DK144098B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum ps-5 eller salte eller estere deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK \R&, (φ

^ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 1i|i+098B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 14^6/78 (51) Int.CI.3 C 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 31. mar. 1978 C 07 D 487/04 (24) Løbedag 31· mar. 1978 (41) Aim. tilgængelig 1. Okt. 1978 (44) Fremlagt 7· dec. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 31 · mar. 1977, 52/35375, JP 9· aug. 1977, 52/94651, JP

(71) Ansøger S ANRAKU-0CEAJN CO. LTD., Tokyo 104, JP: PANLABS INC., Fayette- ville, US.

(72) Opfinder Kazuhiko Okamura, JP: Shoji Hirata, JP: Yasushi Oku= mura, JP: Yasuo Fukagawa, JP: Yasutaka Shimauchi, JP: m. fl.

(74) Fuldmægtig Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønning.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum PS-5 eller sal= te eller estere deraf.

Der kendes nogle antibiotika med β-laktamase-inhiberen-de virkning og nogle β-laktamase-inhiberende midler. Fx er følgende beskrevet: MC696-SY2-A og B, isolerede fra dyrkningsmedier for en MC696-SY2-producerende stamme hørende til slægten Streptomyces (US-patentskrift nr. 3,981,788; Derwent J CPI 17191X); MM4550 eller MM13902, isolerede fra dyrkede ma- y> terialer for den MM4550- eller MM13902-producerende stamme ^ som hører til slægten Streptomyces (DE-offentliggørelses- ί skrift nr. 2,513,855: Derwent CPI 67721W; DE-offentliggørel- sesskrift nr. 2,513,854: Derwent CPI 67720W); clavulansyre ^ isoleret fra dyrkede materialer af Streptomyces clavuligerus 3 2 144098 (DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,517,316: Derwent CPI 72840W) og lignende stoffer. Det antibiotiske stof tienamy-cin med et penicillinlignende kemisk skelet samt derivater deraf har også været angivet (US-patentskrift nr. 3,950,357:

Derwent CPI 31696X; DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,652,677:

Derwent CPI 40282Y; BE-patentskrift nr. 848,346: Derwent CPI 34505Y; BE-patentskrift nr. 848,349: Derwent CPI 34507; DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,652,680 Derwent CPI 40283Y; DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,652,675; Derwent CPI 40280Y; DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,652,674: Derwent CPI 40279Y; DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,652,676: Derwent CPI 40281Y).

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum benævnt PS-5, eller salte eller estere deraf, med den i krav l's indledning viste formel I, hvor R1 er hydrogen, en saltdannende kation, C^g alkyl eller trifenylmetyl. Forbindelserne har kraftig antibiotisk virkning, β-laktamase-inhiberende virkning og evne til synergistisk at forøge den antibiotiske virkning af penicilliner, cefalosporiner og lignende stoffer mod β-laktamaseproducerende organismer.

Det vil blive vist i nærværende beskrivelse at det antibiotiske stof PS-5 og tritylderivatet deraf har evne til synergistisk at forøge den antibiotiske virkning af penicilliner, cefalosporiner og lignende β-laktam-antibiotika mod β-laktamase-producerende, resistente bakterier.

Der er tilvejebragt en ren kultur af en mikroorganisme med evne til at producere det antibiotiske stof PS-5, og ud fra dette kan der tillige som vist i nærværende beskrivelse fremstilles de ovennævnte antibiotisk virksomme derivater af antibiotikum PS-5, navnlig tritylderivatet.

Det antibiotiske stof PS-5 eller dets nævnte derivater, navnlig dets tritylderivat egner sig til anvendelse til bekæmpelse af infektionssygdomme fremkaldt af gram-positive og gram-negative bakterier, herunder i form af synergistiske kombinationer med penicilliner, cefalosporiner og andre β-laktamase-følsomme antibiotika.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at man aerobt i et næringsmedium dyrker en stamme af arten 3 144098

Streptomyces sp. A 271 og isolerer den dannede forbindelse med formel I, hvor R^- er hydrogen, eventuelt i form af et salt, og om ønsket omsætter den med en diazoalkan med 1-6 kulstof atomer eller en forbindelse med formlen RY, hvor R er en C^g alkylgruppe eller en trifenylmetylgruppe og Y et atom eller en gruppe som let kan fraspaltes.

Den art af Streptomyces, som har fået betegnelsen A 271, er blevet isoleret fra en jordprøve nær Eiheiji templet i distriktet Yoshida i præfekturet Fukui i Japan.

Ifølge opfindelsen bruges hensigtsmæssigt den under betegnelsen ATCC 31.358 (FERM 3984) deponerede stamme af A 271.

Taxonomiske karakterer af stammen A271

De taxonomiske karakterer af stammen Streptomyces A271 er som følger: 1) Morfologiske karakterer

Forgrening af sporuleret luft-mycelium: simpel grenet.

Form af sporuleret luft-mycelium: toppen af luft-mycelium udviser hager, løkker eller ufuldstændige spiraler.

