
본 발명은 또한 에어로트리신의 산 부가 염에 관한 것이다. 상기 산 부가 염은 정상적인 단리 방법 이후 트리플루오로아세트산 염으로서 수득될 수 있다. 이어서 수득된 염을 물에 용해시키고, 목적하는 음이온을 보유하는 음이온 교환 칼럼에 통과시킬 수 있다. 목적하는 염을 함유한 용출물을 농축시켜 상기 염을 고형생성물로서 회수할 수 있다.
화학식 I의 에어로트리신은 3급 질소 원자의 존재로 인해 상응하는 염으로 전환될 수 있다.
화학식 I의 에어로트리신의 산 부가 염은 에어로트리신의 유리 기재(base)를, 무기산, 예를 들면 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들면 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 적합한 산의 화학량론적 양 이상으로 처리함으로써 수득될 수 있다. 전형적으로, 유리 기재는 불활성 유기 용매, 예를 들면 에탄올, 메탄올 등에 용해되고, 산은 유사한 용매에 첨가된다. 온도는 약 40℃로 유지된다. 생성된 염은 자연스럽게 침전되거나 극성이 보다 작은 용매를 갖는 용액으로부터 침전될 수 있다.
화학식 I의 에어로트리신의 산 부가 염은 화학량론적 양 이상의 적합한 기재, 예를 들면 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 탄산칼륨, 중탄산나트륨, 암모니아 등으로 처리되어 상응하는 유리 기재로 전환될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 에어로트리신은 다양한 진균에 대해 광범위한 살진균 활성을 나타내고, 진균 감염성 질환의 치료 및 예방을 위한 약제로서 사용될 수 있다. 화학식 I의 대표적인 에어로트리신의 생체외 및 생체내 항진균 활성(표 2 및 3을 참조) 뿐만 아니라 간세포에 대한 독성(표 4를 참조)은 다음과 같다.
1. 생체외 항진균 활성
약물처리 되지 않은 대조군의 성장과 분광광도계상으로 비교하여 진균의 성장을 20% 혼탁도로 억제시키기 위해 항진균제의 최저 농도로서 계산된 50% 억제성 농도(IC50)를 결정함으로써, 본 연구의 대표적인 에어로트리신의 생체외 항진균 활성을 평가하였다.
하기 최소 변형의 NCCLS 승인된 표준(임상 실험 표준을 위한 국립 위원회(National Committee for Clinical Laboratory Standards).(1997) 효모에 대한 육즙 희석 항진균성 민감 시험을 위한 참고 방법. 승인된 표준. 문서 M27-A)을 기준으로 육즙 마이크로-희석 방법에 의해 IC50값을 결정하였다. 포도당 1% 및 K2HPO40.25%로 보충된 효모 질소 기재(yeast nitrogen base; YNB, 디프코 랩(Difco Lab.) 제품)를 효모에 대한 시험 매질로서 사용하고, 0.2%의 낮은 융점의 아가로스(BRL 제품)로 응고된 상기와 동일한 매질을 사상균에 대해 사용하였다. 접종원의 크기는 1×104내지 3×104세포/㎖이고, 35℃에서 1 내지 2일 동안 배양시켰다.
생체외 항진균 활성, IC50(㎍/㎖)
칸디다 알비칸스(Candida albicans)CY 1002 아스페르질루스 푸미가투스(Aspegillus funigatus)CF 1003 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)CF 1008
에어로트리신 1 0.03 0.06 0.21
에어로트리신 5 0.03 0.07 0.19
에어로트리신 12 0.09 0.10 2.20
에어로트리신 31 0.07 0.49 0.70
에어로트리신 36 0.08 0.05 1.00
에어로트리신 39 0.09 0.17 0.70
에어로트리신 41 0.08 0.03 2.40
에어로트리신 43 0.05 0.04 0.70
에어로트리신 45 0.07 0.08 2.30
에어로트리신 46 0.09 0.08 1.80
에어로트리신 47 0.09 0.11 1.40
에어로트리신 53 0.11 0.09 2.30
에어로트리신 54 0.15 0.17 0.74
에어로트리신 55 0.04 0.04 0.39
에어로트리신 57 0.14 0.05 1.30
에어로트리신 75 0.15 0.10 1.40
에어로트리신 77 0.13 0.10 0.67
에어로트리신 95 0.14 0.10 0.74
2. 생체내 항진균 효능
본 발명의 에어로트리신의 생체내 항진균 효능을 하기 표 3에 나타낸다. 통상적인 면역적격성 마우스 균주 Crj:CD-1(ICR)를 갖는 마우스를 전신성 칸디다증의 실험용 감염 모델로 사용하였다. 꼬리 정맥을 통해칸디다 알비칸스5×106분생자/마우스를 주입함으로써 전신성 칸디다증에 대해 4주 된 Crj:CD-1(ICR) 마우스를 사용하였다. 정맥내 주사로(i.v.) 첫 날 2회 치료하고(감염될 때 및 감염 후 4시간), 그 다음 2일간 전신성 칸디다증에 대해 1회/1일로 치료하였다(1일 2회 치료한 후 2일간 1회/1일 치료). 14일째 되는 날 각각의 투여량에서 생존하는 수로부터 효과적인 투여량의 50%(ED50) 값을 계산하였다.
마우스의 전신성 칸디다증에 대한 생체내 항진균 활성, 14일째 되는 날의 ED50(㎎/㎏)
에어로트리신 5 0.3
에어로트리신 16 0.3
에어로트리신 18 0.6
에어로트리신 36 0.6
에어로트리신 41 0.3
에어로트리신 42 0.6
에어로트리신 45 0.3
에어로트리신 46 0.4
에어로트리신 50 <0.3
에어로트리신 55 <0.3
에어로트리신 65 0.6
3. 생체외 간세포독성 시험
상기 마우스의 간세포를 콜라게나제 소화에 의해 단리시키고 마이크로시험판에서 배양시켰다. 상기 간세포의 단층을 1일 동안 상기 배양 시스템에서 시험 에어로트리신에 노출시켰다. 배양 기간 이후, 현미경으로 간세포를 관찰하였고, 이를 형태학적으로 평가하였다. 시험 에어로트리신에 의한 간세포의 형태학적 변형(퇴화) 정도를 WF11243 및 LY303366과 비교하였다.
간세포에 대한 세포독성(㎍/㎖)
에어로트리신 14 >100
에어로트리신 15 >100
에어로트리신 21 >100
에어로트리신 34 >100
에어로트리신 38 >100
에어로트리신 45 >100
에어로트리신 47 >100
에어로트리신 48 >100
에어로트리신 53 >100
에어로트리신 65 >100
에어로트리신 67 >100
에어로트리신 72 >100
에어로트리신 81 >100
WF11243(=에어로트리신3) 100
LY303366 10
4주 동안 마우스에게 에어로트리신 1을 5㎎/㎏ 및 30㎎/㎏으로 투여하였더니 어떠한 심각한 독성도 나타나지 않았다.
따라서, 화학식 I의 신규한 에어로트리신 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용가능한 염은 마우스에게서 광범위한 투여량으로 아스페르질루스증을 포함한 다양한 진균성 감염에 대해 강력한 항진균 활성을 나타내고, 항진균제로서 유용하다. 더욱이, 본 발명에 의해 제공된 에어로트리신은 공지된 환형 펩티드 유도체(WF11243 및 LY303366)보다 간세포에 대한 세포독성이 훨씬 작다.
본 발명의 에어로트리신은 또한 면역이 약화된 환자에게서뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 감염을 억제시키거나 완화시키는데 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 I의 신규한 에어로트리신 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용가능한 염을함유한 약학 조성물에 관한 것이다.
화학식 I의 신규한 에어로트리신 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용가능한염은 높은 활성의 살진균제이다. 이들은칸디다종,아스페르질루스종,푸사리움종,털곰팡이종(Mucor spp.) 및압시디아종(Absidia spp.)을 포함한 각종 진균 종에 대해 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 에어로트리신은 인간 뿐만 아니라 동물의 진균증의 국소적 및 전신성 치료에 유용하다. 예를 들면,칸디다종,백선균종(Trichophyton spp.) 및소포자균종(Microsporum spp.)에 의해 유발된 국소적 및 점막성 진균 감염을 치료하는데 유용하다. 또한, 예를 들면칸디다종,아스페르질루스종또는푸사리움종에 의해 유발된 전신성 진균 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
의학적 용도를 위해, 화학식 I의 신규한 에어로트리신 뿐만 아니라 이의 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 코팅물질, 유화제, 현탁제, 용매, 안정화제, 흡수 증강제 및/또는 연고 기재와 혼합함으로써 특정 용도 및 요구되는 목적에 적합하도록 배합된 약학 혼합물로 투여될 것이다. 상기 혼합물은 경구, 주사, 코, 직장 또는 국소적 투여로 사용될 수 있다.
경구 투여용 에어로트리신의 약학 배합물은 과립, 정제, 설탕으로 코팅된 정제, 캡슐, 환약, 현탁액 또는 유화액일 수 있다. 정맥내, 근육내 또는 피하의 비경구적 주사를 위해, 화학식 I의 에어로트리신은 다른 물질, 예를 들면 염 또는 포도당을 함유하여 등장 용액을 만들 수 있는 무균성 수용액의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 바람직하게는 방부제가 첨가된 앰플주사제 또는 다중투여량 용기의 단위 용량 형태로 존재할 수 있다. 다르게는, 활성 성분은 투여하기 전에 적합한 베히클(vehicle)로 재구성되도록 분말 형태로 존재할 수 있다. 에어로트리신은 또한 좌약 또는 질좌제의 형태로 투여될 수 있거나, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 분진성 분말의 형태로 국소적으로 적용될 수 있다.
화학식 I의 에어로트리신의 1일 투여량 수준은 경구 또는 비경구적으로 투여될 때 0.1 내지 50㎎/㎏(분할 투여량으로)이다. 따라서, 에어로트리신의 정제 또는 캡슐은 단일 투여 또는 2회 이상의 투여에 있어서 한번에 활성 화합물을 5㎎ 내지 0.5g으로 적절히 함유할 것으로 예상할 수 있다. 임의의 경우, 실제 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변할 수 있다.
에어로트리신이 항진균 용도인 경우 임의의 투여 방법이 사용될 수 있다. 진균성 감염을 치료하기 위해, 통상적으로 경구 또는 정맥내 투여가 사용된다.
에어로트리신이 뉴모시스티스 감염의 조절에 사용될 때, 폐 및 기관지를 직접 치료하는 것이 바람직하다. 상기 이유로 흡입 방법이 바람직하다. 흡입 또는 코에 의한 투여를 위해, 본 발명의 에어로트리신은 감압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분사 표현 형태로 편리하게 방출된다. 흡입 또는 코를 위한 바람직한 방출 시스템은 측량된 투여량의 흡입 에어로졸이고, 이는 탄화불소 또는 탄화수소와 같은 적합한 추진체인 화학식 I의 화합물의 분말, 현탁액 또는 용액으로서 배합될 수 있다.
