HU211527A9 - Az átmeneti oltalom az 1. és 6-8. igénypontokra vonatkozik - Google Patents

Az átmeneti oltalom az 1. és 6-8. igénypontokra vonatkozik Download PDF

Info

Publication number
HU211527A9
HU211527A9 HU9500360P HU9500360P HU211527A9 HU 211527 A9 HU211527 A9 HU 211527A9 HU 9500360 P HU9500360 P HU 9500360P HU 9500360 P HU9500360 P HU 9500360P HU 211527 A9 HU211527 A9 HU 211527A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
salt
microorganism
shoulder
formula
spectrum
Prior art date
Application number
HU9500360P
Other languages
English (en)
Inventor
Akihiko Fujie
Michio Yamashita
Shigehiro Takase
Tomoko Nakanishi
Seiji Hashomoto
Masakuni Okuhara
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP3132243A external-priority patent/JPH04335217A/ja
Priority claimed from JP3299552A external-priority patent/JPH05112599A/ja
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co
Publication of HU211527A9 publication Critical patent/HU211527A9/hu

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya a WF 11243 vegyület és sói, valamint eljárás ezek előállítására és módszer alkalmazásukra.
A WF 11 243 új vegyület, amit mikroorganizmusok, különösen gombák tenyészetéből nyerhetünk ki és üsztíthatunk. Kitűnő gomba- és protozoaölő hatása van, ezért alkalmas gombák és protozoák által okozott különféle betegségek és rendellenességek megelőzésére, kezelésére és gyógyítására. Ugyancsak alkalmas a Pneumocystis carinii tüdőgyulladás megelőzésére és kezelésére.
A jelen találmány fontos szerepet játszik tehát a gyógyszerek, kozmetikai szerek, élelmek és italok területén.
Ezideig is állítottak elő különféle fungicideket mikroorganizmusok tenyészeteiből vagy kémiai szintézissel. Ezek némelyike jól alkalmazható, de több különféle problémát felvet, például a drog-rezisztens mikroorganizmusok megjelenésével. Jelenleg nincs olyan fungicid, ami teljesen mentes ettől a problémától.
A protozoák által okozott különféle betegségek különösen a Pneumocystis carinii okozta tüdőgyulladás - elterjedtek és ezek megelőzésére és gyógyítására szolgáló eljárások kidolgozása igen kívánatos.
A találmány tárgya új protozoicid, mely alkalmas a Pneumocystis carinii tüdőgyulladást vagy más betegséget okozó Pneumocystis carinii vagy protozoák növekedését gátolni. A találmány további tárgya új fungicidek, melyek alkalmasak a különféle gombák növekedésének meggátlására.
A fenti célok érdekében természetesen anyagokat különösen mikroorganizmusok fermentációs termékeit - vizsgáltuk meg. A különféle mikroorganizmusokat tanulmányozva úgy találtuk, hogy Japánban Ayabe-shi, Kyoto-fuban gyűjtött lehullott levelekről izolált 11 243 számú gombatörzs a tenyészlevében termel és felhalmoz ilyen kívánt anyagot. Tovább vizsgálva a termék fiziko-kémiai tulajdonságait, úgy találtuk, hogy egy új anyaggal van dolgunk, amit WF 11 243 jelöléssel láttunk el. A továbbiakban ennek az anyagnak a hidrokloridját FR901469-nek neveztük. További vizsgálataink eredményeként kidolgoztuk a WF 11 243 anyag előállításának ipari eljárását.
Az alábbiakban megadjuk a WF 11 243 anyag és hidrokloridja, az FR 901 469 anyag fizikai-kémiai tulajdonságait (I. táblázat).
/. TÁBLÁZAT
FR 901 469 anyag fiziko-kémiai tulajdonságai (1) megjelenés: fehér por (2) olvadáspont: 182-187 °C (3) fajlagos forgatás: [α]β3: +29 °C (c = 1,5, metanol) (4) összegképlet: C7|H,16N14O23 HCI (5) elemanalízis a ΟηΗ^Ν^Ο^: Ηΰ·8Η2Ο képlet alapján:
számított: C: 49,74 H: 7,82, N: 11,44%;
mért: C: 49,65, H: 7,72, N: 11,40% (6) oldhatóság: oldódik: metanolban, vízben gyengén oldódik: acetonban oldhatatlan: n-hexánban (7) színreakciók: pozitív: jódgőz-, cérium(IV)-szulfát-, ninhidrin-reakció negatív: Molish-, Ehrlich-reakció (8) vékonyrétegkromatográfia (TLC):
állófázis mozgófázis Rf érték
szilikagél n-butanol/ecet- sav/víz 0,42
60 Fj54 (Merck) 4:1:2
RP-18
WF 254S (Merck) 45%-os vizes acetonitril, ami 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz 0,18
(9) infravörös-spektrum (FT-IR; KBr):
KBrX™»: 3400, 2920, 1730, 1660, 1650, 1635, 1540, 1520, 1460, 1250, 1090 cm'1 (10) HPLC oszlop: YMC.Pack ODS-AM (AM-303, S-5, 120A,
4.6 mmx250 mm, YMC Co., Ltd.) detektálás: 210 nm mozgófázis: 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 45%-os vizes acetonitril áramlási sebesség: 1 ml/perc retenciós idő (RT): 10,9 perc (11) ,3C mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CDjOD):
(1. ábra).
