JPH0434522B2

JPH0434522B2 -

Info

Publication number: JPH0434522B2
Application number: JP58133506A
Authority: JP
Inventors: Masakuni Okuhara; Hirokazu Tanaka; Hideko Kino; Sumio Kyotoo; Masanobu Kosaka; Hatsuo Aoki
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-07-21
Filing date: 1983-07-21
Publication date: 1992-06-08
Also published as: ZA845372B; JPS6027390A

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は抗腫瘍作用を有するFR−900216物
質またはその医薬として許容され得る塩を含有す
る抗腫瘍剤に関するものである。この発明のFR−900216物質は公知の化合物で
あり、その理化学的性質は次の通りである。分子量：625（マススペクトル法）推定分子式：C₃₅H₄₇NO₉ 融点：130−135℃（分解）比旋光度：［α］²⁰ _D＝＋140゜（Ｃ＝１、クロロ
ホルム中）紫外線吸収スペクトル： λCH₃OH max＝232（ε＝11、300）、238（sh.）、
285（shb）、296（ε＝55、500）、380（ε＝70、
300）、324（ε＝51、900）ｎｍ紫外線吸収スペクトル： ν^KBr _nax：3450、3140、2960、2920、2860、
1730、1715（sh.）、1607、1575、1455、1445、
1435、1377、1360、1343、1305、1280、1260、
1225、1190、1170、1140、1107、1077、1045、
1030（sh.）、980、970、950、930、915、905、
895、875、860、850、835、825、790、780、
755、705、670、635cm^-1 水素の核磁気共鳴スペクトル：図に示す通り（溶媒：重クロロホルム、内部
標準：テトラメチルシラン）炭素13の核磁気共鳴スペクトル：（重クロロ
ホルム中）内部標準：テトラメチルシラン δ（ppm）：9.65、11.41、11.71、13.77、
14.32、16.93、22.57、29.24、31.49、31.85、
34.16、35.86、36.40、37.98、45.32、54.18、
56.12、63.77、65.10、76.81、82.33、89.25、
120.80、123.77、126.44、129.29、135.97、136、
21、136.57、137.67、138.51、139.54、160.84、
168.01、169.34 溶剤に対する溶解性：易溶：メタノール、エタノール、アセトン、
酢酸エチル可溶：ヘキサン、エチルエーテル不溶：水呈色反応：ドラゲンドルフ反応＋塩化第２鉄反応 − モーリツシユ反応 − ニンヒドリン反応 − エーリツヒ反応 − ヨード反応＋塩基性、酸性、中性の区別：弱塩基性 FR−900216物質は、昭和57年10月開催の第25
回天然物有機化合物討論会講演要旨集第491〜497
頁に記載されているリゾキシン（Rhizoxin）と
同一物質であり、その構造式は下記の通りであ
る。 FR−900216物質が抗腫瘍作用を有することは
この出願前には全く知られておらず、この発明の
発明者が初めて見出したものである。 FR−900216物質は、例えばリゾプス属に属す
るFR−900216物質生産菌のようなFR−900216物
質生産菌を培地に培養し、得られる培養物から
FR−900216物質を分離、採取することにより製
造することができる。この発明で使用するFR−
900216物質生産菌のうち、この発明者が京都府宇
治市の土壌から新たに分離した菌株（No.Ｆ−1360
と番号を付す）は、次のような菌学的性質を有す
る。形態学的性質 (a) 肉眼的観察 () 麦芽エキス寒天培地上生育は極めて旺盛で速く、30℃、３−５
日間の培養で直径80cm以上の巨大集落を形
成し、ペトリ皿を覆い尽くす。集落表面は
平坦で厚く培養初期には白色であるが、胞
子、胞子のうが形成され成熟するにつれて
次第に灰色ないし黒色となる。胞子のう、
胞子は非常に多く形成される。集落周辺部
はくもの巣状でペトリ皿や試験管壁面迄付
着して這い上がる。裏面の色は無色ないし
薄黄色。拡散性色素および浸出液は産出し
ない。芳香を放つ。25℃ではやや生育が遅
い。 () Y_pS_s寒天培地上麦芽エキス寒天培地と概ね同様である。 () ポテト・グルコース寒天培地上麦芽エキス寒天培地と概ね同様である。 () ツアペツク寒天培地上ほとんど生育しない。 (b) 顕微鏡的観察胞子のうは薄膜に包まれており、成熟する
と袋が破れて中の多数の胞子が弾け出る。胞
子のうは直径30−200μ。球形。胞子は7.5×
15μ。楕円形で表面は平滑、少ししわがあ
る。基中菌糸は仮根（rhigoid）を形成し、
分生子柄は互いにストロン（stolon）で連結
している。隔壁（septa）は有しない。胞子
のう柄の先端に柱軸（columella）を形成す
る。生理的性質 (a) 生育温度範囲 40−48℃（ポテト・グルコース寒天培地上）胞子のう着生14−39℃（同上培地）至適温度：33℃（同上培地） (b) ペツフアー氏液（Pfeffer solution）で10