Stammen henføres derfor til sektionen Retinaculum-Apertum. Disse former iagttages navnlig ved dyrkning på havremels-agar-medium og glycerin-asparagin-agar-medium, mens en lige eller bugtet form lejlighedsvis iagttages på gærekstrakt-maltekstrakt-agar-medium. Form og antal af sporer i kæde: ovale eller cylindriske sporer der danner en kæde på over 10 (som regel 10-50) sporer. Sporernes størrelse og overfladestruktur: 0,8 - 1,0 x 1,0 - 1,8 μ, glat overflade. Hverken flageller eller sporangium er blevet iagttaget. Der dannes hyfer på luftmyceliet.

2) Kulturkarakterer

Kulturkarakterer af stammen A271 er vist i tabel 1, hvor resultaterne refererer til iagttagelse efter 2 ugers dyrkning ved 28° C med mindre andet er angivet. Benævnelsen af farvetonen er i hovedsagen baseret på H.D. Tresner og E.J. Backus' metode i "System of color wheels for Streptomycete taxonomy" (Appl. Microbiol. 11, 335, 1963) og farvetonekoden i "Guide to color Standard", offentliggjort af Japan Color Institute Foundation.

4 144098

Tabel 1.

Medium Vækst Luftmyceliets Substrat- Opløseligt farve myceliets pigment farve sakkaro- rigelig lyst orange- lysegult intet senitrat- gult (3ea) (2fb) til agar- lyst orangemedium gult (3ea) glukose- rigelig biegt orange- iyseggit intet asparagin- gult (3ca) (1 l/2fb - agar-medium tii lyst 2fb) orangegult (3ea) glycerol- rigelig biegt orange- lysegult intet asparagin- gult (3ca) (2fb) til agar-medium til lyst orange- noget gulgult (3ea) ligt lyse rød (4gc) stivelse- rigelig blegt orange- lyst oran- intet uorganisk gult (3ca) gegult (3ea) salt- til lyst oran- til lysegult agar-medium gegult (3ea) (2fb) tyrosin- rigelig blegt orange- lyst oran- intet agar-medium gult (3ca) gegult (3ea) til lyst oran- til brunlig gegult (3ea) gul nærings- rigelig dannes næppe; lysegult intet agar-medium hvis dannet, (db) noget mørkt gæreks- rigelig blegt orange- lyst orange- intet trakt-malt- gult (3ca) gult (3ea) ekstrakt- til lyst oran- til blegbrun agar-medium gegult (3ea) (4ie) havremels- rigelig blegt orange- lysegult intet agar-medium gult (3ca) (2fb) til lyst orangegult (3ea) 5 144098 3) Fysiologiske karakterer

1) Temperaturområde for vækst: 10-40°C, optimum 20-30°C

2) Smeltning af gelatine (på glukose-pepton-gelatinemedium): smeltes (dyrkning ved 20°C) 3) Hydrolyse af stivelse (på stivelse-uorganisk salt agarmedium) : hydrolyseres 4) Koagulering og peptonisering af skummetmælk: pepto- nisering, men ingen koagulering iagttaget 5) Dannelse af melanoidt pigment: der dannes intet melanoidt pigment på tyrosin-agar-medium og pepton-gæret-jern-agar-medium eller i trypton-gærekstrakt-suppe 6) Udnyttelse af forskellige kulstofkilder: (Pridham og Gottlieb's agarmedium) L-arabinose + D-xylose + D-glukcse + D-fruktose - sakkarose - inositol L-rhamnose + raffinose D-mannitol (+ : udnyttes godt, - : udnyttes svagt, - : udnyttes meget svagt eller slet ikke).

Det er klart^ bedømt udfra de ovenfor anførte karakterer^ at stammen A271 hører til slægten Streptomyces og udviser de karakterer der findes hos Streptomyces-organismer hørende tii sektionen RA, eftersom farvetonen af mycelieoverfiaden er gul eller rød, sporeoverfladen er glat og der ikke dannes noget vandop-løseligt pigment såsom melanoidt pigment.

Waksman's "The Actinomycetes" bind 2 (1961), E.B. Shirling og D.Gottlieb's afhandlinger i International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18, side 69-189 (1968), ibid., side 279-892 (1968), ibid., bind 19, side 391-512 (1969) og ibid., bind 22, side 265-394 (1972) samt Bergey's Mannual of determinative Bacteriology, 8. udgave (1974) blev konsulteret med henblik på at finde frem til stammer med sådanne taksonomiske karakterer. Lignende stammer hø- 6 146098 rende til sektionen RA viser sig at høre til arten Actinomyces cremeus, Antinomyces flavidovirens, Actinomyces alboheivatus, Actinomyces flavescens, Streptomvces rutgersensis, Streptomyces chryseus og Streptomyces helvaticus. Som en kultur der lignede udvalgtes også Streptomyces pluricolorescens, nemlig på grund af dens morfologiske karakterer skønt den hører til sektionen RF.