6c: 176,1 (s), 174,6 (s), 174,0 (s), 173,8 (s), 173,4 (s),
172.8 (s), 172,6 (s), 172,5 (s), 172,4 (s), 172,1 (s),
171.9 (s), 171,8 (s), 171,7 (s), 171,2 (s), 156,1 (s),
131,4 (d) x2, 128,6 (s), 117,9 (d) x2, 74,2 (d), 72,0 (d), 70,5 (d), 70,1 (d), 70,0 (d), 69,1 (d), 68,8 (d),
68,3 (d), 67,7 (d), 61,4 (d), 60,9 (d), 60,3 (d), 59,8 (d), 58,2 (d), 57,9 (t), 57,6 (d), 57,2 (d), 56,8 (d),
51,7 (d), 50,8 (d), 46,4 (t), 43,1 (t), 42,9 (t), 40,4 (t),
39.9 (t), 38,9 (t), 37,6 (t), 35,8 (t), 34,7 (t), 33,1 (t),
31.6 (d), 30,8 (t), 30,7 (t), 30,7 (t), 30,7 (t), 30,6 (t),
30,5 (t), 30,4 (t), 30,3 (t), 28,1 (t), 25,9 (t), 24,9 (t),
23.7 (t), 21,2 (q), 20,9 (q), 20,3 (q), 19,2 (q), 18,9 (q), 18,7 (q), 17,2 (q), 14,4 (q).
(12) ’H mágneses magrezonancia-spektrum (400 MHz, CD3OD):
(2. ábra) δΗ: 7,08 (2H, d, J = 8 Hz), 6,98 (2H, d, J = 8 Hz),
5,18-5,09 (2H, m), 4,88 (1H, br s), 4,76-4,69 (3H, m), 4,65 )1H, m), 4,48 (1H, m), 4,46 (1H, d, J = 5 Hz), 4,41 (1H, d, J = 9 Hz), 4,36-4,27 (3H, m), 4,24-4,13 (6H, m), 3,98 (1H, m), 3,92-3,78 (3H, m), 3,70(lH,dd, J= 11 and 4 Hz), 3,58 (1H, brd, J = 11 Hz), 3,00-2,93 (3H, m), 2,80 (1H, dd, J = 13 and 11 Hz), 2,56 (1H, dd, J = 13 and 11 Hz), 2,45 (1H, dd, J = 14 and 9 Hz), 2,37 (1H, br d, J = 13 Hz), 2,30 (1H, m), 2,21-2,05 (3H, m), 2,03-1,93 (2H, m), 1,89 (1H, m), 1,77 (1H, m), 1,62-1,50 (4H, m), 1,39 (3H, d, J = 6 Hz), 1,35 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,35 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,30 (3H, d, J = 6 Hz),
HU 211 527 A9
1,28 (22H, m), 1,13 (3H, d, J = 6 Hz), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz), 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,80 (3H, d, J =
6,5 Hz), (13) tömegspektrum:
FAB-MS, m/z: 1533 (M+H)+
HRFAB-MS, m/z: 1555,8240 (C71Hn6N14O23Na képletre számolva: 1555,8235) (14) aminosavanalízis (6 n sósavas hidrolízis, 110 °C, óra): Thr (4), Gly (1), Alá (1), Val (1), Tyr (1) (15) ultraibolya-spektrum:
jellemző csúcsok:
H2OXmax: 225 (váll), 275 (1200), 280 (váll) nm O.OlnX^HCl: 225 (váll), 275, 280 (váll) nm O.Oln/^NaOH: 240, 292 nm.
A fenti fiziko-kémiai tulajdonságokól megállapítható volt, hogy a WF 11 243 anyag polipeptid jellegű. A vegyület szerkezet képletét az (I) képlettel írjuk le.
A WF 11 243 anyagot előállíthatjuk - például a 11 243 gombatörzzsel (amit Ayabe-shi, Kyoto-fuban gyűjtött lehullott levelekről izoláltunk), de elkészíthetjük kémiai úton, peptid-szintézissel is. A mikroorganizmus halvány narancsszínű telepeket képezve növeszthető különféle táptalajokon. A különféle agartáptalajokon mutatott jellemző tulajdonságait az I. táblázatban foglaljuk össze. Malátakivonatos agarra oltva a tenyésztelep nagyon korlátozottan növekszik, két hét alatt 25 °C hőmérsékleten 0,5-1,0 cm átmérőt elérve. A felszín kiemelkedő, halvány narancsszínű és hialinnyálkát termel. A fonákoldal szürkés narancsszínű. Konidiális szerkezet megfigyelhető. A burgonyadextrózos agaron a növekedés nagyobb, korlátozott, a fenti körülmények között 0,5-1,0 cm átmérőt ér el. A felület kiemelkedő, sugarasan barázdált, halvány narancsszínű és hialinnyálkát termel. A fonákoldal halványsárga. Anamorfózis megfigyelhető (konidiális szerkezetek).
1. TÁBLÁZAT
A 11243 törzs tenyésztelepének jellemző tulajdonságai
táptalaj tulajdonság
malátakivonatos agar N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralakú, kiemelkedő, konidiális szerkezetet képez, hialinnyálkát termel, halvány narancsszínű (5A3)
F: szürkés narancssárga (5B4)
burgonya- dextrózos agar: N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralakú, kiemelkedő, sugarasan barázdált, konidiális szerkezetet képez, hialinnyálkát termel, halvány narancsszínű (5A3)
F: halványsárga (5A3)
Czapek-Doc agar N: nagyon korlátozott 0,1-1,0 cm átmérő
T: köralakú, nem kiemelkedő, vékony, konidiális szerkezetet képez, narancsos fehér (5A2)
F: sárgás szürke (4B2)
táptalaj tulajdonság
Sabouraud agar N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralakú, kiemelkedő, sugarasan bordázott, konidiális szerkezetet nem képez, hialinnyálkát termel, szürkés narancssárga (5B3)
F: barna (6E7)
zablisztes agar N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralakútól szabálytalanig, sugarasan bordázott, narancsos fehér (5A2), a közepén fekete
F: halványsárga (4A3)
Yp Ss agar N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralakú, kiemelkedő, sugarasan bordázott, konidiális szerkezetet nem képez, hialinnyálkát termel, halvány narancsszínű (5A4)
F: halványsárga (4A3)
kukoricalekváros agar N: nagyon korlátozott, 0,5-1,0 cm átmérő
T: köralaktól szabálytalanig, konidiális szerkezetet képez, hialinnyálkát termel, narancsos fehér (5A2), közepén sötétbarna (6F8)
F: sötétszürke (IFI)
MY20 agar N: nagyon korlátozott, 0,1-0,5 cm átmérő
T: szabálytalan, kiemelkedő, redőzött, konidiális szerkezetet képez, hialinnyálkát termel, halvány narancsszínű (5A4)
F: halvány narancsszínű (5A4)
(rövidítések: N - növekedés
T - telep F - fonákoldal).
