JPH08259585A - 生理活性物質ｆｒ１８３７８３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 カビに分類される微生物（例えばFungus str
ain No. 11288）を培養して、中性淡黄色粉末ＦＲ１８
３７８３物質を製造する。 【効果】 この物質は、すぐれた生理活性を示し、抗菌
剤、抗腫瘍剤等として利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＦＲ１８３７８３物
質、その製法及び用途に関するものである。ＦＲ１８３
７８３物質は、微生物、特に真菌の培養物から分離採取
された従来未知の新規物質であり、すぐれた生理活性を
示し、ヒトや動物用の抗菌剤、抗腫瘍剤等の微生物、カ
ビ、癌細胞に起因する各種疾患の予防、治療剤として有
効である。

【０００２】

【従来の技術】従来より各種の抗菌性物質、抗腫瘍性物
質が開発されてきたが、有効性、抗菌スペクトル、安全
性、製造コスト等の面からみて満足し得るものは少な
く、新規物質の開発が当業界において強く要望されてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
当業界における要望に応えるためになされたものであっ
て、新規にして卓越した生理活性物質を開発する目的で
なされたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明者らは各方面から検討の結果、微生物の発酵生
産物に着目し、各種微生物のスクリーニングを鋭意実施
した。その結果、徳島市で採取した土壌試料より新たに
分離したＮｏ．１１２８８株の培養物からの分離抽出物
がすぐれた抗菌、抗腫瘍作用を有するという新知見を
得、そして更にこの物質についてその理化学的性質を詳
細に研究したところ、従来未知の新規物質であることを
確認してこの物質を新たにＦＲ１８３７８３物質と命名
し、そして更に研究の結果、この工業的製法を確立し、
本発明を完成するに至った。

【０００５】本発明に係るＦＲ１８３７８３物質は、下
記表２、表３、表４に示される理化学的性質を有する新
規物質である。

【０００６】

【表２】

【０００７】

【表３】

【０００８】

【表４】

【０００９】本発明に係るＦＲ１８３７８３物質は、例
えばＮｏ．１１２８８株によって生産される。Ｎｏ．１
１２８８株は、徳島県徳島市で採取した土壌試料から分
離した真菌である。本菌株は各種培地上で抑制的に拡が
り、黄味白色から茶色の集落を形成する。Ｎｏ．１１２
８８株は、培地上で、小型菌核と分生子を形成した。分
生子形成様式は分節型であった。テレオモルフは観察さ
れなかった。以下に本菌の菌学的性質を示す。

【００１０】各種培地上での培養性状を下記表５、表６
に示した。ツァペック・ドックス寒天培地の中心に接種
し、２５℃で１４日間培養した時の生育は極めて抑制的
で、直径０．５−１．０ｃｍであった。集落の表面は隆
起し、フェルト状、放射状の溝を生じ、灰味茶色であっ
た。黄色の可溶性色素を生じた。小型菌核と分生子が観
された。集落裏面は黄味茶色であった。同様の培養を麦
芽抽出寒天培地上で行った時も、生育は極めて抑制的で
あった（直径０．５−１．０ｃｍ）。集落表面は隆起
し、フェルト状で、放射状の溝を生じ、黄味白色であっ
た。小型菌核が観察された。集落裏面は淡オレンジ色で
あった。

【００１１】

【表５】

【００１２】

【表６】

【００１３】以上の特徴は、２５℃で、１４日間培養後
に観察した。色調の記載は、メチューン・ハンドブック
・オブ・カラー（A. Kornerup and J. H. Wanscher, Me
thuen Handbook of Colour, Third ed., Methuen, Lond
on, 1983）をもとにして行った。

【００１４】形態的特徴の観察は、ツァペック・ドック
ス寒天培地上での２週間後の生育をもとに行った。小型
菌核は散在、またはゆるく集合して形成され、表在性
で、亜球形から洋なし形、３５−７５×４５−９０μ
ｍ、滑壁で、茶色であった。分生子構造は気菌糸の先端
または側方に生じ、分生子柄は栄養菌糸との区別が不明
瞭で、先端に分生子鎖を形成する。分節型分生子は無
色、滑面、隔壁はなしまたは１つか２つで、両端に平ら
で明瞭な裁断状痕を持ち、たる型から円筒形、大きさは
２．０−４．５×４．０−１１．０μｍであった。

