NL1001012C2 - Antibioticum WAP-8294A, werkwijze voor de bereiding daarvan alsmede antibacteriële samenstelling. - Google Patents

Description

0 "ANTIBIOTICUM WAP-8294A, WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING DAARVAN ALSMEDE ANTIBACTERIELE SAMENSTELLING"

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw antibioticum, WAP-8294A, dat geschikt is als middel voor het behandelen van ziekten die het gevolg zijn van infectie met pathogene micro-organismes, alsmede op een werkwijze voor 5 het bereiden daarvan en de toepassing daarvan.

Sinds de geschiedenis van chemotherapeutische middelen voor bacteriêle infectieziekten begon met de synthese van kinine en salvarsan en de ontdekking van penicilline, is de mens begunstigd geweest met deze chemotherapeutische midde-10 len. Niet zo lang geleden is echter naar voren gekomen dat het bestaan van deze chemotherapeutische middelen leidt tot de vorming van resistente bacteriën, zoals wordt geïllustreerd door de infectieziekte met MRSA (methicilline-resis-tent Staphylococcus aureus), tegen welke ziekte chemothera-15 peutische middelen anders dan vancomycine en habekacine niet effectief zijn. Dit leidt tot verwarring in het gebied van de medische behandeling en levert een ernstig sociaal probleem op.

Vancomycine als antibioticum, werd ontwikkeld door Eli 20 Lilly & Co. in de Verenigde Staten, en is toegepast voor het behandelen van MRSA infectieziekten, maar een dergelijke behandeling wordt vaak vergezeld door nefrotoxiciteit, hepatotoxiciteit en zeis aandoeningen (autotoxiciteit) van 1001012 2 de craniale zenuw VIII (nervus octavus). Deze behandeling benodigd voorts een lange tijd voor het uitvoeren van pasteurisatie en er is de verdenking gerezen dat bacteriën die resistent zijn tegen dit antibioticum opnieuw voorkomen.

5 Aan de andere kant is habekacine een chemisch bereid antibioticum dat het skelet heeft van kanamycine als één van de aminoglycoside antibiotica, en heeft een uitstekende antibiotische werking alsmede een effect op verschillende soorten resistentie bacteriën. Dienovereenkomstig wordt het 10 gebruikt als één van een beperkt aantal chemotherapeutische middelen voor het behandelen van MRSA infectieziekten, maar de toepassing daarvan kan soms vergezeld worden door ernstige nefrotoxiciteit en craniale zenuw VIII-aandoeningen (autotoxiciteit) als bijwerkingen, die typerend zijn voor de 15 aminoglycoside antibiotica. Derhalve is het, gezien vanuit de medische behandelingen, niet noodzakelijkerwijze een veilig antibioticum.

Onder dergelijke omstandigheden is altijd de wens naar voren gekomen vcor de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe 20 chemotherapeutische middelen met lage toxiciteit, die een antibiotische werking vertonen binnen een korte tijdsspanne en vrijwel geen bij-effecten vertonen. Veel onderzoekingen zijn dan ook verricht om dit probleem op te lossen.

Doel van de onderhavige uitvinding is dan ook te voor-25 zien in een nieuw antibioticum met antibacteriële werking, welke voldoet aan de hiervoorgenoemde vereisten. Een ander doel van de onderhavige uitvinding is te voorzien in een werkwijze voor het bereiden van dit antibioticum. Nog een ander doel van de onderhavige uitvinding is te voorzien in 30 een klinisch geschikt chemotherapeutisch middel dat een lage toxiciteit vertoont of een toxiciteit die zeer selectief is.

De uitvinders van de onderhavige uitvinding hebben verschillende studies uitgevoerd om een nieuw en geschikt antibioticum te ontwikkelen, met als resultaat dat zij erin 35 geslaagd zijn om een stam, behorende tot het genus Lvsobac-ter. te isoleren uit de aarde als nieuw micro-organisme, en hebben zij gevonden dat deze stam een antibioticum produceert dat nog niet in de literatuur beschreven is. Op deze 10010 12 3 wijze hebben zij de onderhavige uitvinding tot stand gebracht .

De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op het antibioticum WAP-8294A, of farmaceutisch aanvaardbare 5 zouten daarvan, met de fysicochemische eigenschappen die in het volgende nader zullen worden toegelicht. De onderhavige uitvinding voorziet tevens in een werkwijze voor het bereiden van dit genoemde antibioticum WAP-8294A, welke werkwijze de stappen omvat van het kweken, in een kweekmedium, van een 10 micro-organisme dat behoort tot het genus Lvsobacter en dat de mogelijkheid heeft tot het produceren van het antibioticum WAP-8294A, waarbij het antibioticum geproduceerd wordt, en het verzamelen van dit antibioticum in het kweekmedium; en vervolgens het winnen van het antibioticum. Verder heeft 15 de uitvinding betrekking op het micro-organisme, behorende bij het genus Lvsobacter, dat in staat is tot het produceren van het antibioticum WAP-8294A. En tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een antibacteriële samenstelling welke tenminste één lid gekozen uit de groep bestaande uit het 20 antibioticum WAP-8294A en farmaceutisch aanvaardbare zouten da a rvan, omva t.

Beschrijving van de tekeningen

Fig. 1 is een chromatogram dat zichtbaar wordt indien 25 het antibioticum WAP-8294A gescheiden wordt in een serie van fracties, door middel van "high performance liquid chromatography" (HPLC).

Fig. 2 is een weergave van een UV-absorptiespectrum (in water) van het antibioticum WAP-8294A (hydrochloride).

30 Fig. 3 is een weergave van het IR-absorptiespectrum (FT-IR, KBr) van het antibioticum WAP-8294A (hydrochloride).

Fig. 4 is een weergave van het 1H-NMR-spectrum (270 MHz, D20) van het antibioticum WAP-8294A (hydrochloride).

Fig. 5 is een weergave van een twee-dimensionaal TLC-35 chromatogram van het zuur-compleet hydrolysaat van het antibioticum WAP-8294A.

1001012 4 4

Fig. 6 is een chromatogram dat gezien wordt indien het antibioticum WAP-8294AX gescheiden wordt door middel van een "high performance liquid chromatography" (HPLC).

Fig. 7 is een weergave van het UV-absorptiespectrum (in 5 water) van het antibioticum WAP-8294AX-8 (hydrochloride).

Fig. 8 is een weergave van het IR-absorptiespectrum (FT-IR, KBr) van het antibioticum WAP-8294AX-8 (hydrochloride) .

Fig. 9 is een lH-NMR-spectrum (270 MHz, D20) van het 10 antibioticum WAP-8294AX-8 (hydrochloride).

Beschrijving van de voorkeursuitvoerinasvormen

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw antibioticum, WAP-8294A genaamd, dat gevonden wordt in het 15 kweekmedium van een nieuwe stam die behoort tot het genus Lysobacter. Dit antibioticum WAP-8294A kan verder worden onderverdeeld in tenminste 7 componenten genaamd AX, A1( A2, A3, A4. A5 en A6 en de componentn AX wordt verder gefractio-neerd in tenminste 13 componenten, genaamd AX-l, AX-2, ax-3. 20 AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12, AX- 13. De term "antibioticum WAP-8294A", hierin toegepast, heeft betrekking op de componenten AX, A1( A2, A3, A4. A5, A6, AX-l, AX-2, AX-3. AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12, AX-13 of een mengsel daarvan.

25 De onderhavige uitvinding omvat, naast het antibioticum WAP-8294A in de vrije vorm, eveneens farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan zoals hydrochlorides, sulfaten en me-thaansulfonaten.

Deze verbindingen vertonen een sterke antibacteriële 30 activiteit tegen gram-positieve bacteriën, in het bijzonder, tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA).

Het antibioticum WAP-8294A wordt gescheiden in fracties met retentietijden van 4,0 tot 6,1 minuten, 8,0 minuten, 11,1 minuten, 12,5 minuten, 16,5 minuten, 17,9 minuten en 35 18,8 minuten, gemeten onder eluerende omstandigheden voor de C18-omgekeerde fase ("reserse phase") silicagel-"high performance liquid chromatography" (C18-RP-silicagel-HPLC) [kolom: YMC A-312 (6 x 150 mm): mobiele fase: 0,05 % triflu- 1001012 5 orazijnzuur-bevattend acetonitril: water (45 : 55); detec-tiegolflengte : UV 214 nm; vloeistofsnelheid: 1 ml/min], dat wil zeggen, de componenten AX, A1( A2, A3, A4, As en A6 (Fig.

1) .

5 De fractie AX wordt, zoals is weergegeven in Fig. 6, verder gescheiden in fracties met retentietijden van 5,3 minuten, 5,9 minuten, 6,2 minuten, 6,5 minuten, 6,9 minuten, 7,3 minuten, 8,1 minuten, 9,3 minuten, 9,8 minuten, 11,3 minuten, 12,1 minuten, 13,7 minuten en 15,0 minuten, gemeten 10 onder eluerende omstandigheden in de Cie-RP silicagel HPLC [kolom: YMC A-312 (6 x 150 mm); mobiele fase: 0,05 % triflu-orazijnzuur-bevattend acetonitril:water (37:63); detectie-golflengte:UV 214 nm; vloeistofsnelheid: 1 ml per min.], dat wil zeggen, componenten AX-1, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, 15 AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 en AX-13.

De antibiotica WAP-8294A, A1( A2 en A„ hebben ultraviolet absorptiespectra (in water) bij Xmax 275 nm, 280 nm en 287 nm. Het ultraviolet absorptiespectrum van het antibioticum WAP-8294A2 wordt weergegeven in Fig. 2. Tevens wordt 20 duidelijk dat de antibiotica WAP-8294A, A1( A2 en A4 trypto-faan omvatten als chromofor in de moleculen, zoals bevestigd wordt door middel van de analyse van de zuurhydrolysaten daarvan, zoals later zal worden beschreven.

De infrarood absorptie spectroscopische analyse van de 25 antibiotica WAP-8294A, A1, A2 en A4 vertoont absorptie bij 3300 cm"1, toegeschreven aan OH- en NH-groepen; 1720 tot 1715 cm"1, toegeschreven aan carboxyl- of estercarbonyl-groepen; 1636 en 1541 cm"1 toegeschreven aan amido-bindin-gen; en 1207 en 1137 cm"1, toegeschreven aan de C-O-rek-30 vibraties, maar zij vertonen geen karakteristieke absorptie. Het IR-absorptiespectrum van het antibioticum WAP-8294A2 wordt weergegeven in Fig. 3.

In de 1H-NMR-spectroscopische meting van de antibiotica WAP-8294A, A1( A2 en A4, wordt een aantal gecompliceerde 35 protonsignalen gezien, welke afkomstig zijn van methyl, methyleen, methine, alsmede van heterocyclische of aromatische ringen. Het ^-NMR spectrum van het antibioticum WAP-8294A2 wordt weergegeven in Fig. 4.

1001012 6

De FAB-massa spectrometrische meting van WAP-8294Alf A2 en A4, geeft aan dat het (M+H)+-ion van de component A3 een m/z-waarde heeft van 1548,9, dat het (M+H)+-ion van de component A2 een m/z-waarde heeft van 1562,9 en dat het 5 (M+H)+-ion van de component A4 een m/z-waarde heeft van 1576,9. De resultaten van een natrium-smelt-test van de componenten Alf A2 en A4 maakt duidelijk dat deze componenten elk afzonderlijk een verbinding zijn welke koolstof, waterstof, zuurstof en stikstofelementen omvat. De volgende 10 moleculaire formules, weergegeven in Tabel 1, kunnen afgeleid worden uit deze feiten, terwijl tevens de structuur-schatting en molaire verhoudingen van alle aminozuren en vetzuren, die deze componenten vormen, zoals later zal worden uitgelegd, in aanmerking worden genomen, evenals de 15 resultaten van de hoge resolutie FAB-massa-spectrometrische metingen.