A fenti adatokat 14 napos, 25 °C hőmérsékleten történő növekedés után kapjuk. A színek leírása Kornerup A. és J. H. Wanscher, Metheuen haandbook of colour (3. kiadás), Methuen, London, 1983 kézikönyvön alapszik.
A 11243 törzs 7-29 °C hőmérsékleten képes növekedni, az optimális növekedési hőmérséklete (burgonyadextróz agaron): 22-26 ”C.
A tulajdonságok alapján megállapítottuk, hogy a 11 243 törzs a gombákhoz tartozik. Letétbe helyeztük a National Institure of Bioscience and Human-Technology intézetben (Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade und Industry; letéti száma FERM BP-3373, letétbehelyezés időpontja: 1991. április 23.).
Nyilvánvaló, hogy a WF 11 243 termelés nem korlátozódik kizárólag az itt példaként bemutatott mikroorganizmusra. A jelen találmány magába foglalja valamennyi olyan WF 11 243 anyagot termelő mesterséges vagy természetes változatot, mutánst, amit a leírt törzs
HU 211 527 A9 változataként vagy mutánsaként kaphatunk Röntgen besugárzással, ultraibolya besugárzással, N-metil-N’nitro-N-nitrozo-guanidines, 2-amino-purinos kezeléssel, stb.
A WF 11 243 anyag előállítható oly módon, hogy a nevezett anyagot termelő gombát (például a 11 243 törzset) asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó tápközegbe oltjuk és aerob körülmények között (például rázott tenyészetben vagy süllyesztett aerob tenyészetben) inkubáljuk.
Az alkalmas szénforrás előnyösen glükóz, szacharóz, keményítő, módosított keményítő, fruktóz, glicerin és más szénhidrát.
Alkalmas nitrogénforrás előnyösen a zabliszt, élesztőkivonat, pepton, sikérliszt, gyapotmagliszt, gyapotmaghulladék, szójaliszt, kukoricalekvár, szárított élesztő, búzacsíra, földimogyoróliszt, csirkecsontliszt, stb. Ugyancsak hasznosan alkalmazhatók szervetlen és szerves nitrogénvegyületek is, például ammóniumsók (ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, ammóniumfoszfát, stb.), karbamid és aminosavak.
A szénforrások, illetve nitrogénforrások kombináltan is alkalmazhatók és nem kell feltétlenül tiszta állapotban lenniük, minthogy egyes szennyező anyagok gyakran előnyösen tartalmazhatnak növekedési faktorokat. nyomanyagokat.
Ha szükséges szervetlen sókat is adunk a táptalajhoz, ez lehet például nátrium-karbonát, kálium-karbonát, nátrium-foszfát, kálium-foszfát, nátrium-klorid, kálium-klorid, nátrium-jodid, kálium-jodid, magnéziumsók. rézsók, kobaltsók, stb.
Ha a tápközeg erősen habzik, habzásgátlóként használhatunk folyékony paraffint, állati olajat, növényi olajat, ásványi olajat, szilikont, stb.
Ahol nagymennyiségű terméket kívánunk iparilag előállítani, a mikroorganizmus süllyesztett aerob tenyészetét használjuk más fermentációs termékek előállításához hasonlóan. Ahol kis mennyiség előállítása elegendő, előnyös a rázottlombikos tenyészet felhasználása.
Amennyiben a WF 11 243 anyagot termelő mikroorganizmust nagy fermentortankokban tenyésztjük, kívánatos, hogy először egy viszonylag kis mennyiségű táptalajon oltóanyagot állítsunk elő, majd ezzel a tenyészettel oltjuk be a termelő tankban lévő táptalajt. Ezzel a termelési lépésnél elkerüljük a növekedés kezdeti késlekedését. Az előkultúra táptalajának összetétele lehet ugyanaz vagy eltérő, mint a termelésre használt tápközegé.
A mikroorganizmus tenyészetét előnyösen aerob kevertetett körülmények között tartjuk, melyhez bármelyikjói ismeri módszert alkalmazhatjuk. így például kevertethetünk lapátos keverővei vagy más berendezéssel. a fermentor forgatásával vagy rázatásával, levegő benyomásával, átfúvatással, stb. A levegőztetéshez használt levegőnek sterilnek kell lennie.
Az inkubációhoz használt hőmérséklet bármi lehet azon a hőmérséklettartományon belül, ahol a termelő mikroorganizmus a WF 11 243 anyagot termeli. Ez általában 1—40 °C tartomány, előnyösen 14-36 °C. A tenyészidő változó, a tenyésztési körülményektől, a beoltott mikroorganizmus mennyiségétől függően. Általában 1-7 nap.
