KR820000513B1 - β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Description

β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 유도체의 제조방법

제1도는 항생물질 PS-6나트륨에 기록된 차아트를 나타낸 것임.

제2도는 항생물질 PS-6나트륨염 적외석 흡수 스펙트럼.

제3도는 항생물질 PS-6나트륨염의 100MHz 푸로톤 핵자기공명 스펙트럼.

제4도는 항생물질 PS-7나트륨염의 자외선 흡수 스펙트럼.

제5도는 KBr정제에서 측정한 적외선 흡수 스펙트럼.

제6도는 중수증에서 측정한 100MHz 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼.

제7도는 적외선 흡수 스펙트럼 차아트를 나타낸 것임.

제8도는 항생물질 PS-6의 메틸에스테르의 100MHz 프로톤 자기 공명 스펙트럼.

본 발명은 β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

β-락타마제 저지 활성을 갖는 항생물질이나 또는 β-락타마제 저지제 중 일부는 공지되었다. 예를들면, 다음과 같은 것이 공지되었다. 스트렙토마이시스(Streptomyces)속에 속하는 MC696-SY2-생성균주의 배양액으로부터 단리시킨 MC696-SY2-A 및 B(미합중국 특허 제3, 981, 788호:Derwent CPI 19171X), 스트렙토마이시스 속에 속에는 MM4550 또는 MM13902 생성균주의 배양체로 부터 단리시킨 MM4550 또는 MM13902(독일연방공화국 특허출원 공개공고 제2, 513, 855호:Derwent CPI 67721W; 독일특허출원 공개 공고 제2, 513, 854호:Derwent CPI 67720W), 스트렙토마이시스 클라불리계루스(Streptomyces clavulgerus)의 배양체로부터 단리시킨 클라불란산(독일연방 공화국 특허출원공개공보 제2, 517, 316호:Derwent CPI 72840W)등, 페니실린과 같은 화학구조식을 갖는 항생체 티에나마이신과 그의 유도체가 또한 공지되었다(미합중국 특허 제3, 950, 375호:Derwent CPI 31696X; 독일 연방공화국 특허출원 공개공고 제2, 652, 677호:Derwent CPI 40282Y; 벨기에 특허 제848, 346호:Derwent CPI 34505Y; 벨기에 특허 제848,349호 : Derwent CPI 34057Y; 독일연방공화국 특허출원 공개공고 제2,652,680호 : Derwent CIP 40283Y; 독일연방공화국 특허출원 공개공고 제2, 652, 675호:Derwent CPI 40280Y: 독일연방공화국 특허출원 공개공고 제2, 652, 674호:Derwent CPI 40279Y:독일연방공화국 특허출원 공개공고 제2, 652, 676호:Derwent CPI 40281Y).

본 발명자는 전술한 선행문헌에 기재되지 않았으며, 1977년 일본 특허출원 제35375호 및 94651호에 기재된 다음과 같은 구조식의 항생물질일 β-락탐 항생물질 “PS-5”를 발견했다.

본 발명은 신규한 항생물질 및 그의 유도체의 제조방법에 관한 것으로, 더 구체적으로, 강력한 항생효과, β-락타마제 저지 활성 및 β-락타마제 생성제에 대해 페니실린, 세팔로스포린 등의 항생효과를 상승적으로 증대시키는 능력을 갖는 PS-6 및 PS-7으로서 정의되는 신규 항생물질 및 그의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제1목적은 강력한 항생효과와 β-락타마제 저지 활성을 갖는 신규 항생물질 PS-6 및 PS-7을 제공하는 것이다.

본 발명의 제2목적은 또한 강력한 항생효과와 β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 PS-6 및 PS-7의 에스테르 유도체, 특히 트릴유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 신규 항생물질 PS-6 및 PS-7 및 그의 트리틸유도체가 또한 β-락타마제-생성내성 균에 대해 페니실린, 세팔로스포린 등의 항생효과를 상승적으로 증대시키는 능력을 갖는 것을 나타내는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 발효법에 의해 항생물질 PS-6 및 PS-7을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항생물질 PS-6 및 PS-7의 유도체, 더 구체적으로 에스테르 유도체, 특히 트리틸유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 목적은 그람-양성 및 그람-음성균이 일으키는 전염병에 사용하기 위한 항생물질 PS-6 및 PS-7 또는 그의 트리틸 유도체에 페니실린, 세팔로스포린 및 기타 β-락타마제 감응 항생물질을 상승 결합시킨 약제, 그의 예방 및 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기타 목적을 구체적으로 기재한다.

본 발명은 다음과 같은 일반식(I)의 화합물

(식중, R₁은 CH₃이고, R₂는 -CH₂-CH₂-이거나 또는 R₁은 H이고, R₂는 -CH=CH-이고, R₃는 수소, 저급알킬 또는 트리페닐메틸이다) 및 R₃가 수소인 일반식(I)의 화합물의 염에 관한 것이다.

R₁이 CH₃이고, R₂가 -CH₂-CH₂-인 일반식(I)의 화합물, 즉 다음과 같은 일반식(Ia)으로 표시되는 화합물은 본 명세서에 항생물질 PS-6이라고 칭한다.

R₁이 H이고, R₂가 -CH=CH-인 일반식(I)의 화합물, 즉 다음과 같은 일반식(Ib)로 표시되는 화합물은 본 명세서에서 항생물질 PS-7이라고 칭한다.

이들 항생물질 PS-6, PS-7 및 그의 유도체를 이하에 구체적으로 설명한다.

[I] 항생물질 PS-6

항생물질 PS-6는 다음과 같은 물리-화학적 성상과 생물학적 성상에 의해 특정지어진다.

항생물질 PS-6의 물리-화학적 성상

(1) 페이퍼 크로마토그라피

항생물질 PS-6(나트륨염)은 하강 페이퍼크로마토그라피에서 도요 휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제)과 다음과 같은 용매를 사용했을 때에 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

아세토니트릴/트리스/EDTA(주 1):R_f=0.41

에탄올/물(7/3):R_f=0.65

[주 1:아세토니트릴 120ml, 1/10M트리스(하이드록시 메틸)-아미노메탄-염산완충액(pH 7.5) 30ml 및 1/10M 소디움 에틸렌디아민테트라아세테이트 수용액(pH4.5) 1ml로 되는 혼합용매]

본 명세서에서 용매비는 별도 지시가 없는 한 용적대 용적비로서 나타낸 것이다.

(2) 박층크로마토그라피(TLC)

박층 크로마토그라피를 크로마토그람시이트 13254셀룰로오스 제6065번(이스트맨코닥회사제)과 다음과 같은 용매를 전개용매로 사용했을 때에 다음과 같은 항생물질 PS-6(나트륨염)의 R_f치가 얻어졌다.

n-부탄올/에탄올/물(4/1/5)(상부층):R_f=0.67

n-프로판올/물(8/2):R_f=0.69

n-부탄올/i-프로판올/물(7/7/6):R_f=0.7

아세토니트릴/물(8/2):R_f=0.63

(3) 고전압 페이퍼전기 영동

고전압 페이퍼 전기 영동장치(사반트 인스트루먼트스 회사제, 고전압 전원 HV 3000A, 플레트 플레이스 전기 영동 챔버 FP 18A)를 사용하여 항생물질 PS-6(나트륨염)를 도요휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제)로 전기 영동 처리했을 경우 다음과 같은 조성과 pH를 갖는 완충용액에서 다음과 같은 현상이 관찰되었다.

항생물질이 물 3000ml, 바르비탈 3.3g 및 소디움 바르비탈 25.5g으로 되는 완충액(pH8.6)에서 42V/cm의 전위구배로 30분 동안 전류를 통과시킬 경우 양극 쪽을 향해 적어도 5mm이상, 통상으로 10 내지 40mm의 거리만큼 이동하는 것을 발견했다.

(4) β-락타마제에 대한 행동

활성은 바실루스 시어리어스(Bacillus cereus)의 β-락타마제에 의해 활성화되지 않았다.

(5) 산, 중성 및 염기 중의 구별

항생물질 PS-6은 분자 중에 한개의 카르복실기를 갖는 일 염기산이다.

(6) 자외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-6(나트륨염)의 특성적인 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같다.

=약 300nm

(7) 적외선 흡수 스펙트럼

KBr 정제법으로 측정한 항생물질 PS-6(나트륨염)의 특성적인 IR 흡수 스펙트럼 최대치는 다음과 같다.

(8) 프로톤 NMR 스펙트럼

항생물질 PS-6(나트륨염)은 중수(D₂O) 중에서 측정한 100MHz 프로톤 NMR 스펙트럼에서 다음과 같은 특성적인 표시를 나타냈다.

(i) 약 7.0Hz의 결합성 수를 갖는 약 0.94 및 0.98ppm에서 중심부를 통과한 한 쌍의 이중선(

)

(ii) 약 1.92ppm에서 예리한 단일선(CH₃-CO-)

(iii) 약 2.40 내지 3.50ppm에서 다중선(-CH₂-CH-)

(iv) 약 3.90 내지 4.20ppm에서 다중선(-CH-)

(9) 분자량

약 312(항생물질 PS-6의 메틸에스테르에 대한 고분해 질량 분광법의 결과로부터 계산)

(10) 정색반응

(11) 용해도

항생물질 PS-6은 pH 6 내지 9에서 물에 가용성이지만, 벤젠, 아세톤 및 에틸아세테이트 중에서 실질적으로 불용성이다.

상기의 물리-화학적 성상은 항생물질 PS-6(나트륨)의 분자 중에 CH₃

, CH₃CO-, -CH₂-,

-NHCO-및-COO

기가 존재함을 명백히 증명해준다.

항생물질 PS-6는 그의 UV 흡수 최대치에서 전술한 항생물질 PS-5에 비슷한 유황측쇄와 이후에 기술하게 될 항생물질의 에스테르화의 결과로서 300nm 내지 316nm의 UV 흡수 최대치의 변화를 갖는 리에나마이신(미합중국 특허 제3, 950, 357호 참조)의 구조식을 갖는다. 또한, 항생물질 PS-6의 분자식은 메틸에스테르의 고분해질량 분광법의 결과로부터 C₁₄H₂₀N₂O₄S로서 계산되었다.

상기의 데이타에서 항생물질 PS-6는 다음과 같은 구조식을 갖는다.

항생물질 PS-6의 생물학적 성상

(1) 항생스펙트라

광범위 스펙트럼의 항생효과를 갖는 항생물질 PS-6는 각종 세균, 예를 들면 그람-양성균에 속하는 포도상구균속, 쌍구균속, 연쇄구균속, 간균속과 그람-음성균에 속하는 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속에 등에 대해 매우 강력한 활성을 나타낸다. 항생물질 PS-6은 또한 그람-음성균에 속하는 클렙시엘라(Klebsiella)속, 프로티우스(Proteus)속 등에 대해 양호한 활성을 나타낸다. 항생물질 PS-6는 β-락탐환구조를 갖는 항생물질에 내성인 그람-음성균, 예를들면 시트로박터(Citrobacter) 프로티우스, 클렙시엘라 등에 대해 강력한 활성을 나타낸다.

(2) β-락타마제-생서균에 대한 기타 항생물질의 항생효과의 증가

항생물질 PS-6은 기타 항생물질, 특히 푸로티우스벌가리스(Proteus Vulgaris), 세라티아마아시센스(Serratia marcescens) 등의 β-락타마제-생성균에 대해, 페니실린 및 세포로스포린 등의 β-락탐 항생물질의 항생효과를 증대시키는 능력을 갖는다.

(3) 생체내활성

항생물질은 그람-양성 병권균을 감염시킨 새앙쥐에 투여했을 때에 현저한 치료 효과를 나타냈다.

(4) 독성

항생물질은 500mg/kg의 복용량으로 새앙쥐에 정맥내로 투여했을 때에 아무런 독성을 나타내지 않았다.

(II) 항생물질 PS-7

항생물질 PS-7의 물리-화학적 성질

(1) 페이퍼 크로마토그라피

항생물질 PS-7(나트륨염)은 다음과 같은 용매계를 사용하여 도요휠터페이퍼 제50번(도요로시 회사제)으로 하강 페이퍼크로마토그라피 했을 때에 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

아세토니트릴/트리스/EDTA:R_f=0.41

에탄올/물(7/3):R_f=0.68

(2) 박층크로마토그라피(TLC)

항생물질 PS-7(나트륨염)은 다음과 같은 용매제를 사용하여 크로마토그람시이트 13254셀룰로오스 제6065번(이스트맨코닥회사제)으로 박층크로마토그라피했을 때에 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

n-부탄올/에탄올/물:R_f=0.60(4/1/5)(상부층)

n-프로판올/물(7/3):R_f=0.81

n-부탄올/이소프로판올/물:R_f=0.71(7/7/6)

아세토니트릴/물(8/2):R_f=0.65

(3) 고전압 페이퍼전기 영동

고전압 페이퍼 전기 영동장치(사반트 인스트루먼트스 회사제, 고전압 전원 HV 3000A, 전기 영동기 FP 18A)를 사용하여 다음과 같은 pH치를 갖는 완충용액으로 도요휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제)을 사용한 전기 영동에서 항생물질 PS-7(나트륨염)에 대해 다음과 같은 이동이 관찰되었다. 항생물질 PS-7은 바르비탈 3.3g, 소디움 바르비탈 25.5g 및 물 3000ml로 되는 완충액(pH8.6)에서 30분동안 42V/cm의 전류를 통과할 때에 양극 쪽을 향해 적어도 5mm 이상, 일반적으로 10 내지 40mm 사이의 범위내에이동된다.

(4) β-락타마제에 대한 행동

항생물질 PS-7은 바실루스 시어리어스로부터 β-락타마제에 의해 활성화되지 않았다.

(5) 산, 중성 및 염기 중의 구별

항생물질 PS-7은 분자 중에 한개의 카르복실기를 갖는 일 염기산이다.

(6) 자외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-7(나트륨염)의 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 특성적인 흡수 최대치를 갖는다.

(7) 적외선 흡수 스펙트럼

KBr 정제법으로 측정한 항생물질 PS-7(나트륨염)의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 파장에서 특성적인 흡수 최대치를 갖는다.

(8) 프로톤 NMR 스펙트럼

중수(D₂O)중에서 100MHz 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼에서, 항생물질 PS-7(나트륨염)은 다음과 같은 명백한 특성적인 표시를 나타냈다.

(i) 약 0.96ppm에서 중심부를 갖는 삼중선

(ii) 약 1.72ppm에서 중심부를 갖는 다중선(-CH₂-CH₃)

(iii) 약 2.05ppm에서 예리한 단일선(CH₃-CO-)

(iv) 약 2.96 내지 3.38ppm에서 다중선(CH₂-CH-)

(v) 약 3.96ppm에서 중심부를 갖는 단일선(

)

(vi) 약 6.02ppm 및 약 7.10ppm(J=약 14Hz)에서 중심부를 갖는 한쌍의 이중선

(9) 분자량

약 296(항생물질 PS-7의 메틸에스테르에 대한 고분해 질량 분광법의 결과로부터 계산)

(10) 정색반응

에틀리히시약반응:양성

옥소-클로로백금산반응:양성

닌히드린반응:음성

(11) 용해도

pH 6 내지 9에서 물에 가용성이지만, 벤젠, 아세톤 및 에틸아세테이트 중에서 실질적으로 불용성이다.

상기의 물리-화학적 성상은 항생물질 PS-7(나트륨염)가 분자 중에 CH₃-CH₂-, CH₃CO-, CH=CH-,

-NHCO 및 -COO

기를 갖고 있음을 확인했다.

이들 데이타로부터 본 발명에 제공된 항생물질 PS-7이 다음과 같은 구조식의 화합물임을 알았다.

항생물질 PS-7의 생물학적 성상

(1) 항생 스펙트라

항생물질 PS-7은 광범위의 항균활성을 가진다. 이것은 각종 미생물, 예를들면 포도상구균속 또는 쌍구균속에 속하는 그람-양성균에 대해 극히 높은 항균활성을 나타내며, 이것은 또한 알칼리 게네스속에 속하는 그람-음성균에 대해 높은 항균활성을 갖는다.