TABEL 1 2 0 Ai A2 A4 FAB-massa (Μ+ΗΓ 1548,9 1562,9 1576,9 FAB-massa (M-H)‘ 1546,7 1561,2 1575,4 Δ massa eenheid 14 massa 14 massa eenheden eenheden 25 A2------>A2 A3---->A4

Moleculair gewicht 1547,9 1561,9 1575,9 HR-FAB-massa 1458,8088 1562,8224 1576,8363

Moleculaire formule O72H109021N17 C73H113021N17 C74H113021Nl7 30 De antibiotica WAP-8294A, A1( A2 en A4 zijn positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, jood-damp, waterige oplossing van kaliumpermanganaat en zwavelzuur; en vertonen uitdelvende plekken ("quenching spots") door middel van bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 35 nm, uitgezonden door een UV-lamp; en zijn negatief in de reacties van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dradendorff. Verder werden de antibiotica WAP-8294A, Ax, A2 1001012 7 en A4, volledig gehydrolyseerd met een zuur en vervolgens onderworpen aan tweedimensionale TLC en aminozuuranalyse, met als doel de aminozuursamenstellingen van deze antibiotica te onderzoeken. De resultaten die op deze wijze verkregen 5 waren, geven aan dat elk van deze verbindingen asparagine-zuur (Asp), glutaminezuur (Glu), glycine (Gly), leucine (Leu), serine (Ser), tryptofaan (Trp) en ornithine (Orn) omvat, alsmede 3 onbekende aminozuren. Het resultaat van de tweedimensionale TLC analyse van het antibioticum WAP-8294A 10 wordt weergegeven in Fig. 5.

Op deze wijze werden onbekend aminozuur 1, onbekend aminozuur 2 en onbekend aminozuur 3 geïsoleerd door het WAP-8294A opnieuw te hydrolyseren met een zuur, met als doel deze onbekende aminozuren te identificeren. Het onbekende 15 aminozuur 1, 2 en 3 bleken respectievelijk β-hydroxy aspara-ginezuur, N-methylvaline en N-methylfenylalanine te zijn, op basis van de resultaten van de verschillende instrumentele analyses.

Aan de andere kant werden 3-hydroxyoctaanzuur, 3-hy-20 droxy-7-methyloctaanzuur of 3-hydroxy-8-methylnonaanzuur geïsoleerd uit het etherextract van elke oplossing, dat verkregen was door zuurhydrolyse van de individuele component WAP-8294A1( A2 of A„.

Verder werd het antibioticum WAP-8294AX gescheiden in 25 tenminste 13 fracties, dat wil zeggen AX-l: retentietijd 5,3 min.; AX-2: retentietijd 5,9 min.; AX-3: retentietijd 6,2 min.; AX-4: retentietijd 6,5 min.; AX-5: retentietijd 6,9 min.; AX-6: retentietijd 7,3 min.; AX-7: retentietijd 8,1 min.; AX-8: retentietijd 9,3 min.; AX-9: retentietijd 9,8 30 min.; AX-10: retentietijd 11,3 min.; AX-11: retentietijd 12,1 min.; AX-12: retentietijd 13,7 min.; en AX-13: retentietijd 15,0 min., zoals duidelijk wordt uit het chromatogram van Cie-omgekeerde fase silicagel-"high performance liquid chromatography" weergegeven in Fig. 6.

35 Het antibioticum WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13, hebben ultraviolet absorptiespectra (in water) bij λΜΧ 273 nm, 280 nm en 289 nm. Het wordt tevens duidelijk dat het WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 één mol tryptofaan omvatten 1001012 8 als chromofor in het molecuul, zoals bevestigd wordt door middel van de analyse van zuur-hydrolysaten daarvan, zoals later nader zal worden toegelicht. Het ultraviolet absorp-tiespectrum van het antibioticum WAP-8294AX-8 wordt weerge-5 geven in Fig. 7.

De infrarood absorptie spectroscopische analyse van de antibiotica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 vertonen absorptie bij 3300 cm'1, toegeschreven aan OH- en NH-groepen,· 1720 tot 1715 cm'1, toegeschreven aan carboxyl- of estercarbonyl-10 groepen; 1636 en 1541 cm'1, toegeschreven aan amidobindin-gen; en 1207 en 1137 cm'1, toegeschreven aan C-O-rekfibra-ties, maar zij vertonen geen andere karakteristieke absorp-ties. Het IR-absorptiespectrum van het antibioticum WAP-8294AX-8 wordt weergegeven in Fig. 8.

15 In de ^-NMR-spectroscopische metingen van de antibio tica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13, wordt een aantal gecompliceerde protonsignalen gezien, die afkomstig zijn van methyl, methyleen, methine, en heterocyclische of aromatische ringen. Het ^-NMR-spectrum van het antibioticum WAP-20 8294AX-8 wordt weergegeven in Fig. 9.

De FAB-massaspectrometrische metingen van het WAP-8294AX-8, AX-9 en AX-13 tonen aan dat het (M+H)*-ion van de component AX-8 een m/z-waarde heeft van 1549, dat het (M+H)*-ion van de component AX-9 een m/z-waarde heeft van 25 1549 en dat het (M+H)’-ion van de component AX-13 een m/z-waarde heeft van 1577. De resultaten van de natrium-smelt-test van de componenten AX-8, AX-9 en AX-13 maken duidelijk dat deze componenten elk afzonderlijk verbindingen zijn die koolstof, waterstof, zuurstof en stikstofelementen bevatten. 30 De volgende moleculaire formules, weergegeven in Tabel 2, kunnen afgeleid worden uit deze feiten, terwijl tevens in aanmerking wordt genomen de structuurschatting en de molaire verhoudingen van alle aminozuren en vetzuren die deze componenten uitmaken, alsmede de resultaten van hogere resolutie 35 FAB-massaspectrometrische metingen, zoals later nader zal worden toegelicht.

1001012 9 TABEL 2

Component AX-8 AX-9 AX-13 FAB-massa (Μ+ΗΓ 1549 1549 1577 5 FAB-massa (M-H)’ -- 1547 Δ massa eenheid 14 massa 14 massa 14 massa eenheden eenheden eenheden A2--->AX - 8 Ai--->AX- 9 A3 >A4

Moleculair gewicht 1548 1548 1576 10 HR-FAB-massa 1548.8079 1548.8065 1576,8324

Moleculaire formule O72H109O21N17 C72H109O21N17 C74H113021N17

De antibiotica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 zijn positief bij reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon Smith, 15 Jooddamp, waterige oplossing van kaliumpermanganaat en zwavelzuur; zij vertonen uitdovende plekken ("queunching spots") door middel van bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm, uitgezonden door een UV-lamp; en zijn negatief in de reacties van Molisch, zilvernitraat, ferri-20 chloride en Dragendorff.

Om de aminozuursamenstellingen van de antibiotica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 te onderzoeken, werd elk van hen volledige gehydrolyseerd met een zuur en vervolgens onderworpen aan tweedimensionale TLC-analyse [celluloseplaat; 25 oplosmiddel 1: n-butanol:azijnzuur:water (4:1:2); oplosmiddel 2: n-butanol:pyridine:azijnzuur:water (15:10:3:12); sproeireagens:ninhydrine] en aminozuuranalyse. Als resultaat werd gevonden dat WAP-8294AX de volgende aminozuren omvat, die positief zijn in de ninhydrinereactie: asparaginezuur 30 (Asp), glutaminezuur (Glu), glycine (Gly), 3-alanine (β-Ala), leucine (Leu), serine (Ser), tryptofaan (Trp), ornithine (Orn), valine (Val), N-methylvaline (N-MeVal), S-hydroxyasparaginezuur (β-ΟΗ-Asp), feneylalanine (Phe) en N-methylfenylalanine (N-MePhe).

35 Aan de andere kant werd tevens bevestigd dat het ether- extract van het zuur-complete hydrolysaat van het antibioticum WAP-8294AX het 3-hydroxy-4-methyloctaanzuur omvatte.

1001012 10

De antibiotica WAP-8294AX-8, ΑΧ-9 en AX-13 werden behandeld door middel van dezelfde procedure die toegepast werd voor de behandeling van het antibioticum WAP-8294AX en de aminozuren en vetzuren die deze componenten uitmaken, 5 konden geïdentificeerd worden op basis van de tweedimensionale TLC-analyse, aminozuurananalyse, en GC-massa-analyse van het etherextract van de zuur-complete hydrolysaten. De resultaten worden weergegeven in Tabel 3, tezamen met de resultaten die zijn opgemerkt voor het antibioticum WAP-10 8294A2.

TABEL 3

Aminozuren en vetzuren die elke fractie vormen (molair aantal wordt gegeven tussen haakjes) 15

Compo- AX-8 AX-9 AX-13 A, (hoofd- nent component)

Amino- Asp(l) Asp(l) Asp(l) Asp(l) zuur Ser(2) Ser(2) Ser(2) Ser(2)

Glu(l) Glu(l) Glu(l) Glu(l)

Gly(l) Gly(l) Ê-Ala(l) Gly(l)

Leu(l) Leu(l) Leu(l) Leu(l)

Trp{1) Trp(1) Trp(1) Trp(1)

Orn(2) Orn(2) Orn(2) Orn(2) β-ΟΗ-Asp- β-ΟΗ-Asp- β-ΟΗ-Asp- β-ΟΗ-Asp- (1) (1) (1) (1)

Val(1) N-MeVal(1) N-MeVal(l) N-MeVal(l) N-MePhe(1) Phe(l) N-MePhe(l) N-MePhe(l)

20 Vet- 3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-OA 3H-7M-0A

zuur (1) (1) (1) (1)

Let op: 3H-7M-OA staat voor 3-hydroxy-7-methyloctaan- zuur.

25 De uitvinders hebben gezocht naar bekende verbindingen op basis van de hiervoor beschreven fysicochemische eigenschappen en kennis van de zuur-compleet hydrolysaten van de 1001012 11 antibiotica WAP-8294A, A1( A2, A4, AX, AX-8, AX-9 en AX-13, en de aminozuren en vetzuren die deze antibiotica vormen.

Als resultaat hebben zij het positieve bewijs van het feit dat dit nieuwe verbindingen zijn, die niet eerder zijn 5 beschreven in de literatuur, bevestigd.

De antibiotica WAP-8294A, Au A2( A„, AX, AX-8, AX-9 en AX-13, volgens de onderhavige uitvinding, kunnen bereid worden door middel van de werkwijze, welke de volgende stappen omvat: het kweken in een kweekmedium van een bacte-10 rie, die het antibioticum WAP-8294A produceert, welke bacterie behoort tot het genus Lysobacter .· het isoleren en verzamelen van het antibioticum WAP-8294A; en, indien noodzakelijk, het aanvullend scheiden en zuiveren daarvan. Een voorbeeld van een bacterie die WAP-8294A produceert, welke 15 behoort tot het genus Lvsobacter. is een Lysobacter sp. WAP-8294-stam, die geïsoleerd is door de uitvinders van de onderhavigeu uitvinding uit de aarde die afkomstig is van Shimoda City, Shizuoka Prefecture, Japan. De taxonomische bacteriologische eigenschappen van de stam zijn als volgt: 20 1. Morfologie:

De stam werd gekweekt gedurende 3 dagen bij 25°C, op een bouillon-agarplaat, bekeken onder een microscoop en bleek te zijn een stafisch vormige cel met een diameter die 25 varieert van 0,4 tot 0,6 μτη en een lengte die varieert van 3,2 tot 4,2 μτη. De stam is een gram-negatieve bacterie, vrij van flagellae maar vertoont een glijdende beweging, vormt geen sporen en is vrij van zuurvastheid.

30 2. Groeikarakteristieken in een verscheidenheid van kweekmedia

De stam werd gekweekt in 25°C in een verscheidenheid van kweekmedia en gedurende 3 tot 14 dagen geobserveerd.

(1) Bouillon-agar-plaat kweek 35 De gevormde kolonie heeft een doorschijnende zwakgele circulaire vorm, een convex cirkelvormig oppervlak en een volledige tot golvende periferie. De stam vormt geen diffunderend pigment.

1001012 12 (2) Bouillon-agar-schuinstaande ("slant") kweek

De stam groeit in de vorm van een verspreid weefsel en heeft een doorschijnende zwakgele kleur.

(3) Bouillon vloeibare kweek 5 Het medium wordt licht troebel, de stam vormt een gladde ring en neerslagen van bacteriéle cellen op de bodem van het kweekvat worden zichtbaar.