℃では生育しない。25−42℃で生育する。 (c) 生育PH範囲PH2.5−12.0（麦芽汁およびY_pS_s
寒天培地上） (d) 有機酸を生産する。以上の実験結果より総合的に判断するNo.Ｆ−
1360株は接合菌類Rhizopus属の１菌種であると
考えられる。従つて、このNo.Ｆ−1360株をリゾプ
ス・エスピーNo.Ｆ−1360（Rhizopus sp.No.Ｆ−
1360）と命名した。このリゾプス・エスピーNo.Ｆ−1360はアメリカ
ン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンに寄託番
号ATCCNo.20577として寄託されている。また、
このリゾプス・エスピーNo.Ｆ−1360は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第5362号とし
て寄託されている。この発明で使用するFR−900216物質生産菌、
例えばリゾプス属に属するFR−900216物質生産
菌は、例えばＸ線、紫外線などの照射処理、例え
ばナイトロジエン・マスタード、アゼセリン、亜
硝酸、２−アミノプリン、Ｎ−メチル−N′−ニ
トローＮ−ニトロソグアニジン（NTG）などの
変異誘起剤による処理、フアージ接触、形質転
換、形質導入、接合などの通常用いられる菌株変
異処理方法により、FR−900216物質の生産能を
高めることができる。リゾプス属に属するFR−900216物質の生産菌
を培地に培養することにより行なわれるFR−
900216物質の生産は原則的には一般微生物の培養
方法に準ずるが、通常は液体培地による深部培養
法が有利である。培地に用いられる培地として
は、リゾプス属に属するFR−900216物質生産菌
が利用する栄養源を含有する培地であればよい。
すなわち、合成培地、半合成培地あるいは天然培
地が用いられ、培地組成は炭素源としては、例え
ばグルコース、シユークロース、マルトース、グ
リセリン、でん粉、液化でん粉等が用いられ、窒
素源として、例えば肉エキス、カゼイン加水分解
物、ペプトン、グルテンミール、コーンミール、
綿実粕、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵
母、酵母エキス、尿素、りん酸アンモニウム等が
用いられる。このほか、例えばりん酸水素２ナト
リウム、りん酸２水素カリウム、塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の無機
塩も必要に応じて培地に添加される。また、培養中発泡の著しい時には、例えば大豆
油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テ
トラデカノール、ヘプタノール等の高級アルコー
ル類、シリコン化合物の消泡剤を適宜添加すれば
よい。培養温度は30℃前後が適用であり、培養容量の
増大に従つて適宜種培養を行なうと好結果が得ら
れることが多い。本培養の培養時間は50〜100時
間位が適当であり、培地が濃厚になるのに従つ
て、培養時間をさらに延長してもよい。以上述べた培養条件は使用生産菌株の特性に応
じてそれぞれの最適の条件を選択して適用され
る。次に、培養により生成したFR−900216物質は
通常、培養物中の菌体内および菌体外の両方に蓄
積されることが多いので、一般には遠心分離、ろ
過等の手段により、菌体およびろ液（上澄液）に
分離した後、双方から一般抗生物質の製造に用い
られる手段により分離、精製および採取される。
すなわち、通常、菌体内の目的物質は溶媒抽出等
の抽出手段により菌体から分離抽出される。そし
てこの抽出物および上記ろ液（上澄液）に減圧濃
縮、溶媒抽出、液性変換、例えば陰イオン交換樹
脂、陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の
樹脂による処理、例えば活性炭、けい酸、シリカ
ゲル、アルミナ、セルロース等の吸着剤による処
理、結晶化、再結晶等の手段を任意の順序に組合
せまたは反復して適用することにより、FR−
900216物質を分離、精製することができる。また、このようにして得られたFR−900216物
質を常法により処理することによつてその医療と
して許容され得ることができる。そのようなFR−900216物質の医薬として許容
され得る塩としては例えば無機もしくは有機酸と
の酸付加塩（例えば、酢酸塩、乳酸塩、マレイン
酸塩、フマール酸塩、修酸塩、くえん酸塩、メタ
ンスルホン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん
酸塩等）等が挙げられる。次にFR−900216物質の抗腫瘍作用を試験例に
よつて説明する。試験例１マウス白血病L1210およびP388に対する抗腫瘍
作用： (1) 腹腔内投与：試験法マウス白血病L1210およびP388それぞれ
DBA／マウスに継代移植し移植後７日目の腹
腔より腹水を採取し、その腫瘍細胞を分離し、
さらに細胞数を調整し、細胞浮遊液とした。そ
の浮遊液の0.2ml（L1210では10⁵細胞、P388で
は10⁶細胞）をBDF₁マウス（L1210の実験で
は、体重17.9−21.7ｇの７週令雌、P388の実験
では体重18.4−22.5ｇの８週令雌）の腹腔内に
移植した。FR−900216物質はメタノールに溶
解した後濃縮し、濃縮物を水に溶解して水溶液
とし、所定量１日１回４日間上記の腫瘍細胞を
移植したマウスの腹腔内に投与した。抗腫瘍活
性は各群の平均生存日数（Ｔ）の対照群の平均
生存日数(C)に対する百分率（Ｔ／Ｃ×100）で
示した。結果表１に示した。

