JPH04335891A - Ｗｆ１１２４３物質、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＷＦ１１２４３物質ま
たはその塩、それらの製法及び用途に関するものである
。ＷＦ１１２４３物質は、微生物、特にかびの培養物か
ら分離採取された従来未知の新規物質であり、すぐれた
抗真菌性を示し、真菌に由来する各種害作用の軽減ない
し防止、各種疾病の予防、治療剤等各種医薬として有用
である。

【０００２】したがって本発明は、医薬品、化粧品、飲
食品等各種技術分野において重要な役割を果すものであ
る。

【０００３】

【従来の技術】従来より、微生物の培養物からあるいは
化学合成により各種の抗真菌剤が製造されている。これ
らの抗真菌剤としては、すぐれたものもいくつかは認め
られるが、薬効のほかに耐性菌の出現、安全性の問題等
各種の問題点があり、これをすベて完全に解消して満足
しうるものとした抗真菌剤はないのが現状である。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】本発明は、上記した技術の現
状に鑑みてなされたものであって、従来の抗真菌剤より
もすぐれた新しい抗真菌剤を開発する目的でなされたも
のである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に各方面から検討した結果、本発明者らは、安全性の面
から天然物に着目し、微生物の発酵生産物に注目するに
至り、各種微生物を検索した結果、京都府綾部市で採取
した落葉サンプルから新たに分離したかび・Ｎｏ．１１
２４３株が培養液中に目的物質を蓄積することを発見し
た。そして更にこの物質についてその理化学的性質を詳
細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを
確認し、この物質を新たにＷＦ１１２４３物質と命名し
、そして更に研究の結果、その工業的製法を確立し、本
発明を完成するに至った。

【０００６】本発明に係るＷＦ１１２４３物質は、下記
表２に示される理化学的性質を有する新規物質である。

【０００７】

【表２】

【０００８】本発明に係るＷＦ１１２４３物質は、例え
ば本発明者らが京都府綾部市で採取した落葉サンプルか
ら新たに分離したＮｏ．１１２４３株によって生産され
る。

【０００９】このＮｏ．１１２４３株は、各種培地上で
抑制的に拡がり、淡オレンジ色の集落を形成する。以下
にＮｏ．１１２４３株の菌学的性質を示す。

【００１０】各種培地上での培養性状を下記の表３に示
した。麦芽抽出寒天培地の中心に接種し、２５℃で１４
日間培養した時の生育はきわめて抑制的で、直径０．５
−１．０ｃｍに拡がった。集落の表面は隆起し、淡オレ
ンジ色であった。また、無色の粘性の浸出液を生産した
。集落裏面は灰色味オレンジ色であった。アナモルフを
生じた。同様の培養をポテト・デキストロース寒天培地
上で行った時は、生育はきわめて抑制的であった（直径
０．５−１．０ｃｍ）。集落表面は隆起し、放射状の溝
を生じ、淡オレンジ色であった。また、無色の粘性の浸
出液を生産した。集落裏面は淡黄色であった。アナモル
フを生じた。

【００１１】

【表３】

【００１２】Ｎｏ．１１２４３株は７−２９℃で生育可
能で、最適生育温度は２２−２６℃である（ポテト・デ
キストロース寒天培地上で測定した）。

【００１３】これらの性質を総合的に検討した結果、こ
のＮｏ．１１２４３株を、かびに属するものと同定して
Ｎｏ．１１２４３株と命名し、これを通産省工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号　　ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−３３７３寄託日：１９９１年４月２３日）
。

【００１４】ＷＦ１１２４３物質の生産は、単に説明を
目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物の
使用に限定されるものではないことを理解すべきである
。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射
、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる人工
変異株並びに自然変異株を含めてＷＦ１１２４３物質を
生産しうる全ての変異株の使用をも包含するものである
。

【００１５】本発明に係るＷＦ１１２４３物質は、かび
に属する該物質生産菌（例えばＮｏ．１１２４３株）を
資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、
好気条件下で培養することにより（例えば、振とう培養
、通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。

【００１６】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。

【００１７】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。

【００１８】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには、生長因子や微量要素が含まれ
ている場合などもあり、有利な場合があるからである。

【００１９】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

【００２０】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。

【００２１】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。

【００２２】また、培養を大きなタンクで行う場合、Ｗ
Ｆ１１２４３物質の生産工程において菌の生育遅延を防
止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種
培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそ
こで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使
用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者
ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えても
よい。