Disse 8 kulturer med undtagelse af sidstnævnte Streptomyces pluricolorescens angives at danne luftmycelium med lige form eller løkker, idet variationen afhænger af dyrkningsbetingelserne. Type kulturer af de ovennævnte 8 arter blev sammenligned med stamen A271 efter dyrkning under ens betingelser. Af resultaterne fremgår det at stammen A271 tydeligt afviger fra disse kulturer med forskelle med hensyn til vækst, farve af luftmycelium og farve af substratsmycelium såvel som udtalte forskelle med hensyn til udnyttelse af kulstofkilder.

I tabellerne 2, 3 og 4 vises resultaterne af sammenligning mellem stammen A271 og de to kulturer som ligner den mest.

Tabel 2

Sammenligning med lignende kulturer Luftmyceliets farve

Medium Stamme A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens _ ISP 5147_ISP 5150 sakkarose- lyst orange- dannes dannes ikke nitrat- gult (3ea) næsten ikke agar-medium glukose-aspara- blegt orange- blegt orange- hvid (b) gin-agar-medium gult (3ca) gult (3ca) til lyst orangegult (3ea) glycerol- blegt orange- blegt orange- dannes næsten ikke; asparagin- gult (3ca) gult (3ca) hvis dannet, agar-medium til lyst hvid (a) orangegult (3ea) 7 144098

Medium Stamme A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens ISP 5147 ISP 5150 stivelse- blegt orange- blegt orange- dannes sparsomt, uorganisk gult (3ca) gult (3ca) hvid (a) til agar-medium til lyst bleggult (2db) orangegult (3ea) nærings- agar-medium dannes næsten hvid (a) til hvid ikke, hvis blegt orange dannet, noget gult (3ca) mørk gærekstrakt- blegt orange- bleggult hvid (b) til maltekstrakt- gult (3ca) tii (2db) blegt gullig- agar-medium lyst orangegult grønt (lcb) (3ea) havremels- blegt orange- hvid (b) til hvid (b) til agar-medium gult (3ca) til blegt orange- blegt gulgrønt lyst orange- gult (3ca) (lbd) gult (3ea)

Tabel 3

Sammenligning med lignende kulturer Substratmyceliets farve

Medium Stamme A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens ISP 5147 ISP 5150 sakkarose- lysegult svag vækst, svag vækst, nitrat- (2fb) til farveløs til farveløs til agar-medium lyst orange- hvid (b) hvid (a) gult (3ea) * glukose- lysegult lyst orange- bleggult (2db) asparagin- (1 1/2 fb- gult (3ea) agar-medium 2fb) glycerol- lysegult lyst orange- grålig gult (3ec) asparagin- (2fb) tii gult (3ea) agar-medium noget gulligt lyserødt (4gc) 8 144098

Medium Stamme A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens ISP 5147 ISP 5150 stivelse- lyst orange- moderat, lysegult (2fb) uorganisk gult (3ea) til gulligt lyse- salt-agar- lysegult (2fb) rødt (4ea) medium tyrosin- lyst orange- lysebrunt grålig gult (3ec) agar-medium gult (3ea) (4ie) til brunlig gult nærings- bleggult (2db) lyst orange- bleggult (2db) agar-medium gult (3ea) gærekstrakt- lyst orange- lyst orange- mat gult maltekstrakt- gult (3ea) gult (3ea) agar-medium til blegbrun til mørkegult (4ie) havremels- lysegult (2fb) noget gulligt bleggult (2db) agar-medium lyserødt (4gc) til blegt orange gult (3ca)

Tabel 4

Sammenligning med lignende kulturer Udnyttelse af kulstofkilder

Kulstofkilde Stamme A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens ISP 5157 ISP 5150 L-arabinose + + + D-xylose + + + D-glukose + ++ D-fruktose - + + sakkarose - - - inositol - - + L-rhamnose + - + raffinose - - D-mannitol - - 144098 9 Følgende sammenfattende betragtninger kan anstilles ud fra de resultater der fremgår af tabellerne: hvad angår luftmyceliets farve: Hos Actinomyces flavidovirens er det generelt nærmest hvidt, men når det er gult er det grønliggult og er således tydeligt forskelligt fra luftmyceliet hos stammen A271; luftmyceliet hos Actinomyces cremeus udviser generelt en svagere rødlig tone i den blegt orangegule farve end stammen A271 gør, og den er derved klart forskellig fra stammen A271.

Hvad angår substratmyceliets farve udviser Actinomyces flavidovirens bleggul farve og Actinomyces cremeus lyst orangegul farve i mange tilfælde, mens stammen A271 generelt har lysegul farve. Desuden viser detaljeret sammenligning af forsøgsresultaterne opnået på forskellige medier definitivt at stammen A271 er forskellig fra de andre to kulturer. Stammen A271 afviger fra Actinomyces cremeus med hensyn til udnyttelse af D-fruktose og L-ramnose og fra Actinomyces flavidovirens ved udnyttelse af D-fruktose og inositol .

Følgelig er stammen A271 tydeligt forskellig fra de to kendte kulturer, der ligger den nærmest.