(4) Bouillon-gelatine geperforeerde kweek

De stam groeit binnen een gebied dat zich uitstrekt van 10 de oppervlakte tot het midden van het medium, terwijl de gelatine vloeibaar wordt gemaakt.

(5) Lakmoes-melkkweek

De stam blijkt niet in staat te zijn tot het reduceren van de lakmoes en is vrij van coagulatie, maar is in 15 staat tot peptonisering.

(6) Magere melk-acetaat-agar kweek

De stam vertoont een sterke proteolytische activiteit en groeit onder het vormen van sterk visceuze gelachtige massa's op de agarplaat.

20 3. Fysiologische eigenschappen:

De fysiologische eigenschappen van de WAP-8294 stam zijn als volgt: 25 (1) Reductie van nitraat (2) Denitrificeringsreactie (3) MR-test (4) VP-test (5) Vorming van indool 30 (6) Vorming van waterstofsulfide (7) Hydrolyse van zetmeel (8) Toepassing van citroenzuur 1. Koser kweekmedium 2. Simmonds kweekmedium 35 3. Christensen kweekmedium + (9) Toepassing van anorganische stikstofbron 1. Natriumnitraat + 2. Ammoniumsulfaat + 1001012 13 3. Natriumglutamaat + (10) Vorming van pigment 1. King A kweekmedium 2. King B kweekmedium 5 (11) Urease (12) Oxidase + (13) Katalase +

(14) Groeitemperatuur 15 tot 37°C

(15) Groei pH 5 tot 8 10 (16) Gedrag ten opzichte van zuurstof aerobisch (17) O-F-test niet-ontledend type (18) Deoxyribonuclease + (19) Fosfatase + (20) Hemolyse β 15 (21) Afbraak van cellulose (22) Afbraak van Tween 1. Tween 20 + 2. Tween 40 + 3. Tween 60 + 20 4. Tween 80 + (23) Afbraak van colloidaal chitine + (24) Afbraak van polysaccharide 1. CMC + 2. Algininezuur 25 3. Pectinezuur (25) Bacteriolytische activiteit 1. Saccharomyces cerevisiae + 2. Bacillus subtilis + 3. Escherichia coli + 30 (26) GC-gehalte 68,3 % (HPLC methode) (27) Vorming van zuur en gas uit suikers 10 010 12 14

Suiker Vorming Vorming Toepassing van zuur van gas van suiker (Pepton (Bouillon- (Davis water) agar) kweekmedium) L-Arabinose - D-Xylose - - - 5 D-Glucose + - D-Mannose + D-Fructose + D-Galactose +

Maltose + - + 10 Sucrose + --

Lactose +

Trehalose +-- D-Sorbitol D-Mannitol - 15 Inositol -

Glycerine -

Zetmeel + - +

Cellobiose + - + 20 Indien de voorafgaande resultaten met betrekking tot WAP-8294 stam, worden vergeleken met de details van bacte-riële species, die worden beschreven in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", vol. 3 (1989), kan geconcludeerd worden dat de stam een gram-negatieve aerobische staaf is, 25 vrij van flagellae en de motiliteit heeft door middel van glijden en dat de stam daardoor behoort tot de glijdende bacteriën.

Glijdende bacteriën worden geklassificeerd in niet-vruchtvormende glijdende bacteriën, die geen vruchtlichaam 30 vormen en vruchtvormende glijdende bacteriën die wel vrucht-lichamen vormen. De stam vormt geen vruchtlichaam en behoort daarmee tot de niet-vruchtvormende glijdende bacteriën. De glijdende bacteriën worden verder onderverdeeld in drie 1001012 15 orden, te weten, Cvtophagales. Beggiotales en Lysobacter-ales. die duidelijk van elkaar onderscheiden kunnen worden op basis van het GC-gehalte van elk DNA, welk gehalte één van de belangrijke sleuteleigenschappen is. Hiertoe werd het 5 DNA van de stam geëxtraheerd door middel van de gebruikelij-ke methode en als resultaat, bleek het GC-gehalte daarvan hoog te zijn, in de orde van 68,3 %, zoals bepaald door middel van de HPLC-methode die beschreven is in FEMS Microbiol . Letters, 1984, 25, p. 125. Dienovereenkomstig kan 10 geconcludeerd worden dat de stam behoort tot de genus Lvsob-acter van de orde Lysobacterales die een hoog GC-gehalte hebben, variërend van 65 tot 71 %.

Indien de eigenschappen van de stam worden vergeleken met de eigenschappen van de species die behoren tot dezelfde 15 genus, blijken de eigenschappen daarvan overeen te stemmen met die van Lysobacter enzymogenes. maar komen met deze laatste niet tot in detail overeen. Een verschil is bijvoorbeeld de mogelijkheid tot het assimileren van citroenzuur. Dienovereenkomstig wordt de stam Lvsobacter sp. WAP-8294 2 0 genoemd.

De WAP-8294 stam werd gedeponeerd bij het National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, op 31 januari 1994, onder het toelatingsnumer FERM BP-4990 (FERM P-14093).

25 Bacteriën, waaronder Lysobacter. ondergaan vrij gemakkelijk veranderingen in hun taxonomische eigenschappen, zoals hun algemene aard is, en de WAP-8294 stam vormt daarop geen uitzondering. Alle micro-organismes, die de mogelijkheid hebben tot het produceren van het antibioticum WAP-8294A, 30 kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding. Deze micro-organismes omvatten varianten die op natuurlijke wijze gemuteerd zijn of op kunstmatige wijze gemuteerd zijn met een verscheidenheid aan mutagenen.

35 (Kweken en produktie)

Het antibioticum WAP-8294A volgens de onderhavige uitvinding wordt geproduceerd door een kweekmedium, dat een voedingsbron bevat, te enten met de genoemde WAP-8294A- 10 010 12 16 producerende bacteriën, en de bacteriën onder aerobische omstandigheden te kweken. Indien de antibioticum WAP-8294A-producerende bacteriën worden gekweekt, gebruiken de bacteriën bijvoorbeeld assimileerbare organische koolstofbevat -5 tende verbindingen zoals glucose, fructose, zetmeel, dextrine, glycerine, molasse, zetmeelsiroop, vetten en oliën en organische zuren als kool stof bronnen,· en organische en anorganische stikstofbevattende verbindingen zoals sojaboon-bloem, katoenzaadbloem, graanaftreksel, caseïne, pepton, 10 gistextract, vleesextract, zaadkiemen, ureum, aminozuren en ammoniumzouten als stikstofbronnen. Daarnaast zijn voorbeelden van dergelijke zouten anorganische zouten zoals natrium-, kalium-, calcium- en magnesiumzouten en -fosfaten die toegepast kunnen worden, ofwel afzonderlijk, ofwel in combi-15 natie. Bovendien is het gewenst om optioneel aan het kweek-medium zware metaalzouten toe te voegen, zoals ijzerzouten, koperzouten, zinkzouten en kobaltzouten; vitamines die noodzakelijk zijn voor de groei van de micro-organismes, zoals biotine en vitamine Bx; alsmede andere organische 20 en/of anorganische verbindingen die in staat zijn tot het verbeteren van de groei van de bacteriën die het antibioticum WAP-8294A produceren, alsmede tot het verbeteren van de opbrengst van het WAP-8294A. Het kweekmedium kan op dezelfde wijze een antischuimmiddel omvatten, zoals siliconenolie of 25 een polyalkyleenglycolether, alsmede een oppervlakteactief middel.

De stam wordt gekweekt door middel van elke werkwijze die gewoonlijk wordt toegepast voor de produktie van antibiotica, maar kweektechnieken die gebruik maken van onderge-30 dompelde beluchtings-agitatie hebben de voorkeur voor het instandhouden van de aerobische omstandigheden en de gebruikelijke schut-kweekmethode in een fles of kolf is geschikt voor de kweek op laboratoriumschaal. Het kweken kan in het algemeen worden uitgevoerd bij een temperatuur variërend van 35 20 tot 40°C en bij voorkeur 25 tot 30°C. Het kweken wordt uitgevoerd bij een pH die varieert van ongeveer 6 tot 8 en bij voorkeur ongeveer 7 is. De kweektijd varieert van ongeveer 2 tot 6 dagen en is voldoende voor het verzekeren van 1001012 17 een gewenste opbrengst van het WAP-8294A, dat zich heeft opgehoopt in het kweekmedium.

(Isolatie en zuivering) 5 Het winnen van het antibioticum WAP-8294A, dat op deze wijze is opgehoopt in het kweekmedium, kan op voordelige wijze worden uitgevoerd door middel van de toepassing van de fysicochemische eigenschappen van de antibiotische verbindingen volgens de onderhavige uitvinding, zoals later zal 10 worden toegelicht. Meer in het bijzonder is het antibioticum WAP-8294A aanwezig in het filtraat van het kweekmedium. Daartoe wordt het filtraat van het kweekmedium verzameld door allereerst een filtreerhulpmiddel, zoals Celite of Radiolite, daaraan toe te voegen en vervolgens de bacteriële 15 cellen te verwijderen door middel van filtratie onder verminderde druk of door middel van centrifugatie.

De antibiotica WAP-8294A worden wateroplosbare polypeptide antibiotica geacht te zijn, in het licht van de fysicochemische eigenschappen daarvan, die hieronder gedetailleerd 20 zijn beschreven. De antibiotica zijn derhalve opgebouwd uit relatief grote verbindingen die elk een moleculair gewicht hebben variërend van 1400 tot 1700. Bij het verzamelen van het WAP-8294A uit het filtraat van het kweekmedium, zijn, indien deze eigenschappen in acht worden genomen, adsorbe-25 rende harsen zoals Diaion HP-20, Sepabeads SP207, CHP-20 (beschikbaar van Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), Amberlite XAD-2 (beschikbaar van Rohm & Haas Co.), Duolite S-30 (beschikbaar van Diamond Shamrock Chemical Co.) bruikbaar. In het bijzonder wordt het antibioticum op efficiënte 30 wijze gezuiverd door middel van kolomchromatografie met actieve kool.

Het filtraat van het kweekmedium, met een pH van 6,9, wordt bijvoorbeeld geleidt door een kolom, die is gevuld met Amberlite IR-120B (H+-type), de resulterende zure vloeistof, 35 die door de kolom is geleid, wordt vervolgens geleid door een kolom gevuld met actieve koolstof zonder enige behandeling, om op deze wijze het filtraat te adsorberen, gevolgd door wassen met water en elutie met een mengsel van 80 % '10 010 12 18 aceton-water of een alkalisch mengsel van 80 % aceton-water als eluaat om op deze wijze het antibioticum WAP-8294A te winnen. Na het afdestilleren, onder verminderde druk, van het aceton uit het eluaat, wordt het verkregen residu ge-5 extraheerd met ethylacetaat onder zure omstandigheden, om de olieoplosbare onzuiverheden te verwijderen. Vervolgens wordt de waterige fase opnieuw geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel met hoge polariteit, zoals bijvoorbeeld N-buta-nol, om het WAP-8294A te winnen. Na het afdestilleren bij 10 lage temperatuur van het N-butanol uit het extract, wordt het residu per se geconcentreerd tot droog of een slecht oplosmiddel wordt aan het concentraat van het residu toegevoegd om op deze wijze het WAP-8294A te laten neerslaan, gevolgd door centrifugatie of filtratie onder verminderde 15 druk om een ruwe verbinding te geven.

De ruwe verbinding die op deze wijze gewonnen is, kan verder gezuiverd worden door tegenstroom-verdelingswerkwij-zen, waaronder centrifugale vloeistof-vloeistof partitie-chromatografie, adsorptiechromatografie, zoals silicagelko-20 lomchromatografie en partitiechromatografie, zoals cellulo-sekolomchromatografie, die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden toegepast, waarbij een sterk gezuiverde verbinding wordt verkregen, omdat het WAP-8294A geëxtraheerd kan worden met polaire organische oplosmiddelen zoals n-25 butanol onder zure omstandigheden.