【００２３】培養は通気撹拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による撹拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。

【００２４】培養温度は、本ＷＦ１１２４３物質生産菌
が本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は
１〜４０℃、好ましくは１４〜３６℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜１週間である。

【００２５】発酵終了後、培養物から目的とするＷＦ１
１２４３物質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及
び／又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的
に又は超音波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び
／又は有機溶媒で抽出した後、常法にしたがって回収、
精製する。培養液の場合は、直接、常法にしたがって回
収、精製すればよい。

【００２６】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

【００２７】ＷＦ１１２４３物質の回収、精製は上記の
ように既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次のよ
うにしてもよい。培養物をアセトン水で抽出し、中性で
中性吸着樹脂〔例えばＨＰ−２０（三菱化成社製）〕に
吸着させ、酸性化アセトン水で溶出し、濃縮し、さらに
酢酸エチルで洗滌した後、ブタノールで抽出し、必要に
応じて中性吸着樹脂による脱着を繰り返し精製する。Ｗ
Ｆ１１２４３物質は両性物質であり、塩基または酸と反
応して塩を形成することができる。ＷＦ１１２４３物質
は遊離の状態（ＷＦ１１２４３物質自体）でも回収、精
製することができるし、またそれらの塩としも回収、精
製できる。また、これらは常法により相互に変換するこ
ともできる。ＷＦ１１２４３物質の塩基との塩としては
ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩などが
挙げられ、酸との塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の酸付
加塩が挙げられる。

【００２８】本発明に係る薬剤組成物は、ＷＦ１１２４
３物質及び／又はその塩を有効成分としてこれに常用さ
れる無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液
体の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤
に製剤化する。

【００２９】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。 本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。

【００３０】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＷＦ
１１２４３または／およびその塩）を０．０１〜１００
０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投
与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００ｍｇ
／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与し、
経口投与の場合も同じく０．５〜２０００ｍｇ／ｋｇ、
好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与する
。

【００３１】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。

【００３２】

【実施例１】

【００３３】

【（１）ＷＦ１１２４３物質の発酵生産】シュークロー
ス４％、綿実油粕２％、乾燥酵母１％、ペプトン１％、
ＫＨ２ＰＯ４　　０．２％、ＣａＣＯ３　　０．２％、
ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０　　０．１％からなる前培
養培地を５００ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコに１６
０ｍｌずつ分注し、１２１℃で３０分間滅菌した。この
各々の培地に　　Ｎｏ．１１２４３株（ＦＥＲＭＢＰ−
３３７３）の斜面培養物を１白金耳ずつ接種し、２５℃
で４日間振とう培養した。

【００３４】次に、変性澱粉２％、グルコース０．５％
、綿実油粕１％、グルテンミール１％、ＫＨ２ＰＯ４２
％、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　　１．５％、ＺｎＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ　　０．００１％、アデカノールＬＧ−
１０９（旭電化社製）０．０２５％、シリコンＫＭ７０
（信越化学工業社製）０．０２５％からなる本培養培地
を調製しておき、この本培養培地２０ｌを３０ｌ容ジャ
ーファーメンターに注入した。これを１２１℃で３０分
間滅菌した後、先に得た前培養物を２％接種し、２５℃
で４日間培養した。撹拌は２００ｒｐｍ、通気量は２０
ｌ／分で行った。培養物中のＷＦ１１２４３物質の量は
ＨＰＬＣ〔カラム：Ｈｉｂａｒ　　ＬｉＣｈｒｏｓｐｅ
ｒ　　１００ＲＰ１８（Ｍｅｒｃｋ社製）；溶媒：０．
５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む５０％アセトニトリル水；
検出：ＵＶ　　２１０ｎｍ；流速：１ｍｌ／分〕で定量
した。検定サンプルは、培養液に等量のアセトンを添加
し、濾過した後、適量まで濃縮したものを用いた。

【００３５】

【（２）ＷＦ１１２４３物質の抽出、精製】上記の培養
方法で得られた培養物７５ｌに等量のアセトンを加え時
々撹拌しながら室温で、一晩放置後、ろ過することで培
養抽出物を得た。その抽出液に水６５ｌを加え、そのｐ
Ｈを６Ｎ　　ＮａＯＨでｐＨ６．５に修正後、６．５ｌ
のＨＰ−２０（三菱化成社製）に付した。３５ｌの水、
４０％アセトン水２７ｌでカラムを洗浄した後、最終濃
度として０．００２ＮのＨＣｌを含む８０％アセトン水
４８ｌで目的物質を溶出した。

