JPH0425950B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は新規な制癌性抗生物質83−16−ａお
よびその製造法に関する。 従来の技術 ストレプトマイセス属が生産するマイコトリ
エニン類抗生物質としては、マイコトリエニン
、（J.Antiotics35、1460、1982）あるい
はアンサトリエニンA₂、A₃（J.Antibiotics36、
187、1983）があげられる。これら抗生物質は、
各種の真菌類に対して抗真菌活性を示すが、抗
生物質83−16−ａは抗真菌活性を示さないにも
かかわらず、人の培養癌細胞（HeLa S₃細胞）
に強い殺細胞作用を有し、又、マウス腫瘍に対
して抗腫瘍効果を示す。更に抗生物質83−16−
ａはマウスに対する急性毒性がマイコトリエニ
ン類より低く、100mg／Kg腹腔投与しても特に
毒性は観察されなかつた。このように効果の特
異な低毒性物質は知られていない。 発明が解決しようとする問題点 本発明は放線菌が生産し、医療用として有用
な新規抗生物質を得ることを目的とする。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、新規な抗生物質を探索を目的
として種々の土壌から菌株を分離し、その生産
する代謝産物について研究を続けた結果、新潟
県で採取した土壌から分離した菌株83−16の培
養物中に、一部の真菌類に対して抗菌活性を示
し、しかもサルコーマ180腫瘍細胞および
HelaS₃細胞に増殖抑制作用を有する物質が生
産されることを見出した。そして該培養物か
ら、HeLa細胞増殖抑制活性物質を分離、精製
し、その理化学的性質を調べた結果、後述の如
くこの理化学的性質を有する物質は他に見当ら
ないことから、この物質を新規物質であると判
断し、抗生物質83−16−ａと呼称することにし
た。 本発明はかかる新知見に基いて完成されたも
のであつて、新規な制癌性抗生物質83−16−ａ
またはその塩およびそれらの製造法を提供する
ものである。 本発明の抗生物83−16−ａは、ストレプトマ
イセス属に属する抗生物質83−16−ａ生産菌を
培地に培養して培養中に抗生物質83−16−ａを
蓄積せしめ、その培養物から抗生物質83−16−
ａを採取することにより製造される。 本発明で使用される抗生物質83−16−ａ生産
菌は、ストレプトマイセス属に属するが、例え
ば、本発明者が分離したストレプトマイセス属
に属する菌株83−16は、本発明に最も有効に使
用される菌株の一例であつて、本菌株の菌学的
特徴を示すと次の通りである。 株の菌学的特徴を示すと次の通りである。 ａ 形態的特徴 83−16菌株はワツクスマン寒天平板培地上で
27℃、14日間静置培養後の観察では、菌糸状に
発育し、その基底菌糸は分断することはなく、
気菌糸は不規則に分岐し、輪生状に分岐するこ
とはなく、その先端には、胞子嚢は認められ
ず、20個以上鎖状につながつた、ほぼ直線状の
胞子鎖が認められる。大部分の胞子は、長径約
0.8〜1.0μｍ短径約0.5〜0.7μｍの楕円形ないし
筒形であり、その表面は粗面である。 ｂ 次の各培地における生育状態（27℃で14日間
培養後の各培地における生育状態）の観察は次
の通りである。

【表】 るか、または全然形成されない。
ｃ 次の各生理学的性質 生育温度範囲；20〜37℃で生育が可能であ
り、27℃付近が最適である。 ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地上）；凝陽性 スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒
天培地上）；陰性 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（10％スキム
ミルク倍地上）；ペプトン化凝陽性、脱脂牛
乳の凝固、陰性、 メラニン様色素の生成（チロシン寒天倍地
およびペプトン・イースト・鉄寒天倍地
上）；陽性 硫化水素の生成（ペプトン・イースト鉄寒
天倍地上）；陰性 亜硝酸塩の生成（硝酸塩倍地上）；陰性 ｄ 次の各炭素源の同化性（プリドハム・コ
ドリーブ寒天倍地上27℃で１〜２ヶ月後に観
察） Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ イノシトール ＋ Ｌ−ラノース ＋ ラフイノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ ｅ 細胞壁の組成 Beckerらの方法〔Appl.Microbiol.，13、