본 발명의 에어로트리신은 정제, 캡슐, 국소적 조성물, 취입 분말, 좌약 등으로서 사용될 수 있지만, 물 및 수성 매질에서의 용해도로 인해 주사가능한 배합물 및 또한 에어로졸 분사에 적합한 액체 조성물로 사용하기가 적합하다.
하기 실시예는 본 발명의 에어로트리신의 바람직한 제조방법을 예시하지만 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.
하기 실시예에서, 다음과 같이 제시된 것으로부터 선택된 역상 칼럼을 이용한 HPLC에 의해 생성물을 분석 및 정제하였다. 혼합된 용매는 각각의 실시예에 기술되어 있는 적합한 비율의 0.05%의 트리플루오로아세트산-물과 0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴로 구성되었다.
HPLC 칼럼
칼럼 A 캡셀 팍 C18, UG-120, 4.6×250㎜
칼럼 B 캡셀 팍 C18, UG-120, 10×250㎜
칼럼 C 캡셀 팍 C18, UG-80, 20×250㎜
칼럼 D 캡셀 팍 C18, SG-120, 4.6×250㎜
칼럼 E 캡셀 팍 C18, SG-120, 10×250㎜
칼럼 F TSK 겔 ODS-80T, 20×250㎜
하기 실시예에서 에어로트리신은 달리 지시되지 않는다면 트리플루오로아세트산 염으로 수득하였다.
참고예 1
(R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)-펜탄산의 제조
(a) 4-브로모-4'-헵틸옥시비페닐의 제조
K2CO3(4.20g, 30.4m㏖) 및 1-브로모헵탄(4.14㎖, 26.4m㏖)을 DMF(100㎖)중4-브로모-4'-하이드록시비페닐(5.05g, 20.2m㏖)의 교반된 용액에 첨가한 다음, 그 혼합물을 80℃에서 가열하였다. 80℃에서 20시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. Et2O(250㎖)로 상기 혼합물을 희석시킨 다음, 그 용액을 포화 염수(150㎖×2)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2-석유 에테르로부터 재결정하여 4-브로모-4'-헵틸옥시비페닐(6.21g, 88%)을 백색 고형물로서 수득하였다; FAB-MS: m/z 347[MH+].
(b) 4-포르밀-4'-헵틸옥시비페닐의 제조
n-BuLi(헥산중 1.66M의 용액, 32.3㎖, 53.6m㏖)을 THF(120㎖)중 4-브로모-4'-헵틸옥시비페닐(6.21g, 17.9m㏖)의 저온(0℃)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, -78℃에서 DMF(4.85㎖, 62.6m㏖)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 -78℃에서 추가로 20분 동안 교반한 다음, 포화된 수성 NH4Cl로 급냉시켰다. 상기 혼합물을 EtOAc(220㎖)로 희석시키고, 포화된 수성 NH4Cl(125㎖) 및 포화 염수(100㎖)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(EtOAc/헥산, 1:20)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 4-포르밀-4'-헵틸옥시비페닐(2.21g, 42%)을 백색의 비결정질 분말로서 수득하였다.
(c) 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)아크릴산 에틸 에스테르의 제조
Ph3P=CHCOOEt(5.19g, 14.9m㏖)를 벤젠(40㎖)중 4-포르밀-4'-헵틸옥시비페닐(2.21g, 7.46m㏖)의 교반된 용액에 첨가한 다음, 그 혼합물을 60℃에서 가열하였다. 60℃에서 3시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(CH2Cl2/헥산, 1:2)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)아크릴산 에틸 에스테르(2.66g, 97%)를 백색의 비결정질 분말로서 수득하였다.
(d) 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온산 에틸 에스테르의 제조
활성 탄소상의 팔라듐(Pd 촉매 10중량%, 1.07g)을 CH2Cl2(60㎖)중 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)아크릴산 에틸 에스테르(2.65g, 7.23m㏖)의 교반된 용액에 첨가한 다음, 그 혼합물을 H2분위기하에 두었다. 2시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 셀라이트 패드(pad)를 통해 여과시키고, CH2Cl2로 세척하였다. 여과액과 세척물을 합치고 진공하에서 농축시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온산 에틸 에스테르(조생성물, 2.74g)를 수득하였다.
(e) 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로판-1-올의 제조
THF(30㎖)중 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온산 에틸 에스테르(조생성물, 2.74g)의 용액을 THF(20㎖)중 LiAlH4(0.47g, 12.4m㏖)의 저온(0℃)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 0℃에서 H2O로 급냉시켰다. 상기 혼합물을 셀라이트 패드로 여과시키고, CH2Cl2로 세척하였다. 여과액과 세척물을 합치고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(EtOAc/헥산, 2:3)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4'-헵틸옥시-비페닐-4-일)프로판-1-올(2.27g, 2단계를 위한 96%)을 백색의 비결정질 분말로서 수득하였다.
(f) 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온알데히드의 제조
분자체 4A 분말(5.17g) 및 PCC(5.25g, 24.4m㏖)를 CH2Cl2(60㎖)중 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로판-1-올(2.26g, 6.92m㏖)의 저온(0℃)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, Et2O(20㎖)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 짧은 실리카 겔 칼럼으로 이동시키고 CH2Cl2로 용출시켰다. 용출물을 진공하에서 농축시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온알데히드(조생성물, 2.45g)를 수득하였다.
(g) 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜트-2-에노산 3급-부틸 에스테르의 제조
Ph3P=CHCOOt-Bu(5.21g, 13.8m㏖)을 벤젠(150㎖)중 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)프로피온알데히드(조생성물, 2.45g)의 교반된 용액에 첨가한 다음, 그 혼합물을 60℃에서 가열하였다. 60℃에서 30분 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(EtOAc/헥산, 1:30)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜트-2-에노산 3급-부틸 에스테르(1.95g, 2단계를 위한 67%)를 백색의 비결정질 분말로서 수득하였다.
(h) (R)-3-[벤질-((R)-1-페닐에틸)아미노]-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르의 제조
n-BuLi(헥산중 1.61M 용액, 15.0㎖, 24.2m㏖)을 THF(40㎖)중 (R)-N-벤질-1-페닐에틸아민 하이드로클로라이드(3.28g, 13.2m㏖)의 저온(0℃)의 교반된 현탁액에첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 25분 동안 교반한 후, THF(30㎖)중 3-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜트-2-에노산 3급-부틸 에스테르(1.94g, 4.38m㏖)의 용액을 -78℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 -78℃에서 추가로 20분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화된 수성 NH4Cl로 급냉시키고, 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 포화된 수성 NH4Cl(200㎖)로 희석시킨 다음, CH2Cl2(200㎖×2)로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(EtOAc/헥산, 1:40)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (R)-3-[벤질-((R)-1-페닐에틸)아미노]-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(2.83g, 정량)를 무색의 오일로서 수득하였다.
(i) (R)-3-아미노-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르의 제조
AcOH(2.5㎖) 및 탄소상 Pd(OH)2(Pd(OH)2촉매 20중량%, 1.07g)를 EtOAc(50㎖)중 (R)-3-[벤질-((R)-1-페닐에틸)아미노]-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(2.82g, 4.45m㏖)의 교반된 용액에 첨가한 다음, 그 혼합물을 H2분위기하에 두었다. 15시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해여과시키고, MeOH로 세척하였다. 여과액과 세척물을 합치고, 진공하에서 농축시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 (R)-3-아미노-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(조생성물, 3.14g)를 수득하였다.
(j) (R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르의 제조
Na2CO3(1.19g, 11.2m㏖) 및 FmocCl(1.28g,4.95m㏖)를 50%의 수성 1,4-디옥산(40㎖)중 (R)-3-아미노-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(조생성물, 3.14g)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 포화 염수(100㎖)로 희석시키고, CH2Cl2(100㎖×3)로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공하에서 농축시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 (R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(조생성물, 3.34g)를 수득하였다.
(k) (R)-3-(9-플루오레닐메틸옥시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산의 제조
TFA(20㎖)를 CH2Cl2(20㎖)중 (R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산 3급-부틸 에스테르(조생성물, 3.34g)의 교반된 용액에 적가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔(MeOH/CH2Cl2, 1:20)상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-5-(4'-헵틸옥시비페닐-4-일)펜탄산(2.07g, 3단계에서 77%)을 백색의 비결정질 분말로서 수득하였다.
방법 B에 사용되는 화학식 IV(이때, Y는 단일 결합 또는 -CH2-이다)의 출발 화합물을 상기 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
참고예 2
(S)-3-(9H-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-N-운데실숙시남산의 제조
(a) N,N-디이소프로필에틸아민(64㎕, 0.36m㏖)을 N,N-디메틸포름아미드(0.2㎖)중 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐-아미노)숙신산(150㎎, 0.36m㏖), BOP 시약(162㎎, 0.36m㏖) 및 HOBT 수화물(56㎎, 0.36m㏖)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 1-아미노운데칸(79㎕, 0.37m㏖)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물로 희석시키고,Et2O로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 실라카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출액으로서 n-헥산:에틸 아세테이트= 3:1를 사용함)에 의해 잔사를 정제하여 (S)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-N-운데실숙시남산 3급-부틸 에스테르(169㎎, 82% 수율)를 무색의 비결정질 고형물로서 수득하였다.
(b) TFA(2㎖)중 (S)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-N-운데실숙시남산 3급-부틸 에스테르(113㎎, 0.2m㏖)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, 진공하에서 증발에 의해 TFA를 제거하였다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(용출액으로서 디클로로메탄:메탄올=9:1)에 의해 잔사를 정제하여 (S)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-N-운데실숙시남산(101㎎, 99% 수율)을 무색의 비결정질 고형물로서 수득하였다.
방법 B에 사용되는 화학식 IV(이때, Y는 -CONH- 또는 -CON(CH3)-이다)의 출발 화합물을 상기 기술된 방법에 따라서 제조하였다.
참고예 3
N-Boc-에어로트리신 3(화합물 A)의 제조
트리에틸아민(2.54㎖, 18.2m㏖), 디-3급-부틸 디카보네이트(13.9㎖, 60.7m㏖)을 MeOH(1500㎖)중 에어로트리신 3(10.0g, 6.07m㏖)의 용액에 연속적으로 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 MeOH(촉매 10㎖)에 용해시키고, 그 용액을 디에틸에테르(1500㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물을 여과하고 디에틸에테르로 세척하여 추가의 정제를 하지 않고서 하기 기술되는 실시예에서 추가의 구조적 변형을 위해 사용되는 N-Boc-에어로트리신 3(화합물 A)을 연한 황색의 비결정질 고형물로서 9.9g 수득하였다.