Anderszins is het eveneens mogelijk om de verbinding te zuiveren door gebruik te maken van het moleculaire zeefeffect van Sephadex G-10, G-15, LH-20 (beschikbaar van Pharmacia Company) of Biogel P-4 gel (beschikbaar van Bio-Rad 30 laboratoria) en vervolgens het ontwikkelen en elueren van de verbinding met water, waterbevattende lagere alkoholen, zoals water-bevattend methanol, verdunde alkalische of zure waterige oplossingen alsmede waterige oplossing die geschikte zouten omvat, welke afzonderlijk of in combinatie kunnen 35 worden toegepast.

De afzonderlijke 7 componenten AX, Alt A2, A3, A4, As en A6 worden verkregen door het WAP-8294A verder te zuiveren en te scheiden door middel van bijvoorbeeld de tegenstroomver- 1001012 19 delingstechnieken die hierboven beschreven zijn en/of "high performance liquid chromatography" ("HPLC")-technieken. De 13 soorten componenten AX-l, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-ll, AX-12 en AX-13 kunnen op 5 dezelfde wijze verkregen worden door zuiveren en scheiden van de AX component op de hierboven beschreven wij ze.

De vulmaterialen die toegepast worden in de HPLC-chro-matografie kunnen silicagel, commercieel beschikbare uitstekende dragers waarin alkylgroepen zoals octadecyl- en octyl-10 groepen chemisch gebonden zijn aan de silanolgroepen van silicagel, of dragers voor algemene toepassing zoals poly-styreen-type poreuze polymeergels, zijn. De WAP-8294A en de AX-component kunnen gescheiden worden in afzonderlijke componenten, door middel van de toepassing van deze vulmate-15 rialen, en wel met hoge effectiviteit. De mobiele fase die toepasbaar is in de HPLC-chromatografie kan water-bevattend acetonitril zijn, dat is aangezuurd door, bijvoorbeeld, trifluorazijnzuur, of water-bevattende lagere alkoholen zoals water-bevattend methanol, alsmede bufferoplossingen.

20 (Fysicochemische eigenschappen)

De fysicochemische eigenschappen van het WAP-8294A, Alf A2, A4, AX, AX-8, AX-9 en AX-13 die verkregen zijn door de hiervoor beschreven verschillende chromatografische technie-25 ken, de verbindingen die verkregen worden door de complete zuur-hydrolyse daarvan en die positief zijn bij de ninhydri-nereacties, alsmede etherextracten van de zuur-hydrolysaten, zullen hieronder beschreven worden.

30 Antibioticum WAP-8294A

(1) Verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 213-220°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 35 in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo- 1001012 20 vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; 5 (5) Retentietijd in HPLC (Fig. l): 4,0 tot 5,1 minuten, 8,0 minuten, 11,1 minuten, 12,5 minuten, 16,5 minuten, 17,9 minuten, 18,8 minuten; (6) Ultraviolet absorptiespectrum {in water):

Xmax; 275 nm, 280 nm, 287 nm; 10 (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr) .· karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1400-1700,- (9) Kwalitatieve test voor organische verbinding (natrium- 15 smeltwerkwijze): het antibioticum is een verbinding welke koolstof-, waterstof- en zuurstof- en stikstof-elementen omvat; (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als ninhydrine-posi-tieve verbindingen, in Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, 20 Orn, N-methylvaline, β-hydroxyasparaginezuur en N- methylfenylalanine; (11) Specifieke rotatie: [a]d20 = +42° (c = 0,5, H20) ,· (12) Klassificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer.

25 Antibioticum WAP-8294A, (1) Verschijning: wit poeder,· (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding) ,- (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 30 in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een 35 golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff ,- (5) Retentietijd in HPLC : 8,0 minuten; 1001012 21 (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water):

Xmax: 275 nm, 280 nm, 287 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 5 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1133 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1547,9 (FABS-MS m/z 1548,9 (M+H)+, m/z 1546,7 (M-H) ') ; (9) Moleculaire formule: C-,2H109021N17 (gemeten m/z-waarde van (M+H)+-ion als bepaald door middel van hoge resoluatie 10 FAB-massa: 1548,8088; berekende m/z-waarde: 1548,8063]; (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet in: Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 mol), β-hydroxyas-paraginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en 15 3-hydroxyoctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [a]/c = +41° (c = 0,5, H20) ,- (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfoteer;

Antibioticum WAP-8294A-, 20 (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder,· (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; 25 (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp,· 30 negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri- chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC : 11,1 minuten; (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) (Fig. 2) : Xmax : 275 nm (Ej cm1% 31,8), 280 nm (E2 OT1% 33,4), 287 nm (Ei 35 „,1* 29,2) ; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr) (Fig. 3): Karakteristiek absorptiespectrum·. 3300 cm'1, 1720-1715 1001012 22 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm' 1 .

t (8) ^-NMR spectrum: (270 MHz, D20) (Fig. 3) : gecompliceer de protonsignalen worden gezien, welke afkomstig zijn 5 van methyl, methyleen, methine en heterocyclische of aromatische ringen; (9) Moleculair gewicht: 1561,9 [FAB-massa m/z 1562,9 (Μ+ΗΓ, m/z 1561.2 (M-H)'J; (10) Moleculaire formule: C73H111021N17 [gemeten m/z-waarde van 10 (M+H)+-ion als bepaald door middel van hoge resolutie FAB-massa: 1562,8224,- berekende m/z-waarde: 1562,8219],- (11) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol, Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 15 mol), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenyla- lanine (1 mol), en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 mol) ,- (12) Specifieke rotatie: [0-)020 = +42° (c = 0,5,- H20) ,- (13) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer,· 20

Antibioticum WAP8294A, (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, 25 dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie.· positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo- 30 vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp,· negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC : 16,5 minuten,· 35 (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xmax : 275 nm, 280 nm, 289 nm; 1001012 23 (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm1,· (8) Moleculair gewicht: 1400-1700; 5 (9) Moleculaire formule: C73H113021N17 [gemeten m/z-waarde van (M+H)+-ion als bepaald door middel van hoge resolutie FAB-massa: 1576,8363,- berekende m/z-waarde: 1576,8375]; (10) Zure hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol, Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 10 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 mol), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol), en 3-hydroxy-8-methylnonaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [o'] D20 = +43° (c = 0,5; H20) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer; 15

De elutieomstandigheden voor de Cle-RP silicagel-HPLC

van de antibiotica WAP-8294A, Aj, A2 en A4 zijn als volgt:

Kolom: YMC A-312 (6 x 150 mm)

Mobiele fase: 0,05 % trifluorazijnzuur-bevattend acetoni- 20 tril:water (45:55)

Detectie golflengte: UV 214 nm

Vloeistofsnelheid: 1 ml/min.

Antibioticum WAP-8294AX

25 (l) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 196~200°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; 30 (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; 35 negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri- chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC (Fig. 6): 5,3 minuten, 5,9 minuten, 6,2 minuten, 6,5 minuten, 6,9 minuten, 7,3 minu- 1001012 24 ten, 8,1 minuten, 9,3 minuten, 9,8 minuten, 11,3 minuten, 12,1 minuten, 13,7 minuten en 15,0 minuten; (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : : 273 nm, 280 nm, 28" nm,· 5 (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteris tiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720~1715 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm"1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1575,9 (FAB-massa m/z 1576,9 (M+H)*, m/z 1575,4 (M-H)']; 10 (9) Kwalitatieve test voor organische verbindinge (natrium- smeltmethode): het antibioticum is een verbinding welke koolstof-waterstof-zuurstof- en stikstofelementen omvat; (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als ninhydrine-posi- 15 tieve verbindingen en vetzuren, in: Asp, Glu, Gly, β-

Ala, Leu, Ser, Trp, Orn, Val, N-methylvaline, β-hy-droxyasparaginezuur, Phe, N-methylfenylalanine en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur; (11) Specifieke rotatie: [a] d20 = +24 ° (c = 0,5, H20) ,· 20 (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer,·

Antibioticum WAP-8294AX-8 (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 196~200°C (ontleding); 25 (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper- 30 manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; 35 (5) Retentietijd in HPLC: 9,3 minuten (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) (Fig. 7) : Xmax : 273 nm, 280 nm, 289 nm; 1001012 25 (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr) (Fig. 8).·

Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm1, 1541 cm 1, 1404 cm'1, 1207 cm1, 1133 cm' 1 # t 5 (8) ^-NMR spectrum: (270 MHz, DMS0-D«) (Fig. 9): gecompli ceerde protosignalen worden gemeten die afkomstig zijn van methyl, methyleen, methine en heterocyclische of aromatische ringen,· (9) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1549 (M+H)+); 10 (10) Moleculaire formule.· C72H109O21N17 (gemeten m/z-waarde van (M+H)* ion als bepaald door middel van hoge resolutie FAB-massa: 1548,8079; berekende m/z-waarde.· 1548,80631 ; (11) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser 15 (2 mol) , Trp (1 mol) , Orn (2 mol) , Val (1 mol) , £- hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 moL) ; (12) Specifieke rotatie: [οΊβ20 = +25° )c = 0,5, H20) ; (13) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer; 20

Antibioticum WAP-8294AX-9 (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 216~220°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, 25 dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo- 30 vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff ,· (5) Retentietijd in HPLC: 9,8 minuten 35 (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xmax : 273 nm, 280 nm, 289 nm; 1001012 26 (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm"1, 1636 cm"1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1549 (M+H)*; 5 m/z 1547 (M-H)‘); (9) Moleculaire formule: C72Hl09O21N17 [gemeten m/z-waarde van (M+H)+ ion als bepaald door middel van hoge resolutie FAB-massa: 1548,8065,- berekende m/z-waarde: 1548,8063],· (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in 10 Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), Val (1 mol), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), Phe (1 mol) en 3-hydroxy- 7-methyloctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [a]c20 = +28° (c = 0,5, H20) ; 15 (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer;

Antibioticum WAP-8294AX-13 (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder,- (2) Smeltpunt: 205~210°C (ontleding); 20 (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper- 25 manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; 30 (5) Retentietijd in HPLC: 15,0 minuten (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xmax : 273 nm, 280 nm, 289 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 35 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm1; (8) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1577 (M+H)*] ; 1001012 27 (9) Moleculaire formule: C74H113021N17 [gemeten m/z-waarde van (M+H)+ ion als bepaald door middel van hoge resolutie FAB-massa: 1576,8324; berekende m/z-waarde: 1576,8375]; (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in: 5 Asp (1 mol), Glu (1 mol), fi-Ala (1 mol), Leu (1 mol),

Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [a]D20 = +27° (c = 0,5, H20) ,· 10 (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer;

De elutieomstandigheden voor de C18-reverse phase silicagel-HPLC van de antibiotica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 zijn als volgt: 15 Kolom: YMC A-312 (6 x 150 mm)

Mobiele fase: 0,05 % trifluorazijnzuur-bevattend acetonitril:water (37:663)

Detectiegolflengte: UV 214 nm Vloeistofsnelheid: 1 ml/min.

20 (Biologische eigenschappen) (1) Antibacteriële activiteit

Tabel 4 geeft de resultaten weer van de inspectie van WAP 8294A, A1, A, en A„ met betrekking tot hun antibacteriële 25 activiteit. De bepaling van de minimale remmende concentratie (MIC) werd uitgevoerd door middel van de werkwijze van het verdunnen van de bouillon, onder toepassing van een gevoelig bouillonmedium (beschikbaar van Eiken Chemical Co., Ltd.).

30 De data, weergegeven in Tabel 4, geven duidelijk aan dat WAP-8294A, A3, A2 en A4 een sterke antibacteriële activiteit vertonen tegen grampositieve bacteriën, waaronder MRSA (methicilline-resistent Staphylococcus aureus). De activiteit wordt gekenmerkt doordat deze niet minder dan 8 maal 35 groter is dan gezien in het voorafgaande kweekmedium, indien 10 % kalfsserum wordt toegevoegd aan het kweekmedium.

10 010 12 28

Aan de andere kant, vertonen deze verbindingen geen activiteit tegen gramnegatieve bacteriën, schimmels en gisten.