【００３６】なお精製は、Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉ
ｃａｎｓに対する抗菌力、また、ＨＰＬＣ〔カラム：Ｙ
ＭＣ　　Ｐａｃｋｅｄ　　Ｃｏｌｕｍｎ　　ＡＭ−３０
３（Ｓ−５、１２０Ａ、ＯＤＳ）ＹＭＣ　　Ｃｏ．，Ｌ
ＴＤ〕；移動層：０．５％　　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む
４５％アセトニトリル水；検出：ＵＶ　　２１０ｎｍ；
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；リテンションタイム（ＲＴ）：
１０．９分〕を指標に行った。

【００３７】上記で得た溶出液を、減圧下で１．９ｌま
で濃縮し、ｐＨを６．０に修正後、２倍量の酢酸エチル
で洗浄した。次にブタノール１．９ｌで活性成分を抽出
し、減圧濃縮後、水１ｌで置換した。その水溶液のｐＨ
を１Ｎ　　ＨＣｌで３．０に修正後、再度、酢酸エチル
１ｌでその水溶液を洗浄、次いで、ブタノール１ｌで活
性成分を抽出した。その有機溶媒層を１％重曹水１ｌお
よびｐＨ４の塩酸水１ｌで洗浄した後、その有機溶媒層
を減圧濃縮した。次にその残渣を５０％アセトニトリル
水３．０ｌで溶解し、１．３ｌのＨＰ−２０のカラムに
付した。カラムを水３．５ｌ、５０％メタノール水３．
５ｌ、８０％メタノール水３．５ｌメタノール３．８ｌ
で洗浄した後、最終濃度として０．００２ＮのＨＣｌを
含む８０％アセトン水２．７ｌで活性成分を溶出した。 次にその溶出液を減圧濃縮し、その残渣を２０％メタノ
ール水５ｌで溶解後、逆相系担体（ＹＭＣ・Ｇｅｌ，Ｏ
ＤＳ−ＡＭ，１２０−Ｓ５０、ＹＭＣ　　Ｃｏ．，ＬＴ
Ｄ製）のカラム（５００ｍｌ）に付した。カラムは予め
０．５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む２０％アセトニトリル
水で平衡化し、目的物質を含む溶液をチャージ後、０．
５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む３０％アセトニトリル水１
ｌ、同３５％アセトニトリル水、１ｌ、同４０％アセト
ニトリル水１ｌで洗浄、同４５％アセトニトリル水、２
ｌで目的物質を溶出した。

【００３８】溶出活性画分　　２８０ｍｌを等量の水で
希釈後、再度、逆相系担体（ＹＭＣ・Ｇｅｌ，ＯＤＳ−
ＡＭ，１２０−Ｓ５０）のカラム（１８０ｍｌ）に付し
、０．５％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含む３０％アセトニトリ
ル水０．４ｌ、同３５％アセトニトリル水０．４ｌ，同
４０％アセトニトリル水０．４ｌでカラムを洗浄後、同
４３％アセトニトリル水で展開し、目的物質を溶出した
。この溶出活性画分５５ｍｌを等量の水で希釈し、４０
ｍｌのＨＰ−２０のカラムに付した。このカラムを水１
８０ｍｌで洗浄後、最終濃度として０．００２ＮのＨＣ
ｌを含む８０％アセトン水１００ｍｌ目的物質を溶出し
た。 この溶出液を減圧濃縮し、アセトンを除去後、凍結乾燥
することにより、ＷＦ１１２４３物質の塩酸塩（ＦＲ９
０１４６９物質と称する）の白色粉末を７２ｍｇ得た。

【００３９】

【（３）ＦＲ９０１４６９物質の物理化学的性質】この
ようにして得られたＦＲ９０１４６９物質の物理化学的
性質は、表２に示したとおりである。なお、アミノ酸分
析は次のようにして行った。まず、ＦＲ９０１４６９物
質１ｍｇを、６ＮＨＣｌ（１ｍｌ）を用いて封管中１１
０℃で２０時間加水分解した。加水分解終了後、反応混
合物を蒸発乾固し、これをアミノ酸分析器（Ｈｉｔａｃ
ｈｉ　　８３５　　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　　Ａｍｉｎｏ
−Ａｃｉｄ　　Ａｎａｌｙｚｅｒ）により分析した。そ
の結果は、Ｔｈｒ（４）、Ｇｌｙ（１）、Ａｌａ（１）
、Ｖａｌ（１）、Ｔｙｒ（１）、Ｏｒｎ（１）であった
。