실시예 4
에어로트리신 1, 2 및 3의 제조
(a) 고형물 발효
10%(v/v)의 글리세롤 용액중 듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)의 냉동 배양물의 0.1㎖부를 해동시키고, 포도당 2%, 감자 전분 1%, 글리세롤 1.5%, 토스트 소야(Toast soya)(니신 세이유(Nissin Seiyu)) 1%, 효모 추출물(닛폰 세이야쿠(Nippon Seiyaku)) 0.35%, 폴리펩톤(니혼 세이야쿠(Nihon Seiyaku)) 0.25%, NaCl 0.3%, CaCO30.5%, ZnSO4·7H2O 0.005%, CuSO4·5H2O 0.0005% 및MnSO4·4H2O 0.0005%로 구성된 매질 100㎖를 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에서 접종하였다. 상기 매질의 pH를 조정하지 않았다. 씨 배양물을 회전식 진탕기에서 27℃, 220rpm으로 7일 동안 배양하였다. 상기 씨 배양물의 2㎖를 가압된 보리 200g, 효모 추출물(디프코) 0.12g, 소듐 타르타레이트 0.06g, KH2PO40.06g 및 물 120㎖로 구성된 고형 매질을 함유하는 3ℓ들이 삼각플라스크에 옮겼다. 정적인 조건하에 27℃로 발효시켰다. 생산양이 약 240시간 정도의 발효에서 최대에 도달했으며, 그 배양물을 에어로트리신 1, 2 및 3의 단리 방법에 가하였다.
수득된 배양된 고형물(10㎏)을 메탄올(40ℓ)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반한 후, 여과로 제거하여 메탄올 추출물(39ℓ)을 수득하였다. 이런 방식으로 수득된 메탄올 추출물을 감압하에 건조 농축시키고, 잔사(64.8g)를 에틸 아세테이트(1ℓ) 및 물(1ℓ)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 교반한 후, 에틸 아세테이트 층을 제거하였다.
추가로, 수성 층을 마찬가지로 에틸 아세테이트(1ℓ)로 2회 세척하였다. 남아있는 수성 층을 n-부탄올(1ℓ)로 3회 추출하였다. 이런 방식으로 수득된 추출물을 합치고, 감압하에 건조 농축시키고, 잔사(28.5g)를 아세토니트릴-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(1:1)의 혼합물(250㎖)에 용해시켰다. 원심분리에 의해 불용성 물질을 제거한 후, 수득된 용액을 감압하에 건조로 증발시키고, 잔사를 메탄올(300㎖)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반한 다음, 여과로 제거하여 메탄올 용액(280㎖)을 수득하였다. 이런 방식으로 수득된 메탄올 용해성 물질(9.3g)을 역상 실리카 겔 C18(1ℓ)의 칼럼 크로마토그래피에 가하였다. 메탄올-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 및 8:2)의 혼합물을 사용하여 상기 칼럼을 단계적으로 용출하였다. 메탄올-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(7:3)으로 상기 순서대로 용출된 에어로트리신 1, 2 및 3을 진공하에 건조 농축시켜 백색의 분말성 에어로트리신 3 트리플루오로아세트산 염(731㎎) 및 에어로트리신 1 트리플루오로아세트산 염(747㎎)을 각각 수득하였다. 에어로트리신 2를 함유하는 분획을 감압하에서 농축시키고, 다음과 같은 조건하에서 HPLC로 추가로 정제하였다: 칼럼: 캡셀 팍 C18(즉, 30×250㎜, 시세이도 캄파니 리미티드); 이동상: 아세토니트릴-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(45:55); 유동 속도: 40㎖/분; 검출: UV 220㎚. 상기 조건하에서 수득된 적합한 용출물을 진공하에 건조 농축시켜 백색의 분말성 에어로트리신 2 트리플루오로아세트산 염(42㎎)을 수득하였다.
(b) 플라스크 발효
10%(v/v)의 글리세롤 용액중 듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)의 냉동 배양물의 2㎖부를 해동시키고, 포도당 1%, 귀리 가루 1%, 토마토 페이스트 4%, 옥수수 침지액(안도 가세이(Ando kasei)) 0.5%, FeSO4·7H20 0.001%, MnSO4·4H2O 0.001%, CaCl20.0001%, ZnSO4·7H2O 0.0002%, (NH4)6MoO2·4H2O 0.00002% 및 H3BO30.00006%로 구성된 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 살균 처리하기 전에 상기 매질의 pH를 6.8로 조정하였다. 씨 배양물을 회전식 진탕기에서 27℃, 220rpm으로 3일 동안 배양하였다. 첫 번째 씨 배양물 2㎖를 상기와 동일한 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에 옮기고, 회전식 진탕기에서 3일 동안 상기와 동일한 조건하에서 배양하였다. 두 번째 씨 배양물 2㎖를 글리세롤 8.5%, 감귤류의 펙틴 1%, 땅콩 분말 0.4%, 비타민이 없는 우유의 카세인 0.4%, 토마토 페이스트 0.4%, 옥수수 침지액(안도 가세이) 0.4%, 글리신 0.2% 및 KH2PO40.2%로 구성된 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 살균 처리하기 전에 상기 매질의 pH를 7.0으로 조정하였다. 27℃에서 220rpm의 교반속도로 발효시켰다. 10일간의 배양후, 최대로 생성되었고, 전체 배양물을 에어로트리신 1, 2 및 3의 단리 방법에 가하였다.
(c) 병(jar) 발효
10%(v/v)의 글리세롤 용액중 듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)의 냉동 배양물의 2㎖부를 해동시키고, 상기 기술된 바와 동일한 씨 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 상기 플라스크를 27℃에서 3일 동안 220rpm으로 진탕하였다. 첫 번재 씨 배양물 2㎖를 상기와 동일한 씨 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에 옮기고, 상기와 동일한 조건하에 회전식 진탕기에서 3일 동안 배양하였다. 상기 기술된 바와 동일한 생성 매질을 30ℓ 및 소포체(니산 디스폼(Nissan Disfoam) CA-123)를 0.4%로 함유하는 50ℓ들이 병 발효기에서 두 번째 씨 배양물 600㎖를 접종하였다. 30ℓ/분으로 통기하고 400rpm으로 교반하면서 27℃에서 발효시켰다. 생산양이 약 168시간의 발효에서 최대에 도달했으며, 전체 배양물을 에어로트리신 1, 2 및 3의 단리 방법에 가하였다.
에어로트리신 1
(1) 외관: 백색 고형물
(2) 분자량(FAB-MS 방법): m/z 1547(M+H)+
(3) 분자식: C72H118N14O23
(4) 고 해상도 질량 분광기((M+H)+에 대해):
C72H119N14O23에 대한 실측치: 1547.8568 이론치: 1547.8572
(5) UV 스펙트럼(도 1): 메탄올중:
λ(ε)max(MeOH에서): 225±5(10600sh), 270±5(2000), 278±5(2100)
λ(ε)max(N/10NaOH-MeOH에서): 240±5(7700), 268±5(1800), 298±5(1800)
(6) IR 스펙트럼(KBr)(도 2):
주 흡수 파수(㎝-1)는 다음과 같다: 3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837
(7)1H-NMR 스펙트럼(도 3): CD3OD에서 400㎒
(8)13C-NMR 스펙트럼(도 4): CD3OD에서 100㎒
(9) 용해도: 물, 메탄올, 디메틸설폭사이드에 용해
(10) 색채 반응:
양성: 닌하이드린, 아니스알데히드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미쓰(Rydon-Smith) 시약, 몰리브도인산
음성: 사카구치(Sakaguchi) 시약, 브로모크레졸 그린(Bromocresol green), 2,4-디니트로페닐하이드라진-황산
(11) 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography; TLC):
담체 용매 Rf
실리카 겔 F254*1 n-BuOH:아세톤:AcOH:H2O(4:5:1:1) 0.74
MeOH:H2O(95:5) 0.12
*1독일 에. 메르크, 아게(E. Merck AG.)
(12) 고성능 액체 크로마토그래피:
담체: 캡셀 팍 C18 겔 S120A, 4.6×250㎜(시세이도 캄파니 리미티드에서 제조)
이동상: 아세토니트릴:0.05%의 수성 트리플루오로아세트산=1:1
유동 속도: 1㎖/분
Rt=12.1±0.5
(13) 아미노산 분석:
6N의 HCl중 에어로트리신 1을 120℃에서 24시간 동안 가열한 후, 아미노산 분석을 실행하여 트레오닌, 3유니트의 알로-트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 티로신, 오르니틴, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 3-하이드록시글루타민을 검출하였다.
에어로트리신 2
(1) 외관: 백색 고형물
(2) 분자량(FAB-MS 방법): m/z 1549(M+H)+
(3) 분자식: C71H116N14O24
(4) 고 해상도 질량 분광기((M+H)+에 대해):
C71H117N14O24에 대한 실측치: 1549.8384 이론치: 1549.8365
(5) UV 스펙트럼(도 5): 메탄올중:
λ(ε)max(MeOH에서): 225±5(10200sh), 275±5(1900), 278±5(2000)
λ(ε)max(N/10NaOH-MeOH에서): 240±5(7700), 293±5(2000)
(6) IR 스펙트럼(KBr)(도 6):
주 흡수 파수(㎝-1)는 다음과 같다: 3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837
(7)1H-NMR 스펙트럼(도 7): CD3OD에서 400㎒
(8)13C-NMR 스펙트럼(도 8): CD3OD에서 100㎒
(9) 용해도: 물, 메탄올, 디메틸설폭사이드에 용해
(10) 색채 반응:
양성: 닌하이드린, 아니스알데히드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미쓰시약, 몰리브도인산
음성: 사카구치 시약, 브로모크레졸 그린, 2,4-디니트로페닐하이드라진-황산
(11) 박층 크로마토그래피(TLC):
담체 용매 Rf
실리카 겔 F254*1 n-BuOH:아세톤:AcOH:H2O(4:5:1:1) 0.29
MeOH:H2O(95:5) 0.15
*1독일 에. 메르크, 아게
(12) 고성능 액체 크로마토그래피:
담체: 캡셀 팍 C18 겔 S120A, 4.6×250㎜(시세이도 캄파니 리미티드에서 제조)
이동상: 아세토니트릴:0.05%의 수성 트리플루오로아세트산=1:1
유동 속도: 1㎖/분
Rt=9.9±0.5
(13) 아미노산 분석:
6N의 HCl중 에어로트리신 2를 120℃에서 24시간 동안 가열한 후, 아미노산 분석을 실행하여 트레오닌, 3유니트의 알로-트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 3-하이드록시티로스밀(3-hydroxytyrosmyl; DOPA), 오르니틴, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 3-하이드록시글루타민을 검출하였다.
에어로트리신 3
(1) 외관: 백색 고형물
(2) 분자량(FAB-MS 방법): m/z 1533(M+H)+
(3) 분자식: C71H116N14O23
(4) UV 스펙트럼: 메탄올중:
λ(ε)max(MeOH에서): 225±5(11000sh), 275±5(2000), 280±5(1900)
λ(ε)max(N/10NaOH-MeOH에서): 243±5(7800), 295±5(1800)
(5) IR 스펙트럼(KBr):
주 흡수 파수(㎝-1)는 다음과 같다: 3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836
(6) 용해도: 물, 메탄올, 디메틸설폭사이드에 용해
(7) 색채 반응:
양성: 닌하이드린, 아니스알데히드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미쓰 시약, 몰리브도인산
음성: 사카구치 시약, 브로모크레졸 그린, 2,4-디니트로페닐하이드라진-황산
(8) 박층 크로마토그래피(TLC):
담체 용매 Rf
실리카 겔 F254*1 n-BuOH:아세톤:AcOH:H2O(4:5:1:1) 0.26
MeOH:H2O(95:5) 0.09
*1독일 에. 메르크, 아게
(9) 고성능 액체 크로마토그래피:
담체: 캡셀 팍 C18 겔 S120A, 4.6×250㎜(시세이도 캄파니 리미티드에서 제조)
이동상: 아세토니트릴:0.05%의 수성 트리플루오로아세트산=1:1
유동 속도: 1㎖/분
Rt=9.1±0.5
(10) 아미노산 분석:
6N의 HCl중 에어로트리신 3을 120℃에서 24시간 동안 가열한 후, 아미노산 분석을 실행하여 트레오닌, 3유니트의 알로-트레오닌, 글리신, 알라닌, 발린, 티로신, 오르니틴, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 3-하이드록시글루타민을 검출하였다.