특히, 항생물질 PS-7은 예를들면 공지의 β-락탐 항생물질에 내성균인 시트로박터속 또는 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 그람-음성균에 대한 그의 항균활성에 의해 특징지어진다.

(2) β-락타마제-생성균에 대한 기타 항생물질의 항생활성의 증가

항생물질 PS-7은 기타 항생물질, 예를들면 프로티우스발가리스 또는 세라티아마아시센스 등의 β-락타마제-생성균에 대해 세팔로스포린과 같은 β-락탐 항생물질의 항균활성을 증대시키는 능력을 갖고 있다.

(3) 생체내활성

항생물질은 그람-양성 병원균을 감염시킨 새앙쥐에 투여했을 때에 현저한 치료 효과를 나타냈다.

(4) 독성

항생물질은 500mg/kg의 복용량으로 새앙쥐에 정맥내로 투여했을 때에 급성독성을 나타내지 않았다.

본 발명에 의해, 상기한 특성을 갖는 항생물질 PS-6 또는 PS-7은 영양배지 중에서 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 제조할 수 있고, 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 단리시킬 수 있는 미생물을 배양시키는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항생물질 PS-6 및 PS-7을 제조할 수 있는 미생물은 PS-6 및 PS-7 중의 하나 또는 양자를 제조할 수 있는 능력을 가진다.

항생물질 PS-6 및 PS-7을 생성할 수 있는 전형적인 미생물은 스트렙토마이시스 속에 속한다. 스트렙토마이시스속의 가장 적합한 균주의 예는 일본국 후꾸이껭, 요시다군의 에이헤이지사원 근처에서 수집한 토양 샘플로부터 분리시킨 균주이면, A271번 균주로 명명했다. 이 균주는 본 발명에 사용하기에 적합한 항생물질 PS-6 및 PS-7 양자를 생성하는 능력을 갖고 있다.

[A271균주의 분류학적 특성]

스트롤토마이시스 A271균주의 분류적학적 특성은 다음과 같다.

(1) 형태학적 특성

포자 형성한 호기성 마이셀리움의 분기:간단히 분기했다.

포자 형성한 호기성 마이셀리움의 형태:

호기성 마이셀리움의 상부는 후크, 고리 또는 불완전한 나선형을 나타냈다.

이것은 섹션 레티나쿨룸-아퍼툼(Section Retinaculum Apertum)에 속하는 것으로 사료된다. 이 형태는 균주를 특히 오우트미일한천 배지에서 배양시킬 때에 관찰되었으며, 한편 직선형 또는 굴곡형은 효모엑기스-맥아엑기스 한천 배지에서 종종 관찰되어 있다.

포자사슬의 형태 및 수효:10개(통상적으로 10 내지 50개) 이상의 포자의 사슬을 형성하는 타원형 또는 원통형 포자. 포자의 크기 및 표면구조 0.8-1.0×1.0-1.8μ 부드러운 표면 편모나 포자낭이 관찰되지 않았다. 호기성 마이셀리움에서 하이패가 형성되었다.

(2) 배양 특성

균주 A271의 배양특성을 표 1에 나타냈으며, 이 표에서 달리 지적하지 않는한 28℃에서 2주 배양후의 관찰결과를 나타냈다. 색깔의 기재는 주로 에이취.디.트레스너(H.D. Tresner)법 및 이.제이.바크스(E.J. Backus)의 “스트렙토마이시트 분류에 대한 칼러 휘일의 시스템”(응용미술용 11, 335, 1963참조)와 일본 칼러 인스티튜트 화운데이션에서 발생한 “칼러스탠다아드의 안내”중 칼러 코드에 기준했다.

[표 1]

3) 생리학적 특성

(1) 성장온도 범위:10~40℃, 최적온도 20~30℃

(2) 젤라틴의 액화(글루코오스-펩톤-젤라틴 배지상에서):액화(20℃에서 배양했다)

(3) 전분의 가수분해(전분 무기염 한천 배지상에서):가수 분해했다.

(4) 탈지유의 응집 및 펩톤화:펩톤화 했지만 응집현상은 관찰되지 않았다.

(5) 델라노이드 안료의 형성:티로신 한천배지와 펩톤 효모 이온 한천배지 및 트립톤-효모 추출액상에 어떤 멜라노이드 안료가 형성되지 않았다.

(6) 다음과 같은 각종 탄소원의 이용 프리담(Pridham) 및 고틀리이브(Gottlieb) 한천배지:

(+ : 양호하게 이용, ±:약간 이용, - : 극히 약간 이용되거나 또는 전혀 이용되지 않음)

상기의 특성치로부터 균주 A271은 스트렙토마이시스속에 속하고, 섹션 RA에 속하는 미생물에 의해 부여되는 특성을 나타나는데 그 이유는 마이셀리움 표면의 색깔은 황색 또는 적색이고, 포자 표면은 부드럽고, 수용성 안료와 같은 멜라노이드 안료가 형성되지 않았다. 이러한 분류 특성을 갖는 배양은 국제 조직적인 세균학지 제18권 69~189페이지(1968), 동 제279~892페이지(1968), 동 제19권 제391~512페이지(1969), 동 제22권, 제265~394페이지(1972)에 기재된 이.비.셔얼링(E.B. Shirling) 및 디.코틀리이브(D. Gottlieb)에 의한 왁스만의 “더악티 노마이세트” 제2권(1961)과 바아기(Bargey)의 맨뉴얼 오브 디러미네이티드 박테리올러지(Mannual of Determinative Bacteriology). 제8판(1974)에 기재되어 있다. 섹션 RA에 속하는 유사한 배양을 악티노마이시스 크레미우스(Actinomyces cremeus), 악티노마이시스 플라비도비렌스(Actinomyces flavidovirens), 악티노마이시스 알보헬바루스(Actinomyces albohelvatus), 악티노마이시스 플라비센스(Actinomyces flavescens), 스트렙토마이시스 루트게르센시스(Streptomyces rutgersensis), 스트렙토마이시스 크리시우스 (Streptomyces chryseus), 스트렙토마이시스 헬바티쿠스(Streptomyces helvaticus)에서 발견했다. 스트렙토마이시스 플루리컬러리센스(Streptomyces pluricolorescens)의 유사한 배양물 중의 하나로서 섹션 RF에 속하지만 그의 형태학적 특성에 기초한 것을 또한 선택했다. 최종 스트렙토마이시스 플루리컬러리센스를 제외한 이들 8개의 배양물은 직선형 또는 고리를 갖는 호기성 마이셀리움을 생성하지만, 배양조건에 따라 변화하는 것으로 보고되었다. 상기 8종의 배양 형태를 동일한 조건하에서 배양시킨 후에 본 발명의 균주 A271과 비교했다. 그리하여, 균주 A271은 성장, 호기성 마리셀리움의 색깔, 기질 마이셀리움의 색깔 및 탄소원의 이용에서 이들 배양물과 명백히 다름을 발견했다.

표 2, 3 및 4는 균주 A271과 가장 비슷하게 닮은 두 개의 배양물과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

상기의 표에 나타낸 결과로부터 다음과 같은 결론을 얻을 수 있다. 호기성 마이셀리움의 색깔에 관하여, 악티노마이시스 플라비도비렌스는 일반적으로 백색이지만, 황색일 경우에 녹색을 띤 황색이므로, 본 발명의 균주 A271와 명백히 차이를 나타낸다. 악티노마이시 크레미우스는 일반적으로 균주 A271보다 엷은 등황색중 보다 약한 적색을 나타내므로 균주 A271과 명백히 구별된다.

기질 마이셀리움의 색깔에 관하여, 악티노마이시스 플라비도 비렌스는 엷은 황색을 나타내며, 악티노마이시스 크레미우스는 여러가지 경우에 있어서 밝은 등황색을 나타내는 한편, 균주 A271은 일반적으로 밝은 황색을 나타낸다. 또한, 여러가지의 매질증에서 얻어진 실험 결과를 상세히 비교한 결과 균주 A271이 다른 두개의 배양물과 상이함을 발견했다. 균주 A271은 D-프락토오스 및 L-람노오스의 이용에 있어서 악티노마이시스 크레미우스와 D-프락토오스 및 이노시톨의 이용에 있어서 악티노마이시스 플라비도비렌스와 상이하다.

그리하여, 본 발명의 균주 A271은 이것과 가장 유사한 두개의 공지의 배양물과 명백히 구별된다. 따라서, 균주 A271은 공지의 스트렙토마이시스속과 상이하며, 이것을 신종으로서 스트렙토마이시스속 A271이라고 정한다. 이 배양물을 일본극 공업과학 및 기술기관인 발효 연구기관에 기탁하여 배양물번호 FERM-P 제3984번을 부여받았다. 스트렙토마이시스속 A271의 샘플은 또한 ATCC에 기탁하여 수집번호 제31358호를 부여받았다.

본 발명에서, 균주 A271 자체 뿐만 아니라 화학적 또는 물리적 처리로 일으킬 수 있는 천연 및 인공변이체를 사용할 수 있다.

항생물질 PS-6 및 PS-7 생성균은 특정속에 한정되지 않는 광범위의 미생물로부터 선택될 수 있다.

항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 생성할 수 있는 미생물의 선택은 본 분야에 숙련된 사람들에 의해 다음과 같은 방법으로 행할 수 있다.

토양으로부터 단리시킨 미생물의 배양액을 β-락탐 감응 미생물로 접종시킨 효력 판정 한천판과 β-락타마제를 함유하고 동일한 미생물로 접종시킨 다른 효력 판정 한천판을 사용하여 분석했다.

전자의 효력 판정보다도 후자의 효력 판정판에서 보다 작은 저지대역을 나타내는 브로스 여액을 만드는 미생물을 추가 실험하기 위해 선택했다. 이어서, 상기의 방법으로 선택한 미생물의 배양액 중의 유효성분을 활성탄에 흡수시킨 다음에 용출시켰다. 농축된 용출물을 페이퍼 크로마토그라피 또는 박층 크로마토그라피로 전개하고, 이어서 효력판정 미생물로서 β-락탐 감응 미생물로 바이오오우트그라피했다. 이 방법의 스크리이닝을 다음의 예로 더 구체적으로 설명한다.

이후에 기술하게 될 코마모나스 효력 판정판은 β-락탐 감응 효력 감정 미생물로 접종시킨 생물학적 효력 판정 한천판으로서 사용했다. 코마모나스 CV 생물학적 효력 판정판과 코마모나스 CM 효력 판정판은 상기의 코마모나스 생물학적효력 판정판에 푸로티우스 벌가리스 P-5와 시트로박터 프리운디(Citrobacter freundii) E-9으로 각각 제조한 β-락타마제를 부가하여 제조했다. 토양으로부터 분리시킨 미생물의 배양여액을 첨가한 직경 8mm의 펄프디스크를 상기의 생물학적 효력판정판에 올려놓고 이것을 35℃에서 20시간 동안 배양시켰다.

배양시킨 후에, 코마모나스 생물학적 효력 판정판상에서 저지대역을 형성하고, 코마모나스 CV 생물학적 효력 판정판 또는 코마모나스 CM 생물학적 효력 판정판 상에서 보다 작은 저지 대역을 형성하는 미생물의 브로스 여액을 선택했다.

이 미생물의 브로스 여액에 활성탄(도꾸세이 시라사기, 다께다 약품 회사제) 2%(w/v)를 부가하고, 15분동안 교반시킨 후에 원심 분리하여 불용성 물질을 수집했다. 불용성 물질을 사용한 브로스 여액과 똑같은 용적의 증류수로 세척하고, 원심분리하여 다시 수집했다. 세척한 불용성 물질을, 사용한 브로스 여액의 절반용적에 해당하는 아세톤 수용액 50%(v/v)를 부가하여 용출시킨 다음에 실온에서 30분동안 교반했다. 원심분리 시킨 후에, 상층액을 회전 증발기를 사용하여 30 내지 5℃에서 증발시켜 사용한 브로스 여액과 비교하여 20배로 농축시킨 용액을 얻었다. 농축된 용액을 80% 아세토니트릴/트리스/EDTA 용매(아세토니트릴 120ml, pH7.5 1/10M 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄-HCl 완충액 30ml 및 소디움에틸렌디아민테트라아세테이트 수용액 1ml의 혼합물)로 16시간동안 전개하여 휠터 페이퍼(도요휠터 페이퍼, 도요로시 회사제)로 하강 페이퍼크로마토그라피했다. 이어서 이것을 효력 판정 미생물로서 코마모나스 테리게나(comamonas terrigena) B-996로 바이오오우트그라피 했다.

항생물질 PS-5와 동일한 이동거리(또는 동일한 R_f치)에서 지지 대역을 제공하는 생물학적으로 활성 생성물의 토양으로부터 단리시킨 미생물을 항생물질 PS-5 생성균의 예비물로 선택하였다. 페이퍼 및 박층크로마토그라피로 더 연구시험한 결과 선택된 예비 미생물은 항생물질 PS-5 생성능력이 있음이 확인되었다.

상기한 방법을 사용하여, 본 분야에 숙련가는 전술한 스트렙토 마이시스균속 A271 외에 다른 항생물질 PS-6 및 PS-7 생성균을 선택할 수 있다.

본 발명의 실시 태양에 의해, 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7은 스트렙토마이시스속 A271과 같은 전술한 항생물질을 제조할 수 있는 세균의 마이셀리움의 포자를 영양매질 중에서 접종시켜 이것을 호기적으로 배양시켜 제조할 수 있다.

스트렙토마이시스에 의해 일반적으로 이용되는 기타 영양원으로서 예를들면 탄수화물, 질소원 및 무기염을 사용할 수가 있다. 탄소원의 예로서 글루코오스, 글리세린, 말토오스, 슈크로오스, 당밀, 덱스트린 및 전분과 같은 탄수화물, 대두유, 낙화생유 또는 라아드 등을 유지를 들 수가 있다. 질소원의 예로서 펩톤, 육엑기스, 대두분, 면실유, 건조효모, 옥수수 스팁 액제, 효모엑기스, 탈지유, 카제인, 질산나트륨, 질산암모늄 및 황산암모늄을 들 수가 있다. 무기염의 예로서 인산이칼륨, 염화나트륨, 탄산칼슘 및 황산마그네슘을 사용할 수가 있다. 필요에 따라 코발트 또는 망간과 같은 미량의 금속을 부가할 수 있다. 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 제조하기 위해 미생물에 이용될 수 있는 모든 영양물을 사용할 수가 있다. 가열 살균 및 발효도중 기포형성을 예방하기 위해, 실리콘유 및 식물성유와 같은 항-포말제를 첨가해도 좋다.

상기한 영양원의 비율은 특히 한정되지 않지만 광위로 변할 수 있다. 본 분야에 숙련가는 간단하고 작은 규모의 실험으로서 항생물질 PS-6 및 PS-7을 생성하는 능력을 갖는 특정균주용영양원의 적정 조정과 양을 용이하게 측정할 수 있다.

본 발명자는 축적된 항생물질 PS-6의 양이 스트렙토마이시스속 A271의 배양중에 배지를 아미노산 또는 유기산을 부가함으로써 증가될 수 있음을 발견했다. 아미노산으로서, 2~10개의 탄소원자를 갖는 중성 아미노산, 특히 발린과 로이신을 사용할 수 있고, 유기산으로서 2~10개의 탄소원자를 갖는 지방족 유기산, 특히 n-발레르산을 사용할 수가 있다. L-, D- 및 DL-형의 아미노산을 사용할 수가 있으나, L-아미노산이 가장 바람직하다. 이 아미노산 또는 유기산의 첨가량은 중요하지 않지만, 일반적으로 배양액 기준으로 0.01% 내지 1%(w/v), 더 바람직 하기로는 0.1 내지 0.5%(w/v)이다. 첨가시간은 한정되지 않았다. 이 화합물들은 배양중 어느 때든지 배지에 첨가할 수 있다. 그러나 이들은 배양초기에 또는 배양개시 100시간 후에 첨가하는 것이 좋다. 아미노산 또는 유기산은 한꺼번에 부가하거나 또는 다른 시간간격으로 나눠서 부가해도 좋다.