236〜243（1965）〕に基づいて分析した結果、
LL型のジアミピメリン酸が検出された。 以上の菌学的性質から、本83−16菌株はストレ
プトマイセス属に属する菌株であることは明らか
である。 なお、本菌株は工業技術院微生物工業研究所に
受託番号微工研第7981号（FEREM−PNO.7981）
として寄託されている。 以上、抗生物質83−16−ａ生産菌について説明
したが、放線菌の一般的性状として菌学上の性状
は極めて変異し易く、一定したものではなく、自
然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照
射または変異誘導剤例えばＮ−メチル−Ｎ−ニト
ロ−Ｎ−ニトロングアニジン、エチルメタンスル
ホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
することは周知の事実であり、この様な人工的変
異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプトマイ
セス属に属し、抗生物質83−16−ａを生産する能
力を有する菌株はすべて本発明に使用することが
できる。 本発明においては、先ずストレプトマイセス属
に属する抗生物質83−16−ａ生産菌が適当な倍地
に培養される。本菌の培養においては、通常放線
菌の培養が一般に用いられる。倍地としては、微
生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さ
らには必要に応じ無機塩などを含有させた栄養倍
地で培養される。同化し得る炭素源としては、ブ
ドウ糖、糖蜜、澱粉、デキストリン、セルロー
ス、コーン・ステーブ・リカー、グリセリン、有
機酸などが単独または組合わせて用いられる。消
化し得る窒素源としては、ペブトン、肉エキス、
酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・ステー
プ・リカー、線実粕、カゼイン、大豆蛋白分解
物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、
アンモニウム塩などの無機窒素化合物が単独また
は組合せて用いられる。その他、必要に応じナト
リウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、リン酸塩などの無機塩類が添加される。
さらに倍地には必要に応じて、本菌の生育や抗生
物質83−16−ａの生産を促進する微量栄養素、発
育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。 培養は通常振とうまたは通気撹拌培養などの好
気的条件下で行うのがよい。工業的には、深部通
気撹拌培養が好ましい。倍地のPHは中性付近で培
養を行うのが好ましい。培養温度は20〜37℃でも
行い得るが、通常は24〜30℃、好ましくは27℃付
近に保つのがよい。培養時間は、液体培養の場
合、通常３〜６日培養を行うと、本抗生物質が生
成蓄積される。好ましくは培養物中の蓄積量が最
大に達したときに培養を終了すればよい。これら
の培養組成、倍地の液性の培養温度、撹拌速度通
気量などの培養条件は、使用する菌株の種類や外
部の条件などに応じて、好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることは言うまでもな
い。液体培養において発泡があるときは、シリコ
ン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使
用する。 このようにして得られた培養物中に蓄積された
抗生物質83−16−ａは主として培養瀘液中に含有
されているので、培養物を必要に応じて濾過補助
剤、例えばセライト、ハイフロスーバーセルなど
を加えて濾過するか、または遠心分離して培養瀘
液と菌体に分離し、その培養瀘液から抗生物質83
−16−ａを採取するのが有利である。 培養瀘液から抗生物質83−16−ａを分離精製す
るためには、抗生物質83−16−ａが後述のよう
に、ヘキサン、水に不溶性であり、メタノール、
エタノールなどのアルコール系溶媒、ジクロルメ
タン、クロロホルムなどのクロロホルム系溶媒、
アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン
系溶媒などの多くの有機溶媒に可溶である弱酸性
物質であるので、これらの性質を利用した精製法
が用いられる。通常、培養瀘液を非親水性有機溶
媒、例えば、クロロホルム、ジクロルメタン、酢
酸エチル、酢酸ブチルなどで抽出することによ
り、抗生物質83−16−ａが有機溶媒層に転溶され
る。上記抽出操作を行う際、培養瀘液を予めPH
5.0〜7.0の範囲に調節するのが好ましい。 このようにして得られた有機溶媒層は、必要に
応じ、金属イオンなどを除去するために希薄なエ
チレンジアミン四酢酸塩水溶液で洗滌した後、
種々の脱水剤、例えば無水硫酸ナトリウム、無水
硫酸マグネシウムなどを加えて脱水される。脱水
された有機溶媒層は減圧下で有機溶媒が留去され
る。この濃縮操作において、抗生物質83−16−ａ
が分解するのを防ぐために、通常加熱温度が60℃
以下となるように行うのが好ましい。残渣にヘキ
サン、石油エーテルなどの有機溶倍を加えて抗生
物質83−16−ａを沈澱させることができる。得ら
れた沈澱物は、数回ヘキサンなどで洗滌後、吸引
濾過または遠心分離により、抗生物質83−16−ａ
を褐色の粗製物として採取することができる。 上記の粗製物をさらに精製するためには、抗生
物質83−16−ａ物質と混雑物との溶解度の差や、
混じり合わない二液相間の分配の差や、各種吸着
担体に対する吸着力の差を利用した多くの手段が
可能であるが、特にクロマトグラフイーは抗生物
質83−16−ａ物質の精製に有効な方法である。抗
生物質83−16−ａ物質の精製に有効なクロマトグ
ライーは、シリカゲル、アルミナ、活性炭、セル
ロース、ヒドロキシアパタイト、HP−20などの
吸着樹脂などによる吸着クロマトグラフイー、シ
ラン化シリカゲル、オクタデシルシラン化シリカ
ゲルなどを用いる逆相分配クロマトグラフイー、
セフアデツクスLH−20、トヨパールなどを用い
た分子ふるいに基づくゲル濾過クロマトグラフイ
ー、DEAEセルロース、DEAEセフアデツクス、
DEAEトヨパールなどを用いられるイオン交換ク
ロマトグラフイーなどが挙げられる。 抗生物質83−16−ａは、これらのクロマトグラ
フイーや電気泳動、向流分配、限外濾過、蒸溜な
どの手段を単独あるいは任意の順序にて組合せ、
または反復して用いることにより分離精製するこ
とができる。例えば上記粗製物を少量のクロロホ
ルム、ベンゼンなどに溶かし、これを予め充填さ
れたシリカゲルのカラムに吸着させ、ベンゼン−
アセトン系混合溶媒を用いてカラムクロマトグラ
フイーを行い、その活性画分を集め減圧濃縮せし
める。これをさらに少量のクロロホルムなどに溶
かし、シリカゲルカラムに吸着させ、クロロホル
ム−メタノール系混合溶媒を用いてカラムクロマ
トグラフイーを行い、その活性画分を減圧濃縮
後、少量のメタノールに溶かし、これを逆層シリ
カゲルカラムに乗せ、メタノール、水系混合溶媒
でカラムクロマトグラフフイーを行うことによ
り、抗生物質83−16−ａを分離し、精製すること
ができる。 このようにして得られた抗生物質83−16−ａは
弱酸性物質であるから、公知の方法により塩、例
えば、ナトリウム塩カルシウム塩、マグネシウム
塩などを形成し得る。 次に本抗生物質83−16−ａの理化学的性質につ
いて述べる。 組成 C₃₆H₅₀N₂O₇（高分解能マス・スペストルによ
る） 分子量 622〔フイールド・デソープシヨン（FD）・マ
ス・スペクトルによる〕 融点 131℃（128℃から一部湿潤し始め、132℃で
ほぼ液化したが、褐変しない） 比旋光度 〔α〕²⁰ _D＋174°（Ｃ＝0.1、メタノール） 紫外線吸収スペクトル（メタノール中）第１
図の通りであつて、 λ^MeOH _nax282、271、260nm 赤外部吸収スペクトル（KBrデイスク法） 第２図の通りであつて、 3400、2940、1730、1650、1620、1540、
1450、1300、1205、1160、1090、1000cm^-1に極
大吸収帯を有する、 溶媒に対する溶解性 ヘキサン、水に不溶、クロロホルム、ジクロ
ロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、
酢酸ブチル、アセトン、メタノール、エタノー
ルに可溶、 呈色反応 ヨード反応および硫酸発色反応は陽性、ニン
ヒドリン反応、ドラゲンドルフ反応、塩化第二
鉄反応は陰性、 塩基性、酸性、中性の区別 弱酸性物質、 物質の色および形状 無色の不安形粉末 〓 ブロトン核磁気共鳴スペクトル〔CDCl₃中、