실시예 5
화학식 IX의 화합물의 제조
(1) 플라스크 발효
10%(v/v)의 글리세롤 용액중 듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)의 냉동 배양물의 2㎖부를 해동시키고, 포도당 1%, 귀리 가루 1%, 토마토 페이스트 4%, 옥수수 침지액(안도 가세이) 0.5%, FeSO4·7H20 0.001%, MnSO4·4H2O 0.001%, CaCl20.0001%, ZnSO4·7H2O 0.0002%, (NH4)6MoO2·4H2O 0.00002% 및 H3BO30.00006%로 구성된 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 살균 처리하기 전에 상기 매질의 pH를 6.8로 조정하였다. 씨 배양물을 회전식 진탕기에서 27℃, 220rpm으로 4일 동안 배양하였다. 씨 배양물의 2㎖를 글리세롤 8.5%, 감귤류의 펙틴 1%, 땅콩 분말 2%, 비타민이 없는 우유의 카세인 0.4%, 토마토 페이스트 0.4%, 글리신 0.4% 및 KH2PO40.2%로 구성된 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 살균 처리하기 전에 상기 매질의 pH를 7.0으로 조정하였다. 27℃에서 220rpm의 교반 속도로 발효시켰다. 14일간의 배양후, 최대로 생성되었고, 전체 배양물을 단리시켰다.
수득된 배양된 전체 육즙(1.9ℓ)을 n-부탄올(2ℓ)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 이런 방식으로 수득된 추출물을 감압하에 건조 농축시켰다. 잔사를 헥산(500㎖) 및 메탄올(500㎖)에 첨가하고, 수득된 혼합물을 교반한 후, 헥산 층을 제거하였다. 감압하에서 메탄올을 제거한 후, 수득된 잔사를 헥산과 에틸 아세테이트(1:1, 200㎖, 2회)의 혼합물로 세척하고, 감압하에서 건조하였다.
잔사(3.9g)를 물(20㎖)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반한 후, 원심분리하여 수용액을 수득하였다. 이런 방식으로 수득된 용액을 역상 실리카 겔 C18(200ℓ)의 칼럼 크로마토그래피에 가하였다. 상기 칼럼을 먼저 0.1%의 수성 트리플루오로아세트산으로 용출한 다음, 메탄올-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(1:9, 3:7, 5:5, 6:4, 7:3 및 8:2)의 혼합물을 사용하여 단계적으로 용출하였다. 메탄올-0.1%의 수성 트리플루오로아세트산(7:3)으로 용출된 화학식 IX의 화합물을 합치고, 그 용액을 1N의 수성 수산화나트륨으로 중화시킨 후, 진공하에 건조 농축시켰다. 수득된 잔사를 물(10㎖) 및 n-부탄올(10㎖)에 첨가하고, 그 혼합물을 교반하였다. 이런 방식으로 수득된 추출물을 감압하에서 농축하여 화학식 IX의 화합물(96.9㎎)을 백색의 분말로서 수득하였다. 분광학을 위해 상기 수득된 화학식 IX의 화합물을 다음과 같은 조건하에서 HPLC에 의해 추가로 정제하였다: 칼럼: 캡셀 팍 C18 UG80(즉, 20×250㎜, 시세이도 캄파니 리미티드); 이동상: 0.05%의 트리플루오로아세트산/아세토니트릴-0.05%의 트리플루오로아세트산/물(38:62); 유동 속도: 22.86㎖/분; 검출: UV 210㎚. 상기 조건하에서 수득된 적합한 용출물을 진공하에 건조 농축시켜 백색의 분말성 화학식 IX의 트리플루오로아세트산 염을 수득하였다.
(c) 병 발효
10%(v/v)의 글리세롤 용액중 듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)의 냉동 배양물의 2㎖부를 해동시키고, 상기 기술된 바와 동일한 씨 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에서 접종하였다. 상기 플라스크를 27℃에서 4일 동안 220rpm으로 진탕하였다. 첫 번째 씨 배양물 2㎖를 상기와 동일한 씨 매질을 100㎖로 함유하는 500㎖들이 삼각플라스크에 옮기고, 상기와 동일한 조건하에 회전식 진탕기에서 3일 동안 배양하였다. 상기 기술된 바와 동일한 생성 매질을 30ℓ 및 소포체(니산 디스폼 CA-123)를 0.4%로 함유하는 50ℓ들이 병 발효기에서 두 번째 씨 배양물 600㎖를 접종하였다. 27℃에서 30ℓ/분의 통기 및 400rpm의 교반으로 발효시켰다. 생산양이 약 278시간의 발효에서 최대에 도달했으며, 전체 배양물을 화학식 IX의 화합물의 단리 방법에 가하였다.
화학식 IX
(1) 외관: 백색 고형물
(2) 분자량(FAB-MS 방법): m/z 1317(M+H)+
(3) 분자식: C59H104N12O21
(4) 고 해상도 질량 분광기((M+H)+에 대해):
C59H105N12O21에 대한 실측치: 1317.7555 이론치: 1317.7517
(5) UV 스펙트럼: 메탄올중:
λ(ε)max(MeOH에서): 말단 흡수
(6) IR 스펙트럼(KBr)(도 9):
주 흡수 파수(㎝-1)는 다음과 같다: 3450, 2928, 1665, 1520, 1450, 1225, 1135
(7)1H-NMR 스펙트럼(도 10): DMSO-d6에서 500㎒
(8)13C-NMR 스펙트럼(도 11): DMSO-d6에서 125㎒
(9) 용해도: 물, 메탄올, 디메틸설폭사이드에 용해
(10) 색채 반응:
양성: 닌하이드린, 아니스알데히드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미쓰 시약, 몰리브도인산
음성: 사카구치 시약, 브로모크레졸 그린, 2,4-디니트로페닐하이드라진-황산
(11) 고성능 액체 크로마토그래피:
담체: 캡셀 팍 C18 UG80A, 4.6×250㎜(시세이도 캄파니 리미티드에서 제조)
이동상: 0.05%의 트리플루오로아세트산/아세토니트릴:0.05%의 트리플루오로아세트산/물=38:62
유동 속도: 1㎖/분
Rt=7.7±0.5
실시예 6
화학식 IX의 오르니틴 잔사의 N-Boc 유도체(N(orn)-Boc-IX)의 제조: 화학식 XII의 화합물(R 6 =Boc)
디옥산중 0.1M의 3급-부틸 N-숙신이미딜 카보네이트(0.0073㎕, 0.0073m㏖) 용액 및 트리에틸아민(3㎕)을 실온에서 디옥산-H2O(0.43㎖-0.5㎖)중 실시예 5에서 수득된 화학식 IX의 화합물(10.4㎎, 0.0073m㏖)의 용액에 첨가하였다. 1.5시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 아세트산으로 산성화시키고, 감압하에서 증발시켰다. HPLC로 잔사를 정제하여 N(orn)-Boc-IX를 무색의 비결정질로서 수득하였다(4.8㎎, 45%의 수율);
HPLC(Rt) 18.0분(칼럼: 소켄(Soken)-ODS, 20×250㎜, 유동 속도: 9㎖/분, 용출액: H2O:CH3CN=구배, 1%의 아세트산); FAB-MS[M+Na]+1440.
실시예 7
화학식 IX의 발린 잔사의 N-Boc 유도체(N(val)-Boc-IX)의 제조: 화학식 X의 화합물(R 7 =Boc)
MeOH(3㎖)중 실시예 5에서 수득된 화학식 IX의 화합물(15.0㎎, 0.0105㏖), 디-3급-부틸 디카보네이트(메탄올 용액중 0.073M, 0.20㎖, 0.015m㏖) 및 트리에틸아민(7.8㎕)의 혼합물을 0℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 n-헥산으로 세척하고, 감압하에서 증발시켰다. 역상 HPLC로 잔사를 정제하여 N(val)-Boc-IX를 무색의 비결정질로서 수득하였다(1.0㎎, 6%의 수율).
HPLC(Rt) 16.0분(칼럼: 소켄-ODS, 20×250㎜, 유동 속도: 9㎖/분, 용출액: H2O:CH3CN=구배, 1%의 아세트산); FAB-MS[M+H]+1418.
실시예 8
에어로트리신 33의 제조
BOP 시약(21.3㎎, 0.048m㏖), HOBT 수화물(7.5㎎, 0.049m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.0095㎖, 0.055m㏖)을 DMF(0.5㎖)중 (R)-3-(9-플루오레닐메톡시카보닐아미노)-7-(4-펜틸옥시페닐)헵탄산(25.5㎎, 0.048m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, DMF(0.6㎖)중 화합물 B[= 국제 특허 공개 공보 제 WO96/30399 호에 기술된 방법에 따라 에어로트리신 1 또는 3으로부터 제조된, R2및 R3이 수소이고, R5가 카바모일기이며, R7이 3급-부톡시카보닐인 화학식 III의 선형 펩티드](50.7㎎, 0.036m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.0095㎖, 0.055m㏖)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반한 후, 피페리딘(0.20㎖)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 준비용 역상 HPLC(칼럼 C, 유동 속도: 9㎖/분; 구배: 용출액: 1%의 AcOH-H2O:1%의 AcOH-CH3CN=80:20 →2:98)로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 환화를 위한 전구체인 선형 펩티드 C를 백색의 비결정질 고형물로서 49.5㎎ 수득하였다.
DMF(4㎖)중 BOP 시약(33.1㎎, 0.075m㏖)의 용액, HOBT 수화물(11.3㎎, 0.074m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.018㎖, 0.105m㏖)을 DMF(27㎖)중 상기 수득된 선형 펩티드 C(49.5㎎, 0.029m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 증발시켰다.
수득된 잔사를 TFA(6㎖)에 용해시키고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, TFA를 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 하기 상세히 제시된 조건하에서 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 33을 백색의 비결정질 고형물로서 19.4㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 12.4분(칼럼 C, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=61:39); FAB-MS(m/z): 1568[MH+].