Følgelig afviger stammen A271 fra alle kendte arter af aktinomyceter og må anerkendes som en ny art, der har fået betegnelsen Streptomyces sp. A271. Denne kultur er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, hvor den har fået tildelt kulturnummeret FERM-p nr.

3984. En prøve af Streptomyces sp. A271 blev desuden deponeret hos ATCC, hvor den har fået tildelt samlingsnummeret 31358.

Antibiotikum PS-5-producenten er fundet på følgende måde. Filtrater af dyrkningssuppe i form af mikroorganismer isoleret fra jord analyseredes ved hjælp af en bioassay-agarplade som er podet med en (3-lak-tam-følsom mikroorganisme, og en anden bioassay-agarplade indeholdende β-laktamase og podet med samme organisme. De mikroorganismer som giver næringssuppefiltrater der udviser mindre inhibitions- ίο 144098 zoner på sidstnævnte bioassay-plade end på førstnævnte bioassay-plade udvælges til yderligere undersøgelse. Derefter adsorberes de aktive komponenter i de brugte dyrkningsmedier for de på ovennævnte måde udvalgte mikroorganismer på aktiveret kul og elueres derefter. De koncentrerede eluater fremkaldes ved papirkromatografi eller tyndtlagskromatografi, hvorefter der foretages bioautograf ering med en β-laktamfølsom mikroorganisme som testorganisme. Denne udvælgelsesmetode forklares mere konkret i efterfølgende eksempel. Comamonas-bioassaypladen, der vil blive beskrevet senere, bruges som bioassay-agarplade podet med β-laktamfølsom prøveorga-. nisme. Comamonas CV-bioassaypladen og Comamonas CM-bioassaypladen fremstilledes ved at man til ovennævnte Comamonas-bioassayplade sætter den β-laktamase, der frembringes af henholdsvis Proteus vulgaris P-5 og Citrobacter freundii E-9.

Pulpskiver med en diameter på 8 mm, hvortil der er sat filtrater af kultursupper fra mikroorganismer isoleret fra jord, anbringes på de ovenfor beskrevne bioassayplader, og pladerne inkuberes ved 35°C i 20 timer.

Efter inkuberingen udvælges de mikroorganismer, hvis næringssuppefiltrat gav inhiberende zone på Comamonas-bioassaypladen og en mindre inhibitionszone på Comamonas CV-bioassaypladen eller Comamonas CM-bioassaypladen.

Til næringssuppefiltraterne for dyrkningen af de således udvalgte mikroorganismer sættes der 2% (v/r) aktiveret kul ("Tokusei Shirasagi", et i Danmark ikke indregistreret varemærke; Takeda Chemical Industries, Ltd.), og efter omrøring i 15 minutter opsamledes det uopløselige materiale ved centrifugering. Det uopløselige materiale vaskedes med destilleret vand i en rumfangsmængde på det samme som det anvendte næringssuppefiltrat, og det opsamledes igen efter centrifugeringen. Det vaskede uopløselige materiale elueredes ved tilsætning af 50 rumfangs% vandig acetone i en mængde på halvdelen af rumfanget af det anvendte næringssuppefiltrat, og der foretages omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter centrifugering inddampes den ovenstående væske ved 30-35°C ved hjælp af en roterende evaporator så der opnås en 20 gange koncentreret opløsning, sammenlignet med det anvendte næringssuppefiltrat. Den koncentrerede opløsning underkastes nedadløbende papirkromato-grafering med filtrerpapir (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.) under fremkaldelse i 16 timer med 30% acetonitril/tris-EDTA- 11 144098 opløsningsmiddel (bestående af 120 ml acetonitril, 80 ml pH 7,5 1/10 M tris-(hydroxymetyl)-aminometan-HCl puffer samt 1 ml ætylen-diamintetraeddikesyre-natriumsalt i vandig opløsning). Dette efterfølges af bioautografering med Comamonas terrigena B-996 som testorganisme.

Antibiotikum PS-5 produceres ved podning af sporer af myceliet af stammen Streptomyces sp. A271 i et næringsmedium, hvorefter der foretages aerob dyrkning.

Som næringsstoffer kan der i mediet bruges mange slags næringsstoffer af de typer der sædvanligvis udnyttes af arter af slægten Streptomyces, specielt kilder til kulstof, nitrogenkilder og kilder til uorganiske salte og lignende. Anvendelige næringsstoffer er fx sådanne kulstofkilder som kulhydrater og lignende stoffer såsom glukose, glycerol, maltose, sakkarose, melasse, dextrin, stivelse eller lignende stoffer, eller olier eller fedtstoffer såsom sojaolie, jordnøddeolie, svinefedt og lignende stoffer; som eksempler på nitrogenkilder kan nævnes pepton, kødekstrakt, sojamel, bomuldsfrøolie, tørret gær, majsstøbevand, gærekstrakt, skummetmælkskasein, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og lignende stoffer; og som eksempler på uorganiske salte kan nævnes dikaliumfosfat, natriumklorid, kalciumkarbonat, magniumsulfat og lignende stoffer; endvidere kan spormetaller komme på tale såsom kobolt, mangan eller lignende stoffer, og de kan tilsættes hvis nødvendigt. Desforuden kan anvendes alle næringsstoffer som kan udnyttes af den organisme der er udvalgt til at producere det antibiotiske stof PS-5. For at forhindre skumning under opvarmning, sterilisation og gæringsprocessen kan der til- 14409* 12 sættes antiskumningsmidler såsom silikoneolie eller vegetabilsk olie.