【００４０】

【実施例２：ＦＲ９０１４６９物質の生物学的性質】

【
００４１】

【（１）抗菌力】ＦＲ９０１４６９物質の抗菌作用を下
記の９６ウエルマルチトレーを使用するマイクロブロス
希釈法常法により測定した。

【００４２】斜面培地で培養した菌より、イーストナイ
トロジェンベースデキストロース（ＹＮＢＤ）培地で試
験菌懸濁液（生菌数２×１０５個／ｍｌ）を調製した。 ＦＲ９０１４６９物質のＹＮＢＤ中連続２倍希釈列を作
り各ウェルに１００μｌずつ加えた。さらに各ウェルに
試験菌懸濁液を１００μｌずつ加えた後、３７℃で２４
時間（Ｃａｎｄｉｄａ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）
又は４８時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）培養した
。培養終了後各ウェルの濁度を測定し、薬剤無添加ウェ
ルの１／２の濁度を示すウェルの薬剤濃度を５０％増殖
阻止濃度（ＩＣ５０）として表わした。結果を下記の表
４に示す。

【００４３】

【表４】

【００４４】

【（２）実験マウス感染における（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎｓに対するＦＲ９０１４６
９物質の感染防御効果】ＦＲ９０１４６９物質の抗真菌
剤としての生体での有効性を下記の方法で明らかにした
。

【００４５】試験動物は、生後４週令、体重１８〜２１
ｇのＩＣＲ系雌マウスを用い、１群が５匹よりなる。生
理食塩水に懸濁したＣａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎ
ｓ　　ＦＰ６３３を、１匹当たり２×１０６個の生菌数
になるように、マウスの側尾静脈に注射することにより
感染させた。感染１時間後、ＦＲ９０１４６９物質の生
理食塩水溶液を皮下注射によりマウスに投与した。この
皮下注射をさらに感染翌日から１日１回、３日間繰り返
した。感染後１４日目のマウスの生存匹数を観察し、得
られた結果を下記の表５に示す。

【００４６】

【表５】

【００４７】

【（３）毒性試験】生後５週令のＩＣＲ系雌マウス５匹
に、ＦＲ９０１４６９物質を１００ｍｇ／ｋｇの投与量
で毎日１回、３日間連続腹腔内注射したが死亡例はなく
、体重増加も無投与マウス群と全く同じであり、ＷＦ１
１２４３物質の安全性の高さが確認された。

【００４８】

【実施例３：注射剤の製造】 　　（１）実施例１で製造したＦＲ９０１４６９物質　
　　　５ｇ　　（２）食　　塩　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
９ｇ　　（３）炭酸水素ナトリウム　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ

【００４９】（１
）〜（４）の全成分を蒸留水１００ｍｌに溶解した後、
アンプルに１ｍｌずつ分注して、注射剤１０００本を製
造した。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、ＷＦ１１２４３物質を提供す
るものであるが、この物質は従来未知の新規薬理活性物
質であって、すぐれた抗真菌作用を示し、医薬品、化粧
品、工業薬品、飲食品の各技術分野において真菌の生育
防止ないし抑制、死滅にきわめて有用である。また、本
発明によって、微生物を利用する上記物質の工業的製法
も確立された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＲ９０１４６９物質の１３Ｃ核磁気共鳴スペ
クトルを示す図面である。

【図２】ＦＲ９０１４６９物質の１Ｈ核磁気共鳴スペク
トルを示す図面である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　その塩酸塩が下記表１に示される物性
   を有することを特徴とするＷＦ１１２４３物質またはそ
   の塩。 【表１】
2. 【請求項２】　　ＷＦ１１２４３物質生産菌を培養して
   ＷＦ１１２４３物質を生成せしめ、これを採取すること
   を特徴とするＷＦ１１２４３物質またはその塩の製造方
   法。
3. 【請求項３】　　ＷＦ１１２４３物質生産菌が、Ｎｏ．
   １１２４３株であることを特徴とする請求項２の製造方
   法。
4. 【請求項４】　　ＷＦ１１２４３物質またはその塩を有
   効成分とする抗真菌剤。