화학식 IV로서 나타낸 상응하는 빌딩 블록(building block)을 사용하여 본 실시예 8에 기술된 바와 유사한 방법으로 하기 에어로트리신 34 내지 38, 40 내지 53, 64 내지 73, 89 내지 95, 97 내지 99 및 123을 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신34 1568 14.1 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신35 1568 13.2 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신36 1610 21.9 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신37 1638 44.1 (C)(9㎖/분;54/46)
에어로트리신38 1610 28.1 (C)(9㎖/분;58/42)
에어로트리신40 1602 16.8 (F)(10㎖/분;57/43)
에어로트리신41 1616 20.6 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신42 1630 16.8 (F)(10㎖/분;62/38)
에어로트리신43 1644 29.2 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신44 1658 35.5 (F)(10㎖/분;50/50)
에어로트리신45 1630 24.7 (C)(9㎖/분;59/41)
에어로트리신46 1664 18.7 (C)(9㎖/분;59/41)
에어로트리신47 1594 22.9 (C)(9㎖/분;54/46)
에어로트리신48 1576 24.4 (F)(10㎖/분;58/42)
에어로트리신49 1590 24.2 (C)(9㎖/분;65/35)
에어로트리신50 1604 48.9 (F)(10㎖/분;55/45)
에어로트리신51 1618 40.4 (F)(10㎖/분;60/40)
에어로트리신52 1632 32.5 (F)(10㎖/분;50/50)
에어로트리신53 1646 27.0 (C)(9㎖/분;54/46)
에어로트리신64 1547 15.5 (B)(4㎖/분;65/35)
에어로트리신65 1575 15.5 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신66 1603 16.6 (C)(9㎖/분;52/48)
에어로트리신67 1587 19.9 (C)(9㎖/분;59/41)
에어로트리신68 1587 19.6 (C)(9㎖/분;59/41)
에어로트리신69 1589 21.8 (C)(9㎖/분;58/42)
에어로트리신70 1617 21.6 (C)(9㎖/분;53/47)
에어로트리신71 1746 30.0 (C)(9㎖/분;64/36)
에어로트리신72 1673 22.6 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신73 1721 20.2 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신89 1630 22.1 (F)(10㎖/분;55/45)
에어로트리신90 1658 24.9 (F)(10㎖/분;50/50)
에어로트리신91 1670 26.7 (F)(10㎖/분;50/50)
에어로트리신92 1642 26.0 (F)(10㎖/분;55/45)
에어로트리신93 1650 21.4 (F)(10㎖/분;57/43)
에어로트리신94 1658 30.8 (F)(10㎖/분;52/48)
에어로트리신95 1574 28.3 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신97 1740 44.7 (F)(10㎖/분;57/43)
에어로트리신98 1656 30.0 (F)(10㎖/분;62/38)
에어로트리신99 1644 16.9 (F)(10㎖/분;53/47)
에어로트리신123 1630 20.7 (F)(10㎖/분;56/44)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 9
에어로트리신 16의 제조
(a) 테트라니트로메탄(0.365㎖, 3.05m㏖)을 피리딘(2.5㎖)중 화합물 A(참고예 3에 기술됨)(1g, 0.61m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 짙은 갈색의 잔사를 역상 HPLC(로바(Lobar) RP18, 10㎖/분, 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=50:50 →33:66 0.05%의 TFA)로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 화합물 A의 조질 니트로 유도체를 담황색의 비결정질 고형물로서 711㎎ 수득하였다.
(b) 상기 수득된 조생성물(12㎎, 0.0071m㏖)과 TFA(0.5㎖)의 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 건조한 질소 스트림하에서 TFA를 증발시켰다. 황색 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 16·TFA 염을 담황색의 비결정질 고형물로서 8㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 15.5분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=54:45); FAB-MS(m/z): 1578[MH+].
출발 물질로서 실시예 8에서 수득된 에어로트리신을 사용하여, 하기 에어로트리신 39, 54, 55 및 77을 실시예 9에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신39 1577 13.2 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신54 1661 14.2 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신55 1689 27.8 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신77 1648 25.0 (C)(9㎖/분;53/47)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 10
에어로트리신 17의 제조
(a) 10%의 목탄상 팔라듐(20㎎)을 MeOH(5㎖)중 실시예 9(a)에서 수득된 화합물 A의 조질 니트로 유도체(55㎎, 0.033m㏖)의 용액에 첨가하고, 반응 용기를 수소로 채웠다. 실온에서 13.5시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 막 필터(기공 크기: 0.2㎛)를 통해 여과시키고, 용매를 증발시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 에어로트리신 3의 조질 아미노 유도체를 갈색의 비결정질로서 52㎎ 수득하였다.
(b) 상기 수득된 화합물 A의 조질 아미노 유도체(참고예 3에 기술됨)(3.4㎎, 0.0021m㏖)와 TFA(0.2㎖)의 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 건조한 질소 스트림하에서 TFA를 증발시켰다. 갈색 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 17을 무색의 비결정질 고형물로서 1.3㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 12.8분(칼럼 A, 유동 속도: 1㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=59:41); FAB-MS(m/z):1548[MH+].
출발 물질로서 실시예 9에서 수득된 에어로트리신을 사용하여, 하기 에어로트리신 29, 56 및 78을 실시예 10에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신29 1606 31.0 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신56 1659 15.1 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신78 1618 16.8 (C)(9㎖/분;57/43)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 11
에어로트리신 18의 제조
(a) Boc-Gly-OH(18㎎, 0.10m㏖), WSCI(30㎎, 0.15m㏖) 및 HOBT 수화물(24㎎, 0.15m㏖)을 메탄올(0.05㎖) 및 피리딘(0.025㎖)중 실시예 10(a)에서 수득된 화합물 A의 조질 아미노 유도체(1.7㎎, 0.001m㏖)의 용액에 연속적으로 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 후, 용매를 건조한 질소 스트림에 의해 제거하였다.
(b) 상기 수득된 조질 잔사를 TFA(0.1㎖)에 용해시키고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 건조한 질소 스트림으로 TFA를 제거하였다. 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 18을 무색의 비결정질 고형물로서 0.54㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 8.9분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=57:43); FAB-MS(m/z):1605[MH+].
출발 물질로서 상응하는 아실화제 및 실시예 10에서 수득된 에어로트리신을 사용하여, 하기 에어로트리신 19 내지 23, 30, 57 내지 62, 79 및 81을 실시예 11에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신19 1590 17.5 (A)(1㎖/분;57/43)
에어로트리신20 1619 6.0 (B)(4㎖/분;55/45)
에어로트리신21 1663 18.0 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신22 1605 12.5 (A)(1㎖/분;55/45)
에어로트리신23 1620 23.9 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신30 1676 24.6 (C)(9㎖/분;61/39)
에어로트리신57 1701 21.2 (C)(9㎖/분;56/44)
에어로트리신58 1730 23.4 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신59 1716 13.7 (C)(9㎖/분;58/42)
에어로트리신60 1730 16.3 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신61 1730 39.1 (C)(9㎖/분;47/53)
에어로트리신62 1730 15.8 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신79 1689 36.1 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신81 1675 24.4 (C)(9㎖/분;60/40)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 12
에어로트리신 12의 제조
MeOH(100㎕)중 소듐 시아노보로하이드라이드(7.5㎎, 0.119m㏖)을 실온에서 MeOH(1.0㎖)중 에어로트리신 5(7.5㎎, 0.0048m㏖), 37%의 포르말린(150㎕) 및 아세트산(50㎕)의 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 증발시킨 후, 잔사를 n-부탄올에 용해시키고, 희석 염산 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 진공하에서 증발시켰다. 하기에 상세히 제시된조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결건조시켜 에어로트리신 12를 무색의 비결정질 고형물로서 5.4㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 7.1분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=50:50); FAB-MS(m/z): 1575[MH+].
하기 에어로트리신 13, 25, 30 및 75를 실시예 12에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신13 1561 13.7 (B)(4㎖/분;55/45)
에어로트리신25 1607 23.5 (C)(4㎖/분;55/45)
에어로트리신30 1676 24.6 (C)(9㎖/분;61/39)
에어로트리신75 1631 24.2 (C)(9㎖/분;55/45)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 13
에어로트리신 111의 제조
(a) MeOH(5㎖)중 소듐 시아노보로하이드라이드(410㎎, 6.52m㏖)를 실온에서 MeOH(45㎖)중 에어로트리신 3(500㎎, 0.326m㏖), (2-옥소에틸)-카밤산 3급-부틸 에스테르*(1.66g, 10.4m㏖)[*CAS 번호 89711-08-0] 및 아세트산(5㎖)의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 증발시킨 후, 잔사를 n-부탄올에 용해시키고, 희석 염산 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 진공하에서 증발시켰다.
조질 잔사를 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용하였다.
(b) TFA(20㎖)중 상기 수득된 조질 잔사의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. TFA를 진공하에서 증발시켰다. 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결건조시켜 에어로트리신 111을 무색의 비결정질 고형물로서 253㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 18.6분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=57:43); FAB-MS(m/z): 1619[M+H]+.
하기 에어로트리신 100, 112, 114 및 115를 실시예 13에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신100 1730 14.8 (F)(10㎖/분;56/44)
에어로트리신112 1647 11.8 (F)(10㎖/분;57/43)
에어로트리신114 1759 23.1 (C)(10㎖/분;60/40)
에어로트리신115 1633 19.6 (F)(10㎖/분;59/41)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 14
에어로트리신 120의 제조
아크릴로니트릴(214㎕, 3.27m㏖)을 실온에서 MeOH(10㎖)중 에어로트리신3(500㎎, 0.326m㏖) 및 트리에틸아민(682㎕, 4.89m㏖)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 증발시킨 후, 잔사를 n-부탄올에 용해시키고, 희석 염산 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 진공하에서 증발시켰다. 하기 상세히 제시된 조건하에서 조질 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결건조시켜 에어로트리신 120을 무색의 비결정질 고형물로서 207㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 27.5분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=53:47); FAB-MS(m/z): 1586[M+H]+.
실시예 15
에어로트리신 113의 제조
10%의 약용탄 팔라듐(20㎎)을 MeOH(5㎖)중 에어로트리신 120(100㎎, 0.063m㏖)의 혼합물에 첨가하고, 반응 용기를 수소로 채웠다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 막 필터(기공 크기: 0.2㎛)를 통해 여과시키고, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 하기 상세히 제시된 조건하에서 조질 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 113을 무색의 비결정질 고형물로서 87.2㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 23.0분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 이동상: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=57:43); FAB-MS(m/z):1590[M+H]+.
에어로트리신 129를 실시예 14 및 15에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조한 후, 트리플루오로아세트산을 이용하여 오르니틴 잔사의 Boc기를 제거하였다. 이 경우, 출발 물질은 실시예 16과 유사한 방법으로 수득된 에어로트리신 106의 (D)-오르니틴 잔기의 Nδ-Boc 유도체였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신129 1705 33.8 (F)(10㎖/분;62/38)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 16
에어로트리신 14의 제조
CH3OH(3㎖)중 에어로트리신 3(100㎎, 0.065m㏖)의 용액을 CH3CN(10㎖)중 N-Boc-사르코신(123㎎, 0.65m㏖), WSC·HCl(240㎎, 1.25m㏖) 및 DMAP(150㎎, 1.23m㏖)의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 다음, 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 n-BuOH(10㎖)에 용해시키고, H2O(5㎖×2, 1N의 HCl로 pH를 3 내지 4로 조정)로 세척하였다. n-BuOH 층을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 0℃에서 TFA(5㎖)에 용해시켰다. 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, TFA를 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하여 에어로트리신 14를 백색의 비결정질 분말로서 40.8㎎(39%의 수율) 수득하였다.