【００１５】栄養菌糸は隔壁を持ち、無色、平滑、分枝
する。菌糸細胞は円筒形で、巾１．５−２．５μｍであ
る。Ｎｏ．１１２８８株は、９〜３７℃で生育可能で、
最適生育温度は２５〜２９℃である（ポテト・デキスト
ロース寒天培地上で測定した）。

【００１６】これらの菌学的性質を検討した結果、Ｎ
ｏ．１１２８８株はカビに属するものと同定し、本生産
株をカビＮｏ．１１２８８（Fungus strain No. 1128
8）と命名し、これを通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４７８８として寄託した
（寄託日：平成７年２月２３日）。

【００１７】ＦＲ１８３７８３物質の生産は、単に説明
を目的として挙げただけの本明細書記載の特定の微生物
の使用に限定されるものではないことを理解するべきで
ある。この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン、２−アミノプリン等の変異処理により取得できる
人工変異株並びに自然変異株を含めてＦＲ１８３７８３
物質を生産しうる全ての変異株の使用をも包含するもの
である。

【００１８】本発明に係るＦＲ１８３７８３物質は、カ
ビに属する該物質生産菌（例えばＮｏ．１１２８８株）
を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養培地中に接種
し、好気条件下で培養することにより（例えば、振とう
培養、通気攪拌培養等）、生産せしめることができる。

【００１９】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。

【００２０】窒素源としては、オートミール、酵母エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、綿実油粕、大
豆粉、コーンスティープリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、
落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましい
が、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。

【００２１】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。不純なものには生長因子や微量要素が含まれて
いる場合などもあり、有利な場合があるからである。

【００２２】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい；炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。

【００２３】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要に応じて、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。

【００２４】目的物質を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、
ＦＲ１８３７８３物質の生産工程において菌の生産遅延
を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を
接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移してそ
こで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使
用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者
ともに同一であってもよいし必要あれば両者を変えても
よい。

【００２５】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹込み等既
知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したも
のを用いる。

【００２６】培養温度は、ＦＲ１８３７８３物質生産菌
が本物質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は
９〜３９℃、好ましくは２３〜３０℃で培養するのがよ
い。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが
通常は約１日〜２週間である。

【００２７】発酵終了後、培養物から目的とするＦＲ１
８３７８３物質を回収する。すなわち、菌体（又は菌体
を含有する培養物）は、直接水及び／又は有機溶媒によ
る抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波等既知の
手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶媒で抽出
した後、常法にしたがって回収、精製する。培養液の場
合は、直接、常法にしたがって回収、精製すればよい。

【００２８】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグ
ラフィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が
適宜単独であるいは組合わせて使用できる。

【００２９】ＦＲ１８３７８３物質の回収、精製は上記
のような既知の方法を適宜利用して行うが、例えば次の
ようにしてもよい。培養物をアセトンで抽出し、さらに
酢酸エチルで抽出した後、クロマトグラフィーで精製す
る。必要あれば更に精製工程をくり返して行い、最終的
に乾燥粉末を得ることができる。

【００３０】本発明に係るＦＲ１８３７８３物質は、後
記するところからも明らかなように、すぐれた生理活
性、特に抗菌作用及び抗腫瘍作用を併有していることが
確認され、且つ低毒性で安全性も高いことも確認され、
抗菌剤ないし抗カビ剤及び抗腫瘍剤として非常に有効で
ある。

【００３１】したがって本発明に係る物質は、医薬の有
効成分として使用することができ、このような医薬も本
発明に包含されるものである。本発明に係る薬剤組成物
は、ＦＲ１８３７８３物質及び／又はその塩を有効成分
としてこれに常用される無機又は有機の担体を加えて、
固体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか、外用
剤等の非経口投与剤に製剤化する。

【００３２】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル
剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤としては、
注射剤、点滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、
スプレー、懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。
本発明の有効成分を製剤化するには、常法にしたがえば
よく、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、
安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その他常用される佐薬
を適宜使用する。

【００３３】本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その
種類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者
の年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、
静脈投与の場合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＦＲ
１８３７８３または／およびその塩）を０．０１〜１０
００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
投与し、筋肉投与の場合は同じく０．０１〜１０００ｍ
ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与
し、経口投与の場合は０．５〜２０００ｍｇ／ｋｇ、好
ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与する。