배지는 배양하기 전에 살균시켜도 좋다. 배지의 pH는 살균전 후에 4 내지 9, 특히 6 내지 8 사이로 조정하는 것이 좋다.

항생물질 PS-6 및/또는 PS-7 생성균주의 배양은 주로 스트렙토마이세트에 의해 항생물질의 일반적인 제조에 사용된 것과 비슷한 방법에 의해 행할 수 있다. 호기성 조건하에서 배양이 일반적으로 적합하다. 통상으로 배양은 교반 및 또는 통풍으로 행할 수 있다. 정지배양, 교반 배양 및 통풍과 교반을 포함하는 침수배양 중 어느 것을 사용할 수 있지만 침수 배양이 유익하다.

사용할 수 있는 발효 온도는 특히 한정되지 않으며, 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 제조하는 능력을 갖는 균주의 성장이 실질적으로 저해되지 않는 범위의 온도가 좋으며, 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 제조할 수 있다. 발효온도는 사용하는 생성균주의 종류에 따라 변할 수 있지만, 적당한 온도는 일반적으로 20 내지 40℃ 바람직하기로는 25 내지 35℃ 사이이다.

배양액의 pH는 발효중 4 내지 9, 특히 6 내지 8 사이의 범위로 조정하여 발효를 양호하게 행할 수 있다. 대균모 발효에서 시이드 균주를 배양시켜 시이드 배양물을 영양배지 중에서 접종시켜 침수배양으로 배양시키는 것이 적합하다.

발효는 통상으로 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7의 충분한 양이 축적될 때까지 지속하는 것이 좋다. 발효시간은 통상으로 30 내지 90시간 사이이지만, 이것은 배지의 조성, 발효온도, 생성균주 등의 종류에 따라 변한다.

본 분야의 숙련가는 목적하는 항생물질을 제조할 능력을 갖는 특정균주의 특성에 의한 간단한 실험을 행함으로써 최적 배양조건을 용이하게 측정할 수 있다. 발효액에 축적된 항생물질 PS-6 및 또는 PS-7의 양은 이후에 기술하는 생물학적 효력 판정법과 바이오오우트그라피에 의해 측정할 수 있다.

발효생성물 중의 축적된 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7은 수용성이고, 주로 미생물 세포중에 존재하므로, 여과, 원심분리 또는 추출등의 공지의 분리방법에 의해 발효시킨 후에 세포를 분리시키고, 여액, 상층액 또는 추출물로부터 항생물질을 회수하는 것이 적합하다.

항생물질의 회수는 공지의 각종 방법에 의해 행할 수 있다. 특히, 카르복실산형의 항생물질을 회수하는 데 흔히 사용되는 것을 이용하는 것이 유익하다. 예를들면, 다음과 같은 방법을 단독으로 또는 혼합해서 그리고 종종 반복해서 사용한다. 저 pH에서 초산 에틸 또는 n-부탈올 등의 용매로 추출, 고 pH에서 용매층에서 수용액층으로 역추출; 염화벤잘코니움 또는 테트라 n-부틸 암모니움 하이드로겐 설페이트와 같은 친유성 4급 암모늄 또는 닛소크라운(NISSO CROWN) 에테르 디사이클로헥실-18-크라운-6-, 닛소 크라운 에테르 15-크라운-5(닛뽕소오다회사제)등과 같은 크라운 화합물 존재하에 염화메틸렌 또는 클로로포름 등의 용매를 사용하는 중성 Ph에서의 추출, 용매층에서 옥화나트륨, 옥화칼륨 등을 함유하는 중성 수용액층으로 역추출; 활성탄 암벨라이트 XAD(롬앤드 하아즈 회사제), Diaion HP-20(미쓰비스 화학 회사제) 등에 흡착시키고 메탄올 수용액, 아세톤 수용액 등으로 용출시키는 방법; 다웩스 1×2(다우케미칼 회사제) 또는 QAE-세파덱스 A-25(화르마시아 화인 케미칼 AB제)등의 이온 교환수지로 흡착 및 용출; 세파덱스 G-10(화르마시아 화인 케미칼 AB제), Bio-겔 P-2(바이오-래드라보라 토리스제), Bio-비드 S-X₃(바이오-래드 라보라토리스제) 등을 겔 여과; 셀룰로오소, 아비 셀 SF(아메리칸 비스코스 회사제), DEAE-셀룰로오스, 화트만 DE-32(화르만회사제), DEAE-세파덱스 A-25(화르마시아화인 케미칼 AB제), 실리카겔, 알루미나 등을 사용하는 컬럼 또는 박층크로마토그라피; 아세톤 등의 용매를 첨가하여 강제 침전.

특히, 유황측쇄의 포화탄소쇄를 갖는 유사한 성분, 예를 들면 제조하는 즉시 저장할 수 있는 항생물질 PS-5 및 PS-6로부터 항생물질 PS-7을 분리시키기 위해, 다음과 같은 방법을 사용하는 것이 적합하다. 포화 탄소쇄를 갖는 동족체를 통상의 음이온 교환수지 크로마토그라피로 분리시키며, 이 방법에서 유효성분을 다웩스 1×2(다우케미칼 회사제), 두오라이트 A-101(케미칼 프로세스 회사제), 암벨라이트 400(롬앤드 하아즈회사제) 또는 다이아이온 P A306(미쓰비스화학회사제) 등의 폴리스티렌형 음이온 교환수지에 흡착시키고,동족체를 무기염 수용액으로 용출시킨 다음에 항생물질 PS-7을 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 불소화나트륨 등의 무기염 0.1 내지 10%, 바람직하기로는 1 내지 5%를 함유하는 메탄올 또는 아세톤(농도:1 내지 80%, 바람직하기로는 10 내지 75%) 등의 극성용매의 수용액으로 용출시킨다.

본 발명자 등은 배양조건에 따라, 항생물질 PS-4 또는 그의 염으로 칭하는 다음과 같은 일반식을 갖는 화합물을 발효액 중에 동시에 형성시켰다.

그리하여, 항생물질 PS-4 및 PS-7을 동시에 제조할 경우에, 이들은 상기한 각종 방법을 결합하거나 또는 반복해서 행해서 서로 분리시킬 수 있다. 다음과 같은 방법을 사용하는 것이 특히 유익하다. 항생물질 PS-4 및 PS-7을 함유하는 용액은 다이아이온 HP-20AG(미쓰비시화학 회사제) 등의 흡착수지에 흡착시키고 항생물질을 아세톤 수용액과 같은 물에 용해시킨 0 내지 50%, 바람직하기로는 0 내지 10% 극성용매로 구배 용출시킨다.

회수 및 분리 공정에서 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7의 행동은 이후에 기술하게 될 생물학적 효력 판정법 및 바이오우트그라피에 의해 항생물질 PS-6 및 PS-7을 측정하여 알수 있다.

상기한 방법에서, 상술한 특징을 갖는 항생물질 PS-6 및/또는 PS-7을 얻을 수가 있다. 항생물질 PS-6 및 PS-7은 상기한 바와 같이 약간 불안정하므로, 회수 및 분리 공정을 조심하면서 행해야 한다.

항생물질 PS-6 및 PS-7은 일반적으로 유리산 상태에서 보다 염형태에서 더 안정화되는 경향이 있기 때문에 염 형태가 이후에 기술하게 될 제약용, 또는 유도체를 합성하기 위한 중간체로서 사용할 경우 또는 전술한 정제공정을 행할 경우에 적합하다.

상기한 염의 형태로 나트륨염, 칼륨염 또는 리튬염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염 또는 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염, 알루미늄염 등의 기타 금속염, 암모늄염, 모노에틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 모노에탄올아민 또는 디에탄올아민과 같은 일급, 이급 또는 삼급 아민과의 염류, 벤자틴 또는 푸로케인과 같이 유기염기와의 염류를 들 수 있다. 특히 적합한 염류는 나트륨염 또는 칼륨염과 같은 알칼리 금속염을 들 수가 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 항생물질 PS-6 및 PS-7은 분자중에 카르복실기를 갖는 일염기 산이다. 공지의 항생물질, 클라불란산 또는 티에나마이신의 경우와 동일한 방법으로 각종 알코올, 메르갑탄 또는 그의 유도체로 항생물질로부터 여러 가지의 에스테르를 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 이들 에스테르를 포함한다.

본 발명에 적합한 항생물질 PS-6 및 PS-7의 에스테르는 다음과 같은 구조식을 갖는 것이다.

식중, R₃₁은 저급 알칼기 또는 트리페닐메틸기이고, R₁및 R₂는 상기와 동일한 의미를 갖는다.

상기의 구조식(II)에서, 저급 알킬기는 직쇄 또는 측쇄기, 특히 6개의 이하의 탄소원자를 갖는 기, 더 구체적으로 1~개의 탄소원자를 갖는 기이다. 그 예로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸 및 n-헥실기이다.

본 발명에 의해 상기의 구조식(II)의 에스테르는 일반식(I)의 화합물(즉, 항생물질 PS-6 또는 PS-7) 또는 그의 염을 일반식(III)의 화합물 또는 저급 디아조알칼과 반응시켜 제조할 수 있다.

R₃₁Y (III)

식중, R₃₁은 상기와 동일한 의미를 가지며, Y는 분열될 수 있는 원자 또는 기를 나타낸다.

분열 원자 또는 기에 관해서 일반식(III)의 Y는 항생물질 PS-6 또는 PS-7의 카르복실기와 접촉할 경우에 분열될 수 있는 원자 또는 기, 예를들면 염소, 불소 또는 요오드 등의 할로겐원자, 하이드록실기, 티올기, 술포닐옥시기, COH, -O-CO-CF₃와 같은 반응성 카로보닐 옥시기 등을 사용할 수가 있다. 이중 할로겐 원자가 특히 적합하다.

일반식(III)의 화합물의 대표적인 예로 다음과 같은 것을 들 수가 있다.

메틸알코올, 요오드화메틸, 술폰산디메틸, 메틸메르갑탄, 에탄올, 불소화에틸, 요오드화에틸, 에틸메르갑탄, 염화 n-프로필, 요오드화 n-프로필, 프로필알코올, 이소-프로필알코올, 불소화이소프로필, 요오드화 이소-프로필, n-부틸알코올, 불소화 n-부틸, 요오드화 n-부틸, n-펜틸알코올, 염화 n-프로필, 불소화 n-펜틸, 요오드화 n-펜틸, n-헥실알코올, 불소화 n-헥실, 요오드화 n-헥실, 트리메틸알코올, 트리틸메르갑탄, 염화트리틸 및 불소화트리틸.

저급 디아조알칸의 대표적인 예중의 하나는 디아조메탄이다.

항생물질 PS-6 또는 PS-7과 일반식(III)의 화합물 또는 저급 디아조알칸과의 반응은 공지의 에스테르화 법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항생물질 PS-6 또는 PS-7과 일반식(III)의 화합물 또는 저급 디아조 알칸과의 반응은 반응 매질 부재하에서 행할 수 있다. 그러나 이 반응은 일반적으로 불활성 액체 매질 중에서 행한다. 사용될 수 있는 불활성 액체매질로 예를들면 벤젠, 톨루엔, n-헥산 또는 사이클로헥산과 같은 탄화수소, 클로로포름 또는 염화메틸렌과 같은 할로겐화 탄화수소, 디메틸포름 아미드 또는 헥사메틸인산트리아미드 등의 아미드류, 디메틸술폭사이드, 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 디 n-부틸에테르, 테트라하이드로푸란 또는 디옥산 등의 에테르류, 에틸아세테이트 또는 n-부틸아세테이트 등의 에스테르류 및 아세톤 또는 메틸에틸케톤 등의 케톤류를 사용할 수가 있다. 이 용매는 단독으로 또는 두개 이상의 혼합물로서 사용할 수 있다.

반응 온도는 중요하지 않지만, 일반식(III)의 화합물의 종류 저급 디아조 알칸의 종류, 액체매질의 종류에 따라 광위로 변할 수 있다. 반응 온도는 항생물질 PS-6 또는 PS-7이 현저하게 분해되지 않는 온도의 범위에서 선택될 수 있다. 일반적으로 적당한 온도는 60℃ 이하의 정도, 바람직하게로는 0 내지 40℃ 사이, 더 바람직하게로는 5℃ 내지 실온 사이의 온도이다. 필요에 따라 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘 또는 디사이클로헥실카르보디이드 등의 반응 촉진제를 반응에서 사용할 수 있다.

이러하 조건하에서 반응은 1 내지 24시간, 통상으로 3 내지 12시간 사이에서 종료시킬 수 있다.

일반식(III)의 화합물 또는 저급 디아조알칸과 반응시키고자 하는 항생물질 PS-6 또는 PS-7은 단독으로 분리시킬 필요가 없다. 이것은 항생물질 PS-6 또는 PS-7 생성균의 배양액 또는 배양액으로부터 세균 세포를 분리시킨 후에 남아있는 여과브로스 일 수 있다. 상기한 방법에 의한 배양물을 적어도 부분적으로 정제하여 수득한 조항생물질 PS-6 또는 PS-7을 또한 사용할 수 있다. 이와 같이 부분적으로 정제한 생성물의 예로 활성탄으로 처리한 여과 브로스로부터의 농축된 용출물; 다이아이온 HP-20(미쓰비스 화학 회사제)에 여과 브로스를 처리한 농축용출물, 디이아이온 HP-20으로부터의 농축용출물을 흡착시킨 QAE-세파덱스(화르마시아 화인 케미칼스 회사제)로 부터의 인산염 완충액 중 염화나트륨의 구배 농축으로 수득한 용출물의 활성탄으로 탈염시킨 농축물; 염화벤즈알코니움 존재하에 염화메틸렌으로 농축시킨 추출물; 크라운 화합물 존재하에 클로로포름으로 농축시킨 추출물; 및 pH 3.5에서 저온으로 부탄올로 농축시킨 추출물을 들 수가 있다.

이와같이 수득된 항생물질 PS-6 또는 PS-7의 에스테르는 반응 혼합물로부터 공지의 방법에 의해 단리시키거나 또는 정제할 수 있다. 예를들면, 반응을 종료한 후에, 반응 혼합물은 처음에 수용성 배지에 붓고 부산물과 같은 수용성 불순물을 제거한다. pH를 중성에 가깝게 유지하기 위해 수용성 배지로서 중성 완충액을 사용하는 것이 적합하다. 이 혼합물의 항생물질 PS-6 또는 PS-7의 에스테르를 초산에틸, 벤젠 또는 클로로포름과 같은 실질적으로 물과 혼화할 수 없는 보다 극성이 적은 유기 용매로 추출시킨다. 염화나트륨 또는 황산 암모늄과 같은 염을 부가하여 염석 효과에 의해 추출효율을 증대시킨다.

무수황산 나트륨으로 건조시킨 후에, 에스테르는 공지의 방법, 예를들면 Bio-비드 S-X₃(바이오-레드라보다로리스제), 또는 세파덱스 LH-20(화르마시아 화인 케미칼스 AB제)을 사용하는 겔여과, 실리카겔, 알루미나 또는 플로리실(플로리딘 회사제) 등의 담체를 사용하는 흡착크로마토그라피를 필요에 따라 적당힌 결합하여 반복해서 사용될 수 있는 방법에 의해 용매층으로부터 단리시킬 수 있다.

이와같이 정제한 에스테르를 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 초산에틸, 디에틸에테르, 염화메틸렌, 클로로포름, 헥산 및 석유에테르(비점 30~60℃) 등의 용매를 단독으로 또는 혼합한 용매로부터 재결정하여 더 정제시킬 수 있다.

상기의 방법에 의해 제조될 수 있는 일반식(II)의 에스테르 중에서 다음과 같은 일반식(II-a)을 갖는 항생물질 PS-6 또는 PS-7 트리틸에스테르가 특징적이다.