HPLC(Rt): 23.1분(칼럼 C, 유동 속도: 9㎖/분, 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=60:40); FAB-MS(m/z): 1605[MH+].
빌딩 블록으로서 상응하는 산을 사용하여, 하기 에어로트리신 15, 21, 26 내지 29, 101 내지 107, 109, 110, 118, 130 및 131을 실시예 16에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신15 1631 24.0 (C)(9㎖/분;57/43)
에어로트리신21 1663 18.0 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신26 1650 19.9 (C)(9㎖/분;50/50)
에어로트리신27 1676 22.5 (C)(9㎖/분;55/45)
에어로트리신28 1636 20.9 (C)(9㎖/분;50/50)
에어로트리신29 1606 31.0 (C)(9㎖/분;60/40)
에어로트리신101 1647 16.5 (F)(10㎖/분;56/44)
에어로트리신102 1661 16.3 (F)(10㎖/분;56/44)
에어로트리신103 1689 13.4 (F)(10㎖/분;54/46)
에어로트리신104 1633 22.6 (F)(10㎖/분;58/42)
에어로트리신105 1619 29.2 (F)(10㎖/분;52/38)
에어로트리신106 1647 17.3 (F)(10㎖/분;56/44)
에어로트리신107 1661 36.5 (F)(10㎖/분;60/40)
에어로트리신109 1633 26.1 (F)(10㎖/분;58/42)
에어로트리신110 1619 28.8 (F)(9㎖/분;58/42)
에어로트리신118 1685 15.2 (F)(10㎖/분;51/49)
에어로트리신130 1847 16.0 (F)(10㎖/분;63/37)
에어로트리신131 1818 21.1 (F)(10㎖/분;63/37)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 17
에어로트리신 74의 제조
MeOH(1㎖)중 에어로트리신 66(20㎎, 0.012m㏖), 3,5-디메틸피라졸-1-카복사미딘 니트레이트(13㎎, 0.064m㏖) 및 트리에틸아민(18㎖, 0.13m㏖)의 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 하기 상세히 제시된 조건하에서 조질 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 74를 무색의 비결정질 고형물로서 10.2㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt) 21.2분(칼럼 C, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=54:46); FAB-MS(m/z): 1645[MH+].
출발 물질로서 에어로트리신 3 및 111을 각각 사용하여, 하기 에어로트리신 4 및 116을 본 실시예 17에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신4 1576 7.6 (D)(1㎖/분;50/50)
에어로트리신116 1703 14.9 (F)(10㎖/분;57/43)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 18
에어로트리신 5의 제조
(a) 메틸 요오드화물(8㎕, 0.129m㏖)을 실온에서 DMF(1㎖)중 참고예 3에서 수득된 화합물 A(10㎎, 0.0061m㏖) 및 탄산칼륨(10㎎, 0.072m㏖)의 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 43시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 셀라이트-패드에 의해 여과시키고, 여과액을 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 n-부탄올에 용해시키고, 희석 염산 및 물로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 진공하에서 증발시켰다. 조질 잔사를 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용하였다.
(b) TFA(1.0㎖)중 상기 수득된 조질 잔사의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. TFA를 진공하에서 증발시켰다. 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 5를 무색의 비결정질 고형물로서 3.8㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 14.5분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=55:45); FAB-MS(m/z): 1547[MH+].
상응하는 알킬화제를 사용하여, 하기 에어로트리신 6 내지 10 및 76을 실시예 18에 기술된 바와 유사한 방법으로 제조하였다.
FAB-MS HPLC 분석 조건
화합물 명칭 m/z:[MH+] 체류시간(분) (칼럼)(유동 속도;용출액*의 비율)
에어로트리신6 1561 16.0 (A)(1㎖/분;55/45)
에어로트리신7 1573 8.4 (A)(1㎖/분;50/50)
에어로트리신8 1589 26.1 (B)(4.7㎖/분;58/42)
에어로트리신9 1591 38.5 (B)(4㎖/분;60/40)
에어로트리신10 1590 6.7 (A)(1㎖/분;53/47)
에어로트리신76 1617 26.0 (C)(9㎖/분;53/47)
*0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴의 비율
실시예 19
에어로트리신 24의 제조
(a) 참고예 3에서 수득된 화합물 A(100㎎), 나트륨 요오드화물(29.5㎎,0.197m㏖), 및 메탄올(2㎖)중 소듐 하이포클로라이트 용액(250㎕)의 저온 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 포화된 수성 나트륨 티오황산염으로 급냉시키고, 1N의 HCl로 산성화시키고, n-부탄올로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 진공하에서 증발시켰다. 이 지점에서, 출발 물질은 여전히 남아있다. 요오드화 반응을 완료시키기 위해, 동일한 실험 방법을 반복하였다. 동일한 작동 이후, 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하여 화합물 A의 요오드 유도체를 무색의 고형물로서 수득하였다(54㎎, 50%의 수율).
(b) 아세토니트릴(250㎕) 및 N,N-디메틸포름아미드(750㎕)중 상기 수득된 화합물 A의 요오드 유도체(23.8㎎), 메틸 아크릴레이트(16㎕), 트리에틸아민(40㎕) 및 팔라듐 아세테이트(2.1㎎)의 혼합물을 70℃에서 28시간 동안 가열하였다. 생성된 혼합물을 C-18 짧은 칼럼에 통과시키고, 잔사를 0℃에서 1시간 동안 트리플루오로아세트산(1㎖)으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 진공하에서 증발시켰다. 준비용 역상 HPLC로 잔사를 정제하여 에어로트리신 24를 무색의 고형물로서 수득하였다(8.8㎎, 40%의 수율).
HPLC(Rt): 86.3분(칼럼 F, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=58:42); FAB-MS(m/z): 1617[MH+].
실시예 20
에어로트리신 96의 제조
탈기체화된 디메틸설폭사이드(2㎖)중 실시예 19(a)에서 수득된 화합물 A(30㎎), 포타슘 아세테이트(6.9㎎) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(4.6㎎)의 혼합물을 일산화탄소 분위기하에 60℃에서 20시간 동안 가열하였다. 생성된 혼합물을 C-18 역상의 짧은 칼럼에 통과시키고, 잔사를 0℃에서 1시간 동안 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 감압하에서 증발시켰다. 준비용 역상 HPLC로 잔사를 정제하여 에어로트리신 96을 무색의 고형물로서 수득하였다(2.3㎎, 8%의 수율).
HPLC(Rt): 23.2분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=52.2:47.8); FAB-MS(m/z): 1677[MH+].
실시예 21
에어로트리신 32의 제조
(a) 아세토니트릴(3㎖)중 참고예 3에서 수득된 화합물 A(20㎎) 및 (메톡시카보닐설파모일)트리에틸암모늄 하이드록사이드(26.5㎎, 0.108m㏖)의 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 1N의 HCl로 산성화시키고, 진공하에서 증발시켰다. 잔사를 n-부탄올로 추출하고, 추출물을 진공하에서 증발시켰다.
(b) 조생성물을 0℃에서 1시간 동안 트리플루오로아세트산으로 처리하였다.TFA를 진공하에서 증발시켰다. 준비용 역상 HPLC로 잔사를 정제하여 에어로트리신 32를 무색의 고형물로서 수득하였다(2.0㎎, 10%의 수율).
HPLC(Rt): 42.9분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=55:45); FAB-MS(m/z): 1516[MH+].
실시예 22
에어로트리신 31의 제조
(a) 보란-디메틸설피드 착체(25㎖)를 -10℃에서 테트라하이드로푸란(5㎖)중 참고예 3에서 수득된 화합물 A(25.7㎎)의 저온 용액에 첨가하였다. -10℃에서 5시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 2N의 HCl로 급냉시키고, n-부탄올로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 진공하에서 증발시켰다.
(b) 조생성물을 0℃에서 1시간 동안 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. THF를 감압하에서 증발시켰다. 준비용 역상 HPLC로 잔사를 정제하여 에어로트리신 31을 무색의 고형물로서 수득하였다(3.7㎎, 15%의 수율).
HPLC(Rt): 25.1분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=62:38); FAB-MS(m/z): 1519[MH+].
실시예 23
에어로트리신 121의 제조
메틸 요오드화물(0.010㎖)을 DMF(1㎖) 및 트리에틸아민(0.025㎖)중 에어로트리신 3(50㎎)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 트리에틸아민(0.025㎖) 및 메틸 요오드화물(0.05㎖)을 상기 혼합물에 추가로 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 LCMS 분석한 결과 목적하는 화합물로 90%보다 크게 전환되었다. 용매를 질소 스트림으로 퍼징(purging)시키고, 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 121을 무색의 비결정질 고형물로서 23㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 20.5분(칼럼 B, 유동 속도: 4㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=52:48); FAB-MS(m/z): 1576[M+].
실시예 24
에어로트리신 122의 제조
삼산화황 N,N-디메틸포름아미드 착체(23㎎)를 피리딘(1㎖)중 에어로트리신 3(50㎎)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 건조한 질소 스트림으로 퍼징시켰다.
TFA(1㎖)중 상기 수득된 조질 잔사의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. TFA를 건조한 질소 스트림으로 퍼징시키고, 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 122를 무색의 비결정질 고형물로서 5㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 24.6분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=52:48); FAB-MS(m/z): 1613[MH+].
실시예 25
에어로트리신 63의 제조
(a) BOP 시약(355㎎, 0.80m㏖), HOBT 수화물(124㎎, 0.81m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.174㎖, 1.00m㏖)을 DMF(10㎖)중 Nα-Fmoc-Nβ-Boc-(S)-2,3-디아미노프로피온산(343㎎, 0.80m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, DMF(9.5㎖)중 에어로트리신 3(1.10g, 0.67m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.174㎖, 1.00m㏖)의 용액을 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한 후, 상기 혼합물을 진공하에서 농축시켰다.
(b) 피페리딘-4-카복실산 폴리아민 수지(200 내지 400메쉬), HL(1.50m㏖/g, 2.66g)을 DMF(20㎖)중 상기 수득된 잔사의 교반된 용액에 첨가하고, 그 반응 혼합물을 6시간 동안 초음파에 조사하였다. 수지를 셀라이트 패드로 여과시켜 제거하고, MeOH로 세척하고, 합쳐진 여과액 및 세척물을 냉동시키고, 동결 건조시켜 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용되는 에어로트리신 3의 조질 유도체를 백색의 비결정질 고형물로서 1.08g 수득하였다.
(c) (2-옥소-에틸)카밤산 3급-부틸 에스테르(조생성물, 207㎎), AcOH(0.1㎖) 및 NaBH3CN(19.1㎎)을 MeOH(1㎖)중 상기 수득된 에어로트리신 3의 조질 유도체(25.6㎎, 0.015m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 n-BuOH(4㎖)로 희석시키고, H2O(1㎖×2, 0.1N의 HCl로 pH를 3 내지 4로 조정)로 세척하였다. n-BuOH 층을 진공하에서 농축시켰다. 조질 잔사를 추가의 정제를 하지 않고서 다음 단계에 사용하였다.