A fermentáció után a WF 11 243 anyagot kinyerjük a fermentléből. Röviden, ez történhet a tenyésztett gomba vízzel és/vagy szerves oldószerrel történő közvetlen extrahálásával vagy - mechanikai aprítás után ultrahangos kezeléssel vagy más módon feltárva vizes és/vagy szerves oldószeres extrahálással. Ezt követően a WF 11 243 anyagot a szokásos módon elkülönítjük és tisztítjuk. A tenyészlé esetében a WF 11 243 anyag kinyerése történhet közvetlenül, amit egy szokásos tisztítási eljárás követ.
Az elkülönítéshez és tisztításhoz alkalmazott alkalmas módszer például a vízzel, szerves oldószerrel, ezek keverékével történő extrahálás, a kromatográfiás módszerek, oldószerből vagy oldószerelegyből történő átkristályosítás. Ezeket a módszereket kombinálhatjuk is.
A WF 11 243 anyag izolálására és tisztítására a fent említett ismert eljárások alkalmazhatók. Erre az alábbiakban röviden megadunk egy példát. A tenyészetet vizes acetonnal extraháljuk, semleges körülmények között egy semleges adszorbensen (például HP-20, Mitsubishi Kaséi Corp. Japán) adszorbeáltatjuk, savas vizes acetonnal eluálunk, az eluátumot bepároljuk, etilacetáttal mossuk és butanollal extrahálunk. Ha szükséges a semleges adszorbensen végzett adszorbicót deszorpciót megismételhetjük.
Ezzel a kívánt anyagot tiszta állapotban kapjuk meg. A WF 11 243 anyag amfoter, így bázissal vagy savval sót képez. A WF 11 243 anyag kinyerhető és tisztítható szabad állapotban vagy sóként. A szabad állapotú vegyület és a só az ismert módszerekkel egymásba átalakítható.
A WF 11 243 anyag bázisokkal képzett sója lehet alkálifémsó, például nátriumsó, káliumsó; alkáliföldfémsó, például kalciumsó vagy magnéziumsó, szervetlen bázisokkal képzett só, például ammóniumsó, szerves aminokkal képzett só, például metil-amin-só, etilamin-só, butil-amin-só, terc-butil-amin-só, propilamin-só, izopropil-amin-só, dimetil-amin-só, dietilamin-só, trimetil-amin-só, trietil-amin-só, piridinsó. pikolinsó, diciklohexil-amin-só, N,N’-dibenzil-etiléndiamin-só; és aminosavakkal alkotott só, például argininsó, aszparaginsó és glutaminsavas só.
A savakkal képzett sókra példaként említhetjük a hidroklorid-, hidrobromid-, hidrojodid-sót, a kénsavval, salétromsavval, foszforsavval képzett sókat, a szerves savakkal képzett savaddíciós sókat, melyben a felhasznált szerves sav lehet ecetsav, trifluorecetsav, maleinsav, borkősav, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, hangyasav, toluolszulfonsav, aminosavak, például aszparaginsav, glutaminsav, stb.
A találmány foglalkozik azokkal a gyógyszerkészítményekkel is, melyek WF 11 243 anyagot és/vagy sóját tartalmazzák hatóanyagként. A gyógyszerkészítmények alkalmazhatók szilárd, félfolyékony vagy folyékony állapotban. Ezekben a készítményekben a WF 11 243 és/vagy sója mint hatóanyag szerves vagy szervetlen vivőanyaggal képzett keverékben található, illetve olyan
HU 211 527 A9 adalékanyaggal képez gyógyszerkészítményt, mely alkalmas végbélen, tüdőn (orron vagy szájon át történő inhalációval), orron, szemen, szájon át vagy parenterális bevitelre, külső helyi kezelésre vagy befúvásra.
A hatóanyagot olyan nem-toxikus, gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyaggal társítjuk, mely lehetővé teszi tabletta, pirula, pasztilla, kapszula, kúp, krém, kenőcs, aeroszol, befúvásra használt por, oldat, emulzió, szuszpenzió vagy bármilyen más formátum elkészítését. Ha szükséges, más adalékanyagot, stabilizálószert, sűrűsítő anyagot, szín- vagy aromaanyagot is adhatunk a készítményhez.
A WF 11 243 anyagot és/vagy sóit olyan mennyiségben alkalmazzuk a gyógyszerkészítményekben, mely a kellő hatást gyakorolja a betegség előmenetelére vagy állapotára.
Ember esetében előnyös a készítményt intravénásán, intramuszkulárisan vagy szájon át bejuttatni. Noha az aktív hatóanyag terápiás hatású dózisa változó és függ az egyes beteg korától és állapotától, a napi dózis embernél intravénás bevitel esetén 0,01-100 mg/kg, intramuszkuláris bevitelnél 0,1-100 mg/kg, orális adagolásnál 0,5100 mg/kg. Általában ilyen dózistartományban adjuk be a hatóanyagot ember esetében a fertőzéses megbetegedések megelőzésére vagy kezelésére.
A WF 11 243 anyag és/vagy sói széles spektrumú hatóanyagok a különféle gombafertőzéses betegségek, illetve a különféle protozoák által okozott protozoózisok megelőzésére és/vagy kezelésére. Különösen hatásos a különféle Pneumocystis carinii fertőzések (például Pneumocystis carinii pneumónia megelőzésére és/vagy kezelésére. A Pneumocystis carinii pneumónia megelőzésével és/vagy kezelésével kapcsolatban az alábbiakat állapíthatjuk meg.
Inhalációs bevitelre a találmány szerinti vegyületeket előnyös nyomás alatt lévő tartályból vagy porlasztókészülékből származó aeroszol permetként használni. Forgalomba hozható a vegyület olyan por alakjában is, ami egy befúvó készülék segítségével inhalálható. Előnyös olyan készüléket használni az inhalációhoz, mely pontosan adagolt dózis inhalációját teszi lehetővé. Ehhez a vegyületek szuszpenzióját vagy oldatát használjuk alkalmas hajtóanyagokkal.