(식중, R₁및 R₂는 상기와 동일한 의미를 갖는다.)

또한 상기 일반식(II-a)는 일반식(I)의 항생물질 PS-6 또는 PS-7 보다 더 안정하여 보다 용이하게 단리되며, 망력한 항균성과 β-락타마제 저지활성을 가지고 있음에 반하여 공지의 페니실린의 트리틸에스테르는 실질적인 항균 활성을 나타내지 않았다. 그 이유는 본 발명의 항생물질 PS-6 또는 PS-7 트리틸에스테르 분자 중에 트리틸기가 극히 활성이어서 효력 판정배지 또는 생체중에서 용이하게 분열될 수 있기 때문이다. 일반식(IIa)의 트리틸에스테르는 기타 약학적으로 유용한 유도체의 합성용 중간체로서 극히 중요한데, 그 이유는 일반식(II-a)의 트리틸에스테르 중의 트리틸기가 극히 활성이어서 용이하게 분열될 수 있기 때문이다.

본 발명에 의해 제공되는 일반식(II-a)의 항생물질 및 PS-6/PS-7의 트리틸에스테르의 물리-화학적 및 생물학적 성상을 이하에 구체적으로 기술한다.

[I] 항생물질 PS-6 트리틸에스테르

항생물질 PS-6 트리틸에스테르의 물리-화학적 성상

(1) 자외선 흡수 스펙트럼

(2) 정색반응

에틀리히 시약 반응 양성

요오드-클로로백금산 반응 양성

닌히드린 반응 음성

(3) 박층크로마토그라피(TLC)

TLC 에스테르 중에서 다음과 같은 용매를 사용했을 때에 다음과 같은 Rf치가 다음과 같은 플레이트상에서 얻어졌다.

DC-페르티그플래턴 키젤겔(Fertigplatten Kieselgel) 60 F254(E. 메르크회사제)

벤젠/아세톤(2/1):R_f=0.37

벤젠/초산에틸(1/8):R_f=0.34

항생물질 PS-6 트리틸에스테르의 생물학 성상

(1) 항균 스펙트라

본 발명의 항생물질 PS-6 트리틸에스테르는 광범위 항균스펙트럼을 가지며, 여러 가지의 세균, 예를들면 포도상구균속, 쌍구균속 및 연쇄구균속에 속하는 그람-양성균과 알칼리게네스속에 속하는 그람-음성균에 대해 강력한 활성을 나타낸다.

본 발명의 항생물질 PS-6 트리틸에스테르는 또한 클렙시엘라, 프로티우스 속에 속하는 그람-음성균에 대해 양호한 활성을 나타낸다.

항생물질 PS-6 트리틸에스테르가 구조중에 β-락탐환을 갖는 항생물질에 내성인 그람-음성균, 예를들면 시트로박터속, 프로티우스속, 클렙시엘라속 및 세라티아속의 세균에 대해 강력한 활성을 나타낸다.

(2) 생체내 활성

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르는 그람-양성병원균으로 감염시킨 새앙쥐에게 투여했을 경우에 현저한 치료효과를 나타냈다.

(3) 독성

트리틸에스테르는 500mg/kg의 복용량으로 새앙쥐에게 복강내로 투여했을 경우에 급성 독성을 나타내지 않았다.

[II] 항생물질 PS-7 트리틸에스테르

항생물질 PS-7 트리틸에스테르의 물리-화학적 성상

(1) 자외선 흡수 스펙트럼

(2) 정색반응

(3) 박층크로마토그라피(TLC)

TLC에서 하기와 같은 용매를 사용하여 하기와 같은 Rf치를 하기와 같은 판에서 얻었다.

DC-페르티그플래턴 키젤겔 60F254(E. 메르크회사제)

벤젠/아세톤(2/1):R_f=0.51

벤젠/초산에틸(1/8):R_f=0.67

항생물질 PS-7 트리틸에스테르의 생물학적 성상

(1) 항균 스펙트라

본 발명의 항생물질 PS-7 트리틸에스테르는 광범위의 항균스덱트럼을 가지며, 각종 세균, 예를들면 포도 상구균속, 쌍구균속 및 연쇄상 구균속에 속하는 그람-양성균과 알칼리게네스속에 속하는 그람-음성균에 대해 매우 강력한 활성을 나타낸다.

본 발명의 항생물질 PS-7 트리틸에스테르는 또한 클렙시엘라, 프로티우스 속에 속하는 그람-음성균에 대해 양호한 활성을 나타낸다.

항생물질 PS-7 트리틸에스테르는 구조중에 β-락탐환을 갖는 항생물질에 내성인 그람-음성균, 예를들면 시트로박터, 프로티우스, 클렙시엘라 및 세라티아 등에 대해 강력한 활성을 나타낸다.

(2) 생체내 활성

항생물질 PS-7의 트리틸에스테르는 그람-양성병원균으로 감염시킨 새앙쥐에게 투여했을 경우에 현저한 치료효과를 나타냈다.

(3) 독성

트리틸에스테르는 500mg/kg의 용량으로 새앙쥐에게 복강내로 투여했을 경우에 급성 독성을 나타내지 않았다.

상기한 항생물질 PS-6 및 PS-7과 그의 트리틸유도체는 인체에서 뿐만 아니라 동물, 예를들면 포유동물, 가금 및 어류에서 발생하는 세균전염병의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있는 충분히 강력한 항균활성을 나타낸다.

또한, 트리틸에스테르는 기타 유용한 약품 합성의 중간체로서 극히 중요한데 그 이유는 일반식(II-a)의 트리틸에스테르에서 트리틸기가 극히 활성이어서 용이하게 분열되기 때문이다.

본 발명의 항생물질 PS-6 및 PS-7 또는 그의 트리틸에스 테르는 경구용 국소용 또는 비경구용(정맥내, 근육내, 복강내 등)으로 투여할 수 있으며, 투여경로에 따라 유용한 약품으로 사용할 수 있다. 예를들면, 본 발명의 항생물질 PS-6 또는 그의 트리틸에스테르는 약학적으로 무독한 담체 또는 증량제와 혼합하여 고상형(예를들면, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 당의정, 트로치제, 분무산제, 좌약), 준-고형제(예, 연고제, 크리임제, 준-고형 캡슐제) 또는 액상형제(예, 액제, 유탁제, 현탁제, 로숀제, 시럽제, 주사액제, 액상분무제)로 제제할 수 있다.

본 발명의 항생물질 PS-6 또는 그의 트리틸에스테르를 함유하는 단위복용제는 일반적으로 액상제, 준고형제 및 고상제중 어느 형태로 유효성분 0.1 내지 99중량%, 바람직하기로는 10 내지 60중량% 함유할 수 있다.

이들 제제에 사용될 수 있는 전형적인 담체, 부형제 및 증량제 및 제제법은 이하에 더 구체적으로 기술한다.

경구 투여용 정제 및 캡슐제는 단위 복용제로 제제할 수 있고, 예를들면 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라칸트 또는 폴리비닐 피롤리돈 등의 결합제, 락토오스, 슈크로오스, 전분, 인산칼슘, 소르비톨 또는 글리신 등의 부형제, 스테아린산마그네슘, 활석, 폴리에틸렌 글리코올 또는 실리가 등의 윤활제, 감자전분 등의 분해제, 소디움라우릴설페이트제 등의 수화제를 함유시킬 수 있다. 정제는 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 피복할 수 있다.

경구용 액제는 유상 도는 현탁수용액, 액제, 유탁제, 시럽 등의 제제형태로 제제할 수 있고, 또한 물이나 또는 사용하기에 재합한 기타 담체를 혼합한 건조 생성물로 제재할 수 있다. 경구용 액제는 약학적으로 무독한 첨가제, 예를 들면 현탁제(예, 메틸셀룰로오스, 소르비톨시럽, 슈가시럽, 하이드록시에틸 셀루로우즈, 젤라틴, 카르복시메틸셀룰로오스, 알루미늄스테아레이트겔, 수소첨가 식용유지), 유화제(예, 아카시아, 레시틴, 소르비탄모노올레이트), 비-수용성담체(예, 에틸알코올, 프로필렌글리코올, 유상에스테르 분류시킨 야자유, 알몬드유) 및 방부제(예, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 소르브산)를 함유할 수가 있다.

좌약은 종래의 좌약염기와 같은 코코아 버터와 기타 글리세라이드를 함유할 수가 있다.

주사제는 방부제를 첨가하여 앰플 또는 다수복용 용기에 넣어 단위복용 형태로 제제할 수 있다. 이들은 현탁제, 액제 및 유상 유탁제 또는 수용성 부형제형으로 제제할 수 있으며, 필요에 따라 현탁제, 분산제 및 안정제 등의 제제시약을 함유시킨다. 선택적으로 본 발명의 항생물질은 사용하기 전에 무발열성 물질(pyrogenfree), 살균수중에서 다시 제제할 수 있는 산제형으로 제제할 수 있다.

본 발명의 항생물질 PS-6 또는 PS-7 및/또는 항생물질 PS-6 또는 PS-7의 트리틸에스테르를 함유하는 조성물은 코, 목구멍의 점막과 기관지를 통해 흡수하기에 적합한 여러가지 형태로 제제할 수 있다.

예를들면, 분말상 또는 액상분무제, 흡입제, 트로치제, 인후페이트제 등의 상기의 목적에 유익하게 될 것이다. 귀와 눈을 치료할 경우, 본 발명의 항생물질은 날개로된 캡슐제, 액상 또는 중-고상형인 드롭제로 제제할 수 있다. 첨가해서, 국소용으로, 산제, 로오숀제, 크리임제 또는 연고제 용으로 친수 또는 소수성 염기를 제제물 중에 함유시킬 수 있다.

필요에 따라, 담체이외에 상기한 조성물은 기타 성분, 예를들면 방부제, 산화방지제, 윤활제, 점성제, 풍미제, 현탁제 결합제 및 안정제를 함유할 수 있다.

항생물질 PS-6 또는 PS-7 및/또는 그의 트리틸에스테르를 돼지, 암소, 양, 병아리 등의 전염병을 치료하기 위한 수의용 약품에 사용하고자 할 경우, 약제는 장기간 지속하거나 또는 신속하게 유리되는 염기의 내유선제, 예를 들면 사료 첨가제로 제제할 수 있다.

본 발명에 의해 상기한 약제는 항생물질 PS-6 또는 PS-7 및 또는 그의 트리틸에스테르를 단독 유효성분 또는 기타 치료적으로 유효한 성분과 혼합해서 사용할 수 있다.

구체적으로 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 항생물질 PS-6 또는 PS-7 및 그의 트리틸에스테르는 β-락탐 화합물과 결합해서 각종 β-락타마제-생성균에 대해 상승효과를 나타내므로, 약제에 β-락탐 화합물을 화합하는 것이 유익하다. β-락탐 화합물의 적당한 예로서, 벤질페니실린, 페녹시메틸 페니실린, 카르베니실린, 암피실린 및 아목실린 등의 페니실린 유도체와 세팔로디딘, 세팔로딘, 세파졸린, 세팔렉신, 세폭시틴, 세파세트릴, 세파만돌, 세파피린, 세프라딘 및 세팔로글리신 등의 세팔로스포린 유도체를 사용할 수가 있다.

항생물질 PS-6 또는 PS-7 및 또는 그의 트리틸에스테르를 상기한 하나 이상의 β-락탐 화합물과 화합할 경우, 본 발명의 항생물질과 공지의 β-락탐 화합물의 비는 중요하지 않지만, 광위의 범위에서 변화시킬 수 있다. 그러나, 실용적인 면에서 본 발명의 항생물질과 공지의 β-락탐 화합물 사이의 정량적인 비율은 20:1 내지 1:50, 바람직하기로는 10:1 내지 1:100 사이로 사용하는 것이 좋다.

인체의 세균성 전염병의 치료에 있어서, 항생물질 PS-6 또는 PS-7 및 또는 그의 트리틸에스테르의 복용량은 치료하고자 하는데 상물, 체중, 전염병의 종류, 심도 및 징후, 투여방법 및 회수 등에 따라 변할 수 있다. 통상으로 경구 또는 비경구로 투여하기 위해, 분할 복용으로 0.05mg/kg 내지 500mg/kg, 바람직하기로는 0.5mg/kg 내지 200mg/kg 사이의 복용량으로 매일 투여하는 것이 적합하다. 전문 내과의사는 치료하고자 하는 환자의 개개의 조건에 따라 상기한 범위 외의 복용량을 선택할 수가 있다.

항생물질 PS-6 또는 PS-7 및 또는 그의 트리틸에스테르는 상기한 약제형으로 사용하거나 또는 직접 또는 동물사료에 사료첨가제로 첨가하여 사용할 수 있다. 첨가해서, 이것은 식품보존제 또는 소독 제용 유효성분으로 사용할 수 있다.

본 발명을 다음의 실시예에서 더 구체적으로 설명한다. 이들 실시예에서, 항균활성의 정량 및 정성분선은 다음 방법에 기초한 것이다.

(1) 항균활성의 생물학적 효력판정

영양한천 경사판상에서 코마모나스 테리게나(Comamonas terrigena) B-996의 철야배양물을 영양 브로스 중에 현탁시켜 610nm에서 시각세포밀도 0.040을 갖는 시이드 배양물을 제조했다. 시이드 현탁물을 1% 양으로 0.8% 고꾸또 영양브로스파우더(고뚜또 제약회사제)와 1.0% 박토-한천(디프코라보라토리스제)를 함유하는 용융한천배지에 부가했다. 시이드한 용융한천 배지 각 7ml를 페트리접시(직경 9cm)에 분포시켜 응고시켰다. 이것을 코마모나스 효력 판정판이라고 칭한다.

황색 포도상구균 FDA209P를 교반하면서 영양브로스 중에서 철야 배양시키고, 영양브로스 중에서 50배로 희석하여 시이드 현탁액을 제조했다. 1% 고꾸또 영양 브로스 파우더(고꾸또 제약회사제)와 1% 박토-한천(디프코보라토리스제)을 함유하는 용융한 천 배지를 시이드 현탁액 1%(v/v)으로 양호하게 접종했다.

상기의 시이드 용융 한천배지 각 7ml를 경사하고, 페트리접시(직경 9cm)중에서 겔화했다. 이것을 포도상구균 효력 판정판이라고 칭한다.

이와 비슷하게 알칼리게네스 효력판정판을 제조했다. 즉, 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis) B-326의 일야숙성 영양한천경사 배양물을 영양브로스 중에서 현탁시켜 시이드 현탁액을 제조하고, 그의 셀농도를 610nm에서 0.020의 시각밀도로 조정했다. 0.5% 고꾸또 영양브로스 파우더(고꾸또제약 회사제)와 1.0% 박터-한천(디프코 라보라토리스제)으로 되는 한천배지를 허용온도에서 용융시켜, 직경, 9cm의 페트리접시에 7.0ml의 양을 넣은 시이드 현탁액의 접종물로 접종시켜 겔로 만든다. 이것을 알칼리게네스 효력 판정판이라고 칭한다.

직경 8mm의 필프디스크를 통상으로 분석하고자 하는 시료용액으로 침액시키고, 이어서 충분한 시간 동안 깨끗한 여과지를 사용하여 과량의 용액을 제거하고, 분석판으로 옮기고, 35℃에서 20시간 동안 배양시켰다. 관찰된 저지대역의 직경을 측정하여 세팔로리딘의 표준용액과 비교했다. 항생물질 PS-6 및 관련 화합물의 항균활성은 세팔로리딘 당량 유니트/ml로서 나타냈다.

더 구체적으로, 세팔로리딘 100㎍/ml과 동일한 직경을 나타낼 경우에, 고상시료의 비활성을 1세팔로리딘 유니트/mg으로 나타냈다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 표준 효력판정 커어브는 시험 미생물종에 따라 약간 변한다. 시험 미생물의 속을 구체화하기 위해, 다음과 같은 유니트 표현, 즉 코마모나스-세팔로리딘 유니트(CCU약칭), 스타필로코쿠스-세팔로리딘 유니트(SCU 약칭) 및 알칼리게네스-세팔로리딘 유니트(ACU약칭)를 사용했다.