(d) TFA(2㎖)중 상기 수득된 조질 잔사의 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TFA를 진공하에서 농축시키고, 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 63을 백색의 비결정질 고형물로서 8.8㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 24.8분(칼럼 F, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=54:36); FAB-MS(m/z): 1706[MH+].
실시예 26
에어로트리신 127의 제조
Nα-Fmoc-Nβ-Boc-(D)-오르니틴을 사용하여 에어로트리신 127을 에어로트리신 63에 대한 제조방법과 유사한 방법으로 제조하였다. 에어로트리신 127을 백색의비결정질 고형물로서 수득하였다.
HPLC(Rt): 23.9분(칼럼 F, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=54:36); FAB-MS(m/z): 1734[MH+].
실시예 27
에어로트리신 124의 제조
(a) BOP 시약(62㎎, 0.14m㏖), HOBT 수화물(22㎎, 0.144m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(24㎕, 0.138m㏖)을 DMF(2㎖)중 Boc-D-Orn(Boc)-OH(46㎎, 0.138m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, DMF(2㎖)중 에어로트리신 120(100㎎, 0.063m㏖) 및 N-디이소프로필에틸아민(24㎕, 0.138m㏖)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 증발시켰다.
잔사를 TFA(4㎖)에 용해시키고, 그 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 건조한 질소 스트림으로 TFA를 제거한 후, 하기 상세히 제시된 조건하에서 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 니트릴 유도체를 백색의 비결정질 고형물로서 48.6㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 20.2분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=57:43); FAB-MS(m/z): 1700[M+H]+.
(b) 10%의 약용탄 팔라듐(10㎎)을 디옥산(1㎖) 및 물(1㎖)중 상기 수득된 니트릴 유도체(48.6㎎, 0.0286m㏖)의 혼합물에 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 14시간 동안 수소 분위하에서 교반하였다. 이어서, 상기 혼합물을 막 필터(기공 크기: 0.2㎛)로 여과시키고, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 하기 상세히 제시된 조건하에서 조질 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 124를 무색의 비결정질 고형물로서 26.5㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 18.2분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=60:40); FAB-MS(m/z): 1704[M+H]+.
실시예 28
에어로트리신 125의 제조
(a) 2-브로모-5-니트로피리딘(185㎎)을 DMF(1㎖) 및 트리에틸아민(0.126㎖)중 에어로트리신 3 모노 TFA 염(천연 생성물: 50㎎)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 25시간 동안 교반한 후, 용매를 건조한 질소 스트림으로 퍼징시켰다. 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 3의 5-니트로피리드-2-일 유도체를 담황색의 비결정질 고형물로서 25㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 29.9분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=47:53); FAB-MS(m/z): 1655[M+H]+.
(b) 상기 수득된 에어로트리신 3의 5-니트로피리드-2-일 유도체(10㎎)를 디옥산-H2O(1㎖-5㎖)에 용해시켰다. 5%의 약용탄 팔라듐(20㎎)을 첨가하고, 반응 용기를 수소로 채웠다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 막 필터(기공 크기: 0.2㎛)로 여과하고, 용매를 증발시켜 조생성물 14㎎을 수득하고, 하기 상세히 제시된 조건하에서 준비용 역상 HPLC로 수득된 조생성물을 정제하였다. 순수한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 125를 무색의 비결정질 고형물로서 2.5㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 18.7분(칼럼 F, 유동 속도: 10㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=52:48); FAB-MS(m/z): 1625[M+H]+.
실시예 29
에어로트리신 128의 제조
(a) BOP 시약(378㎎, 0.85m㏖), HOBT 수화물(131㎎, 0.86m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(171㎕, 0.98m㏖)을 DMF(10㎖)중 Fmoc-D-Orn(Boc)-OH(389㎎, 0.86m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반한 후, DMF(10㎖)중 에어로트리신 3(1.08g, 0.66m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(171㎕, 0.98m㏖)의 용액을 상기 혼합물에 첨가하였다.실온에서 2.5시간 동안 교반한 후, 피페리딘(4㎖)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 n-BuOH(50㎖)로 희석시키고, H2O(25㎖×2, 1N의 HCl로 pH를 3으로 조정)로 세척하였다. n-BuOH 층을 진공하에서 농축시켰다.
(b) BOP 시약(13.3㎎, 0.030m㏖), HOBT 수화물(4.6㎎, 0.030m㏖) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(4.8㎕, 0.028m㏖)을 DMF(1㎖)중 Boc-D-Orn(Boc)-OH(9.6㎎, 0.029m㏖)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, DMF(1㎖)중 상기 수득된 조질 잔사(31.9㎎) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(4.8㎕, 0.028m㏖)의 용액을 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공하에서 농축시켰다.
(c) 상기 수득된 조질 잔사를 TFA(1.5㎖)에 용해시키고, 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 준비용 역상 HPLC로 정제하였다. 적합한 분획을 합치고, 냉동시키고, 동결 건조시켜 에어로트리신 128을 백색의 비결정질 고형물로서 16.6㎎ 수득하였다.
HPLC(Rt): 27.23분(칼럼 F, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액: 0.05%의 트리플루오로아세트산-물:0.05%의 트리플루오로아세트산-아세토니트릴=55:35); FAB-MS(m/z): 1762[MH+].
실시예 30
화학식 IX의 화합물로부터 에어로트리신 106의 제조
(a) DMF(0.5㎖)중 Fmoc-Tyr(But)(21㎎, 0.0457m㏖), HOBt 모노 수화물(6.6㎎, 0.0431m㏖), BOP 시약(18.8㎎, 0.0424m㏖) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 20㎕)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, DMF(1㎖)중 실시예 6에서 수득된 N(orn)-Boc-IX(19.3㎎, 0.0131m㏖) 및 DIEA(10㎕)의 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 생성된 혼합물을 피페리딘(0.375㎖)으로 1시간 동안 처리한 다음, 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 및 디에틸에테르로 세척하여 시약을 제거하였다. HPLC로 잔사를 정제하여 목적하는 선형 펩티드 A를 백색 고형물로서 수득하였다(16.6㎎).
HPLC(Rt) 19분(칼럼: 소켄-ODS/20×250㎜, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액 H2O:CH3CN=구배, 1%의 AcOH).
(b) DMF(0.5㎖)중 Fmoc-D-Ala 모노 수화물(1.2㎎, 0.034m㏖), HOBt 모노 수화물(4.7㎎, 0.031m㏖), BOP 시약(13.6㎎, 0.031m㏖) 및 DIEA(8㎕)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, DMF(1㎖)중 상기 수득된 선형 펩티드 A(16.6㎎, 0.0098m㏖) 및 DIEA(6㎕)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 교반하고, 출발 물질이 거의 소모될 때까지 활성 에스테르를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄 및 디에틸에테르로 세척하여 시약을 제거하였다. 조생성물을 0℃에서 1시간 동안 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 상기 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. HPLC로 잔사를 정제하여 목적하는 선형 펩티드 B를 백색 고형물로서 수득하였다(6.1㎎).
HPLC(Rt) 19분(칼럼: 소켄-ODS/20×250㎜, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액 H2O:CH3CN=구배, 1%의 AcOH).
(c) DMF(0.5㎖)중 Boc-D-Orn(But)(5.7㎎, 0.017m㏖), HOBt 모노 수화물(2.3㎎, 0.015m㏖), BOP 시약(5.4㎎, 0.012m㏖) 및 DIEA(6㎕)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, DMF(1㎖)중 선형 펩티드 B(6.1㎎, 0.0033m㏖) 및 DIEA(3㎕)의 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 생성된 혼합물을 피페리딘(0.375㎖)으로 1시간 동안 처리하고, 진공하에서 농축시켰다. HPLC로 잔사를 정제하여 선형 펩티드 C를 백색 고형물로서 수득하였다(4.1㎎).
HPLC(Rt) 16.7분(칼럼: 소켄-ODS/20×250㎜, 유동 속도: 9㎖/분; 용출액 H2O:CH3CN=구배, 1%의 AcOH).
(d) 선형 펩티드 C를 0.01N의 염산염으로 산성화시키고, n-부탄올로 추출하였다. 부탄올 추출물을 진공하에서 농축시켰다. 상기 추출물을 DMF(2㎖)에 용해시켰다. 이어서, HOBt 모노 수화물(DMF중 0.1M, 60㎕), BOP 시약(DMF중 0.1M, 60㎕) 및 DIEA(2㎕)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 생성된 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 트리플루오로아세트산으로 0℃에서 1시간 동안 처리하였다. 상기 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 잔사를 HPLC로 정제하여 에어로트리신 106을 백색 고형물로서 수득하였다(2.2㎎, N(orn)-BOC-IX으로부터 9%).
분석 자료를 실시예 16의 표에 나타낸다.
실시예 A
하기 성분을 함유하는 주사용 용액을 각각 그 자체로 통상적인 방식으로 제조하였다.
에어로트리신 45 20㎎
디-소듐 하이드로겐포스페이트, 무수물 7.6㎎
소듐 디포스페이트 디하이드레이트 2.0㎎
에틸 알콜 150㎎
증류수, 탈이온화되고 살균됨 850㎎
총 1029.6㎎
국 제 양 식
특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약
하기 국제 기탁 기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 대한 수탁증
기탁자
성명(명칭): 닛폰 로슈 가부시키가이샤
대표 취체역 사장: 시게타 히로아키
주소: 일본 도쿄도 105 미나토쿠 시바 2초메 6반 1고
I. 미생물의 표시
(기탁자가 붙인 식별을 위한 표시)듀테로미코티나 NR 7379 (수탁 번호)FERM BP-6391
II. 과학적 성질 및 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는, 다음 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있었음.(X) 과학적 성질(X) 분류학상의 위치
III. 수령 및 수탁
본 국제 기탁 기관은 평성 10년 6월 16일(원 기탁일)에 수령한 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 이관 청구의 수령
본 국제 기탁 기관은, 년 월 일(원 기탁일)에 상기 I란의 미생물을 수령하였다. 그리고, 년 월 일에 원 기탁일로부터 부다페스트 조약에 기초한 기탁으로 이관 청구를 수령하였다.
V. 국제 기탁 기관
명칭: 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소소장: 오하시 시니치주소: 일본 이바라키켕 305-8566 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고날짜: 평성 10년(1998년) 6월 16일
규칙 28(1)(d)에 따른 기탁자에 의한 인증
하기 서명한닛폰 로슈 가부시키가이샤의 대표 취체역 사장인 시게타 히로아키는
일본 도쿄도 105 미나토쿠 시바 2초메 6반 1고 소재의 닛폰 로슈 가부시키가이샤가
1998년 6월 16일자로일본 이바라키켕 305 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고 소재의 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 부다페스트 조약에 의거해 수탁 번호듀테로미코티나 NR 7379(FERM BP-6391)로 생물 물질을 기탁하였음을 확인함.