Minthogy kívánatos, a tüdő és légcsövek közvetlen kezelése, az aeroszolos bevitel előnyös módszer. A befúvatás ugyancsak kívánatos mód, különösen ahol a fertőzés a fülekben vagy más testüregben lép fel.
Alternatív eljárásként alkalmazhatunk cseppinfúziós intravénás bevitelt is.
Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.
/. példa
1) A WF 11 249 anyag fermentációs előállítása
Előtenyészethez 160 ml táptalajt teszünk 500 ml-es Erlenmeyer lombikba. A táptalaj összetétele: 4% szacharóz, 2% gyapot! maghulladék, 1% szárított élesztő, 1% pepton, 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,2% kalcium-karbonát és 0,1% Tween 80. A táptalajt 121 ’Con sterilizáljuk 30 percen át. Az egyes lombikokat ferde tenyészetről beoltjuk egy kacsnyi 11 243 gombatörzzsel (FERM BP-3373) és 25 °C-on inkubálunk 4 napon át rázatva a tenyészetet.
A fermentációs közeg összetétele: 2% módosított keményítő, 0,5% glükóz, 1% gyapotmaghulladék, 1% sikérliszt, 2% kálium-dihidrogén-foszfát, 1,5% dinátrium-hidrogén-foszfát. 12H2O, 0,001% cink-szulfát. 7H2O, 0,025% Adekanol LG-109 (Asahi Denka Co., Japán) és 0,025% Silicone KM70 (Shin-etsu Chemical Co., Japán). 30 literes fermentorba 20 liter táptalajt teszünk. 121 ’C-on 30 percen át sterilizálunk, és 2% előzőek szerint kapott előtenyészettel beoltjuk a táptalajt. 4 napon át fermentálunk 25 ’C hőmérsékleten. A tenyészetet percenként 200 fordulatszámmal kevertetjük és percenként 20 liter levegőt vezetünk át rajta. A WF 11 243 anyag termelődését HPLC analízissel követjük nyomon (oszlop: Hibar Lichrosper 100 RP 18; Merk; oldószer: 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 50%-os vizes acetonitril; detektálás: 210 nm-en; átfolyási sebesség: 1 ml/perc). A tenyészetből vett mintához hozzáadunk vele azonos térfogatú acetont, szűrjük, a szűrletet egy meghatározott töménységre bepároljuk és ezt használjuk fel az analízishez.
2) A WF 11 243 extrakciója és tisztítása
A fentiek szerint nyert fermentlé 75 literéhez hozzáadunk azonos térfogatú acetont és időnkénti megkeverés mellett szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán át. Szűrés után a szürlethez hozzáadunk 65 liter vizet és a kémhatását 6 n nátrium-hidroxid oldattal pH = 6,5 értékre állítjuk be. Az extraktumot 6,5 literes HP-20 oszlopra (Mitsubisi Kaséi Corp., Japán) viszszük. Miután az oszlopot 35 liter víz és 27 liter 40%-os vizes acetonnal mostuk, a kívánt terméket 48 liter 80%-os vizes acetonnal eluáljuk, mely 0,002 n végső koncentrációban sósavat tartalmaz.
A tisztaság megállapításához a Candida albicans-szal szembeni fungicid aktivitás vizsgálatát, illetve HPLC analízist (oszlop: YMC Packed Column AM-303, S-5, 120 A, ODS, YMC Co., Ltd.; mozgófázis: 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 45%-os vizes acetonitril; detektálás: 210 nm UV fényen; átfolyási sebesség: 1 ml/perc; retenciós idő: 10,9 perc) használunk.
Az eluátumot csökkentett nyomáson 1,9 liter térfogatra pároljuk, a kémhatását pH - 6,0 értékre állítjuk be, majd kétszeres térfogatú etil-acetáttal mossuk. Az aktív anyagot 1,9 liter butanollal extraháljuk, az extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot 1 liter vízben oldjuk. A vizes oldat kémhatását 1 n sósavval pH = 3,0 értékre állítjuk be, 1 liter etil-acetáttal mossuk, 1 liter butanollal extraháljuk. A szerves extraktumot 1 liter 1%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, majd 1 liter pH = 4 kémhatású sósavas vízzel mossuk és a szerves extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot 3,0 liter 50%-os vizes acetonitrilben oldjuk és 1 ,3 literes HP-20 oszlopra visszük. Az oszlopot 3,5 liter vízzel, 3,5 liter 50%-os vizes metanollal, 3,5 liter 80%-os vizes metanollal és 3,8 liter metanollal mossuk, a
HU 211 527 A9 hatóanyagot 2,7 liter 80%-os vizes acetonnal eluáljuk, melyben 0,002 n végkoncentrációban sósav van. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk, a bepárlási maradékot 5 liter 20%-os vizes metanolban oldjuk és az oldatot 500 ml-es fordított fázisú oszlopra (YMC Gél, ODS-AM, 120-S50, YMC Co., Ltd.) visszük. Az oszlopot előzőleg 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 20%-os vizes acetonitrillel kiegyensúlyoztuk. A kívánt anyag felvitele után az oszlopot 1 liter 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 30%-os vizes acetonitrillel és egy liter 0,5% ammónium-dihidrogénfoszfátot tartalmazó 35%-os vizes acetonitrillel és egy liter 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 40%-os vizes acetonitrillel mossuk. A kívánt terméket 2 liter 0,5%-os ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 45%-os vizes acetonitrillel eluáljuk.