トリメチルシラン（TMS）基準〕 第３図の通り、 〓 Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中、
TMS基準） 第４図の通り、 〓 マス・スペクトル 主なマス・フラグメント・ピークを下記に示
す（EI−MS法） ｍ／z622、604、590、572、423、405、391、
373、199、155、111、83 〓 シリカゲル薄層クロマトグラフイー（TLC）
担体としてメルク社製Kieselgel60F₂₅₄を用い
る下記の展開溶媒におけるRf値を示す。 展開溶媒 Rf値 クロロホルム−メタノール（９：１） 0.47 クロロホルム−メタノール（19：１） 0.26 トルエン−アセトン（６：４） 0.31 ベンゼン−酢酸エチル（１：１） 0.24 〓 酸、アルカリに対する安定性 酸性下では常温で安定、塩基性（PH10以上）
下では不安定、 以上述べた抗生物質83−16−ａ物質の理化学的性
質に比較的類似した既知抗生物質として、第２表
の通り、マイコトリエニン（アンサトリエニン
Ａ）、マイコトリエニン（アンサトリエニン
Ｂ）、アンサトリエニンA₂、アンサトリエニン
A₃、アンサトリエノンＡが挙げられるが、抗生
物質83−16−ａ物質とは、分子組成、分子式、核
磁気共鳴スペクトルが明らかに異つており、抗生
物質83−16−ａ物質は新規抗生物質と認められ
る。 第２表 Mycotrienin C₃₆H₄₈N₂O₈ 366 Mycotrienin C₃₆H₄₈N₂O₈ 638 Ansatrienin Ａ C₃₆H₄₈N₂O₈ 636 Ansatrienin Ｂ C₃₆H₅₀N₂O₈ 638 Ansatrienin A₂ C₃₄H₄₆N₂O₈ 610 Ansatrienin A₃ C₃₄H₄₆N₂O₈ 610 Anatrienin Ａ C₃₆H₄₈N₂O₈ 634 （Mycotrienin とAnatrienin Ａ、
Mycotrienin とAnatrienin Ｂとは同一物質
である。 本発明の抗生物質83−16−ａは下記の化学構造
式を有するものと認められた。 作 用 本発明の抗生物質83−16−ａの生物学的性質に
ついて述べる。 (1) 抗菌、抗真菌スペクトル ペーパーデイスク法による微生物生育最小濃
度（MIC）は第３表に示す通りである。

【表】 (2) HeLaS₃細胞に対する殺細胞作用 ４×10⁴個のHeLaS₃細胞を、細胞培養器中で
26日間培養せしめ、抗生物質83−16−ａを培地
中に添加し、更に３日間培養してその細胞数を
計測したところ、HeLa S₃細胞の50％致死量
は、約0.07μｇ／mlであつた。また抗生物質83
−16−ａを1.0μｇ／mlになるように添加した場
合は、ほとんどのHeLa S₃細胞は死滅した。 (3) 抗腫瘍活性 サルコーマ180腫瘍をICRマウスの腹腔に移
植し、抗生物質83−16−ａを１〜５日７〜11日
腹腔内投与したところ、10mg／Kg／dayで33
％、また20mg／Kg／dayで76％の延命率が認め
られた。 発明の効果 本発明の抗生物質83−16−ａは第３表で示す如
く、多くのグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵
母および真菌類に対して抗菌活性を示さず、一部
の真菌類、例えばピリキユラリア・オリゼエに対
してMICmg／mlの弱い抗真菌活性しか示さない
が、HeLaS₃細胞およびサルコーマ180腫瘍細胞
に対して増殖抑制活性を有し、制癌剤として有用
な物質である。 実施例 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これにより本発明を限定するものではな
い。 実施例 １ 83−16−ａ生産菌の培養 500ml容三角フラスコにグルコース2.0％、ペブ
トン0.5％、肉エキス0.5％、乾燥酵母0.3％、食塩
0.5％、炭酸カルシウム0.3％を含む液体培地（PH
7.0）〔Ａ培地〕100mlを減菌し、これにグルコー
ス1.0％、ププトン0.5％、肉エキス5.0％、食塩
0.3％、寒天1.2％を含む寒天斜面培地上に27℃で
14日間培養したストレプトマイセスSP、NO、83
−16（FERM−P7981）の斜面培養から１白金耳
を接種し、振幅17cm毎分120回往復するレシプロ
カル・シエーカーで、27℃で721時間振とう培養
して種母を得た。次に、200容ジヤー・フアー