TABEL 4-1 5

Geteste bacterie MIC ^g/ml) A A,

Toevoeging van serum Geen 10 % Geen 10 %

Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0,10 0,39 <0,10 I (MRSA klinisch geïso-10 leerde stam)

Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0,10 0,39 <0,10 II (MRSA klinisch geïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0 10 0,39 <0,10 15 371 R (MRSA klinisch ge ïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus 0,78 <0,10 0,39 <0,10 (ATCC 25923)

Staphylococcus epidermis 0,78 <0,10 0,39 <0,10 20 (ATCC 12228)

Streptococcus pvrogenes 6,25 25 6,25 25 (ATCC 19615)

Bacillus subtilis (ATCC 0,78 <0,10 0,39 <0,10 6633) 25 Escherichia coli (ATCC >100 >100 >100 >100 25922)

Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 (ATCC 9027)

Candida albicans (TIMM >100 >100 >100 >100 30 0239)

Aspergillus fumiqatus >100 >100 >100 >100 (IAM 2004) 1001012 29 TABEL 4-2

Geteste bacterie MIC {μς/χύΐ) A Aj

Toevoeging van serum Geen 10 % Geen 10 % 5 Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0,10 0,78 <0,10 I (MRSA klinisch geïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0,10 0,78 <0,10 II (MRSA klinisch geïso-10 leerde stam)

Staphylococcus aureus Nr. 0,78 <0 10 0,78 <0,10 371 R (MRSA klinisch geïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus 0,78 <0,10 0,78 <0,10 15 (ATCC 25923)

Staphylococcus epidermis 0,78 <0,10 0,78 <0,10 (ATCC 12228)

Streptococcus pvrogenes 6,25 25 6,25 25 (ATCC 19615) 20 Bacillus subtilis (ATCC 0,78 <0,10 0,78 <0,10 6633)

Escherichia coli (ATCC >100 >100 >100 >100 25922)

Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 25 (ATCC 9027) |

Candida albicans (TIMM >100 >100 >100 >100 0239)

Aspergillus fumigatus >100 >100 >100 >100 (IAM 2004) 30

De antibacteriële activiteiten van de antiibiotica WAP-8249AX, AX-8, AX-9 en AX-13 worden op dezelfde wijze bepaald. De resultaten worden weergegeven in Tabel 5. De 1001012 30 bepaling van de minimale remmende concentratie (MIC) daarvan, werd uitgevoerd door de bouillon-verdunningsmethode onder toepassing van Muller-Hinton bouillon (beschikbaar van DIFCO Company), aangevuld met 2 % natriumchloride voor MRSA 5 en Muller-Hinton bouillon als zodanig, voor andere bacteriën.

De data weergegeven in Tabel 5, geven aan dat de antibiotica WAP-8294AX, AX-8, AX-9 en AX-13 sterke antibacte-riële werking vertonen tegen grampositieve bacteriën waaron-10 der methicilline-resistent Staphylococcus aureus en er is gevonden dat de activiteit ongeveer tweemaal toeneemt, in vergelijking met de waarde uit het voorafbeschreven kweekme-dium, indien 10 % kalfsserum wordt toegevoegd aan het kweek-medium.

15 Aan de andere kant vertonen deze verbindingen geen activiteit tegen gramnegatieve bacteriën, schimmels en gisten.

1001012 TABEL 5-1 31

Geteste bacterie MIC ^g/ml) A Ax

Toevoeging van serum

Geen 10 % Geen 10 % 5 Staphylococcus aureus Nr. 1,56 0,78 3,13 3,13 1 (MRSA klinisch geïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus 1,56 0,78 3,13 1,56 (ATCC 25923) 10 Staphylococcus epidermis 1,56 0,78 1,56 0,78 (ATCC 12228)

Streptococcus pyrogenes >100 >100 >100 >100 (ATCC 19615)

Bacillus subtilis (ATCC 1,56 0,78 1,56 0,78 15 6633)

Escherichia coli (ATCC >100 >100 >100 >100 25922)

Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 (ATCC 9027) 20 Candida albicans (TIMM >100 >100 >100 >100 0239)

Aspergillus fumiqatus >100 >100 >100 >100

(IAM 2004) I

25 1001012 TABEL 5-2 32

Geteste bacterie MIC (μg/ml) A Ax

Toevoeging van serum

Geen 10 % Geen 10 % 5 Staphylococcus aureus Nr. 3,13 1,56 3,13 3,13 1 (MRSA klinisch geïsoleerde stam)

Staphylococcus aureus 3,13 1,56 3,13 3,13 (ATCC 25923) 10 Staphylococcus epidermis 1,56 0,78 1,56 0,78 (ATCC 12228)

Streptococcus pyrooenes >100 >100 >100 >100 (ATCC 19615)

Bacillus subtilis (ATCC 3,13 1,56 3,13 1,56 15 6633)

Escherichia coli (ATCC >100 >100 >100 >100 25922)

Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 (ATCC 9027) 20 Candida albicans (TIMM >100 >100 >100 >100 0239)

Aspergillus fumiaatus >100 >100 >100 >100 (IAM 2004) 25 (2) Beschermend effect van WAP-8294A tegen experimente le MRSA-infectie in muizen

Omdat het antibioticum WAP-8294A een sterke antibacte-riële werking tegen grampositieve bacteriën, waaronder MRSA, vertoont, zoals blijkt uit de in vitro antibacteriële wer-30 king daarvan als weergegeven in Tabel 4, werd een test uitgevoerd waarbij muizen worden beschermd tegen infectie met Staphylococcus aureus, nr. 1 (een klinisch geïsoleerde stam van MRSA).

1001012 33

De experimenten werden uitgevoerd door intraperitoneaal 0,5 mg per 0,5 ml per muis cyclofosfamide toe te dienen aan ICR-MCS-muizen [4 weken oude mannelijke muizen (beschikbaar van Nippon Clea Co., Ltd.), 8 dieren per groep]. De toedie-5 ning werd uitgevoerd 3 dagen voor infectie van de dieren door middel van intraperitoneale toediening van 0,5 ml elk van een vloeistof die 2 x 106/rol Staphylococcus aureus nr. 1 stam bevatte, aangevuld met 5 % mucine. 1 uur na infectie werd eenmaal, subcutaan, 10 mg/kg vancomycine HC1 (beschik-10 baar van Shionogi & Co., Ltd.) en 0,2 ml/muis van het antibioticum WAP-8294A (bevattend 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,1 mg/kg of 0,05 mg/kg van het antibioticum), in de muizen geïnjecteerd. Aan de controlegroepen, werd aan elke muis subcutaan 0,2 ml fysio-15 logische zoutoplossing toegediend.

Zoals blijkt uit de resultaten van deze experimenten, die zijn weergegeven in de onderstaande tabel 6, overleden alle controledieren, die geen behandeling ontvingen, binnen 3 dagen na de infectie. Aan de andere kant bleven, in de met 20 antibioticum behandelde groep, 5 van de 8 dieren, waaraan 10 mg/kg vancomycine was toegediend, tot 5 dagen na de infectie in leven. In tegenstelling hiermee vertoonde WAP-8294A een uitstekende therapeutische werking bij lage doseringsgehal-tes, zoals blijkt uit de resultaten die zijn weergegeven in 25 Tabel 6. De EDS0 waarde daarvan werd bepaald door middel van de "probit"-methode en bleek 0,155 mg/kg te zijn.

1001012 34 TABEL 6

Resultaten van WAP-8294A behandeling van experimentele systemische MRSA-infectie in muizen 5 Testgroep Dosis (mg/kg) Overleving/# testdieren

Controle (fysio- 0/8 logische zoutoplossing)

Vancomycine 10 5/8 10 Antibiotisch WAP- 10 8/8 8294A 5 8/8 2,5 8/8 1,0 8/8 0,5 7/8 0,25 5/8 0,10 3/8 0,05 1/8

Omdat het antibioticum WAP-8294AX sterke antibacteri-ele werking vertoonde tegen gram-positieve bacteriën, waar-15 onder MRSA, zoals blijkt uit de in vitro antibacteriële werking daarvan, als weergegeven in Tabel 5, werd een test voor het beschermen van muizen tegen infectie met Staphylococcus aureus JCM8702 (een klinisch geïsoleerde stam van MRSA) uitgevoerd.

20 De experimenten werden uitgevoerd door middel van het intraperitoneaal toedienen van 0,5 mg/0,5 ml/muis cyclofos-famide aan iCR-MCH-muizen (4 weken oude mannelijke muizen (beschikbaar van Nippon Clea Co., Ltd.), 8 dieren per groep]. De toediening werd uitgevoerd 3 dagen voordat de 25 dieren door middel van intraperitioneale toediening van elk 0,5 ml van een vloeistof die 2 x 104/ml van een Staphylococcus aureus JCM98702-stam, aangevuld met 5 % mucine, werden besmet.

1001012 35 Eén uur na de infectie werd éénmaal subcutaan 10 mg/kg vancomycine HC1 (beschikbaar van Shionogi & Co., Ltd.) en 0,2 ml/muis van een antibioticum WAP-8294AX (welke 10 mg/kg, 2,5 mg/kg, 1,0 mg/kg of 0,5 mg/kg van het antibioticum 5 omvatte) geïnjecteerd in de muizen. Aan de muizen uit de controlegroepen werd elk 0,2 ml fysiologische zoutoplossing subcutaan toegediend.

Zoals blijkt uit de resultaten van deze experimenten, weergegeven in onderstaande Tabel 7, overleden 6 van de 8 10 controledieren die niet behandeld werden, binnen 3 dagen na de infectie. Aan de andere kant bleven, uit de met antibioticum behandelde groep, 5 van de 8 dieren, waaraan 10 mg/kg vancomycine was toegediend, tot 5 dagen na infectie in leven. In tegenstelling hiermee vertoonde het WAP-8294AX een 15 uitstekende therapeutische werking bij een lager doserings-gehalte, zoals blijkt uit de resultaten die zijn weergegeven in Tabel 7. De EDS0 waarde daarvan werd bepaald door middel van de probit-methode en bleek 1,25 mg/kg te zijn.

20 1001012 TABEL 7 36

Resultaten van WAP-8294AX behandeling van experimentele systemische MRSA-infectie in muizen 5 Testgroep Dosis (mg/kg) Overleving/# testdieren

Controle (fysio- 2/8 logische zoutoplossing)

Vancomycine 10 5/8 10 Antibiotisch WAP- 10 7/8 8294A 2,5 5/8 1,0 4/8 0,5 2/8 (3) Acute toxiciteit-test in muizen

Het antibioticum WAP-8294A werd intraveneus toegediend 15 aan muizen (4 weken oude ICR-MCH mannelijke muizen; 5 dieren per groep) bij een dosering van 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg of 250 mg/kg, er werd geen acute toxiciteit gezien.

Het antibioticum WAP-8294AX werd intraperitoneaal toegediend aan muizen (4 weken oude ICR-MCH mannelijke 20 muizen; 5 dieren per groep) bij een dosering van 25 mg/kg of 100 mg/kg. Er werd echter geen acute toxiciteit gezien.

Uit het voorgaande blijkt dat de antibiotica WAP-8294A, A1( A2, A3, A,, As, A6, AX, AX-l, AX-2, AX-3, AX-4, AX-5, AX-6, AX-7, AX-8, AX-9, AX-10, AX-11, AX-12 en AX-13 effectief 25 zijn als therapeutisch middel voor het behandelen van bacte-riële infectie-ziekten, in het bijzonder, van infectieziektes die het gevolg zijn door infectie met methicilline-resistent Staphylococcus aureus, in de mens en in dieren.

30 (Toepassingen)

Indien de nieuwe antibiotica volgens de onderhavige uitvinding worden toegediend als medicijnen, kunnen zij worden toegediend in verschillende doseringsvormen, in T 0 01 6 T 2 37 overeenstemming met de gebruikelijke wijze. Zij kunnen bijvoorbeeld worden toegepast in oraal toedienbare vormen, zoals poeder, granules, tabletten, capsules en siropen. Zij kunnen veilig worden toegediend in parenteraal toedienbare 5 vormen, zoals (intraveneuze, intramusculaire, subcutane) injecties, druppels, zetpillen, smeersels en zalven. Verder kunnen de nieuwe antibiotica volgens de onderhavige uitvinding op dezelfde wijze veilig worden toegepast in het gebied van de oogheelkundige geneeskunde, als parenteraal toedien-10 bare doseringsvormen zoals oogdruppels en oogzalven. Hierbij wordt in aanmerking genomen dat hun bactericide werking sneller is dan die van vancomycine en dat hun effecitiveit zich uit bij lage concentraties.