【００３４】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。

【００３５】

【実施例１：ＦＲ１８３７８３の発酵生産】

【００３６】（１）培養 コーンスターチ（１％）、シュークロース（３％）、フ
ァーマメディア（１％）、乾燥酵母（１％）、ペプトン
（０．５％）および炭酸カルシウム（０．２％）の組成
の種培地を５００ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコ６本
に１６０ｍｌずつ加え、１２０℃で３０分間滅菌した。
それらにＮｏ．１１２８８株の斜面培養物を一白金耳ず
つ接種し、ロータリーシェイカーで毎分２５０回転、２
５℃で４日間振とう培養した。あらかじめシュークロー
ス（４％）、小麦胚芽（２％）、ファーマメディア（１
％）、リン酸１カリウム（０．４％）およびリン酸２ナ
トリウム（１．６％）の組成の培地４０Ｌを３０Ｌ容ジ
ャーファーメンター２基中に２０Ｌずつ注入し、１２０
℃で３０分間滅菌したあと、上記培養物を４８０ｍｌず
つ接種して、通気量１ＶＶＭ、攪拌速度毎分２００回
転、培養温度２５℃にて、１１日間培養した。

【００３７】（２）分離精製 培養終了後培養物（４０Ｌ）に等量のアセトンを加え、
１時間室温にて抽出した。けい藻土１．６ｋｇを添加
し、ろ過した。得られたろ液（６４Ｌ）を３０Ｌまで減
圧濃縮した。この濃縮物をｐＨ７．0に調整した後、等
量の酢酸エチルを加え抽出した。抽出残渣に再び酢酸エ
チルを加え、抽出を繰り返した。抽出液を減圧濃縮し、
得られた油状物質はシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（１Ｌ）に付した。このカラムをｎ−ヘキサン（３
Ｌ）、ｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（３：１；ｖ／
ｖ）の混液（３Ｌ）、ｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル
（１：１；ｖ／ｖ）の混液（３Ｌ）で洗った後、酢酸エ
チル（３Ｌ）で溶出した。活性溶出液を減圧濃縮し、油
状物質を得た。

【００３８】このようにして得られた油状物質を再びシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（１Ｌ）に付した。
カラムをジクロロメタンおよびメタノール（３０：１；
ｖ／ｖ）の混液で展開し、活性溶出液を減圧濃縮した。
得られた油状物質をさらにシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（６００ｍｌ）に付した。カラムをｎ−ヘキサ
ンおよび酢酸エチル（１：１；ｖ／ｖ）の混液（３
Ｌ）、ｎ−ヘキサンおよび酢酸エチル（１：２；ｖ／
ｖ）の混液（３Ｌ）で洗った後、ｎ−ヘキサンおよび酢
酸エチル（１：４；ｖ／ｖ）の混液（３Ｌ）で溶出し
た。活性溶出液を減圧濃縮し、得られた油状物質（５．
８ｇ）を２０ｍｌのメタノールに溶解した。このメタノ
ール溶液を逆相樹脂「ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＭ」（商標、
ＹＭＣ社製）（ＯＤＳ−ＡＭ １２０−Ｓ−５０タイ
プ）を充填したカラムに付した。カラムを５０％水性ア
セトニトリルで展開し、活性画分を減圧濃縮し、溶媒を
除去した後に酢酸エチルで抽出した。得られた抽出液を
減圧濃縮し、乾燥してＦＲ１８３７８３物質の粉末
（３．８ｇ）を得た。

【００３９】

【実施例２：ＦＲ１８３７８３の生理化学的性質】

【００４０】（１）抗菌活性 ＦＲ１８３７８３物質の数種の細菌、カビに対する抗菌
活性はパルプ法により検討した。培養培地は、細菌には
ブイヨン培地、カビにはサブロー培地を用いた。最小発
育阻止濃度（ＭＩＣ）は３７℃で一晩培養した後、測定
した。結果を下記表７に示す。ＦＲ１８３７８３物質
は、試験した細菌に対してはグラム陽性細菌、グラム陰
性細菌ともに抗菌活性を示さなかった。しかし、ある種
のカビ、例えば、オーレオバシディウム・プルランス・
エス・アール５６（Aureobasidium pullulans SR56）
（ＭＩＣ：３２μｇ／ｍｌ）に関しては、抗カビ作用を
示した。