280 ml eluátum azonos térfogatú vízzel hígítunk és ismét rávisszük egy 180 ml-es fordított fázisú oszlopra (YMC Gél, ODS-AM, 120-S50). Miután az oszlopot 0,4 liter 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 30%-os vizes acetonitrillel, 0,4 liter 0,5%-os ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 35%-os vizes acetonitrillel és 0,4 liter 0,5% ammónium-dihidrogénfoszfátot tartalmazó 40%-os vizes acetonitrillel mostuk, a kívánt anyagot 0,5% ammónium-dihidrogénfoszfátot tartalmazó 43%-os vizes acetonitrillel eluáljuk az oszlopról. Az 55 ml eluátumot azonos térfogatú vízzel meghígítjuk és rávisszük egy 40 ml-es HP-20 oszlopra. Az oszlopot 180 ml vízzel mossuk és a kívánt anyagot 100 ml 80%-os vizes acetonnal eluáljuk, ami 0.002 n végkoncentrációban sósavat tartalmaz.
A nyert eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk. az aceton eltávolítása után fagyasztva szárítjuk, 72 mg WF 11 243 hidrokloridot nyerve fehér por alakjában. Ezt a terméket FR 901 469 anyagnak nevezzük.
3) Az FR 901 469 fiziko-kémiai tulajdonságai
Az FR 901 469 fiziko-kémiai tulajdonságait a korábbi táblázatban foglaljuk össze.
Az aminosavanalízist a következőképpen végezzük: 1 mg FR 901 469 anyagot 1 ml 6 n sósavban hidrolizálunk 110 °C hőmérsékleten, lezárt csőben 20 órán át. Hidrolízis után a hidrolizátumos oldatot szárazra pároljuk és a nyert szilárd anyagot aminosavanalizátoron (Hitachi 835 Automatic Amino-Acid Anolyzer) elemezzük. Az eredmények azt mutatják, hogy a termék az alábbi aminosavakat tartalmazza: Thr (4), Gly (1), Alá (1), Val (1), Tyr (1) és Om (1). A vegyület kémiai szerkezetét az (I) képlet ábrázolja.
2. példa
Az FR 901 469 anyag biológiai tulajdonságai
1) Mikrobicid aktivitás
Az FR 901 469 anyag mikrobicid aktivitását a szokásos hígításos módszerrel határozzuk meg 96 lyukú lemezt használva az alábbiak szerint.
A vizsgálati mikroorganizmust (lásd alább) ferde táptalajon inkubáljuk. Élesztőnitrogén alapú dextrózos táptalajban szuszpendáljuk a tenyészetről nyert sejteket
2xl05/ml sejtsűrűséggel. Az FR 901 469 anyagból készítünk egy folyamatos 1/2-szeres hígítást sorozatot és 100 μΐ-t mérünk mindegyik hígításból a titterlemez egy-egy lyukába. 100 μΐ mikroorganizmus szuszpenziót adunk hozzá és 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk. Candida és Aspergillus esetén 24 órán, Cryptococcus esetén 48 órán át. Az inkubációs idő leteltével az egyes lyukakban lévő reakciókeverék zavarosságát (turbiditását) megmérjük. A hatóanyagnak azt a koncentrációját, mely a kontrolihoz (nem tartalmaz hatóanyagot) mérten fele olyan zavarosságot mutat tekintjük az 50%-os növekedés gátlási koncentrációnak (ICsq). Az eredményeket a II. táblázatban foglaljuk össze.
II TÁBLÁZAT
Az FR 901 469 anyag mikrobicid aktivitása
vizsgálati mikroorganizmus IC50^g/ml)
Candida albicans FP582 <0,0093
FP578 0,16
FP629 0,16
FP633 0,16
Candida utilis YC123 0,16
Candida krusei YC109 0,0039
Candida tropicalis YC118 0,0039
Cryptococcus neoformans YC203 >10
Aspergillus fumigatus 8004 <0,0093
Aspergillus niger ATCC9642 0,63
2) Az FR 901 469 anyag megelőző hatása egér
Candida albicans fertőzésével szemben
Az FR 901 469 anyag in vivő fungicid hatékonyságát az alábbiak szerint vizsgáljuk.
Vizsgálati állatként négyhetes ICR nőstény egereket (testsúly 18-21 g) használunk. Egy csoportba öt állat tartozik. Élő Candida albicans FP633 sejteket szuszpendálunk fiziológiás sóoldatban és az egyes állatok farokvénájába 2xl66 sejtet injektálunk, megfertőzve a gombával az egereket. Egy órával az injektálás után, mindegyik egérbe szubkután FR 901 469 fiziológiás sóoldatban készült oldatát adagoljuk. A következő három napon át naponként egyszer megismételjük a szubkután injektálást. 14 nappal a fertőzés után megállapítjuk az életben maradt egerek számát. A kapott eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze.
III. TÁBLÁZAT
Az FR 901 469 anyag in vivő preventív hatékonysága fertőzéssel szentben
hatóanyag dózisa (mg/kg) éló állatok száma
10 5
1 5
0 0
HU 211 527 A9
3) Toxicitási vizsgálatok
Öt darab öthetes ICR nőstény egérbe három napon át, naponként egyszer testsúlykilogrammonként 100 mg FR 901 469 anyagot injektálunk intraperitoneálisan. Az egerek nem pusztulnak el. Valamennyi állat testsúlynövekedése azonos a hatóanyagot nem kapott kontrollállatokéval. Ezzel bizonyítást nyert a WF 11 243 anyag nagy biztonságossága.
3. példa
Az injekció elkészítése
100 ml desztillált vízben feloldunk 5 g FR 901 496 anyagot (az 1. példában leírtak szerint előállított), 9 g konyhasót és 1 g nátrium-hidrogén-karbonátot. 1 ml oldatot töltünk egy ampullába.