Deze verschillende farmaceutische bereidingen kunnen 15 bereid worden door middel van de gewoonlijke werkwijzen, dat wil zeggen, door in het hoofdingrediënt farmaceutisch aanvaardbare en op dit moment toegepaste bekende hulpmiddelen op te nemen, zoals excipiëntia, bindmiddelen, desintegreer-middelen, bekledingsmiddelen, smeermiddelen, stabilisatoren, 20 corrigeermiddelen of smaakstoffen, solubiliseermiddelen, suspendeermiddelen en verdunningsmiddelen, en vervolgens het mengsel in de gewenste doseringsvorm te brengen.

De dosering daarwan kan variëren afhankelijk van, bijvoorbeeld, de te behandelen ziektes, de toedieningswegen 25 en de doseringstijd, maar zij worden bij voorkeur toegediend in een doseringsbereik variërend van 5 mg tot 2000 mg/dag, voor volwassenen, welke doseringen in één keer of in gedeelten op verschillende tijdstippen, kan worden toegediend.

De onderhavige uitvinding zal hierna in meer detail 30 worden beschreven, waarbij verwezen wordt naar de volgende voorbeelden, maar de onderhavige uitvinding wordt niet geacht beperkt te zijn tot deze voorbeelden.

Voorbeeld 1 35 Aan elk van vier Erlenmeyer-kolven met een volume van 500 ml, werd 100 ml van een kweekmedium (pH 7,2), dat 2,5 % glucose, 2,0 % ontvette sojabonenbloem, 0,4 % sojabonenolie, 0,25 % natriumchloride en 0,5 % calciumcarbonaat, bevatte, 1001012 38 toegediend. Dit werd gevolgd door sterilisatie, het enten van elk kweekmedium met één platina oogje van Lvsobacter sp. WAP 8294-stam, welke gekweekt was in een "slant"-agarmedium. Er werd gedurende 2 dagen bij 30°C gekweekt, terwijl de 5 flessen in een rondbewegende schudder, met een snelheid van 180 bewegingen per minuut, werden geschud. Vervolgens werden Erlenmeyer kolven met een volume van 500 ml (150 stuks), waaraan telkens 100 ml van het hiervoor beschreven kweekmedium was toegevoegd en welke vervolgens werden gesterili-10 seerd, bereid, gevolgd door enten daarvan met elk 2 ml van het kweekmedium en kweken gedurende 4 dagen bij 30°C, terwijl de kolven in een ronddraaiiende schudder met 180 bewegingen per minuut, werden bewogen. De antibacteriële activiteit werd bepaald door middel van de agarplaat-werkwijze, 15 onder toepassing van Staphylococcus aureus nr. 1.

Voorbeeld 2

De kweekmedia, verkregen in Voorbeeld 1, werden onderworpen aan continue centrifugatie (9000 rpm) waarbij 15 1 20 supernatans werd verkregen Het supernatans (pH 6,9) werd geladen op een kolom die gepakt was met Amberlite IR-120B (H+-type, 1,5 1, beschikbaar van Rohm & Haas Co.), om 15 1 effluens te verzamelen en 3 1 van een waterige wasvloeistof. Nadat het effluens en de wasvloeistof verzameld waren en de 25 pH daarvan op 3 was gesteld, werd de gecombineerde vloeistof gechromatografeerd door het op een kolom te laden die gepakt was met actieve koolstof (700 ml, beschikbaar van Wako Pure Chemical Co., Ltd.). Na wassen met 4 1 water, werden de actieve verbindingen geëlueerd met 4 1 van een 80 % aceton-30 watermengsel en 4 1 van een 80 % aceton-watermengsel met een pH van 12. Het resulterende eluaat werd geconcentreerd tot 800 ml, gevolgd door het stellen van de pH tot 3, met zoutzuur, en extractie met ethylacetaat (3 x 400 ml) en vervolgens met n-butanol (3 x 400 ml). Het concentreren van de 35 butanol-fase en lyofylisatie daarvan gaf 6,4 g van een ruw produkt (hydrochloride).

1001012 39

Voorbeeld 3

De ruwe verbinding (6,4 g) die verkregen was in Voorbeeld 2 werd gechromatografeerd door deze te laden op een kolom, gepakt met cellulose (450 ml, beschikbaar van E.

5 Merck Company), deze vervolgens te elueren en te fractione-ren met een oplosmiddelsysteem: acetonitril-azijnzuur-water (75:1:25). De actieve fracties werden verzameld, geconcentreerd en vervolgens gelyofyliseerd, waarbij 880 mg van hete WAP-8294A (hydrochloride) als wit poeder werd verkregen.

10

Voorbeeld 4

Het WAP-8294A (700 mg) dat verkregen was in Voorbeeld 3, werd geladen op een "reverse phase high performance liquid chromatography" - (RP-HPLC) - kolom, gepakt met 15 octadecylsilicagel [kolom: YMC-GEL SH-343-5, 20 x 250 mm, beschikbaar van Yamamura Chemical Research Laboratory; mobiele fase: 0,05 % trifluorazijnzuur-bevattend acetoni-tril-water (45:55)], in 10 gedeeltes, om de fracties die WAP-8294A1, A3 en A4 bevatten, te verzamelen. Dit werd ge-20 volgd door het concentreren van elke fractie waarbij WAP-8294AX (50 mg), A2 (210 mg) en A4 (16 mg) als wit poeder (hydrochloride) werden verkregen.

Voorbeeld 5

25 Aminozuuranalyse van WAP-8294A

Het WAP-8294A (5 mg) dat verkregen was in Voorbeeld 3, werd opgelost in 0,5 ml 4N methaansulfonzuur-oplossing, waaraan 0,2 % 3-(2-aminomethyl)indool was toegevoegd om het antibioticum volledig te hydrolyseren met het zuur, geduren-30 de 24 uur bij 110°C. Het resulterende hydrolysaat werd geconcentreerd tot droog, opgelost in een kleine hoeveelheid water, gevolgd door het laden van de oplossing op een kolom, die gepakt was met Dowex 50WX-8 (H+-type, 1 ml, bescchikbaar van Dow Chemical Co.), wassen met 20 ml water en vervolgens 35 elueren met 20 ml van een 0,5 N NH4OH-oplossing. Het eluaat werd geconcentreerd tot drogen, opgelost in een kleine hoeveelheid water, vervolgens onderworpen aan tweedimensionale dunnelaagchromatografie [celluloseplaat ,· oplosmiddel 1: 10 01 0 12 40 n-butanol:azijnzuur:water (4:1:2); oplossing 2: n-buta-nol:pyridine:azijnzuur:water (15:10:3:12)] en aminozuurana-lyse (Hitachi Amino Acid Analyzer L-8500). Op deze wijze werd gevonden dtit het eluaat Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly 5 (1 mol), Ser (2 mol), Leu (1 mol), Trp (1 mol) en Orn (2 mol), omvatte, alsmede drie soorten onbekende aminozuren. De resultaten van deze tweedimensionale TLC-analyse van het antibioticum WAP-8294A wordt weergegeven in Fig. 5.

10 Voorbeeld 6

Identificatie van de onbekende aminozuren

Aan 100 mg van het WAP-8294A, verkregen in Voorbeeld 3, werd 10 ml van een 6N HC1-oplossing toegevoegd, welke 4 % thioglycolinezuur bevatte. Dit werd gevolgd door hydrolyse 15 van het antibioticum bij 110°C gedurende 20 uur. Na concentreren van het hydrolysaat, werd de pH daarvan gesteld op 7,0 en werd het hydrolysaat onderworpen aan kolomchromato-grafie, onder toepassing van Sepabeads SP207 (beschikbaar van Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) terwijl ontwikkeld 20 werd met water. De fractie die tussen 18 ml en 27 ml elueer-de uit de kolom, en die het onbekende aminozuur-l omvatte, werd geconcentreerd en geladen op een kolom, gepakt met Dowex 50WX-8 (H+-type, 9 ml) . Na elueren met 0, IN HCl-oplos-sing, werd het resulterende eluaat geconcentreerd tot droog, 25 waarbij 4 mg van het onbekende aminozuur-l-hydrochloride, als wit poeder, werd verkregen. Het aminozuur bleek een moleculair gewicht te hebben van 149 [FAB-MS m/z: 150 (M+H)*] en ^-NMR spectrum [D20, 270 MHz; chemische verschuiving: Ö (ppm)] bij 4,53 (1H, d, J=2,9Hz) en 5,00 (1H, d, 30 J=2,9Hz). Op deze wijze ondersteunde het de aanname dat het om β-hydroxyasparaginezuur ging.

Indien dit vergeleken werd met een authentiek monster van β-hydroxyasparaginezuurhydrochloride (beschikbaar van Sigma Company), bleken de ^-NMR spectra (chemische ver-35 schuivingen) en de Rf-waarde (0,20) die gemeten was op de cellulose TLC [oplosmiddel: n-butanol:pyridine:azijnzuur:wa-ter (15:10:3:12)] van het onbekende aminozuur-l-hydrochlori-de volledig identiek te zijn aan die welke gemeten worden 1001012 41 voor het authentieke monster. Dienovereenkomstig werd het onbekende aminozuur-l geïdentificeerd als β-hydroxyasparagi-nezuur.

Daarnaast werd de fractie die tussen 30 ml en 45 ml 5 elueerde uit de Sepabeads SP207 kolom, welke het onbekende aminozuur-2 bevatte, geconcentreerd en geladen op een kolom die gepakt was met 10 ml actieve koolstof. De fractie die tussen 24 en 34 ml elueerde, werd verzameld, geladen op een Dowex 50WX-8 kolom (1 ml), geëlueerd met 0,5 N NH40H-oplos-10 sing, gevolgd door concentreren tot droog. Daarbij werd 2,1 mg van het onbekende aminozuur-2 als wit poeder verkregen. Dit aminozuur bleek een moleculair gewicht te hebben van 131 [FAB-MS m/z: 132 (M+H) *] en 1H-NMR spectrum [D20, 27 0 MHz ; chemische verschuiving: δ (ppm)] bij 1,18 (6H, dd, J=7,0Hz), 15 2,38 (1H, dq, J=4,8, 7,0 Hz), 2,87 (3H, s) en 3,55 (1H, d, J=4,8Hz). Op deze wijze leek het om N-methylvaline te gaan. Dit aminozuur werd dan ook vergeleken met een authentiek monster N-methyl-DL-valine (beschikbaar van Sigma Company) en het bleek dat het 1H-NMR spectrum (chemische verschuivin-20 gen) en de Rf-waarde (0,71), die gemeten waren op cellulose TLC (oplosmiddel: n-butanol:pyridine:azijnzuur:water (15:10:3:12)] van het onbekende aminozuur-2 volledig identiek waren aan de waarden die gemeten waren voor het authentieke monster. Dienovereenkomstig werd het onbekende amino-25 zuur-2 geïdentificeerd als N-methylvaline.

Verder werd de fractie die met 80 % aceton elueerde uit de Sepabeads SP207 kolom, en die het onbekende aminozuur-3 bevatte, geconcentreerd en geladen op een Dowex 50WX-8 kolom (H+-type, l ml). Na de eluering daarvan met IN HC1-oplos-30 sing, werd het resulterende eluaat geconcentreerd tot droog, waarbij 3,5 mg van het onbekende aminozuur-3 hydrochloride, als wit poeder, werd verkregen. Dit aminozuur bleek een moleculair gewicht te hebben van 179 [FAB-MS m/z.· 180 (M+H)+] en 1H-NMR spectrum [D20, 270 MHz,· chemische verschui-35 ving: δ (ppm)] bij 2,78 (1H, s), 3,32 (2H, d, J=6,2Hz), 3,95 (1H, t, J=6,2Hz), 7,4~7,5 (5H, m). Het leek dan ook te gaan om N-methylfenylalanine. Dit aminozuur werd dan ook vergeleken met een authentiek monster van N-methyl-L-fenylalanine 1001012 42 (beschikbaar van Sigma Company) en het bleek dat het 1H-NMR spectrum (chemische verschuivingen) en de Rf-waarde (0,82) die gemeten waren op cellulose TLC (oplosmiddel: n-buta-nol:pyridine:azijnzuur:water (15:10:3:12)] van het onbekende 5 aminozuur-3 volledig identiek waren aan de waarden die gemeten waren voor het authentieke monster. Dienovereenkomstig wordt het onbekende aminozuur-3 geïdentificeerd als N-methylfenylalanine.