Den bedst egnede recept og sammensætning af næringsstoffer kan let bestemmes ved simple forsøg i lille målestok, forsøg som sagkyndige nemt kan udføre.

Mediet kan steriliseres før dyrkningen.

Mediets pH-værdi reguleres fortrinsvis til en værdi i området 4-9, fortrinsvis til en værdi i området 6-8, og pH-regule-ringen kan ske før eller efter mediets sterilisation.

Dyrkning af den antibiotikum PS-5-producerende stamme kan udføres på i det væsentlige lignende måder som dem der generelt anvendes til antibiotikum-produktion ved hjælp af stammer af slægten Streptomyces eller andre aktinomyceter. Dyrkningen foretages under aerobe betingelser, dvs. dyrkning under omrøring og/eller luftning.

Selv om man i og for sig kan vælge mellem dyrkning i stationær kultur, rystekultur og submers kultur, foretrækkes det at bruge submers dyrkning. Den temperatur ved hvilken gæringen kan foretages er ikke særligt begrænset, men dyrkningstemperaturen vælges inden for det temperaturområde hvor væksten af antibiotikum PS-5-producenten ikke inhiberes væsentligt og ved hvilken den kan producere antibiotikum PS-5. Selv om gæringstemperaturen kan ændres med den anvendte producerende stamme, er en hensigtsmæssig temperatur generelt i området 20-40°C, fortrinsvis 25-35°C.

Dyrkningsmediets pH-værdi kan reguleres under gæringen til området 4-9, fortrinsvis til en værdi i området 6-8.

Ved gæring i stor målestok foretrækkes det først at dyrke en passende udsædskultur og derefter at pode næringsmidlet til den submerse dyrkning med denne udsædskultur.

Gæringen fortsættes indtil der er akkumuleret en tilstrækkelig mængde antibiotikum PS-5. Gæringstiden ligger sædvanligvis i området 30-90 timer, men den kan variere noget med sammensætningen af dyrkningsmediet, med gæringstemperaturen, med den anvendte producerende stamme og lignende faktorer. De optimale gæringsbetingelser der skal bruges, kan let bestemmes efter dyrk- 144098 13 ningsforsøg i lille målestok, udført af en sagkyndig, pen akkumulerede mængde antibiotikum PS-5 i næringsmediet kan bestemmes ved bioassay-metoden og bioautografi som er beskrevet senere i nærværende beskrivelse.

Da det akkumulerede antibiotikum PS-5 i det gærede materiale er vandopløseligt og befinder sig i hovedsagen uden for myceliet, foretrækkes det at fjerne myceliet efter gæringen ved i og for sig kendte fraskillelsesprocesser såsom filtrering, centrifugering eller ekstraktion og at udvinde det antibiotiske stof fra filtratet, den ovenstående væske eller ekstrakten.

Udvinding af antibiotiket kan udføres yed forskellige i og for sig kendte processer. Fremgangsmåder der i særlig grad foretrækkes til udvinding af det antibiotiske stof er de metoder der hyppigt har været anvendt til udvinding af antibiotika af karboxyl-syretypen.

Fx kan følgende processer udnyttes uafhængigt af hinanden eller i kombination eller gentagne gange til udvinding og isolering af antibiotikum PS-5: a) ekstraktion ved lav pH-værdi med sådanne opløsningsmidler som fx ætylacetat eller n-butanol og tilbageekstraktion fra opløsningsmiddellaget til et vandigt lag med højere pH-værdi; b) ekstraktion ved neutral pH-værdi med sådanne opløsningsmidler som fx metylenklorid eller kloroform og i nærværelse af et lipofilt kvaternært ammoniumsalt som fx benzalkonium-klorid eller tetra-n-butylammoniumhydrogensulfat, eller en krone-forbindelse såsom dicyklohexyl-18-krone-6 eller dicyklohexyl-15-krone-5 "NISSO" kroneætere ("NISSO" er et i Danmark indregistreret varemærke der tilhører Nippon Soda Co., Ltd.) og tilbageekstraktion fra opløsningsmiddellaget til et neutralt vandigt lag indeholdende natrium jodid, kaliumjodid eller et lignende salt; c) adsorption til aktiveret kul eller til højporøse styren/divinyl-benzenharpikser såsom "Amberlite" XAD (et i Danmark indregistreret varemærke tilhørende Rohm & Haas Co.) "Diaion HP-29" (et i Danmark ikke indregistreret varemærke tilhørende Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) eller lignende og eluering med vandig metanol, vandig acetone eller et lignende opløsningsmiddel; d) adsorption og eluering med ionbytterharpikser såsom "Dowex" 1-X2 (et i Danmark indregistreret varemærke tilhørende Dow Chemical Co.), QAE-"Sepha-dex" A-25 ("Sephadex" er et i Danmark indregistreret varemærke) eller lignende harpikser; e) gelfiltrering med "Sephadex" G-10, 14 144098 "Bio-Gel" P-2 eller "Bio-Beads" S-X3 ("Bio-Gel" og "Bio-Beads" er i Danmark ikke indregistrerede varemærker tilhørende Bio-Rad Laboratories) eller lignende materialer; f) søjle- eller tyndtlags-kromatografi med cellulose, "Avicel" SF ("Avicel" er et i Danmark ikke indregistreret varemærke tilhørende American Viscose Corp.), DEAE-Cellulose "Whatman" DE-32, DEAE-"Sephadex" A-25, silikagel, aluminiumoxyd eller et lignende kromatografimateriale; eller g) forceret udfældning ved tilsætning af et opløsningsmiddel som fx acetone. Opførslen af antibiotikum PS-5 ved udvindings- og isolationsprocesserne kan følges ved bestemmelse af tilstedeværelsen af antibiotikum PS-5 ved en bioassay-metode eller bioautografering som beskrevet senere i nærværende beskrivelse.