【表】 (2) 経口投与：試験法：マウス白血病L1210をDBA／２マウスに継
代移植し移植後７日目の腹腔より腹水を採取
し、その腫瘍細胞を分離し、さらに細胞数を調
整し、細胞浮遊液とした。その浮遊液の0.2ml
（L1210では10⁵細胞、P388では10⁶細胞）を
BDF₁マウス（体重17.9−21.7ｇの７週令雌）
の腹腔内に移植した。FR−900216物質はメタ
ノールに溶解した後濃縮し、濃縮物を水に溶解
して水溶液とし、所定量１日１回４日間上記の
腫瘍細胞を移植したマウスに経口投与した。抗
腫瘍活性は各群の平均生存日数（Ｔ）の対照群
の平均日数(C)に対する百分率（Ｔ／Ｃ×100）
で示した。結果表２に示した。

【表】試験例２マウスメラノーマB16に対する抗腫瘍作用試験法マウスメラノーマB16をDBA／２マウスに継
代移植し、移植後14日目の皮下より腫瘍を無菌的
に採取し、その１ｇをハンクス液10mlに混合し、
ホモジナイズした。この0.5mlをBDF₁マウス（体
重19.7−24.8ｇの12週令雌）の腹腔に移植した
後、メタノールに溶解後濃縮し、濃縮物を水に溶
解して調製したFR−900216物質の水溶液の所定
量を１日１回４日間腹腔内に投与した。抗腫瘍活
性は試験例１と同様に算出した。結果表３に示した。