10 Voorbeeld 7

Amino zuur analyse van WAP-8294A!, k2 en A4

Ongeveer 30 μg WAP-8294A1( A2 of A4, verkregen in Voorbeeld 4, werd volledig gehydrolyseerd met een 6N HC1-oplossing bij 110°C gedurende 24 uur. Vervolgens werd het gecon-15 centreerd en onderworpen aan aminozuuranalyse. Als resultaat bleek dat elk van hen Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Ser (2 mol), Leu (1 mol), Orn (2 mol), Trp (1 mol), β-hy-droxyasparaginezuur (1 mol), N-methylvaline (1 mol) en N-methylfenylalanine (1 mol), omvatte.

20

Voorbeeld 8

Isolatie van de vetzuren die WAP-8294A!, A2 en A4, uitmaken alsmede de structuur daarvan

Het WAP-8294Aj (10 mg) dat verkregen was in Voorbeeld 25 4, werd gehydrolyseerd met 6N HC1 gedurende 2 uur bij 110°C. Het resulterende hydrolysaat werd geëxtraheerd met ether, gevolgd door concentratie van de etherfase tot droog, waarbij 0,8 mg wit poeder werd verkregen. Deze verbinding bleek een moleculair gewicht te hebben van 160 [FAB-MS m/z: 161 30 (M+H)*] en 1H-NMR spectrum [CDC13, 270 MHz; chemische verschuiving: ö (pprn)J bij 0,89 (3H, t, J-7,0Hz), 1,3-1,55 (8H, m), 2,46 (1H, dd, J=16,5, 8,8Hz), 2,58 (1H, dd, J=16,5, 3,3Hz) en 4,03 (1H, m). Het leek dan ook te gaan om 3-hy-droxyoctaanzuur. Deze verbinding (100 μg) werd opgelost in 35 0,1 ml benzeen .-methanol (8:2) en omgezet in de methylester daarvan bij kamertemperatuur gedurende 10 min., door het toevoegen van een druppel trimethylsilyldiazomethaan (beschikbaar van Tokyo Chemical Industrie Co., Ltd.). Indien de 1001012 43 verkregen methylester werd onderworpen aan EI-MS-metingen, werd een ionenpiek gezien bij m/z = 173 (M+ -1) , fragment ionenpieken bij 156 (M* -18) , 143 (M+ -31) en 125 (M* -31 -18) en een karakteristieke basisfragmentionenpiek bij m/z 5 103, afkomstig van de splitsing van C3-C4 van de 3-hydroxy vetzure methylester. Deze verbinding werd dienovereenkomstig geïdentificeerd als 3-hydroxyoctaanzuur.

Het WAP-8294A2 (10 mg) werd gehydrolyseerd met een zuur op dezelfde wijze als hierboven beschreven, gevolgd door 10 extractie met ether en concentratie van de etherfase tot droog, waarbij 0,9 mg wit poeder werd verkregen. Deze verbinding bleek een moleculair gewicht te hebben van 174 [FAB-MS m/z: 175 (M+H)*] en 1H-NMR spectrum [CDClj, 270 mHz; chemische verschuiving: δ (ppm)] bij 0,87 (6H, d, J=6,6Hz), 15 1,15-1,56 (7H, m), 2,50 (1H, dd, J=16,5, 8,8Hz), 2,60 (1H, dd, J=16,5, 3,3Hz) en 4,03 (1H, m), en het methylesterderi-vaat daarvan vertoonde EI-MS-pieken bij m/z 187 (NT -l) , 170 (M* -18), 157 (M+ -31), 139 (M+ -31) 018) en 103 (basisfragment ionenpiek, afkomstig van het splitsen van C3-CJ . Deze 20 verbinding werd dienovereenkomstig geïdentificeerd als 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur.

Het WAP-8294A, (10 mg) werd gehydrolyseerd met een zuur op dezelfde wijze als hierboven beschreven, gevolgd door extractie met ether en concentratie van de etherfase tot 25 droog, waarbij 0,8 mg wit poeder werd verkregen. Deze verbinding bleek een moleculair gewicht te hebben van 188 [FAB-MS rn/z: 189 (M+H)*] en ^-NMR spectrum [CDClj, 270 MHz; chemische verschuiving: δ (ppm)] bij 0,80 (6H, d, J=6,8,

Hz), 1,15-1,6 (9H, m), 2,43 (1H, dd, J-16,5, 8,8Hz), 2,50 30 (1H, dd, J=16,5, 3,3Hz) en 3,95 (1H, m) en het methylester- derivaat daarvan vertoonde EI-MS pieken bij m/z 2 01 (Μ* -1) , 184 (M+ -18), 171 (M+ -31), 153 (M+ -31 -18) en 103 (basisfragment ionenpiek afkomstig van het splitsen van C3-C4) .

Deze verbinding werd dienovereenkomstig geïdentificeerdd als 35 3-hydroxy-8-methaannonaanzuur.

1001012 44

Voorbeeld 9

Een ruwe verbinding (9,0 g), verkregen op dezelfde wijze als toegepast in Voorbeeld 2, werd gechromatografeerd door deze te laden op een kolom, die gepakt was met octade-5 cylsilicagel (chromatolex ODS-DM1020T, afkomstig van Fuji Silicia Chemical Co., Ltd., 450 ml). Vervolgens werd deze geëlueerd en gefractioneerd met een 0,05 % trifluorazijnzuur bevattend acetonitril:water (4:6)-oplosmiddelsysteem. De actieve fracties werden verzameld, geconcentreerd, en ver-10 volgens gelyofyliseerd waarbij 450 mg WAP-8294AX (hydrochloride) als wit poeder werd verkregen.

Voorbeeld 10

Het WAP-8294AX (120 mg) dat verkregen was in Voorbeeld 15 9, werd geladen, in 10 gedeelten, op een kolom die gepakt was met octadecylsilicagel voor "high performance liquid chromatography” (HPLC) [kolom: YMC-GEL SH-343-5, 20 x 250 mm, beschikbaar van Yamamura Chemical Research Laboratory; mobiele fase: 0,05 % trifluorazijnzuur-bevattend acetoni-20 tril-water (37:63)], in tien gedeelten, waarbij de fracties die elke WAP-8294AX-8, AX-9 of AX-13, omvatten, werden verzameld. Dit werd gevolgd door concentratie van elke fractie waarbij WAPO-8294AX-8 (14 mg), AX-9 (10 mg) of AX-13 (12 mg), als wit poeder (hydrochloride) werd verkregen.

25

Voorbeeld 11

Aminozuuranalyse van WAP-8294AX-8, AX-9, AX-13

Het WAP-8294AX-8 (5 mg), dat verkregen was in Voorbeeld 10, werd opgelost in 0,5 ml 4N methaansulfonzuur oplossing, 30 aangevuld met 0,2 % 3-(2-aminomethyl)indool, om zuur complete hydrolyse daarvan uit te voeren gedurende 24 uur bij 110°C. Vervolgens werd het resulterende hydrolysaat geconcentreerd tot droog, opgelost in een kleine hoeveelheid water, gevolgd door laden op een kolom, die gepakt was met 35 Dowex 50WX-8 (H+-type, beschikbaar van Dow Chemical Co., l ml). Dit werd gevolgd door wassen met 20 ml water en elueren met 20 ml 0,5 N NH40H. Het resulterende eluaat werd geconcentreerd tot droog, opgelost in een kleine hoeveelheid 1001012 45 water en vervolgens onderworpen aan tweedimensionale dunne-laagchromatografie (ontwikkelingsoplosmiddel voor eerste dimensie:n-butanol:azijnzuur:water (4:1:2); ontwikkelings-vloeistoffen voor de tweede dimensie: n-butanol .-pyridi-5 ne:aijnzuur:water (15:10:3:12)) en aan aminozuuranalyse (Hitachi Aminozuur Analyzer L-8500). Als resultaat werd gevonden dat het WAP-8294AX-8 Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Ser (2 mol), Leu (1 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), Val (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en β-hydroxyaspa-10 raginezuur (1 mol), omvatte.

Daarnaast werden WAP-8294AX-9 en AX-13, elk 5 mg, onderworpen aan zuurcomplete hydrolyse en vervolgens werden de resulterende hydrolysaten onderworpen aan aminozuuranalyse, op dezelfde wijze als hierboven beschreven. Als resul-15 taat werd gevonden dat het WAP-8294AX-9 Asp (1 mol), Glu (1 mol) , Gly (1 mol) , Ser (2 mol) , Leu (1 mol) , Trp (l mol) ,

Orn (2 mol), Phe (1 mol), N-methylvaline (1 mol) en β-hy-droxyasparaginezuur (1 mol), omvatte,· en dat het WAP-8294AX-13 Asp (1 mol), Glu (1 mol), β-Ala (1 mol), Ser (2 mol), Leu 20 (1 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylfenylalanine (1 mol), N-methylvaline (1 mol) en β-hydroxyasaparaginezuur (1 mol), omvatte.

Voorbeeld 12 25 Vetzuuranalyse van WAP-8294AX-8, AX-9, AX-13

Het WAP-8294AX-8, AX-9 en AX-13 (1 mg elk), verkregen in Voorbeeld 10, werden gehydrolyseerd gedurende 2 uur bij 110°C, met 6N HC1. Elk hydrolysaat werd geëxtraheerd met ether, gevolgd door concentratie van de etherfase tot droog, 30 oplossen van het residu in 0,1 ml van een mengsel van benzeen en methanol (8:2) en omzetten in de methylester daarvan gedurende 10 min. bij kamertemperatuur, door toevoeging van een druppel trimethylsilyldiazomethaan (beschikbaar van Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). Elke methylesterderivaat 35 werd onderworpen aan GC-MS-analyse (kolom: DB-5 (binnenste diameter: 0,25 mm,· lengte: 30 m; filmdikte: 0,25 μπί; beschikbaar van J & W Company); temperatuur: 100 tot 240°C (verhittingssnelheid: 10°C/min.); gasfase: helium,· vloei- 1001012 46 t stofsnelheid: 0,993 ml/min.]. In alle gevallen was de reten-tietijd (9,7 min.) in de GC analyse en m/z, als bepaald door middel van EI-MS, van 187 (M+ -1) , 170 (M+ -18) , 157 (M+ -31), 139 (M* -31 -18) en 103 (afkomstig van het splitsen van 5 C3-C4; een karakteristieke basisfragmentionenpiek) in overeenstemming met de metingen die gezien waren voor het methy-lesterderivaat van 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (een vetzuur dat het WAP-8294A2 uitmaakt) . Dit geeft aan dat zowel WAP-8294AX-8, AX-9 als AX-13 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur als 10 vetzure component omvatten.

Voorbeeld 13

Farmaceutische bereidingen van WAP-8294A

Typische voorbeelden van farmaceutische bereidingen van 15 het WAP-8294A zullen hieronder beschreven worden.

Injectie:

Volgens de regels die zijn neergelegd in de algemene regels voor bereidingen, "injecties", in de Pharmacopoeia 20 van Japan, 12de uitgave, werd 40 mg WAP-8294A hydrochloride opgelost in 3 ml gesteriliseerd fysiologische zoutoplossing (Japanse Pharmacapoeia), op steriele wijze gebracht in een ampul met een volume van 3 ml, en verzegeld door middel van fusie, om klaar te zijn voor injectiedoeleinden.