이에 서명한 기탁자는스위스 체하-4070 바젤 그렌짜체스트라쎄 124 소재의 에프. 호프만-라 로슈 아게가 유럽 특허원제 98113744.1 호에서 전술된 기탁된 생물 물질을 나타내었으며 규칙 28 EPC에 따라 상기 기탁된 물질이 공중에 의해 이용가능한 것임을 진정하고도 확고하게 동의하였음을 인증함.
서명:
(닛폰 로슈 가부시키가이샤의 대표 취체역 사장: 시게타 히로아키)
날짜: 1999년 3월 26일

Claims (33)

  1. 하기 화학식 I의 에어로트리신 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 구아니디노, 트리-저급 알킬암모니오, -N(R10)-R11, -N(R15)-CO-R14, -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13, -NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13, 또는이고,
    R10및 R11은 각각 독립적으로 수소; 1 또는 2개의 아미노로 치환된 헤테로아릴; 1개 이상의 아미노, 아미노-저급 알킬, 시아노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고,
    R13은 천연 또는 인공 아미노산으로부터 유도된 잔기이고,
    R14는 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급 알킬이고,
    R15는 수소, 1개 이상의 아미노, 구아니디노, 질소-함유 헤테로사이클 또는 아미노, 아미디노 또는 구아니디노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이고;
    R2는 수소, 하이드록시설포닐, 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고, 이때 저급 알킬 및 저급 알케닐은 아실, 카바모일, 아미노, 모노-저급 알킬아미노 또는 디-저급 알킬아미노로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고;
    R3은 수소, 하이드록시, 니트로, 아미노, 아실아미노, (저급 알킬카바모일)아미노, 카복실, 저급 알콕시, 저급 알콕시카보닐, 저급 알킬, 저급 알케닐 또는 저급 알키닐이고, 이때 저급 알킬, 저급 알케닐 및 저급 알키닐은 하이드록시, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 알콕시카보닐 또는 카바모일로치환되거나 치환되지 않을 수 있고;
    R4는 저급 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 불소 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시 또는 알케닐옥시이고;
    R5는 -CONH2, -CN 또는 -CH2NH2이고;
    X는 단일 결합이거나, 또는 1개 이상의 헤테로원자를 함유하거나 함유하지 않고/않거나 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 비페닐 또는 터페닐기이고;
    Y는 단일 결합, -CH2-, -CH(저급 알킬)-, -CONH- 또는 -CON(저급 알킬)-이고;
    Z는 -O-, -NH- 또는 -N(저급 알킬)-이고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    n은 2 내지 5의 정수이나;
    단 -Y-(CH2)m-X-R4가 비치환된 알킬 또는 아르알킬인 경우, R1은 아미노가 아니고, R2및 R3은 수소 이외의 것이며, R5는 -CONH2가 아니고, Z는 동시에 -O- 또는 -NH-가 아니어야 한다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 -N(R10)-R11이고, 이때 R10및 R11이 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  3. 제 1 항에 있어서,
    R1이 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13이고, 이때 R10, R11, R13및 R15가 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  4. 제 1 항에 있어서,
    R1이 -NHCOCH(R13)-NHCOCH(NH2)-R13이고, 이때 R13이 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  5. 제 1 항에 있어서,
    R1이이고, 이때 R10, R11, R13, R15및 n이 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  6. 제 1 항에 있어서,
    R1이이고, 이때 R10, R11, R13, R15및 n이 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  7. 제 1 항에 있어서,
    R1이 -N(R15)-CO-R14이고, 이때 R14및 R15가 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  8. 제 1 항에 있어서,
    R1이이고, 이때 R10및 R15가 제 1 항에 정의된 바와 같은 에어로트리신.
  9. 제 1 항에 있어서,
    R1이 아미노 또는 구아니디노인 에어로트리신.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2가 수소, 하이드록시설포닐 또는 저급 알킬인 에어로트리신.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 수소, 하이드록시, 니트로, 아미노 또는 아실아미노인 에어로트리신.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 (저급 알킬카바모일)아미노, 카복실, 저급 알콕시 또는 저급 알콕시카보닐인 에어로트리신.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 -CONH2또는 -CH2NH2인 에어로트리신.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 단일 결합이거나, 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬로 추가로 치환될 수 있는 라디칼
    및중 하나인 에어로트리신.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 단일 결합이거나, 할로겐 원자(들), 또는 저급 알킬로 추가로 치환될 수 있는 페닐, 비페닐 또는 나프틸인 에어로트리신.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4가 저급 알킬, 아릴, 사이클로알킬 또는 불소 원자(들)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 알킬 또는 알콕시인 에어로트리신.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    m이 0 내지 2의 정수인 에어로트리신.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y가 -CH(CH3)-, -CON(CH3)-, -CONH-, -CH2- 또는 단일 결합인 에어로트리신.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 -NH-인 에어로트리신.
  20. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 -O-인 에어로트리신.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    에어로트리신 2, 4 내지 32, 63, 96 내지 99, 101 내지 131로 구성된 군에서 선택된 에어로트리신.
  22. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    에어로트리신 14, 15, 21, 26 내지 29, 63, 98, 99 및 101 내지 131로 구성된 군에서 선택된 에어로트리신.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    의학적 치료법에 사용하기 위한 에어로트리신.
  24. 하기 화학식 III의 화합물 또는 이의 염:
    화학식 III
    상기 식에서,
    R2, R3및 R5는 제 1 항에 정의된 바와 같고,
    R6은 아미노 보호기이나,
    단 R5가 -CONH2인 경우, R2또는 R3은 수소 이외의 것이어야 한다.
  25. 하기 화학식 IX의 화합물 또는 이의 염:
    화학식 IX
  26. 하기 화학식 X의 화합물 또는 이의 염:
    화학식 X
    상기 식에서,
    R7은 아미노 보호기이다.
  27. 하기 화학식 XII의 화합물 또는 이의 염:
    화학식 XII
    상기 식에서,
    R6은 아미노 보호기이다.
  28. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  29. 사상균병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물의 용도.
  30. 듀테로미코티나(Deuteromycotina) NR 7379(FERM BP-6391)의 생리학적으로 순수한 배양물.
  31. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 화합물을 인간 또는 동물에게 투여함을 포함하는, 병원성 미생물에 의해서 일어나는 감염성 질환을 예방적으로 및/또는 치료적으로 처치하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)듀테로미코티나속에 속하는 미생물을 배양하고, 제 25 항에 정의된 바와 같은 화학식 IX의 선형 펩티드 및/또는 에어로트리신 1,2를 배양물 육즙으로부터 단리하는 단계; 또는
    (b) 하기 화학식 III의 화합물을 하기 화학식 IV의 화합물과 축합하고, 아미노 보호기 R7을 제거하고, 연속적으로 환화시키고 아미노 보호기 R6을 제거하는 단계:
    화학식 III
    화학식 IV
    [상기 식에서,
    R6및 R7은 아미노 보호기이고,
    R8은 수소 또는 저급 알킬이고,
    R2, R3, R4, R5, X, Y 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다]; 또는
    (c) 하기 화학식 I의 에어로트리신을 질소화시키는 단계:
    화학식 I
    [상기 식에서,
    R3은 수소 원자이고,
    R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다]; 또는
    (d) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 니트로기이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 니트로기를 환원시키는 단계; 또는
    (e) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R3은 아미노기이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 아미노기를 아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (f) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기 또는 -N(R15)-COCH(NH2)-R13이고; R13, R15, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 아미노기를 시아노에틸렌화 또는 2,2-디시아노에틸렌화시키고, 이어서 시아노기를 환원시키고, 필요한 경우, 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (g) 상기 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노, (2-시아노에틸)아미노 또는 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 수소 및 (2-시아노에틸)아미노로 구성된 군에서 선택된다)이고; R13, R15, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 상기 정의된 바와 같다]의 아미노기를 하기 화학식 V의 알데히드로 환원 알킬화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하거나 또는 시아노기를 환원시키는 단계:
    화학식 V
    R9-CH0
    [상기 식에서,
    R9는 수소; 1개 이상의 보호 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 보호 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 추가로 치환될 수 있는 저급 알킬이다]; 또는
    (h) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)을 하기 화학식 VI의 화합물로 아릴화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하거나 또는 니트로기를 환원시키는 단계:
    화학식 VI
    R12-Q
    [상기 식에서,
    R12는 보호 아미노기 또는 니트로기로 추가로 치환될 수 있는 질소-함유 헤테로아릴이고, Q는 클로로 또는 브로모와 같은 할로겐 원자이다]; 또는
    (i-1) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)을 아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (i-2) 상기 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 둘다 아미노기로 치환된 저급 알킬이다) 또는 -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R15는 아미노기로 치환된 저급 알킬이고; R10, R11및 R13은 제 1 항에 정의된 바와 같으나,단 R10, R11및 R13에 존재하는 아미노기는 보호된다]의 아미노기를 아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (j) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R1은 아미노기이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)을 모노 N-알킬화시키고, 연속적으로 N-아실화시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (k) 상기 화학식 I의 에어로트리신[이때, R1은 아미노기; -N(R10)-R11(이때, R10및 R11은 각각 독립적으로 1개 이상의 아미노기, 또는 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬로 구성된 군에서 선택된다); -N(R15)-CO-CH[N(R10)R11]-R13(이때, R10, R11및 R13은 제 1 항에 정의된 바와 같고, R15는 1개 이상의 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노기를 갖는 페닐기로 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이다); 또는 -NHCO-R14(이때, R14는 1개 이상의 아미노기, 질소-함유 헤테로사이클(들), 또는 아미노기를 갖는 페닐기(들)로 치환된 저급-알킬이다)이고; R2, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다]의 아미노기를 활성화된 아미딘 유도체로 처리하여 구아니디노기로 전환시키는 단계; 또는
    (l) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 수소이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 페놀계 하이드록시기를 O-알킬화시키는 단계; 또는
    (m) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2및 R3은 수소이고; R1, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)을 요오드화시키고, 이어서 화학식 I(이때, R3은 요오드이고; R1, R2, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 생성된 요오드 유도체를 팔라듐(0) 촉매 커플링시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (n) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CONH2이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 카바모일기를 탈수시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (o) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R5는 -CONH2또는 -CN이고; R1, R2, R3, R4, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 카바모일 또는 시아노기를 환원시키고, 이어서 필요한 경우, 아미노 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (p) 상기 화학식 I의 에어로트리신(이때, R2는 수소이고; R1, R3, R4, R5, X, Y, Z 및 m은 제 1 항에 정의된 바와 같다)의 티로신 잔기를 하이드록시설폰화시키고, 이어서 보호기(들)를 제거하는 단계; 또는
    (q) 화학식 IX의 선형 펩티드를 펩티드 합성에 의해서 화학식 I의 에어로트리신으로 전환시키고, 이어서 상기 방법 (c) 내지 (o)로 구성된 군에서 선택된 방법에 따라서 변형시키는 단계
    를 포함하는 에어로트리신의 제조 방법.
  33. 본원에 기술된 바와 같은 발명.
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