4. példa
Inhaláláshoz használt aeroszol elkészítése
A szeleppel ellátott készülékbe az alábbi összetételű oldatot töltjük: 2% (tömeg) (I) képletű vegyület, 33% (tömeg) etanol és 65% (tömeg) hajtóanyag (propán/izobután, 70:30 arányú elegye).
A jelen találmány a WF 11 243 vegyületet tartalmazza, amely ismeretlen, új, fiziológiailag aktív vegyület. A vegyület kiváló fungicid és protozoa ellenes hatást fejt ki és különösen előnyösen alkalmazható gombák és protozoák növekedésének inhibiálására, valamint elpusztítására különféle technikai területeken ez lehet gyógyszer, kozmetikum, ipari hatóanyag, élelmiszeripari hatóanyag és ital gyártási hatóanyag. A jelen találmány szerinti vegyület azzal jellemezhető, hogy fungicid és protozoa ellenes aktivitást is kifejt. Az utóbbi aktivitással kapcsolatban például a találmány szerinti vegyület azzal jellemezhető, hogy kiváló hatást fejt ki Pneumocystis carinii Pneumonia megelőzésében és kezelésében.
Ezen túlmenően, mivel a találmány szerinti aktív hatóanyag szerkezetét meghatároztuk, az adott vegyület ipari előállítása is lehetséges szerves, szintetikus eljárás során, továbbá lehetséges ipari mikroorganizmus felhasználással történő előállításuk. Ennek eredményeképpen a találmány szerinti vegyület különféle származékainak előállítása lehetséges. Az ilyen előállítások során számos új vegyületet állíthatunk elő, illetve új felhasználások is várhatóak.
A 13.2 törvény alapján a mikroorganizmus letétbe helyezése az alábbi.
1. No. 11 243 (a) A letétbe helyezés neve és címe:
National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry,
1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japán (b) A letétbe helyezés dátuma: 1991. április 23.
(c) A letétbe helyezés száma (hozzáférhetőségi szám, amelyet a letétbe helyező cég határozott meg) (a): FERM BP-3373.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. WF 11 243 anyag, melynek hidrokloridja az alábbi fiziko-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik és ennek sói:
    (1) megjelenés: fehér por (2) olvadáspont: 182-187 °C (3) fajlagos forgatás: [α]$: +29 ’C (c = 1,5, metanol) (4) összegképlet: C71H116N14O23HC1 (5) elemanalízis a C7|Hn6N|4O23: HC1-8H2O képlet alapján:
    számított: C: 49,74 H: 7,82, N: 11,44%;
    mért: C: 49,65, H: 7,72, N: 11,40%.
    (6) oldhatóság: oldódik: metanolban, vízben; gyengén oldódik: acetonban; oldhatatlan: n-hexánban (7) színreakciók: pozitív: jódgáz-, cérium(IV)-szulfát-, ninhidrin-reakció; negatív: Molish-, Ehrlich-reakció (8) vékonyrétegkromatográfia (TLC):
    állófázis mozgófázis Rf érték szilikagél n-butanol/ecet- sav/víz 0,42 60 F254 (Merck) 4:1:2 RP-18 WF 254S (Merck) 45%-os vizes acetonitril, ami 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz 0,18
    (9) infravörös-spektrum (FT-IR; KBr):
    KBr?.max: 3400, 2920, 1730, 1660, 1650, 1635, 1540, 1520, 1460, 1250, 1090 cm1 (10) HPLC oszlop: YMC.Pack ODS-AM (AM-303, S-5, 120A,
    4.6 mmx250 mm, YMC Co., Ltd.) detektálás: 210 nm mozgófázis: 0,5% ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 45%-os vizes acetonitril áramlási sebesség: 1 ml/perc retenciós idő (RT): 10,9 perc (11) l3C mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CDjOD):
    (1. ábra).
    óc: 176,1 (s), 174,6 (s), 174,0 (s), 173,8 (s), 173,4 (s),
    172.8 (s), 172,6 (s), 172,5 (s), 172,4 (s), 172,1 (s),
    171.9 (s), 171,8 (s), 171,7 (s), 171,2 (s), 156,1 (s),
    131,4 (d) x2, 128,6 (s), 117,9 (d) x2, 74,2 (d), 72,0 (d), 70,5 (d), 70,1 (d), 70,0 (d), 69,1 (d), 68,8 (d),
    68,3 (d), 67,7 (d), 61,4 (d), 60,9 (d), 60,3 (d), 59,8 (d), 58,2 (d), 57,9 (t), 57,6 (d), 57,2 (d), 56,8 (d),
    51,7 (d), 50,8 (d), 46,4 (t), 43,1 (t), 42,9 (t), 40,4 (t),
    39.9 (t), 38,9 (t), 37,6 (t), 35,8 (t), 34,7 (t), 33,1 (t),
    31.6 (d), 30,8 (t), 30,7 (t), 30,7 (t), 30,7 (t), 30,6 (t),
    30,5 (t), 30,4 (t), 30,3 (t), 28,1 (t), 25,9 (t), 24,9 (t),
    23.7 (t), 21.2 (q), 20,9 (q), 20,3 (q), 19,2 (q), 18,9 (q), 18,7 (q), 17,2 (q), 14,4 (q).