25

Tablet:

Volgens de regels die zijn neergelegd in de algemene regels voor bereidingen, "tabletten", werden aan 100 mg WAP-8294A2 hydrochloride, 65 mg lactose (Japanse Pharmacopoeia) 30 en 14,2 mg zetmeel (Japanse Pharmacopoeia) toegevoegd als excipièntia; 20 mg polyvinylpyrrolidon K25 (Japanse Pharmacopoeia) toegevoegd als bindmiddel; en 0,8 mg magnesiumstea-raat (Japanse Pharmacopoeia) toegevoegd als smeermiddel, gevolgd door uniform mengen, vormen onder druk met een 35 tabletteermachine waarbij onbeklede tabletten worden gevormd die elke een gewicht hebben van 200 mg.

10 0 10 12 47

Zalven:

Volgens de regels die zijn neergelegd in de Algemene Regels voor Bereidingen, "zalven", werden aan 40 mg WAP-8294A2 hydrochloride, 1,2 g polyethyleenglycol 4000 (Japanse 5 Pharmacopoeia), 600 mg polyethyleenglycol 400 (Japanse

Pharmacopoeia), 156 mg hydrofiel vaseline (Japanse Pharmacopoeia) , en 0,8 mg propyl p-oxybenzoaat (Japanse Pharmacopoeia) en 3,2 mg ethyl p-oxybenzoaat (Japanse Pharmacopoeia) toegevoegd als antischimmelmiddelen, gevolgd door smelten en 10 uniform kneden onder verhitting, waarbij een zalf wordt verkregen (4 g/samenknijpbare tube).

Oogdruppels:

Volgens de regels die zijn neergelegd in de algemene 15 regels voor bereidingen, "oogdruppels", werd 25 mg WAP-8294A2 hydrochloride opgelost in 5 ml van een 0,9 %-ige gesteriliseerde natriumchlorideoplossing. Vervolgens werd 0,5 mg benzalkoniumchloride (Japsne Pharmacopoeia) als conserweringsmiddel daaraan toegevoegd waarbij een uniforme 20 oplossing werd verkregen, gevolgd door steriele filtratie en steriel verpakken in een oogdruppelaar met een volume van 5 ml, waarbij oogdruppels werden verkregen.

Zoals hierboven is beschreven, wordt door de toepassing 25 van een klein dieren-infectie-model aangetoond, dat het nieuwe antibioticum WAP-8294A volgens de onderhavige uitvinding, uitstekende therapeutische effecten vertoont op infectieziekten die het gevolg zijn van infectie met grampositie-ve bacteriën, in het bijzonder, met MRSA (methicilline-30 resistent Staphylococcus aureus), dat tegenwoordig een serieus probleem is geworden in de medische geneeskunde. Dientengevolge kan het antibioticum effectief zijn bij het behandelen van ziekten, waaronder MRSA-infectieziekten, die het gevolg zijn van infectie met grampositieve bacteriën als 35 infecterende bacteriën.

1001012

Claims (12)

1. Antibioticum WAP-8294A of farmaceutisch aanvaardbaar 5 zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigenschappen: (1) Verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 213-220°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 10 in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een 15 golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorf f ,· (5) Retentietijd in HPLC (Fig. 1): 4,0 tot 5,1 minuten, 8,0 minuten, 11,1 minuten, 12,5 minuten, 16,5 minuten, 17,9 20 minuten, 18,8 minuten,- (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water): Xmax: 275 nm, 280 nm, 287 nm,· (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 25 cm'1, 1541 cm"1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) H-NMR spectrum: (270 MHz, D20): gecompliceerde proton- signalen worden gezien, welke afkomstig zijn van methyl, methyleen, methine en heterocyclische of aromatische ringen; 30 (9) Moleculair gewicht: 1400-1700; (10) Kwalitatieve test voor organische verbinding (natrium-smeltwerkwijze): het antibioticum is een verbinding welke koolstof-, waterstof- en zuurstof- en stikstof-elementen omvat; 35 (11) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als ninhydrine-positieve verbindingen, in Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Trp, Orn, N-methylvaline, β-hydroxyasparaginezuur en N-methylfenylalanine; i 0 010 12 (12) Specifieke rotatie: [a] d20 = +42° (c = 0,5, H20) ; (13) Klassificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer.

2. Xmax: 27 5 nm, 2 80 nm, 2 87 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm"1, 1207 cm"1, 1133 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1547,9 (FABS-MS m/z 1548,9 (M+H)*, 25 m/z 1546,7 (M-H) ) ; (9) Moleculaire formule: C72H109O2lN17 (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet in: Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 mol), β-hydroxyas- 30 paraginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en 3-hydroxyoctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [of]d20 = +41° (c = 0,5, H20) ,· (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfoteer,·

2. Antibioticum WAP-8294A1( of farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigen- 5 schappen: (1) Verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 10 in aceton, ethylacetaat en chloroform; (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een 15 golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC : 8,0 minuten; (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water):

3. Antibioticum WAP-8294A2 of farmaceutisch aanvaard-35 baar zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigenschappen : (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding); 1001012 (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine,

4. Antibioticum WAP-8294A4 of farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigen- 30 schappen: (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder,· (2) Smeltpunt: 215-225°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 35 in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo- 1001012 t vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp,· negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; 5 (5) Retentietijd in HPLC : 16,5 minuten,· (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xm,x : 275 nm, 280 nm, 289 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 10 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm"1, 1207 cm'1, 1137 cm'1,· (8) Moleculair gewicht: 1400-1700,- (9) Moleculaire formule: C73H113021N17,· (10) Zure hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol, Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 15 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 mol), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol), en 3-hydroxy-8-methylnonaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie.· [of]D20 = +43° (c = 0,5; H,0) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer;

5. Antibioticum WAP-8294AX of farmaceutisch aanvaard baar zout daarvan met de volgende fysicochemische eigenschappen : (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 196~200°C (ontleding); 25 (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper- 30 manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff,· 35 (5) Retentietijd in HPLC: 5,3 minuten, 5,9 minuten, 6,2 minuten, 6,5 minuten, 6,9 minuten, 7,3 minuten, 8,1 minuten, 9,3 minuten, 9,8 minuten, 11,3 minuten, 12,1 minuten, 13,7 minuten en 15,0 minuten; 1001012 (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : \nax ·. 273 nm, 280 nm, 287 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm1, 1636 5 cm'1, 1541 cm 1, 1404 cm'1, 1207 cm"1, 1137 cm'1; (8) 1H NMR spectrum: (270 MHz, DMS0-d6) : gecompliceerde protonsignalen worden gemeten, welke afkomstig zijn van methyl, methyleen, methine en heterocyclische of aromatische ringen,· 10 (9) Moleculair gewicht: 1400-1700 (10) Kwalitatieve test voor organische verbindinge (natrium-smeltmethode): het antibioticum is een verbinding welke koolstof-waterstof-zuurstof- en stikstofelementen omvat; 15 (11) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als ninhydrine-posi- tieve verbindingen en vetzuren, in: Asp, Glu, Gly, β-Ala, Leu, Ser, Trp, Orn, Val, N-methylvaline, β-hy-droxyasparaginezuur, Phe, N-methylfenylalanine en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur; 20 (12) Specifieke rotatie: [ar]d20 = +24° (c = 0,5, H20) ; (13) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer;

5 Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper- manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-10 chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC : 11,1 minuten; (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xmax : 275 nm, 280 nm, 287 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteris- 15 tiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm'1, 1541 cm'1, 1404 cm"1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1561,9 [FAB-massa m/z 1562,9 (M+H)\ m/z 1561.2 (M-H)'] ; (9) Moleculaire formule·. C73H11102lN17 20 (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol, Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline (1 mol), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenyla-lanine (1 mol), en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 25 mol) ; (11) Specifieke rotatie: [or] D20 = +42° (c = 0,5; H20) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer,·

6. Antibioticum WAP-8294AX-8 of farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigenschappen : 25 (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder,· (2) Smeltpunt: 196~200°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; 30 (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp,· 35 negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri- chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC: 9,3 minuten 1001012 t (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : \max : 273 nm, 280 nm, 289 nm,· (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 5 cm"1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1133 cm'1; (9) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1549 (M+H)+); (9) Moleculaire formule : C72Hl09O21N17 ; (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (l mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser 10 (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), Val (1 mol), β- hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine (1 mol) en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 moL); (11) Specifieke rotatie: [a] D20 = +25° )c = 0,5, H20) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer;

7. Antibioticum WAP-8294AX-9 of farmaceutisch aanvaard baar zout daarvan, met de volgende fysicochemische eigenschappen : (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder,· (2) Smeltpunt: 216~220°C (ontleding); 20 (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar in aceton, ethylacetaat en chloroform; (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper- 25 manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdo vende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp; negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorf f ,· 30 (5) Retentietijd in HPLC: 9,8 minuten (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water): XMX : 273 nm, 280 nm, 289 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 35 cm'1, 1541 cm"1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1549 (M+H)+; m/z 1547 (M-H)'); (9) Moleculaire formule: C72H109O21N17; 1001012 ♦ (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in Asp (1 mol), Glu (1 mol), Gly (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol) , Trp (1 mol) , Orn (2 mol) , Val (1 mol) , β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), Phe (1 mol) en 3-hy- 5 droxy-7-methyloctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [alt,20 = +28° (c = 0,5, H20) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer,·

8. Antibioticum WAP-8294AX-13 of farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, met de volgende fysicochemische 10 eigenschappen: (1) Uiterlijke verschijning: wit poeder; (2) Smeltpunt: 205~210°C (ontleding); (3) Oplosbaarheid: oplosbaar in water, methanol, n-butanol, dimethylformamide en dimethylsulfoxyde en onoplosbaar 15 in aceton, ethylacetaat en chloroform,· (4) Kleurreactie: positief in reacties van ninhydrine, Ehrlich, Rydon-Smith, waterige oplossing van kaliumper-manganaat, zwavelzuur en jooddamp, en vertoont uitdovende vlekken bij bestraling met lichtstralen met een 20 golflengte van 254 nm uitgezonden door een UV lamp,· negatief in reactie van Molisch, zilvernitraat, ferri-chloride en Dragendorff; (5) Retentietijd in HPLC: 15,0 minuten (6) Ultraviolet absorptiespectrum (in water) : Xmax : 273 nm, 25 280 nm, 289 nm; (7) Infrarood absorptiespectrum (FT-IR, KBr): Karakteristiek absorptiespectrum: 3300 cm'1, 1720-1715 cm'1, 1636 cm"1, 1541 cm'1, 1404 cm'1, 1207 cm'1, 1137 cm'1; (8) Moleculair gewicht: 1548 (FAB-massa m/z 1577 (M+H)*]; 30 (9) Moleculaire formule: C74Hu3021Nl7 ,· (10) Zuur-complete hydrolyse voorziet, als hydrolysaten, in: Asp (1 mol), Glu (1 mol), β-Ala (1 mol), Leu (1 mol), Ser (2 mol), Trp (1 mol), Orn (2 mol), N-methylvaline), β-hydroxyasparaginezuur (1 mol), N-methylfenylalanine 35 (1 mol) en 3-hydroxy-7-methyloctaanzuur (1 mol); (11) Specifieke rotatie: [or]D20 = +27° (c = 0,5, H20) ; (12) Classificatie in base, zuur en neutraal: amfotheer. 1001012 4 *

9. Een werkwijze voor het produceren van het antibioticum WAP-8294A volgens één van de conclusies 1 tot 8, welke werkwijze de stappen omvat van het kweken, in een kweekmedi-um, van een micro-organisme dat behoort tot het genus Lysob-5 acter. dat de mogelijkheid heeft van het produceren van het antibioticum WAP-8294A, volgens één van de conclusies 1 tot 8, om het antibioticum te produceren en het te laten ophopen in het kweekmedium; en vervolgens het antibioticum te winnen.

10. Micro-organisme behorende tot het genus Lvsobacter. dat de mogelijkheid heeft tot het produceren van het antibioticum WAP-8294A, volgens één van de conclusies l tot 8.

11. Micro-organisme volgens conclusie 10, waarin het micro-organisme Lysobacter sp. WAP-8294 is.

12. Antibacteriële samenstelling, welke tenminste één lid gekozen uit de groep bestaande uit het antibioticum WAP-8294A en farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, als weergegeven in één van de conclusies 1 tot 8, omvat. 1001012