【表】試験例３ヒト乳癌由来ヌードマウス移植癌MX−１に対
する抗腫瘍作用：試験法 MX−１腫瘍移植後約１か月のSwiss−nu／nu
マウスを殺し、腫瘤を無菌的に剔出した。壊死部
を除去した後、ハンクス液で２−３mm角に鋏で細
切した後、腎皮膜に移植した。腫瘍移植後約２週
間後腫瘍体積が約100mm³に達した時期から、メタ
ノールに溶解後濃縮し、濃縮物を水に溶解して調
製したFR−900216物質の水溶液の所定量を４日
おきに腹腔内投与し、投与終了14日後に判定し
た。効果の判定は、各マウスの薬剤投与開始日の
腫瘍体積Voと、各マウスの効果判定日の腫瘍体
積Ｖを求め、相対比Ｖ／Voを計算する。効果判
定日の対照群、薬剤投与群のＶ／Voの平均値を
各々Cn、TnとするTn／Cn×100を治療効果の指
標とする。その結果は、表４に示した。

【表】なお、FR−900216物質の急性毒性は下記の通
りであつた。マウス（ddY） LD₅₀ 2.5mg／Kg（腹腔内）このようにFR−900216物質は優れた抗腫瘍作
用を有する。この発明の目的化合物であるFR−900216物質
またはその医薬として許容され得る塩を腫瘍の治
療目的で投与するに当つては、FR−900216物質
を有効成分とし、これに医薬上許容される担体、
例えば経口もしくは非経口の有機もしくは無機、
固体または液体の賦形剤を加えた製剤の形で使用
できる。このような製剤としては、カプセル、錠
剤、顆粒剤などの固体製剤および液剤、けんだく
剤、乳剤などの液体製剤のほか坐剤などが含まれ
る。さらに必要に応じて前記製剤中に補助剤、安
定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、その他繁用され
る添加剤を含有させることができる。FR−
900216物質またはその医薬として許容し得る塩の
投与量は患者の年令、状態、疾病の種類および病
状により異なるが、この発明の化合物を平均１回
につき、約100mg、200mg、400mgまたは1600mgの
量を投与すれば、腫瘍の治療に有効である。一般
にFR−900216物質またはその医薬として許容し
得る塩は１日当り約200mgないし4000mg、場合に
よつてはそれ以上の量で投与することができる。次にFR−900216物質の製造例を説明する。製造例１コーンスターチ１％、グルコース0.5％、グル
テンミール１％、乾燥酵母１％、コーンスチープ
リカー１％の組成の培地（滅菌前PH7.0）を275ml
容広口エルレンマイヤーフラスコ６本にそれぞれ
80mlずつ分注し、120℃で30分間滅菌する。これ
らにリゾプス・エスピーNo.Ｆ−1360の斜面培養物
をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、ロータリーシエ
イカーで毎分250回転、30℃で48時間培養を行う。
別に可溶性でん粉２％、グリセリン0.5％、グル
テンミール１％、乾燥酵母１％、コーンスチープ
リカー１％の組成の培地（PH7.0）20を30容
ジヤーフアーメンターに注入し、120℃で30分間
滅菌する。次いで、これに上記培養物の全量を接
種し、通気1VVM、撹拌速度毎分200回転、培養
温度30℃で24時間培養し、これを種培養とする。さらに、可溶性でん粉２％、グリセリン0.5％、
乾燥酵母１％、綿実粕１％、大豆粉0.5％、炭酸
カルシウム１％の組成の培地（PH7.0）15を200
容ジヤーフアーメンターに注入し、120℃で30
分間滅菌する。これに上記種培養物８を接種
し、通気量0.7VVM、撹拌速度毎分250回転、培
養温度30℃で72時間培養する。培養終了後、培養
物にけい藻土５Kgを加えてろ過する。得られた菌
体を含むケーキに酢酸エチル80を加えて撹拌
し、次いで酢酸エチル層を分取する。この菌体か
らの有効性分の抽出操作を再度くり返し、得られ
た酢酸エチル抽出物を１まで減圧濃縮する。濃
縮物を0.5％重曹水500mlで洗浄して酢酸エチル層
を分取する。この酢酸エチル層を無水硫酸ナトリ
ウムで脱水し300mlまで濃縮する。この濃縮物を
シリカゲルクロマトグライー（シリカゲル：2500
ml）に付し、クロロホルムでカラムを洗浄後、ク
ロロホルムとメタノールの混液（100：１）で溶