(2) 바이오-오우트그라피(Bio-outography)

대형 효력 판정판을 상기(1)에 기재한 바와 같이 제조했다. 항균활성의 생물학적 효력판정을 시이드한 용융한천 배지 100ml를 직경 9cm의 페트리접시 대신 32×24cm의 장방형 접시에 부었다.

분석하고자 하는 페이퍼 크로마토 그람을 15분 동안 전술한 대형 분석판에 놓았다. 페이퍼를 제거한 후에, 효력 판정판을 35℃에서 20시간 동안 배양시켜 저지대역을 형성했다. 이것으로 본 발명자 등은 저지 대역의 크기에 기초해서 R_f치(정성분석)를 계산할 수 있을 뿐만아니라 항균활성(준-정량분석)을 측정할 수 있었다.

TLC판의 경우에, 얇은 한장의 종이를 판과분석판의 표면 사이에 삽입시킨다. 비슷한 방법을 정성 및 준-정량분석법으로 행했다.

[실시예 1]

다음과 같은 시이드 배양배지(SE-4)를 함유하는 500ml용 삼각플라스크를 120℃에서 15분 동안 살균시켰다. 스트렙토마이시스속 A271의 양호하게 포자형성된 경사 배양물에 0.02% Tween-80(계면 활성제 아틀라스 파우더 코오포레이숀의 상표) 용액 10ml를 붓고 서서히 교반시켜 포자 현탁액을 제조했다.

포자 현탁액의 1ml를 500ml용 삼각플라스크에서 접종시키고 28℃에서 48시간 동안 회전 교반기(200r.p.m, 사이를 반경 3.5cm)로 교반-배양했다. 이어서 시이드 배양물 2ml를 다음과 같은 생성배지 100ml를 함유하는 500ml용 삼각플라스크에서 접종한 다음 28℃에서 48시간 내지 96시간 동안 회전 교반기 상에서 교반배양했다.

소량의 배양액을 일정한 간격으로 각 플라스크로부터 샘플링했다. 시료중 유효성분을 추출하고, 농축하고, 항생물질 PS-6 및 PS-7의 존재를 후술하는 바와 같이 페이퍼크로마토그라피 및 바이오오우르트라피로 검출했다.

[항생물질 PS-6의 검출]

원심 분리한 배양액의 상층액 10ml를 다이아이온 Hp-20(이온 교환기, 미쓰비시 화학회사제)이 들어있는 소형-컬럼 내에 용출시켰다. 유효성분을 흡수한 후에, 아세톤 수용액(50% v/v)으로 용출시켰다. 초기에 용출물 0.5ml를 경사 제거하고, 이어서 용출물 2ml를 취했다. 용출물을 농축시키고, 농축 용출물 20μl를 휠터페이퍼(도요로시 제50번, 도요로시 회사제)를 사용하는 하강 페이퍼 크로마토그라피하여 5℃에서 7 내지 20시간 동안 각종 용매로 전개했다. 전개 후에, 여전히 축축한 휠터페이퍼를 각종 미생물을 사용하여 15 내지 30분 동안 바이오오우트그라피용 효력 판정판을 30℃에서 약 18시간 동안 배양시켰다. 항생물질 PS-6를 함유하는 시료는 항생물질 PS-6의 Rf위치에서 저지 대역을 형성한다. 상기한 방법에 의해, 항생물질 PS-6는 상기한 6배지의 배양액 중에서 검출되었다.

[항생물질 PS-7의 검출]

배양액을 원심 분리하여 수득한 상층액 10ml를 다이아이온 PA-306(미쓰비시 화학회사제) 1.5ml로 충전된 소형-컬럼에 적용시켰다. 이 컬럼을 5%(w/v) 염화나트륨 용액 0.5ml로 세척하여, 3%(w/v) 염화나트륨을 함유하는 50%(w/v) 염화나트륨 용액으로 세척했다. 최초의 용출물 1.0ml를 제거하고, 그 다음 용출물 5.0ml를 수집했다. 메탄올을 제거하기 위해 감압하에서 증발시킨 후에 용출물을 다이아이온 HP-20(미쓰비시 화학회사제) 1.5ml를 충전한 소염-컬럼에 적용시켰다: 수지에 흡착된 유효성분을 50%(v/v) 아세톤 용액으로 용출시켰다. 용출물중 처음 0.5ml를 경사 제거하고, 이어서 용출물 2.0ml를 수집했다. 용출물을 농축시키고, 생성된 농축물 20μl를 도요휠터페이퍼 제50번(도요로시 회사제)상에 스폿트시켰다. 각종 용매계로 5℃에서 7 내지 20시간 동안 하강 페이퍼 크로마토그라피했다. 전개한 후에 반쯤 건조된 크로마토그람을 15 내지 30분동안 효력 판정판의 한천 표면과 접촉시켜 각종 시험미생물에 대해 바이오오우트그라피를 행했다.

효력 판정판을 35℃에서 18시간 동안 배양시켰다. 항생물질 PS-7을 함유하는 시료는 항생물질 PS-7의 Rf치의 위치에서 성장지지 대역을 나타냈다.

상기한 방법에 의해 수득한 결과는 항생물질 PS-7이 비록 배지의 축적량이 서로 다를지라도 상기한 4종류의 배지를 사용하여 수득한 모든 브로스 여액중에서 검출되었음을 발견했다.

[실시예 2]

후술하는 배지 AGB-42를 사용한 것을 제외하고는 스트렙토마이시스속 A271을 실시예 1과 비숫한 방법으로 배양시켰다. 24시간 전후에, 배양시키고, DL-발린 또는 L-발린 0.2%를 배지에 첨가했다. 배양물을 72시간 동안 교반시킨 후에 배지중에 축적된 항생물질 PS-6의 양은 발린을 첨가하지 않은 대조용배양액의 량보다 4배 이상이었다.

[실시예 3]

상기한 ML-19배지를 사용한 것을 제외하고는 스트렙토마이시스속 A271을 실시예 1과 비슷한 방법으로 배양시켰다. 24시간 전후로 배양시키고, 이 배지에 DL-발린 또는 L-발린 0.2%를 부가했다. 배양물을 72시간 동안 교반시킨 후에 브로스 속에 축적된 항생물질 PS-6의 양은 발린을 추출한 대조용 배양액의 량보다 4배 이상이었다.

[실시예 4]

DL- 또는 L-발린대신에 DL- 또는 L-로이신을 첨가한 것을 제외하고는 스트렙토마이시스속 A271을 실시예 3과 비슷한 방법으로 배양시켰다. 배양물을 72시간 동안 교반한 후에, 축적된 항생물질 PS-6의 양은 류우신을 추출한 대조용 배양액의 량보다 2배 이상이었다.

[실시예 5]

후술하는 배지 AGB-3을 사용한 것을 제외하고는 스트렙토마이시스속 A271을 실시예 1과 비슷한 방법으로 배양시켰다.

배양시키기 전에, L-발린 0.1 및 L- 루우신 0.3%를 배지에 첨가했다. 72시간 동안 배양물을 교반시킨 후에, 브로스 중에 상당량의 항생물질 PS-6을 축적했다.

[실시예 6]

DL- 또는 L-발린 대신에 n-발레리안산을 첨가한다. 실시예 2에 기술한 유사한 배양을 했다. 배양물을 72시간 동안 교반한 후에 브로스 중에 축적된 항생물질 PS-6의 양은 n-발레리안산을 추출한 대조용 브로스의 량보다 4배 이상이었다.

[실시예 7]

DL- 또는 L-발린 대신에 n-발레리안산을 첨가한 실시예 3에 기술한 유사한 배양을 했다. 축적된 항생물질 PS-6의 양은 n-발레리안산을 첨가하지 않은 대조용 브로스의 량보다 2배 이상이었다.

[실시예 8]

L-발린 대신에 n-발레리안산을 첨가한다. 실시예 5에 기술한 유사한 배양을 했다. 배양액중에 축적된 항생물질 PS-6의 양은 n-발레르산을 추출한 대조용 브로스의 것보다 4배 이상이었다.

[실시예 9]

실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한 시이드 배양물 100ml를 상기한 SE-4 배지 15ℓ를 함유하는 30ℓ융자아발효기에 옮기고, 28℃에서 24시간 동안 200r.p.m.에서 강제 송풍하에 배양시키고, 살균공기를 7.5ℓ/분으로 공급했다. 배지 1ℓ를 200ℓ 용량의 스테인레스 발효기 중에서 상기한 AGB-42배지(L-발린 0.5%를 접종전에 첨가했음) 100ℓ에서 배양시키고, 28℃에서 72시간 동안 100r.p.m.에서 강제송풍하에 배양시켰다. 브로스를 원심분리한 상층액의 항생역가는 450CCU/ml이었다. 브로스에, 퍼얼라이트 휠터에어드(Topco Perlite. Topco 제34번, 도꾜퍼얼라이드 공업회사제) 3%(w/v)를 첨가하고, 이것을 휠터-프레스를 통해 여과시켜 여액 60를 제조했다(전체 항균활성:25.5×10⁶CCU).

6℃ 이하의 냉각조건하에서 다음과 같은 조작을 행했다. 여액을 6ℓ의 이온-교환수지, 다이아이온 PA-306(미쓰비시 화학회사제)을 충전한 컬럼에 흡착시켰다. 컬럼을 5%(w/v) 염화나트륨 용액으로 용출시켜 항생물질 PS-5 및 PS-6을 함유하는 활성 분류물(A)(전체 항균활성:4.2×10⁶CCU)을 수득했다. 용출 후에 컬럼을 항생물질 PS-7을 단리시키기 위해 후에 사용될 것이다. 활성 분류물(A)을 다이아이온 HP-20수지(미쓰비시 화학회사제)(3×70cm) 컬럼에 충전시킨 다음에 10% 아세톤 수용액으로 용출시켰다. 용출물을 감압하에서 농축시켜 아세톤을 유거하고, 미리 M/100인산염 완충액으로 pH8까지 평형시킨 QAE-세파덱스(화르마시아 화인 케미칼스 AB제)의 컬럼(2.4×22cm)에 통과시키고, 용출을 1 내지 0.4M의 NaCl 농도를 갖는 M/100 인산염 완충액의 직선형 염화 나트륨 구배농도로 행하고, 용출물을 10g 분류물로 수집했다. 수집한 분류물을 100배로 희석하고, 활성분류물을 UV 흡착 스펙트럼과 생물학적 효력 판정법으로 검출시킨 후에 수집했다. 함유된 항생물질 PS-5를 완전히 제거하기 위하여 활성 분류물을 다이아이온 HP-20 AG(미쓰비시 화학 회사제)의 컬럼(1.2×40cm)에 충전하여, 10 내지 75%의 메탄올 수용액의 선형메탄올 구배농도를 갖는 용액 300ml로 용출시켰다. 각 분류물의 용적은 4g이었다. 각 분류물을 하강 페이퍼크로마토그라필로 아세토니트릴 120ml, 1/10M 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄-HCl, 완충액(pH7.5) 30ml 및 1/10M 소디움 에틸렌디아민 테트라아세테이트 수용액(pH7.5) 1ml로 된 혼합 용매로 전개하고, 바이오-오우트그라피로 분석했다. 항생물질 PS-5를 함유하는 제25 내지 30번 유효분류물을 수집했다. 항생물질 PS-6을 함유하는 제33 내지 40번 유효분류물을 농축시키고, 메탄올을 증류제거한 후에, 동결-건조시켰다. 이와 같이 수득한 동결 건조한 생성물을 M/100인산염 완충액(pH8.0) 1ml에 용해시킨 다음에 세파덱스 G-10(화르마시아 화인케미칼스 회사제)의 컬럼(1.2×80cm)을 통해 정제시키고, 동일한 완충액으로 전개했다. 유효 분류물을 수집하고, 묽은 NaOH 수용액으로 pH8.3까지 조정한 다음에 다이아이온 pH-20수지(미쓰비시 화학회사제)의 컬럼(1.2×20cm)에 충전시켰다. 탈염시키기 위해 10% 아세톤 수용액으로 용출을 행했다. 유효 분류물을 수집하고, 동결건조하여 항생물질 PS-6 나트륨염의 백색동결 제제물 2.4mg을 제조했다. 염화나트륨 용액으로 용출시킨 후 항생물질 PS-7의 단리를 위해 유지시킨 다이아이온 PA-306(미쓰비시 화학 회사제)의 컬럼을 3%(w/v) 염화나트륨을 함유하는 50%(v/v) 메탄올 수용액으로 용출시켜 활성 분류물(B)(전체 항균활성:1.1×10⁶CCU, 4.3% 수율)을 얻었다.

메탄올을 제거하기 위해 감압하에 농축시킨 후에, 유효 분류물(B)의 용출물을 다이아이온 HP-20(미쓰비시 화학회사제)을 충전한 컬럼(3cmø×70cm)에 흡착시키고, 10%(v/v) 아세톤 수용액으로 용출시켰다. 용출물을 각각 25g씩 분류시켰다.

유효 분류물을 결합시켜 감압하에서 농축시켜 아세톤을 제거했다. 농축물을 미리 M/1000인산염 완충액(pH-8.0)으로 완충시킨 QAE-세파덱스(화르마시아화인 케미칼스 AB제) 컬럼(2.5cmø×30cm)에 흡착시킨 다음에 M/100인산염 완충액중에서 0.1 내지 0.7M의 염화나트륨 농도의 선경구배로 용출시켰다. 용출물을 각각 17g씩 분류시켰다. 각 분류물을 생물학적 분석과 페이퍼크로마토그라피로 분석한 다음에 바이오오우트그라피하고, 제25번 내지 33번 분류물을 수집해서 혼합했는데 여기에 항생물질 PS-7이 포함되었다.

상기의 유효분류물을 다이아이온 HP-20AG(미쓰비시 화학회사제)을 충전한 컬럼(1.1cmø×20cm)에 흡착시키고, 전체 용적 40ml중 0 내지 10%의 아세톤 농도를 갖는 선형구배로 용출을 행했다. 이 용출물을 각각 5g씩 분류시켰다. 각 분류물을 자외선 분광시험하기 위해 50배로 희석했다. 항생물질 PS-7을 함유한 제15 내지 제20번 분류물을 수집해서 동결 건조하여 항생물질 PS-7의 조제제물을 수득했다.

항생물질 PS-7을 더 정제하기 위해, 수득된 항생물질 PS-7의 동결 건조시킨 조제제물을 M/100 인산염완충액(pH 8.0)에 용해시키고, 세파덱스 G-10(화르마시아화인 케미칼스 AB제) 컬럼(1.1cmø×20cm)에 흡착시켜전체 용적 20cm 중의 0 내지 0.4M의 염화나트륨 농도의 선형구배로 용출시켰다. 컬럼으로 부터의 유효분류물을 화합했다. 분류물에 염화나트륨을 3%(w/v)의 농도로 부가했다. 이 용액을 다이아이온 HP-20AG(미쓰비시 화학회사제) 컬럼(1.1cmø×20cm)에 흡착시키고, 유효성분을 10(v/v)아세톤수용액으로 용출시킨 다음에 탈염시켰다. 유효분류물을 동결 건조시켜 백색 동결건조한 제제물 형태로 항생물질 PS-7의 나트륨염 1.5mg을 수득했다. 유사한 방법을 반복하여 제제물을 수득했다.

수득된 항생물질 PS-6 및 PS-7의 나트륨염은 각각 다음과 같은 물리-화학적 성상을 나타냈다.

I. 항생물질 PS-6

1) 색깔

무색

2) 용해도

물에 가용성이고, 실질적으로 아세톤 중에 불용성이다.