På den foran angivne måde kan man vinde antibiotikum PS-5 med de egenskaber der er beskrevet i det følgende.

Fysisk-kemiske egenskaber af antibiotikum PS-5 1) Opløseliqhed

Antibiotikum PS-5 er opløseligt i vand ved pH 6-9. Nærmere betegnet er dette antibiotiske stof opløseligt ikke blot i vand ved pH 7 men også i et svagt surt vandigt medium reguleret til pH 6 eller over 6 ved tilsætning af fx saltsyre, samt i et svagt alkalisk medium reguleret til en pH-værdi på under 9 ved tilsætning af fx natriumhydrogenkarbonat eller natriumhydroxyd. Dette antibiotikum er i det væsentlige uopløseligt i ætylacetat og benzen ved pH-værdier over 4.

2) Tyndtlagskromatografi (TLC)

Det antibiotiske stof PS-5 i form af natriumsaltet giver følgende Rf-værdier ved afprøvning med nedenstående TLC-plader og opløsningsmidler. Mængdeforholdene mellem opløsningsmidlerne i de anvendte opløsningsmiddelblandinger er udtrykt som rumfangsforhold med mindre andet udtrykkeligt er angivet.

a) "Avicel" SF cellulose-tyndtlagsplade (Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) n-butanol/ætanol/vand 7:7:6 Rf = 0,94 i-propanol/vand 7:3 Rf = 0,96 b) Forovertrukne silikagelplader 60 F254 (E. Merck) ætanol/vand 7:3 Rf = 0,82 n-propanol/vand 7:3 Rf = 0,77 144098 15 3) Papirkromatografi

Antibiotikum PS-5 giver i form af natriumsaltet følgende Rf-værdier (ved anvendelse af Toyo filtrerpapir nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.)) ved papirkromatografering i nedadvendende retning og fremkaldelse med følgende opløsningsmidler: n-propanol/vand 7:3 Rf = 0,68 n-propanol/i-propanol/vand 7:7:6 Rf = 0,70 acetonitril/vand 8:2 Rf = 0,36

acetonitril/tris/EDTA

(se nedenstående note 1) Rf = 0,34 ætanol/vand 7:3 Rf = 0,63

Note 1: Blandet opløsningsmiddel sammensat af 120 ml aceto'· nitril, 30 ml pH 7,5 1/10 M tris- (hydroxymetyl)-aminometan-salt-syrepuffer og 1 ml pH 7,5 1/10M ætylendiamintetraeddikesyre-natri-umsalt.

4) Høj spændinqs-papirelektroforese Følgende opførsel iagttages når antibiotikum PS-5 i form af natriumsaltet deraf underkastes elektroforese på Toyo filtrerpapir nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) ved hjælp af et højspændings-papirelektroforeseapparat (Savant Instruments Inc., High Voltage Power Supply HV 3000A, Flat Plate Electrophoresis Chamber FP18A): mindst 5 mm, sædvanligvis 10-40 mm vandring til anoden ved usæt-telse i 30 minutter for en potentiel gradient på 42 volt pr. cm i pH 8,6 puffer sammensat af 3000 ml vand, 3,3 g barbital (5,5-diætylbarbitursyre) og 25,5 g barbital-natrium (natrium-5,5-di-ætylbarbiturat).

5) Surhed

Antibiotikum PS-5 er en monobasisk syre med én karboxyl-gruppe i molekylet.

6) UV-absorptionsspektrum

Karakteristisk UV-absorptionsmaksimum for antibiotikum PS-5 (natriumsaltet) er som følger: (Ho0) = 301 nm.

max c.