    (12) ’H mágneses magrezonancia-spektrum (400 MHz, CDjOD):
    HU 211 527 A9 (2. ábra) δΗ: 7,08 (2H, d, J = 8 Hz), 6,98 (2H, d, J = 8 Hz),
    5,18-5,09 (2H, m), 4,88 (IH, br s), 4,76-4,69 (3H, m), 4,65 (IH, m), 4,48 (IH, m), 4,46 (IH, d, J = 5 Hz), 4,41 (IH, d, J = 9 Hz), 4,36-4,27 (3H, m), 4,24—4,13 (6H, m), 3,98 (IH, m), 3,92-3,78 (3H, m), 3,70(lH,dd, J= 11 and 4 Hz), 3,58 (IH, brd,J = 11 Hz), 3,00-2,93 (3H, m), 2,80 (IH, dd, J = 13 and 11 Hz), 2,56 (IH, dd, J = 13 and 11 Hz), 2,45 (IH. dd, J = 14 and 9 Hz), 2,37 (IH, br d, J = 13 Hz),
  2. 2,30 (IH, m), 2,21-2,05 (3H, m), 2,03-1,93 (2H, m), 1,89 (IH, m), 1,77 (IH, m), 1,62-1,50 (4H, m), 1,39 (3H, d, J = 6 Hz), 1,35 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,35 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,30 (3H, d, J = 6 Hz), 1,28 (22H, m),
    1,13 (3H, d, J = 6 Hz), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz), 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,80 (3H, d, J = 6,5 Hz), (13) tömegspektrum:
    FAB-MS, m/z: 1533 (M+H)+
    HRFAB-MS, m/z: 1555,8240 (C71H|l6N]4O23Na képletre számolva: 1555,8235) (14) aminosavanalízis (6 n sósavas hidrolízis, 110 ’C, 20 óra): Thr (4), Gly (1), Ala (1), Val (1), Tyr (1) (15) ultraibolya-spektrum:
    jellemző csúcsok:
    H2OÁmiu: 225 (váll), 275 (1200), 280 (váll) nm Ο.ΟΙηλ maxHCl: 225 (váll), 275, 280 (váll) nm 0,01nXmaKNaOH: 240, 292 nm.
    (16) az (I) képletű szerkezet
    2. Eljárás az (1) képletű WF 11 243 anyag és sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a WF 11 243 anyagot termelő mikroorganizmust táptalajon tenyésztjük és a tenyészléből a WF 11 243 anyagot kinyerjük.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a WF 11 243 anyagot előállító mikroorganizmus a 11 243 számú törzs.
  4. 4. (I) képletű WF 11 243 anyagot termelő mikroorganizmus.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti WF 11 243 anyagot termelő mikroorganizmus, ahol a mikroorganizmus a 11 243 számú törzs.
  6. 6. Fungicid, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként (I) képletű WF 11 243 anyagot vagy sóját tartalmazza.
  7. 7. Protozoicid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként WF 11 243 anyagot vagy sóját tartalmazza gyógyszerészetileg elfogadható hordozó vagy kiszerelő anyagokkal együtt.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti protozoicid, ahol a protozoa a Pneumocystis carinii.
  9. 9. WF 11 243 vegyület, eljárás a WF 11 243 vegyület előállítására, mikroorganizmus, amely képes a WF 11 243 vegyület termelésére fungicid vagy protozoa ellenes szer, amely a WF 11 243 találmány szerinti vegyületet tartalmazza, amelyet a fenti példákban, illetve leírásban megadtunk.
    HU 211 527 A9 Int. Cl.6: C 07 K 11/02
    HU 211 527 A9 Int. Cl.6: C 07 K 11/02
    FR 901469 onyog C15 mágneses mogrczononcia spektruma
HU9500360P 1991-05-09 1995-06-22 Az átmeneti oltalom az 1. és 6-8. igénypontokra vonatkozik HU211527A9 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3132243A JPH04335217A (ja) 1991-05-09 1991-05-09 分離型光学式ピックアップ装置
JP3299552A JPH05112599A (ja) 1991-10-21 1991-10-21 Ｗｆ１１２４３物質、その製法及び生物学的利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211527A9 true HU211527A9 (hu) 1995-11-28

Family

ID=26466866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500360P HU211527A9 (hu) 1991-05-09 1995-06-22 Az átmeneti oltalom az 1. és 6-8. igénypontokra vonatkozik

Country Status (1)

Country Link
HU (1) HU211527A9 (hu)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5502033A (en) Antimicrobial polypeptide compound a pharmaceutical composition comprising the same, and a method for treating infectious diseases
US5470827A (en) Method of producing iturin A and antifungal agent for profound mycosis
US5547934A (en) WF11243 substance
KR101558632B1 (ko) 환형 화합물 및 그 염
WO1998056755A1 (fr) Substances physiologiquement actives tkr2449, leur procede de preparation et micro-organisme
US5854276A (en) Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof
HU211527A9 (hu) Az átmeneti oltalom az 1. és 6-8. igénypontokra vonatkozik
WO2002068456A1 (en) Echinocandin derivatives, pharmaceutical compositions containing same and use thereof as drugs
JP2661367B2 (ja) Ｗｆ１１２４３物質
JPH05112599A (ja) Ｗｆ１１２４３物質、その製法及び生物学的利用
EP1254161B1 (en) Aerothricin analogs, their preparation and use
JPH1045617A (ja) 抗原虫剤
JP4095815B2 (ja) トリプシンの新規インヒビターｔｕ−５３５０物質とその製造法及び用途
JPS6250474B2 (hu)
JP2002510335A (ja) 新規化合物ｗｆ００１４４
EP0601187A1 (en) Novel antibiotic and production and use thereof
JPH06145067A (ja) カリニ感染症予防治療剤
GB2271355A (en) Novel antibiotic and production thereof
WO1995018142A1 (en) Wf15604 substances
GB2293379A (en) WF17819 substance
JPH0971598A (ja) Ｗｆ１６６１６物質、その製法及び用途
JPH04335891A (ja) Ｗｆ１１２４３物質、その製法及び用途
MXPA01000655A (en) Aerothricin analogs, their preparation and use
JPH08259585A (ja) 生理活性物質ｆｒ１８３７８３
JP2003503416A (ja) 新規化合物