3) 분해점

매분당 1℃의 비율로 온도를 상승시키는 코플러마이크로멜팅포인트 장치(Kofler micromeltiong point apparatus) BY-1(야자와 사이언티픽 매뉴팩츄어링 회사제)에서 측정했을 때에, 이 제제물은 명백한 용융점을 나타내지 않았다. 143℃ 주위에서 연화되기 시작했으며, 서서히 갈색으로 변하여 165℃에서 용적이 수축하기 시작했다. 2200℃ 주위에서 제제물의 색조는 서서히 갈색수지로 변했다.

4) 자외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-6 나트륨염의 60 마이크로그람을 물 2.0ml에 용해시키고, 히다찌 더블-빔 분광계 모델 200-20(히다죄 회사제)에서 측정했다. 기록된 차아트를 제1도에서 나타냈다.

하기는 특성치이다.

증류수중에 용해시킨 이 제제물의 수용액에 하이드록실아민 용액(pH7.5)을 부가하여 PS-6의 농도를 20㎍/ml로 하고, 후자의 농도를 10mM으로 했다. 22℃에서 30분 후에, 반응 혼합물은 300.0nm에서 초기 시각 밀도의 약 95%를 상실했다.

5) 적외선 흡수 스펙트럼

제2도는 히다찌 적외선 분광계 모델 215(히다찌 회사제)에 기록된 KBr중의 항생물질 PS-6 나트륨의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 다음과 같은 특성적인 흡수 최대치가 후술하는 파수에서 나타났다.

(i) 약 1760cm^-1(베타-락탐환에서 -CO-)

(ii) 약 1660cm^-1(아미드 결합에서 -CO-)

(iii) 약 1600cm^-1(-COO

)

(iv) 약 1555cm^-1(아미드결합에서 -CO-NH-)

6) 프로톤핵자기 공명스펙트럼

제3도는 지올 NMR 분광계 JNM PS-100(일본국 일렉트론 옵틱스 라보라토리 회사제)에 기록된 중수중의 PS-6 나트륨염의 100MHz 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

다음과 같은 특성적인 표시가 확인되었다.

(i) 0.94ppm 주위와 0.98ppm 주위에서 중심부를 갖는 한 쌍의 이중선(J=약 7.0Hz)(

)

(ii) 1.92ppm 주위에서 예리한 단일선(CH₃-CO-)

(iii) 2.42-3.50ppm 주위에서 다중선(-CH₂-

)

(iv) 3.90-4.20ppm 주위에서 다중선 (

)

7) 정색반응

에를리히 시약반응:양성

요오드-클로로백금산 반응:양성

닌히드린 반응:음성

8) 페이퍼 크로마토그라피

항생물질 PS-6은 도요휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제)과 다음과 같은 용매를 사용하여 하강 페이퍼크로마토그라피하여 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

아세토니트릴/트리스 완충액/EDTA(주 1):R_f=0.41 에탄올/물(7/3):R_f=0.65

(주 1:아세토니트릴 120ml, 1/10M 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄-HCl 완충액(PH 7.5) 30ml 및 1/10M 소디움 에틸렌디아민테트라 아세테이트 수용액(pH7.5) 1ml로 구성된 용매 혼합물)

9) 박층 크로마토그라피(TLC)

항생물질 PS-6을 다음과 같은 용매를 사용하여 크로마토그람시이트 13254 셀룰로오스(이스트맨코닥회사제)로 처리하여 다음과 같은 R_f치를 얻었다.

n-부탄올/에탄올/물(4/1/5) 상부층 : R_f=0.67

n-푸로판올/물(8/2) : R_f=0.69

n-부탄올/i-푸로판올/물(7/7/6) : R_f=0.70

아세토니트릴/물(8/2) : R_f=0.68

10) 고전압 페이퍼 전기 영동

항생물질 PS-6은 지시된 조건하에서 고전압 페이퍼 전기 영동으로 분석했다. 장치는 사반트 인스트루먼트인코포레이팃드(고전압 전원, 모델 HV 3000A번 및 평판 전기영동, 모델 FP18A번)의 것을 사용했다. 이 분석에 사용한 여과지는 도요휠터 페이퍼 제50번을 사용했으며, 결과는 다음과 같다.

전기 영동을 바르비탈 3.3g과 물 3000ml중의 소디움 바르비탈 25.5g을 함유하는 완충액(pH 8.6)에서 42V/cm의 전위에서 냉각(4℃ 이하) 하에 30분 동안 행하였으며, 항생물질 PS-6는 양극쪽을 향해 28mm 이동했다.

상기한 물리-화학적 성상은 본 실시예에서의 항생물질 PS-6 제제물의 분자구조가 다음과 같이 나타낼 수 있음을 보여주고 있다.

다음과 같은 생물학적 성상은 본 실시예의 항생물질 PS-6 나트륨염 제제물로 확인되었다.

1) 항균 스펙트럼

항생물질 PS-6 나트륨염의 MIC 치는 브레인 허어트인퓨전 브로스 에이껭(BRAIN HEART INFUSION BROTH Eiken)(에이껭 화학 회사제)을 이용하는 브로스 희석법에 의해 내성균을 포함하는 각종 병원균에 대해 측정했다.

항생물질 PS-6 나트륨염 제제물을 5-100㎍/ml 사이의 농도에서 브레인 허어트인퓨전 브로스에이껭(에이껭 화학회사제) 중에 용해시키고, 동일한 액상 매질중에서 적당히 희석게를 사용하여 희석했다. 표 5에 나타낸 미생물을 18시간 동안 28℃에서 브레인 허어트 인퓨전브로스에이껭에서 배양시키고, 최종 접종물 크기 1×10⁵cells/ml로 항생물질 PS-6의 희석계에서 접종했다. 35℃에서 20시간 동안 방치한 후에, 미생물의 성장을 각각의 항생물질 PS-6의 희석계에서 탐독했다. 최소 저지농도(MIC)는 적절한 미생물의 번식이 육안으로 확인되지 않는 항생물질 PS-6 나트륨염 제제물의 최소농도를 나타낸다. 대조용으로서, 두 개의 공지된 베타-락탐 항생물질, 세파조린 및 세폭시틴을 1㎍/ml 내지 100㎍/ml 사이의 농도에서 pH7.0에서 브레인 허어트 인퓨죤 브로스중에 용해시키고, 희석시켜 전술한 액상매질 중에서 수개의 희석계를 만들고, MIC를 측정하기 위해 상기한 바와 같이 처리했다. 얻어질 결과를 표 5에 요약했다. 항생물질 PS-6의 MIC치 이외에도 세파조린 및 세폭시틴의 치를 참고용으로 포함시켰다.

[표 5]

주 :1^*베타-락타마제 생성균

2^*가나마이신, 젠타마이신 및 토보라마이신의 내성균

3^*젠타마이신 및 토브라마이신의 내성균

4^*배지에 10% 말의 혈액을 보충시킨 것

2) β-락탐-내 미생물에 대한 공지의 β-락탐화합물의 항균활성의 전위 및 상승효과

페니실린 G 또는 세팔로리딘 50㎍/ml를 함유하는 2.5배로 희석한 영양한천(pH7.0) 10ml를 β-락타마제 생성균과 β-락탐-내미생물로 시이드하여 직경 9cm의 페트리접시에 붓고 생물학적 효력 판정 한천판을 제조했다. 이 효력판 정판상에, 240㎍/ml 농도의 항생물질 PS-6 용액 20㎕를 직경 8mm의 펄프 디스크에 놓고, 저지대역을 탐독하기 전에 35℃에서 18시간 동안 접종했다. 대조효력 판정판을 페니실린 G나 또는 세팔로리딘을 사용하지 않고 비슷하게 제조했다. 참조 항생물질로서, 페니실린 G 10,000㎍/ml 또는 세팔로리딘 20㎕를 동일한 조건하에서 디스크 효력 판정했다. 결과를 표 6에 나타났다.

표 6의 결과로부터, 검출한계치 이하의 농도에서 페니실린 G 또는 세팔로리딘에 항생물질 PS-6을 부가한 결과 β-락탐-내미생물에 대해서 상승효과를 명백히 나타냈다. 항생물질 대신에 페니실린 G 또는 세팔로리딘을 부가한 결과 상승 효과가 전혀 나타나지 않았다.

[표 6]

3) 생체내 활성

항생물질 PS-6 나트륨염 제제물의 치료효과를 황색포도상구균 스미스를 5×10⁵cells/마우스에 복강내로 감염시킨 새앙쥐를 치료하여 검토했다. 감염 직후에, 항생물질 PS-5 나트륨염제제물의 수용액을 피하주사했다. DDY 새앙쥐 숫컷(시즈오까)에서, 이 제제물 50% 치료복용량은 5.2mg/kg으로 발견되었다.

4) 독성

항생물질 PS-6 나트륨염 제제물의 주사용액을 500mg/kg의 용량으로 DDY 새앙쥐 숫컷(시즈오까)에게 복강내로 투여했다. 급성독성이 기록되지 않았다.

5) 공지의 베타-락타마제에 대한 감수성

(효모기질로서 항생물질 PS-6의 성상)

효모기질로서 항생물질 PS-6의 나트륨염 제제물의 베타-락타마제에 대한 감수성은 다음과 같은 반응 조건하에서 바실루스리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 749/C(ATCC 25972)의 엑소-페니실리나제와 바실루스 시리우스(Bacillus cereus) 569(ATCC 27348)의 감응 페니실리나제에 대해 검토했다.

(A) 시약

(1) 기질

항생물질 PS-6 나트륨염 제제물을 지시된 농도에서 25nM 인산염 완충액(pH6.8)에 용해시켰다.

(2) 베타-락타마제

(a) 바실루스 리체니포르미스 749/C(ATCC 25972)의 엑소-페니실리나제

세팔렉신-세파로오즈 4B(화르마시아 화인 케미칼스 AB제) 친화성 컬럼 크로마토그라피로 정제했다. 이 효소제의 역가는 16,600유니트/ml이었다. 칼륨페니실린 G의 가수분해를 30℃에서 M/10, pH6.8의 인산염 완충액으로 요오도메트리로 측정했다. 페니실리나제 1 유니트는 30℃, pH6.8에서 60분동안 에페니실린 G의 1 마이크로몰을 가수분해할 수 있는 효소의 양을 의미한다.

(b) 바실루스 시리우스 569(ATCC 27348)의 감응 페니실리나제.

이 베타-락타마제를 암피실린으로 감응시키고, CM-셀룰로오스 칼럼 크로마토그라피로 정제했다. 이 제제물은 26,900 칼륨 페니실린 G 유니트/ml의 역가를 가졌다.

(B) 반응 및 효력 판정 조건

30℃에서 항생물질 PS-6 나트륨염 제제물의 완충액 3ml를 함유하는 1cm 석영큐베트에 베타-락타마제를 지시된 양으로 첨가하고, 반응을 개시하기 위해 즉시 혼합했다. 가수분해의 기간 경과를 30℃에서 항생물질의 농도에 특히 대응하는 301nm에서 광학밀도의 감소를 측정하여 알아냈다. 일본국 특허출원 제94651호/77에 기재된 바와같이, 항생물질 PS-5 나트륨염 제제물은 301nm λmax에서 267.5의

치를 나타냈다. 이 제제물이 결정수를 전혀 함유하지 않는 경우, 그의 엡실론치는 8560이었다.

301nm에서 항생물질 PS-5의 초기 광학밀도의 5%가 하이드록실아민 또는 베타-락타마제로 완전히 분해시킨 후에도 잔류할 경우에, 301nm에서 이 기질의 상이한 광학밀도는 Δε가 8132이 되었음을 지시하였다. 이것을 항생물질 PS-6에 사용해서 다음과 같은 계산을 했다.

(C) 결과

(a) 바실루스 리체니포르미스 749/C의 엑소-페니실리나제 상기효소제제물 1/2ml와 항생물질 PS-6의 30m 물을 함유하는 기질용액 2.5ml를 혼합하고(항생물질 PS-6의 최종농도=10P몰/ml=3.3㎍/ml, 301nm에서 초기 광학밀도=0.086), 실질적으로 항생물질 PS-6를 가수분해하지 않고, 상기의 특정 조건하에서 15분간 배양했다.

(b) 바실루스 시리우스 569의 감응 페니실리나제.

이 베타-락타마제에 의한 항생물질 PS-6의 가수분해의 시간 경과를 상기한 조건하에서 상기한 효소제제물 7.5㎕ 와전전체용적 3.0ml중 기질로서 항생물질 PS-6의 77.5P몰(항생물질 PS-6의 최종농도=25.8P몰/ml=8.63㎍/ml, 301nm에서 광학밀도=0.366)을 함유하는 반응 혼합물 301nm에서 광학밀도를 측정하여 알아냈다. 이 데이타로부터, km치 17.7μM을 시운-롱윤(Shyun-Long yun) 및 클라렌스 에이취. 슈엘터(Clarence M. Suelter) 법으로 게산했다(Biochemica et biophysica Acta, Vol. 480, pp. 1-13, 1977 참조).

II. 항생물질 PS-7

1) 색깔

무색

2) 용해도

물에 가용성이지만, 실제롤 아세톤 중에 불용성이다.

3) 분해온도

생성물에서 일정한 융점이 나타나지 않았으며, 이것은 145 내지 150℃에서 서서히 연화되었으며, 수축하며, 마이크로멜팅 포인트 시험장치, 타입 BY-1(야자와 화학기계공업 회사제)을 사용하여 매분 1℃씩 승온시키는 코플러법으로 측정했을 때에 220℃에서 정색하며 응고했다.

4) 자외선 흡수 스펙트럼

제4도는 M/100 인산염 완충액(pH7.0) 3ml중의 항생물질 PS-7의 나트륨염 45mg을 함유하는 용액을 시마드주 디지탈더블 비임 분광계 UV210A를 사용하여 측정해서 얻은 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 특성치는 다음과 같다.

308.0nm에서 흡수물질 약 95%를 상실했으며, 이때에 pH7.5의 하이드록실 아민 수용액을 생성물의 탈이온수용액에 첨가하여, 생성물 및 하이드록실아민의 농도를 각각 20㎍/ml 및 10mM으로 조정하고, 혼합물을 22℃에서 30분동안 접종했다.

5) 적외선 흡수 스펙트럼

제5도는 히다찌 적외선 분광계 타입 215를 사용하여 KBr 정제를 측정한 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 특징적인 최대 흡수 파장은 다음과 같다.

6) 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼

제6도는 니오덴시 JNM형 PS-100 장치를 사용하며 중수 중에서 측정한 100MHz 프로톤 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 것이다. 명백한 특징적인 표시는 다음과 같다.

(i) 약 0.96ppm에서 중심부를 갖는 삼중선(CH₃-CH₂)

(ii) 약 1.72ppm에서 중심부를 갖는 다중선(-CH₂-CH₃)

(iii) 약 2.05ppm에서 예리한 단일선(CH₃-CO-)

(iv) 약 2.96 내지 3.38ppm에서 다중선(-CH₂-, N-CH-)

(v) 약 3.96ppm에서 중심부를 갖는 표시(-CH-)

(vi) 약 6.06ppm과 약 7.16ppm에서 중심부를 갖는 한 쌍의 이중선(J=약 14Hz)(-CH=CH-)

7) 정색반응

8) 페이퍼 크로마토그라피

항생물질 PS-7은 다음과 같은 용매계를 사용하는 도요휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제) 하강 페이퍼크로마토그라피하여 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

아세토니트릴/트리스/EDTA¹: R_f=0.41 에탄올/물(7/3) : R_f=0.68

9) 박층 크로마토그라피(TLC)

항생물질 PS-7은 다음과 같은 용매계를 사용하는 크로마토그람 시이트 13254 셀룰로오스 제6065번(이스트맨코닥 회사제) TLC에서 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

n-부탄올/에탄올/물(4/1/5) 상부층:R_f=0.65

n-푸로판올/물(7/3):R_f=0.81

n-푸로판올/이소푸로판올/물(7/7/6):R_f=0.71

아세토니트릴/물(8/2):R_f=0.65

10) 고전압 페이퍼 전기 영동

고전압 페이퍼 전기 영동장치(사반트 인스트루먼트 회사제) 고전압 전원 HV 3000A 전기 영동기 FP18A)를 사용하여 다음과 같은 pH치의 완충액으로 도요휠터 페이퍼 제50번(도요로시 회사제)에서 항생물질 PS-7의 전기 영동에서 다음과 같은 이동을 발견했다.