【００４１】

【表７】

【００４２】（２）抗腫瘍活性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
（細胞毒性） ＦＲ１８３７８３のヒト乳腺癌（ＭＣＦ−７）、ヒト肺
腺癌（Ａ５４９）、ヒト結腸腺癌（ＨＴ２９）、ヒトＴ
細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）、マウス黒色肉腫（Ｂ１
６）、マウス白血病細胞（Ｐ３８８）に対する細胞増殖
抑制活性を調べた。活性検定は常法によった。すなわ
ち、培養培地としては、ＭＣＦ−７、Ａ５４９、ＨＴ２
９、Ｂ１６およびＰ３８８細胞にはダルベッコ最小培
地、またＪｕｒｋａｔ細胞にはＲＰＭＩ−１６４０培地
を用い、さらに各培地には牛胎児血清（ＦＢＳ）１０％
および抗生物質（ペニシリン ５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、
ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌ）を添加した。Ｆ
Ｒ１８３７８３物質はメタノールに溶かした後、２倍列
の希釈液を作り、９６穴タイタープレートを用いて測定
した。細胞濃度５×１０³／ｗｅｌｌで培養を開始し、
４日目に生細胞数をＭＴＴ法にて定量した。結果を下記
表８にまとめた。

【００４３】

【表８】

【００４４】上記結果から明らかなように、いずれの癌
細胞に対しても、ＦＲ１８３７８３物質は、おおむね
０．５−２μｇ／ｍｌのＩＣ₅₀値を示し、すぐれた抗腫
瘍活性を示すものである。

【００４５】（３）Ｐ３８８マウス白血病細胞を用いた
抗腫瘍効果 Ｐ３８８マウス白血病細胞をＢＤＦ₁（雌、８週令）に
１×１０⁶細胞／マウス（５×１０⁶細胞／ｍｌを０．２
ｍｌ／マウス）腹腔内（ｉｐ）移植し、翌日から１日１
回、６日間（１、２、３、４、７および８日）、２０％
ＰＥＧあるいはｏｌｉｖｅ ｏｉｌに溶解したＦＲ１８
３７８３を０．２ｍｌ／マウスｉｐ投与した。各群のＭ
ＳＴを求め、Ｔ／Ｃを算出した。その結果、ＦＲ１８３
７８３物質は、３２０ｍｇ／ｋｇおよび６４０ｍｇ／ｋ
ｇの投与量で、１２０％の延命効果を示した。

【００４６】（４）毒性試験 生後５週令のＩＣＲ系雌マウス５匹にＦＲ１８３７８３
物質を５ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日１回、３日間連続腹
腔内注射したが死亡例はなく、体重増加も無投与マウス
群と全く同じであり、ＦＲ１８３７８３物質の安全性の
高さが確認された。

【００４７】

【実施例３：注射剤の製造】 （１）実施例１で製造したＦＲ１８３７８３物質 ５ｇ （２）食塩 ９ｇ （３）炭酸水素ナトリウム １ｇ

【００４８】（１）〜（３）の全成分を蒸留水１００ｍ
ｌに溶解した後、アンプルに１ｍｌずつ分注して、注射
剤１００本を製造した。

【００４９】

【発明の効果】本発明は、ＦＲ１８３７８３物質を提供
するものであるが、この物質は従来未知の新規物質であ
って、すぐれた生理活性を有し、抗菌剤、抗腫瘍剤等と
して各種の医薬品に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＲ１８３７８３物質の¹Ｈ核磁気共鳴スペク
トルを示すチャートである。

【図２】ＦＲ１８３７８３物質の¹³Ｃ核磁気共鳴スペク
トルを示すチャートである。

フロントページの続き (72)発明者 寺野 紘 茨城県土浦市真鍋2600−３

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記表１に示される理化学的性質を有す
   ることを特徴とするＦＲ１８３７８３物質。 【表１】
2. 【請求項２】 ＦＲ１８３７８３物質生産菌を培養して
   ＦＲ１８３７８３物質を生産せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするＦＲ１８３７８３物質の製造方法。
3. 【請求項３】 ＦＲ１８３７８３物質生産菌がカビＮ
   ｏ．１１２８８（Fungus strain No. 11288）であるこ
   とを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 ＦＲ１８３７８３物質又は医薬として許
   容されるその塩、及び、医薬として許容され且つ実質的
   に無毒の担体又は賦形剤を含むものであることを特徴と
   する医薬製剤。
5. 【請求項５】 抗菌剤として使用されるものである請求
   項４に記載の医薬製剤。
6. 【請求項６】 抗腫瘍剤として使用されるものである請
   求項４に記載の医薬製剤。