出する。目的物を含むクロロホルムメタノール溶
出画分（10）を減圧濃縮し、約20mlにまで濃縮
しヘキサン1.5を加えて、得られる沈澱をろ過
して集め、乾燥して目的物を含む粗粉末1.1ｇを
得る。この粗粉末を100mlのメタノールに溶解し
てNSゲル（日本精密化学社製）を用いた逆相ク
ロマトグラフイー（NSゲル：1500ml）に付し、
メタノールで溶出し細かく分画する。目的物を含
む溶出画分（800ml）を減圧濃縮し、約10mlにま
で濃縮しヘキサン１を加えて、得られる沈澱を
ろ過して集め、粉末630mgを得る。この粉末をシ
リカゲル薄層クロマトグラフイーに付し、クロロ
ホルムとメタノールの混液（20：１）で展開し、
目的物を含む画分をかきとつてクロロホルムメタ
ノール混液（10：１）で溶出する。溶出液80mlを
減圧濃縮し約５mlにまで濃縮してヘキサン500ml
を加えて得られる沈澱をろ過して集め、FR−
900216物質の白色粉末300mgを得る。元素分析値（％）：C66.30、H7.61、N2.18 製造例２コーンスターチ１％、グルコース0.5％、グル
テンミール１％、乾燥酵母１％、コーンスチープ
リカー１％の組成の培地（減菌前PH7.0）を275ml
容広口エルレンマイヤーフラスコ６本にそれぞれ
80mlずつ分注し、120℃で30分間減菌する。これ
らにリゾブス・エスピーNo.Ｆ−1360の斜面培養物
をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、ロータリーシエ
イカーで毎分250回転、30℃で48時間培養を行う。
別に可溶性でん粉２％、グリセリン１％、グルコ
ース0.5％、グルテンミール１％、乾燥酵母１％、
コーンスチープリカー１％の組成の培地（PH7.0）
20を20容ジヤーフアーメンターに注入し、
120℃で30分間滅菌する。次いで、これに上記培
養物の全量を接種し、通気量1VVM、撹拌速度
毎分200回転、培養温度30℃で24時間培養しこれ
を種培養とする。さらに可溶性でん粉２％、グリセリン１％、乾
燥酵母１％、綿実粕１％、大豆粉0.5％、炭酸カ
ルシウム１％の組成の培地（PH7.0）150を200
容ジヤーフアーメンターに注入し、120℃で30
分間滅菌する。これに上記種培養物８を接種
し、通気量0.7VVM、撹拌速度毎分250回転、培
養温度30℃で72時間培養する。培養終了後、培養物にけい藻土５Kgを加えてろ
過する。得られた菌体を含むケーキに酢酸エチル
80を加え、撹拌した後濾過する。この操作を再
度くり返し、得られた酢酸エチル抽出物を１ま
で減圧濃縮する。濃縮物を0.5％重曹水500mlで洗
浄して酢酸エチル曹を分取する。この酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで脱水し300mlまで濃縮
する。この濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフイー（シリカゲル：2500ml）に付し、クロロ
ホルムでカラムを洗浄後、クロロホルムとメタノ
ールの混液（100：１）で溶出する。目的物を含
むクロロホルムメタノール溶出画分（10）を減
圧濃縮し、約50mlにまで濃縮しヘキサン２を加
えて、得られる沈澱をろ過して集め、乾燥して目
的物を含む粗粉末2.5ｇを得る。この粗粉末を大
量分取用高速液体クロマトグラフ（日本ウオータ
ーズリミテツド社製、使用カラムはプレパツク
500／シリカ）にかけてクロロホルム−メタノー
ルの混液（100：1.5）の溶媒系を用いて活性画分
を得る。得られた活性画分を減圧濃縮し、ヘキサ
ン100mlを加えて、得られる沈澱をろ過して集め、
乾燥して粉末1.2ｇを得る。この粉末を再び同一
条件で大量分取用高速液体クロマトグラフにかけ
て同一処理をおこなうとFR−900216物質の白色
粉末500mgを得る。

【図面の簡単な説明】

図面はFR−900216物質の水素の核磁気共鳴吸
収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記構造式を有するFR−900216物質またはその医薬として
許容され得る塩を含有することを特徴とする抗腫
瘍剤。