メンターにＡ培地120を仕込み減菌した後、上
記方法で得られた種母2.5を無菌的に移植し、
28℃で毎分60の空気を通気し、撹拌しながら３
日間培養して、培養液約110を得た。 実施例 ２ 培養物からの抗生物質83−16−ａの抽出 実施例１で得られた培養液に、約５Kgのハイフ
ロスーパーセルを加え吸引濾過し、その濾過約
105を6N塩酸でPHを６付近に調整した後、60
の酢酸エチルを加え撹拌して、抗生物質83−16−
ａを酢酸エチル層に転溶させた。水層と酢酸エチ
ル層とを分液した後、水槽に再び60の酢酸エチ
ルを加えて抗生物質83−16−ａを転溶させた。次
に両酢酸エチル層を合せて約４になるまで減圧
濃縮し、濃縮液を２の脱イオン水で洗浄した
後、有機溶培層に無水硫酸ナトリウムを加え脱水
し、溶媒を減圧下で留去して抗生物質83−16−ａ
を含有する油状物約30ｇを得た。 実施例 ３ シリカゲルクロマトグラフイーによる抗生物質
83−16−ａの精製。 実施例２で得られた油状物を、予めベンゼンを
用いて充填されたシリカゲル60（メルク社製）カ
ラム（4.6×60cm）に吸着せしめ、展開、溶出溶
媒を、ベンゼンからアセトンに連続的に変化させ
ることによりクロマトグラフイーを行つた。溶出
液のうち、HeLa細胞に対し殺細胞活性のあるフ
ラクシヨンを集めて減圧濃縮し、残渣を予めクロ
ロホルムを用いて充填されたシリカゲルカラムに
再び吸着させ、展開溶倍をクロロホルムからクロ
ロホルム：メタノール（１：１）混合溶媒に連続
的に変えることによりクロマトグラフイーを行
い、得られた活性画分を減圧濃縮して、純度約50
％程度の抗生物質83−16−ａ約200mgを得た。 実施例 ４ 高速液体クロマトグラフイーまたは分取・薄層
シリカゲルクロマトグラフイーによる抗生物質
83−16−ａ物質の単離 抗生物質83−16−ａ物質の純品を得るために
は、高速液体クロマトグラフイー、あるいは分取
薄層シリカゲルクロマトグラフイーにより分離精
製した。高速液体クロマトグラフイーでは、送液
ポンプとしてTRIROTAR−Ｖ（日本分光）、検出
機としてUVIDEC−100−Ｖ（日本分光）、カラム
は、オクタデンルシラン化シリカゲルのYMCパ
ツクカラムＡ−324、内径10mm×長さ300mm（山村
化研究所）を用いた。実施例３で得られた抗生物
質83−16−ａ粗精製物約５mgをメタノール100μ
に溶解させたサンプルをインジエクトし、展開
溶媒として水：メタノール＝36：64混合溶媒を用
い、波長272nmの紫外部吸収で抗生物質83−16−
ａに該当するピークを集めた。この画分を減圧濃
縮してメタノールを除いた後、クロロホルムを加
え抗生物質83−16−ａをクロロホルムに転溶さ
せ、精製水でクロロホルム層を洗浄し、次に無水
硫酸ナトリウムで脱水してクロロホルム層を減圧
濃縮乾固して抗生物質83−16−ａの純品約2.0mg
を得た。 分取薄層クロマトグラフイーを薄層クロマトグ
ラフイー用プレートとして、シリカゲル60F₂₅₄、
20cm×20cm（メルク社製）を用い、20mgの抗生物
質83−16−ａ粗精製物を少量のクロロホルムに溶
かしたものを、シリカゲルプレートに帯状にスポ
ツトして、クロロホルム、メタノール＝19：１混
液で展開して、紫外線ランプ下で検出され得る抗
生物質83−16−ａのスポツトを掻き取つた。次に
掻き都つたシリカゲルをアセトンで抗生物質83−
16−ａを抽出し、その抽出液を減圧乾固して抗生
物質83−16−ａの純品約９mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質83−16−ａの紫外線吸収スペ
クトル、第２図は該抗生物質の赤外線吸収スペク
トル、第３図は該抗生物質のプロトン核磁気共鳴
スペクトル、第４図は該抗生物質の核磁気共鳴ス
ペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式、 で表される新規な抗生物質83−16−ａまたはそ
   の塩。 ２ ストレプトマイセス属に属する抗生物質83
   −16−ａ生産菌を培地に培養して培養物中に抗
   生物質83−16−ａを蓄積せしめ、その培養物か
   ら抗生物質83−16−ａを採取することを特徴と
   する新規抗生物質83−16−ａまたはその塩の製
   造法。 ３ 抗生物質83−16−ａの生産菌がストレプト
   マイセス・スピーシーズ83−16株（FERM Ｐ
   −7981）である特許請求の範囲第２項に記載の
   製造法。