7) IR-absorptionsspektrum

Karakteristiske IR-absorptionsmaksima for antibiotikum PS-5 (i form af natriumsaltet), målt ved KBr-tabletmetoden er som følger:

Ca. 1750 cm 1 (-CO- i 0-laktamringen), ca. 1650 cm 1 (amid-CO-), ca. 1640-1540 cm"1 (-COO-).

16 144098 8) Proton-NMR-spektrum

Natriumsaltet af antibiotikum PS-5 giver følgende karakteristiske signaler ved 100 MHz pr oton-NMR-spektrum, målt i D20: i) triplet centreret ved ca. 1,06 ppm med koblingskonstanter på ca. 7,5 Hz (CH3-CH2-) ii) multiplet ved ca. 1,72-2,00 ppm (CH^-C^-) iii) en skarp singlet ca. ved 2,05 ppm (CH..-C0-) -3 i iv) multiplet ca. ved 2,88-3,58 ppm (CH2 -CH-) v) multiplet ved ca. 3,92-4,20 ppm (-CH-)

N

9) Specifik rotation [a]22 = +77,3 (c = 1,59, 0,01M pH 8 natriumfosfatpuffer) 10) Molekylvægt og molekylformel

Molekylvægten er ca. 298 (beregnet ud fra resultaterne af højopløsnings-massespektrometri for metylesteren af antibiotikum PS-5). Molekylformlen er C13H18N2°4S* 11) Farvereaktion

Reaktion med Ehrlich's reagens: positiv

Jod-klorplatinsyrereaktion: positiv N inhydr inr eaktion: negativ

Ved disse fysisk-kemiske egenskaber er det definitivt fast- i slået af grupperne CH^-CH^-, CH^CO-, -CH2~, -CH-, -CH- -s # N · J- 0 —NHCO— og -COO er til stede i molekylet af antibiotikum PS-5 i form af natriumsaltet.

Elementæranalysen af tritylesteren af antibiotikum PS-5 (eksempel 10) afslører tilstedeværelsen af svovl. Data for UV-absorptionsmaksimum og minimum såvel som absorptionsforholdet og extinktionskoefficienten understøtter antagelse af et tienamycin-skelet i molekylet. Dette bekræftes af den kendsgerning at UV-absorptionsmaksimet skifter fra 301 nm til 315 nm ved forestring af karboxylgruppen (16th Interscience Conference on Antimicrobial Agents & Chemotherapy, Chicago, 29. oktober 1976).

På basis af de foran angivne undersøgelsesresultater antages det at antibiotikum PS-5 har følgende molekylstruktur: .s-ch„-ch9-nh-co-ch? CH,--CH_ —-f 1 I 11

0^ H ^COOB

17 “ 144Q98

Denne struktur understøttes af yderligere beviser, således at antibiotikum PS-5 som beskrevet senere (eksempel 9) giver 13 sig-13 naler i C-NMR-spektret og at deres kemiske skifter stemmer med den ovenfor anførte struktur i sammenligning med de data der ken-* des for tienamycin.

Skønt antibiotikum PS-5 synes at være ustabilt når fx isolationen udføres ved stuetemperatur, er stoffet rimeligt stabilt ved lave temperaturer som fx under 0°C og navnlig under -10°C. Stoffet er rimeligt stabilt i vandig opløsning ved omkring neutral og svagt alkalisk pH-værdi. Mindst 50% eller som regel over 70% af den antibiotiske aktivitet af antibiotikum PS-5 er tilbage efter mindst 15 minutters opvarmning til 60°C i vandig opløsning ved en pH-værdi mellem ca. neutral værdi og svagt alkalisk pH-værdi under pH 9.

Biologiske egenskaber af antibiotikum PS-5 1) Antibiotisk spektrum

Antibiotikum PS-5 har bredspektret antibiotisk aktivitet og udviser meget kraftig virkning mod forskellige bakterier, fx grampositive bakterier hørende til sådanne slægter som staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina og Bacillus; og gram-negative hørende til sådanne slægter som fx Alcaligenes og Comamonas. Antibiotikum PS-5 udviser også god aktivitet mod gram-negative bakterier hørende til sådanne slægter som Escherichia, Klebsiella og Proteus.

Antibiotikum PS-5 udviser kraftig aktivitet mod gram-negative bakterier som er resistente mod antibiotika med β-laktam-ring-struktur, fx bakterier hørende til sådanne slægter som fx Citro-bacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella og Serratia, 2) Stigende antibiotisk virkning af andre antibiotika mod β-lakta-maseproducerende bakterier ______________

Antibiotikum PS-5 har evne til at forøge den antibiotiske aktivitet af andre antibiotika, navnlig af β-laktamantibiotika såsom penicilliner og cephalosporiner, mod en række β-laktamase-producerende bakterier som fx Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes og Serratia marcescens. Aktivitets-mønsteret er i de fleste tilfælde synergistisk.

18 144098 3) Aktivitet in vivo

Ved indgift hos mus inficeret med patogene gram-positive bakterier udviser antibiotikum PS-5 udtalt terapeutisk virkning.

4) Toxicitet

Antibiotikum PS-5 bevirker ikke død hos forsøgsdyr ved intra-peritoneal indgift hos mus i en dosis på 500 mg/kg.