항생물질 PS-7은 pH 8.6과 30분 동안 42V/cm의 하전에서 바르비탈 3.3g, 소디움 바르비탈 25.5g 및 물 3000ml되는 완충용액에서 양극쪽을 향해 28mm 거리만큼 이동했다.

상기한 물리-화학적 성상으로 본 실시예에서 얻은 항생물질 PS-7이 다음과 같은 분자식을 갖는 것을 알았다.

또한, 본 실시예에서 수득한 항생물질 PS-7의 나트륨염이 다음과 같은 생물학적 성상을 갖는 것으로 측정했다.

1) 항균 스펙트럼

최소저지 농도를 브레인 허어트 인퓨존 브로스에이껭(에이껭 화학 회사제)으로 브로스 희석법에 의해 항생물질 PS-7에 내성균을 함유하는 각종 병원균에 대해 측정했다.

항생물질 PS-7 나트륨염을 5㎍/ml 및 100㎍/ml 사이의 농도로 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭으로 용해하여 회석했다. 용액을 동일한 배지로 회석하여 등비농도계를 수득했다. 희석계열에 28℃에서 18시간 동안 브레인 허어트인퓨존 브로스 중에서 표 5에 나타낸 각종 시험균의 배양물을 교반하고, 최종 셀을 약 1×10⁵/ml로 하여 제조한 시이드 배양물을 첨가했다. 35℃에서 20시간 동안 방치한 후에 세포성장을 시험했다. 세포성장이 관찰되지 않는 최저 농도는 시험 미생물에 대항생물질 PS=7.0의 최소저지 농도이었다. 대조 실험으로서, 공지의 항생물질 세파졸린 및 세포시틴을 1 및 100㎍/ml 사이의 농도에서 pH7.0의 브레인 허어트 인퓨존 브로스 중에 용해시키고, 동일한 매질로 등비로 희석하여 일련의 희석액을 얻었다. 시험균 수에 대한 최소 저지농도를 상기한 것과 동일한 방법으로 측정했다. 그 결과를 표 7에 나타냈다. 비교하기 위해, 공지의 항생물질 세파졸린과 세폭시틴에 대한 결과를 또한 같은 표에 나타냈다.

*β-락타마제-생성균

** 배지중에 말의 혈청 10%가 함유되었다.

2) β-락탐-내 미생물에 대한 β-락탐 항생물질의 항균활성의 전위 및 상승효과

세팔로리딘을 2.5배로 희석한 영양한천(pH7.0)에 첨가하고, 배지를 β-락타마제를 생성하는 β-락탐 생성균으로 접종했다. 배지 10ml를 분무하고, 직경 9cm의 페트리접시에 응고시켜 효력 판정판을 제조했다. 항생물질 PS-7을 50㎍/ml 또는 29㎍/ml의 농도로 각각 용해시켰다. 이 용액과 20㎕ 및 2- 및 4-배로 희석한 그의 용액을 직경 8mm의 필프디스크에서 적셨다. 상기 영양한천의 표면에 필프디스크를 놓고 35℃에서 18시간 동안 배양시킨 후에 디스크 주위의 성장 지지대역의 크기를 검사했다. 대조 실험으로서 유사한 실험을 세팔로리딘을 첨가하지 않고 동일한 배지로 행했다. 또한 비교하기 위해 유사한 실험을 항생물질 PS-7 대신에 10,000㎍/ml 페니실린 G 또는 세팔로리딘 용액 20㎕로 적신 필프디스크로 행했다. 결과를 표 8에 나타났다.

[표 8]

항생물질 PS-7을 부가한 결과, β-락탐-내성균에 대한 항균활성의 명백한 증대현상이 무첨가시 항균활성이 나타나지 않는 농도에서 페니실린 G 또는 세팔로리딘에서 관찰했다. 항생물질 PS-7 대신에 페니실린 G 또는 세팔로리딘을 부가했을 때에 항균 활성의 증대 현상이 관찰되지 않았다.

3) 생체내 활성

상기와 같이 수득한 항생물질 PS-7의 활성을 황색포도상구균속 스미스를 감염시킨 새앙쥐를 사용하여 새앙쥐에게 5×10⁵셀단위로 복강내로 투여했다. 항생물질 PS-7의 나트륨염을 감염 직후 새앙쥐에게 피하 투여했다. 화합물 C₅₀치는 DDy 새앙쥐 숫컷(시즈오까)에서 각각 7.5mg/kg이었다.

4) 독성

항생물질 PS-7의 나트륨염을 복강내로 투여한 DDY 새앙쥐 숫컷(시즈오까)에게 급성독성이 관찰되지 않았다.

5) 공지의 β-락타마제에 대한 감수성(효소기질로서 항생물질 PS-7의 특징)

기질로서 바실루스 시리우스 569(ATCC 27348)에 의해 생성한 감응-형 페니실리나제에 대한 항생물질 PS-7(나트륨염)의 행동을 다음과 같은 방법으로 시험했다.

(A) 시약

(1) 기질

항생물질 PS-7의 나트륨염을 표시된 농도에서 100mM 인산염 완충액(pH6.8)에 용해시켰다.

(2) β-락타마제

바실루스 시리우스 569(ATCC 27348)의 감응형 페니실리나제를 암피실린으로 감응시키고, CM-셀룰로오스(브라운 회사제) 컬럼 크로마토그라피로 정제했다. 효소제제물은 기질로서 페니실린 G의 칼륨염으로 효소역가 14,800 유니트/ml을 나타냈다.

(B) 반응 및 효력 판정 조건

기질로서 사용하는 항생물질 PS-7의 용액을 30℃로 가온했다. 이 용액 3.0ml를 시각통로 1cm의 석영 큐베트에 경사하고, 표시량의 효소를 첨가, 혼합하여 반응을 개시했다. 반응을 30℃에서 행하고, 기질 항생물질의 감소를 308nm에서 흡수물질로 감지했다.

308nm에서 흡수물질의 균형량은 항생물질 PS-7의 ε치가 항생물질 PS-7의 순수한 제제물이 상기한 효소에 의해 완전히 분해했을 경우에 흡수제 중에서 감소량 기준으로 10,800이었을 때에 ε=9720로 측정되었다.

(C) 결과

전체 용적 3.0ml중 페니실린 제제물 10μl와 항생물질(최종농도=34㎛몰/ml) 102㎛몰을 함유하는 반응혼합물을 상기한 조건하에서 배양하고, 항생물질 PS-7의 감소 농도의 변화를 배양시간에 관련해서 측정했다.

이 결과에 기초해서, 시운-롱윤 및 클라덴스 에이취서들터법(Biochemica et Biophysica Acta 480. 1-13(1977)에 의해 측정한 Km치는 PS-7에서 13.0㎛이었다.

[실시예 10]

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르

실시예 9에 기재한 것과 유사한 방법에 의해 수득한 항생물질 PS-6 나트륨염의 백색 동결-건조한 제제물 25.9mg을 디메틸 포름아미드 5mg 및 트리에틸아민 20μl중에 용해시키고, 이어서 염화트리틸 50mg을 첨가했다. 실온에서 3시간 동안 교반시킨 후에, 반응 혼합물을 벤젠 200ml로 희석하고, 0.1M 인산염 완충액(pH6.8) 70ml로 3회 세척했다. NaCl 포화수용액 3ml를 부가하여 탈수시킨 후에, 벤젠 용액을 무수황산나트륨을 부가하여 건조시켰나 벤젠을 감압하에서 증류시켜 벤젠 용액 약 0.5ml를 수득하고, 이것을 Bio-Beads S-X₃(바이오-라드라보라토리스제) 컬럼(1.2×96.0cm)을 통과시켰다. 이 컬럼을 벤젠으로 전개했다. 이와같이 수득한 활성분류물을 아세톤 0.5ml에 용해시키고, 미리 아세톤으로 팽윤시킨 세파덱스 LH-20(화르마시아 화인 케미칼스 AB제)의 컬럼(1.2×96.0cm)에 충전시키고, 이 컬럼을 아세톤으로 전개했다. 유효분류물을 화합해서 감압하에서 건조시까지 농축시켜 백색분말 23.7mg을 제조했다. 벤젠-n-헥산혼합물 중에서 이 분말을 재결정하여 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 무색결정형 분말 17.5mg을 수득했다. 이 무색결정형 분말은 다음과 같은 물리-화학적 성상을 가졌다.

1) 색깔

무색

2) 자외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 자외선 흡수 스펙트럼을 메탄올 100㎍/3ml의 농도에서 히다찌 더블 비임분광계 모델 200-20(히다찌 회사제)에 기록했다.

3) 적외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르 200㎍을 CHCl₃0.3ml에 용해시키고, 그의 적외선 흡수 스펙트럼을 KBr 고정셀을 사용하여 히다찌 적외선 분광계(모델 260-30, 히다찌 회사제)로 측정했다. 적외선 흡수 스펙트럼 차아트를 제7도에 나타냈다.

다음과 같은 특징적인 흡수 최대치가 다음과 같은 파수에서 관찰되었다.

(i) 약 1780cm^-1(β-락탐환에서 -CO)

(ii) 약 1700cm^-1(아미드 결합에서 -CO-)

(iii) 약 1675cm^-1(에스테르 결합에서 -COO

)

4) 용해도

항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물의 용해도는 항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물 각 5mg을 20℃에서 다음과 같은 용매 각 0.1ml에 교반하에 용해시켜 측정했다. 결과를 아래에 요약했다.

물과 n-헥산에 실질적으로 불용성이었으나 벤젠, 초산에틸, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디메틸포름 아미드(DMF) 및 디메틸술폭사이드(DMSO)에 극히 가용성이다.

5) 정색 반응

에를리히 시약반응 : 양성

요오드-클로로 백금산 반응 : 양성

닌히드린 반응 : 음성

6) 박층 크로마토그라피(TLC)

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르가 지시된 조건하에서 다음과 같은 Rf치를 나타냈다. 코마모나스테리게나 B-996에 대한 바이오-오우트 그라피에서 이동 현상이 관찰되었다.

실리카겔 TLC(메르크, DC-페르티그플래턴키젤겔 60 F254)을 사용했으며, 스폿팅하기전에, 디메틸포름아미드 10%를 함유하는 아세톤 용액 2.5μl를 스폿트했다. Rf치는 다음과 같다.

용매계 : 벤젠/아세톤(2/1):Rf=0.37

벤젠/에틸 아세테이트(1/g):Rf=0.34

항생물질 PS-6의 분자구조와 항생물질 PS-6 트리틸에스테르 제제물의 상기한 물리-화학적 성상으로 부터, 항생물질 PS-6 트리틸에스테르는 다음과 같은 구조식을 갖는 것으로 발견되었다.

항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 생물학적 성상을 다음에 나타냈다.

1) 항균 스펙트럼

화합물의 MIC(최소저지 농도)치를 브레인 허어트 인퓨존 브로스에이껭(에이껭 화학 회사제)에서 브로스 희석법을 사용하여 수개의 내성균을 포함하는 각종 병원균에 대해서 측정했다.

더 구체적으로, 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르를 소량의 메탄올에 용해시키고, 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 농도가 40㎍/ml 내지 20㎍/ml 사이가 되고, 최종 용액중의 메탄올의 농도가 10%를 초과하지 않을 때까지 브레인허어트 인퓨존 브로스 에이껭(pH7.0)(에이껭 화학회사제) 중에서 가능한 빨리 희석했다. 이 용액을 2배의 등비계로 희석했다. 표 7에 나타낸 미생물을 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭 중에서 28℃에서 18시간 동안 배양하고, 1×10⁵셀/ml의 최종 접종 크기에서 상기한 희석계에 접종했다. 35℃에서 20시간 동안 접종시킨 후에 결과를 탐독했다. 최소 농도치는 대응하는 미생물의 성장이 상기한 조건하에서 관찰되지 않는 항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물의 최저 농도 단위를 의미한다. 대조 항생물질로서, 암피실린 및 세팔로리딘의 용액을 100㎍/ml의 농도에서 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭(pH7.0)에서 제조하여, 본 발명의 시험화합물과 동일하게 처리했다. 표 9에 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 MIC치와 대조용 항생물질로서 세팔로리딘의 MIC치를 함께 요약했다.

[표 9]

주 : *β-락타마제 생성균

** 배지에 10% 말의 혈액을 보충했다.

상기의 표로부터 명백한 바와 같이, 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르는 광범위의 항균스펙트럼을 나타내며, 특히 미생물의 각종 베타-락탐-내성(베타-락타마제-생성)균에 대해 강력한 항균활성을 가졌다.

2) 생체내 활성

항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물의 생체내 활성을 황색 포도상구균 스미스를 5×10⁵셀/마우스로 복강 내로 감염시킨 새앙쥐에서 측정했다. 항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물을 감염 직후에 피하 주사했다. DDY 숫컷 새앙쥐(시즈오까)에서 50% 치료 복용량은 5.5mg/kg이었다.

3) 독성

DDY 숫컷 새앙쥐(시즈오까)에서, 항생물질 PS-6 트리틸 에스테르 제제물의 급성 독성은 500mg/kg의 복강내 투여량에서 관찰되지 않았다.

[실시예 11]

실시예 9에 기재한 것과 동일한 방법으로 수득한 항생물질 PS-7 나트륨염의 백색 동결-건조한 제제물 24.5mg을 디메틸포름아미드 5ml와 트리에틸아민 20㎕에 용해시키고, 이어서 염하트리틸 50mg을 첨가했다. 실온에서 3시간동안 교반시킨 후에, 반응 혼합물을 벤젠 200ml로 희석하고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.8) 70ml로 3회 세척했다.

NaCl 포화수용액 3ml를 첨가하여 탈수시킨 후에, 벤젠용액을 무수황산나트륨을 부가하여 건조시켰다. 벤젠을 감압하에서 부분적으로 증류시켜 벤젠 용액 0.5ml를 수득한 다음에 바이오-비이드스 S-X₃(바이오-라드라보라토리스제)의 컬럼(1.2×96.0cm)에 통과시켰다. 이 컬럼을 벤젠으로 전개했다.

이와 같이 수득한 유효분류물을 화합하여, 감압하에서 건조시까지 농축시켰다. 수득된 잔류물을 아세톤 0.5ml에 용해시키고, 미리 아세톤으로 팽윤시킨 세파덱스 LH-20(화르마시아 화인 케미칼스 AB제의 컬럼(1.2×96.0cm)에 충전하고, 이 컬럼을 아세톤으로 전개했다. 유효분류물을 화합하고, 감압하에서 건조시까지 농축시켜 백색분말 20.5mg을 제조했다. 이 분말을 벤젠-n-헥산 혼합물로 재결정하여 항생물질 PS-7의 트리틸에스테르의 무색결정형 분말 15.5mg을 수득했다. 이 무색결정형 분말은 다음과 같은 물리-화학적 성상을 가졌다.

1) 색깔:무색

2) 자외선 흡수 스펙트럼

항생물질 PS-7의 트리틸화 생성물의 자외선 흡수 스펙트럼을 메탄올 100㎍/3ml의 농도에서 히다찌 더블비임 분광계 모델 200-20(히다찌 회사제)에 기록했다.

3) 용해도

항생물질 PS-7의 트리틸화 생성물의 용해도를 항생물질의 트리틸화 생성물 각각 5mg을 20℃에서 다음과 같은 각각의 용매 0.1ml에 교반하에 용해시켜 측정했다. 그 결과를 다음에 나타냈다.

물과 n-헥산에 실질적으로 불용성이며, 벤젠 초산에틸, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디메틸포름 아미드(DMF) 및 디메틸술폭사이드(DMSO) 중에서 극히 가용성이다.

4) 정색반응

에를리히 시약반응:양성

요오드-클로로백금산반응:양성

닌히드린 반응:음성

5) 박층크로마토그라피(TLC)

항생물질 PS-7의 트리틸에스테르는 지시된 조건하에서 다음과 같은 Rf치를 나타냈다. 코마모나스테리게나 B-996에 대한 바이오-오우트그라피에 의해 이동현상이 관찰되었다.

실리카겔 TLC판(메르크, DC-페르티그플래턴키젤겔 60F254)을 사용하고, 스폿트하기 전에 디메틸포름아미드 10%를 함유하는 아세톤 용액 2.5μl를 스폿트했다. Rf치는 다음과 같았다.

용매계 : 벤젠/아세톤(2/1):R_f=0.51

벤젠/아세톤(1/1):R_f=0.67

항생물질 PS-7의 분자구조와 항생물질 PS-7 트리틸에스테르 제제물의 상기한 물리-화학적 성상으로 부터 다음과 같은 구조식이 항생물질 PS-7 트리틸에스테르에 대해서 확인되었다.

항생물질 PS-7의 트리틸에스테르의 생물학적 성상을 다음에 나타냈다.

1) 항균 스펙트럼

화합물의 MIC(최소 저지농도)치를 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭(에이껭 화학회사제)에서 브로스 희석법을 사용하여, 수개의 내성균을 포함하는 각종 병원균에 대해서 측정했다.

더 구체적으로, 항생물질 PS-7의 트리틸에스테르를 소량의 메탄올에 용해시키고, 항생물질 PS-6의 트리틸에스테르의 농도가 40㎍/ml 내지 20㎍/ml 사이가 되고, 최종 용액중 메탄올의 농도가 10% 초과하지 않을 때까지 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭(pH7.0)(에이껭 화학회사제)에 가능한 빨리 희석했다.

이 용액을 2배의 등비계에 희석했다. 표 7에 나타낸 미생물을 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭에서 38℃에서 18시간 동안 배양시키고, 최종 접종 크기가 1×10⁵셀/ml가 될때까지 상기한 희석계에 접종시켰다. 35℃에서 20시간 동안 접종시킨 후에 결과를 탐독했다. 최소 저지농도(MIC)치는 상기한 조건하에서 대응하는 미생물의 성장이 그 이상 더 관찰되지 않을 대에 항생물질 PS-7의 트리틸화 생성물의 최소농도 단위를 의미한다. 대조 항생물질로서, 암피실린 및 세팔로리딘의 용액을 100㎍/ml의 농도에서 브레인 허어트 인퓨존 브로스 에이껭(pH7.0)에서 제조하고, 본 발명의 시험 화합물과 동일하게 처리했다. 표 10에 항생물질 PS-7의 트리틸에스테르의 MIC와 대조 항생물로서 세팔로리딘의 것과 함께 요약했다.

[표 10]

주 : *β-락타마제 생성균

** 배지에 말의 혈액 10%를 보충했다.

상기한 표로부터 명백한 바와 같이, 항생물질 PS-7의 트리틸에스테르는 광위의 항균스펙트럼을 나타냈으며, 특히 미생물의 각종 베타-락탐-내성(베타-락타마제-생성) 균주에 대해 강력한 항균활성을 가졌다.

2) 생체내시험

항생물질 PS-6의 트리틸화 생성물의 생체내 활성을 황색포도상 구균 스미스 5×10⁵셀/새앙쥐로 복강내로 감염시킨 새앙쥐에서 측정했다. 항생물질 PS-7의 트리틸화 생성물을 감염직후에 피하로 주입했다. DDY 숫컷 새앙쥐(시즈오까)에 대한 50% 치료 복용량은 4.5mg/kg이었다.

3) 독성

DDY 새앙쥐 숫컷(시즈오까)에, 항생물질 PS-7 트리틸에스테르 제제물의 급성독성이 500mg/kg의 복강내 투여량에서 관찰되지 않았다.

[실시예 12]

항생물질 PS-6 메틸에스테르

실시예 9에서 수득한 동결건조한 제제물 2.0mg을 건조 디메틸포름아미드(DMF) 1ml에 현탁시키고, 여기에 트리에틸아민 20μl와 요오드화메틸 50μl를 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반시킨 후에, 이 혼합물 약 20μl를 샘플링하고, 메탄올에 용해시킨 다음 히다찌 기록 분광계 모넬 EPS-3T(히다찌 히사제)에 사용하여 315nm에서 흡수물질의 증가를 측정하여 반응의 진행을 확인했다. 반응을 확인한 후에 반응 혼합물 전체를 벤젠 20ml에 경사하고, 즉시로 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0) 각 10ml로 2회 세척했다.

벤젠용액을 무수황산나트륨으로 탈수시키고, 감압하에서 35℃에서 1ml까지 농축했다. 농축된 용액을 바이오-비이드 S-X₃(바이오-라드라보라토리스제)의 컬럼(1.2×85cm)에 충전하여 벤젠으로 전개했다. 용출물을 박층크로마토그라피(키젤겔 60 F254; 벤젠/아세톤(1/1))로 전개하고, 용출분료물을 자외선 흡수 스펙트럼에 의해 항생물질 PS-6 메틸에스테르를 함유하는 분류물을 확인한 후에 수집했다. 분류물을 감압하에서 건조시까지 농축하여 무색 유상물을 얻고 이것을 아세톤 1ml에 용해시켰다. 아세톤 용액을 미리 아세톤을 충전한 세파덱스 LH-20(화르마시아 화인케미칼스 AB제)의 컬럼(1.2×85cm)에 충전하고, 아세톤으로 전개했다.

상기한 방법에 의해 항생물질 PS-6 메틸에스테를 함유하는 분류물을 확인한 후에, 그의 분류물을 확인했다. 수집된 분류물을 건조시까지 농축하여 백색 유상 항생물질 PS-6 메틸에스테르 약 1.0mg을 수득했다.

(1) 박층크로마토그라피

R_f=0.45(키젤겔 60F254 플레이트:벤젠:아세톤=1:1)

(2) 메탄올 중에서 자외선 흡수 최대치 316.6nm

(3) 분자량(고분해 질량분광계) 326.128683(실측치) 326.130000; C₁₅H₂₂N₂O₄S에 대한 계산치

(4) 프로톤핵자기공명

제8도는 JEOL NMR 분광계 JNM PS-100(일본국 일렉트론 옵틱스 라보라토리회사제)에서 항생물질 PS-6(듀테로클로로포름 0.5ml 중의 메틸에스테르 2mg의 용액)의 메틸에스테르의 100Mh₂프로톤자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

다음과 같은 특징적인 표시가 확인되었다.

(i) 1.06ppm 주위에서 중심부를 갖는 삼중선^*(CH3

)

(ii) 2.0ppm 주위에서 예리한 단일선(CH₃-CO-)

(iii) 2.6 내지 3.6ppm 대역에서 다중선(-CH₂-, -CH-)

(iv) 3.88ppm 주위에서 예리한 단일선(

)

*서로 중복하는 한쌍의 이중선을 6개의 프로톤을 갖는 명백한 삼중선을 만들었다.

항생물질 PS-6 메틸에스테르의 분자구조는 항생물질 PS-6의 전술한 구조식과 상기한 물리-화학적 데이타로부터 다음과 같이 확인되었다.

실시예 11에서 기술한 방법을 옥화메틸 대신에 요오드화에틸, 요오드화 이소-프로필, 요오드화 이소-부틸, 요오드화 n-펜틸 또는 요오드화 n-헥실로 반복해서 각각 다음과 같은 에스테르를 얻었다.

항생물질 PS-6 에틸에스테르

항생물질 PS-6 이소프로필에스테르

항생물질 PS-6 이소-부틸에스테르

항생물질 PS-6 n-펜틸에스테르

항생물질 PS-6 n-헥실에스테르

이들 에스테르의 형성을 박층크로마토그라피, 적외선 흡수 분광법, 프로톤 자기 공명 분광법 및 질량 분광법으로 확인했다.

[실시예 13]

항생물질 PS-7 메틸에스테르

실시예 9에서 수득한 동결 건조제제물 2.0mg을 건조 디메틸포름아미드(DMF) 1ml에 현탁시키고, 여기에 트리에틸아민 20μl와 옥화메틸 50μl를 부가했다.

이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시킨 후에, 혼합물 약 20μl를 샘플링하고 메탄올에 용해시키고, 히다찌기록 분광 광도계 모델 EPS-3T(히다찌 회사제)를 사용하여 32.15nm에서 흡수물질의 증가량을 측정하여 반응의 진행을 확인했다. 반응을 확인한 후에, 반응 혼합물 전체를 벤젠 20ml에 경사하고, 즉시로 0.1M 인산염완충액(pH7.0) 각 10ml로 2회 세척했다.

벤젠용액을 무수황산나트륨으로 탈수시키고, 감압하에서 35℃에서 1ml까지 농축시켰다. 농축된 용액을 바이오-비이드 S-X₃(바이오-라드 라보라토리스제)의 컬럼(1.2×85cm)에 충전시켜, 벤젠으로 전개했다. 용출물을 박층크로마토그라피(키젤겔 60F 254; 벤젠/아세톤(2/1)로 전개하고, 용출 분류물을 자외선 흡수 스펙트럼에 의해 항생물질 PS-7 메틸에스테르를 함유하는 분류물을 확인한 후에 수집했다. 분류물을 감압하에서 건조시까지 농축시켜 무색 유상물을 수득하고, 이것을 아세톤 1ml에 용해시켰다. 아세톤 용액을 미리 아세톤을 충전한 세파덱스 LH-20(화르마시아화인 케미칼스 AB제)의 컬럼(1.2×85cm)에 충전하여 아세톤으로 전개했다. 상기한 방법에 의한 항생물질 PS-7 메틸에스테르를 함유하는 분류물을 확인한 후에, 분류물을 수집했다. 수집된 분류물을 건조시까지 농축시켜 백색-유상 항생물질 PS-7 메틸에스테르 약 1.0mg을 수득했다.

(1) 박층 크로마토그라피

Rf=0.44(키젤겔 60F 254 플레이트; 벤젠:아세톤=2/1)

Rf=0.07(키젤겔 60F 254 플레이트; 클로로포름:메탄올=99:1)

(2) 메탄올 중에서 자외선 흡수 최대치 230.5nm 및 321.5nm

(3) 분자량(고분해 질량 분광계) 310.37443(실측치) 310.375760 : C₁₄H₁₈N₂O₄S에 대한 계산치

항생물질 PS-7 메틸에스테르의 분자구조에 대해, 항생물질 PS-7의 전술한 구조식과 상기한 물리화학적 데이타로 부터 다음과 같은 구조가 확인되었다.

실시예 11에서 기재한 방법을 요오드화 메틸 대신에 요오드화에틸, 요오드화 이소-프로필, 요오드화 이소-부틸, 요오드화 n-펜틸 또는 요오드화 n-헥실로 반복하여 다음과 같은 에스테르를 수득했다.

이들 에스테르의 형성을 박층크로마토그라피, 적외선 흡수 분광법, 프로톤자기 공명 분광계 및 질량 분광계로 확인했다.

전술한 바와 같이, 항생물질 PS-7, PS-7 및 트리틸 유도체를 적어도 하나 이상을 함유하는 조성물을 고상 또는 액상 경구 섭취 복용형 등의 여러가지 단위 복용형으로 투여했다. 고상 또는 액상이던 간에 단위 복용량당 전술한 조성물은 0.1 내지 99%, 바람직하기로는 10 내지 60%양의 유효성분을 함유할 수 있다. 조성물중 유효성분의 양은 복용형태에 따라 다르며, 조성물의 전체 중량은 통상으로 10 내지 1000mg, 바람직하기로는 100 내지 1000mg 사이이다.

비경구 투여에서, 단위 복용량은 통상으로 순수하거나 또는 정제한 항생물질 PS-6, PS-7 중의 적어도 하나 이상과 살균수용액 또는 용액용 가용성 분말형의 트리틸 유도체이다.

항생물질 PS-6, PS-7 및 그의 트리틸 유도체 중 적어도 하나이상의 나트륨염을 함유하는 대표적인 제제물을 다음과 같은 방법으로 제제할 수 있다.

[실시예 A : 캡슐]

유효화합물과 증량제를 약연(mortar) 중에서 막자로 양호하게 혼합하여 균일한 혼합물을 제조했다. 이 혼합물을 200mg을 엔트릭-코우팅한 제3번 경 젤라틴 캡슐에 충전했다.

[실시예 B:정제]

상기한 조성물에서 유효성분을 락토오스와 옥수수 전분의 절반양과 혼합했다. 이 혼합물 10% 전분의 페이스트와 함께 과립화하여 채로 쳤다. 옥수수 전분과 마그네슘스테아레이트의 균형량을 첨가하고, 이 혼합물을 직경 약 1cm와 중량 500mg의 정제로 압축했다. 이와 같이 제제한 정제를 처음에 엔테릭-코우팅한 다음에 당의로 코우팅했다.

[실시예 C:주사용 리요형(LYO FORM)]

유효성분을 주사용 살균증류수에 용해시켜, 여과시키고, 살균했다. 이 용액을 살균변에 다시 나누고 물을 동결 건조하여 무균적으로 제거했다. 살균건조 고상물을 함유하는 병을 무균적으로 밀봉했다.

비경구로 투여하기 위해, 살균식염수(J.P.) 2ml를 병속에 들은 내용물에 첨가했다.

[실시예 D:정제]

항생물질 PS-6 또는 PS-7과 세팔로리딘을 다른 성분과 혼합하여, 실시예 B에 기재한 바와 같이 정제로 압축했다. 정제를 처음에 엔테릭코우팅한 다음에 당의로 코우팅했다.

[실시예 E:정제]

실시예 B에 기재된 것과 동일한 방법에 의해, 항생물질 PS-6 또는 PS-7(나트륨염)과 아미노벤질페니실린을 함유하는 정제를 수득했다.

[실시예 F:캡슐]

전술한 유효성분과 증량제를 양호하게 혼합하여 균일한 혼합물을 제조했다. 각 혼합물 약 200mg을 제3번 캡슐에 충전하고, 엔테릭 코우팅했다.

[실시예 G:정제]

상기의 실시예에서, 유효성분을 락토오스 및 표시된 비율의 옥수수 전분 절반양과 혼합했다. 이 혼합물을 10% 전분의 페이스트로 과립화한 후 체질했다. 마그네슘 스테아레이트 및 옥수수 전분의 균형량을 첨가하고, 이 혼합물을 직경 1cm 중량 500mg의 정제로 압축했다. 정제를 처음에 엔테릭-코우팅한 다음에 당의로 코우팅했다.

[실시예 H:주사용 리요형]

유효성분을 주사용 살균증류수에 용해시킨 후 여과하여 살균시켰다. 이 용액을 병에 다시 나누고, 무균적으로 동결 건조했다. 살균 건조 고상물을 함유하는 병을 무균적으로 밀봉했다.

주사용으로, 살균한 70% N-(β-하이드록시에틸)-락타미드 2ml를 병에 들은 내용물에 첨가했다.

[실시예 I:정제]

항생물질 PS-6 또는 PS-7의 트리틸에스테르 및 세팔로리딘을 혼합한 다음에 실시예 G에 기재한 바와 같이 처리하여, 정제로 압축한 다음에 코우팅했다.

[실시예 J:정제]

유효성분(항생물질 PS-6 또는 PS-7의 트리틸에스테르 및 아미노벤질페니실린)을 혼합하여 실시예 1에 기술한 것과 동일한 방법으로 처리했다.

Claims (1)

1. 탄소원, 질소원 및 필수무기산 염을 함유하는 수성 영양배지 중 호기성조건하에서 스트렙토마이시스속(streptomyces Sp.) A271을 배지로 부터 실질적으로 항균작용이 나타날 때까지 배양한 후 이 배양액으로부터 하기 일반식 화합물을 회수함을 특징으로 하는 하기 일반식 화합물의 제조방법.

   

   상기식에서, R₁은 CH₃이고 R₂가 -CH₂-CH₂-이거나, R₁이 H이고 R₂가 -CH=CH-이다.

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