Derivater af antibiotikum PS-5

Eftersom antibiotikum PS-5 som ovenfor beskrevet er labilt, må udvindings- og isolationsprocesserne gennemføres med stor omhu og forsigtighed. Da antibiotikum PS-5 i almindelighed er mere stabilt i saltform end i form af den fri syre, må saltformen foretrækkes når stoffet skal anvendes til farmaceutisk brug eller når det bruges som mellemprodukt til syntetisering af derivater samt under isolationsprocessen. Den ovennævnte saltform omfatter fx følgende: alkalimetalsalte som fx natriumsaltet, kaliumsaltet og litiumsaltet; jordalkalimetalsalte som fx kalciumsaltet eller magniumsaltet; andre metalsalte som fx aluminiumsaltet; ammoniumsaltet; salte med primære, sekundære eller tertiære aminer som fx salte med monoætyl-amin, dimetylamin, triætylamin, monoætanolamin eller diætanolamin; og salte med organiske baser som fx benzatin eller prokain. Egnede salte er farmaceutisk acceptable salte, og særlig egnede er kaliumsaltet og især natriumsaltet. Ifølge opfindelsen foretrækkes det derfor at gå frem som angivet i krav 4.

Som beskrevet foran er antibiotikum PS-5 en monobasisk syre med en enkelt karboxylgruppe i molekylet. Det er derfor klart at der kan afledes forskellige estere af antibiotiket med den almene formel x-v /S-CH0-CH„-NH-CO-CH0 CH--CH- —-S 1 3 ΤΠΪ

^COOR

19 144096 hvor R er en cj_g alkylgruppe eller en trifenylmetylgruppe. I formel III er alkylgruppen ligekædet eller grenet, især en gruppe med 1-4 kulstofatomer. Eksempler på gruppen R er således metyl, ætyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, iso-pentyl, n-hexyl og lignende grupper.

Som nævnt kan estere med den almene formel III fremstilles ved at man omsætter antibiotikum PS-5 med formlen II eller salte deraf med en forbindelse med den almene formel RY, hvor R har den ovenfor angivne betydning og Y angiver en atom eller en atomgruppe som kan fraspaltes, eller med en diazoalkan.

Hvad angår atomet eller gruppen Y i forbindelsen med den almene formel RY kan der anvendes en hvilken som helst slags atom eller gruppe der kan fraspaltes når forbindelsen bringes i kontakt med karboxylgruppen i antibiotikum PS-5, fx halogenatomer såsom klor, brom eller jod eller en sulfonyloxygruppe; eller en reaktiv karbonyloxygruppe såsom gruppen -O-CO-CF^ eller en lignende gruppe. Det foretrækkes at Y er et halogenatom.

Repræsentative eksempler på forbindelser med den almene formel er metylalkohol, metyljodid, dimetylsulfat, metylmerkap-tan, ætanol, ætylbromid, ætyljodid, ætylmerkaptan, n-propylklorid, n-propyljodid, propylalkohol, isopropylalkohol, isopropylbromid, n-butylalkohol, n-butylbromid, n-butyljodid, n-pentylalkohol, n-pentylklorid, n-pentylbromid, n-pentyljodid, n-hexylalkohol, n-hexylbromid, n-hexyljodid, tritylalkohol, tritylmerkaptan, trityl-klorid og tritylbromid.

Et repræsentativt eksempel på en lavere diazoalkan der egner sig til fremstilling af estere af antibiotikum PS-5 er diazometan.

Omsætningen af antibiotikum PS-5 med forbindelser med den almene formel RY eller med en lavere diazoalkan udføres ved i og for sig kendte forestringsmetoder. Fx kan omsætningen af antibiotikum PS-5 med en forbindelse med den almene formel RY eller med en lavere diazoalkan fortrinsvis udføres i et inaktivt væskeformigt medium, men den kan også gennemføres under fravær af et sådant medium. Som eksempler på anvendelige inaktive medier kan nævnes (a) kulbrinter som fx benzen, toluen, n-hexan eller cyklohexan; (b) halogenerede kulbrinter som fx kloroform eller metylenklorid; (c) amider som fx dimetylformamid eller hexametylfosfotriamid; (d) dimetylsulfoxyd; (e) en æter som fx dlætylæter, diisopropylæter, 20 144098 di-n-butylæter, tetrahydrofuran eller dioxan; (f) en ester som fx ætylacetat eller n-butylacetat; eller (g) en keton som fx acetone eller metylætylketon. Disse opløsningsmidler kan bruges hver for sig eller i form af blandinger af to eller flere deraf.

Reaktionstemperaturen er ikke kritisk og kan ændres inden for vide grænser, til dels i afhængighed af typen af forbindelsen med den almene formel RY, arten af den lavere diazoalkan eller typen af væskeformigt medium der anvendes. Reaktionstemperaturen kan vælges i det område i hvilket antibiotikum PS-5 ikke sønderdeles udtalt, og i almindelighed er en passende temperatur under 60°C, fortrinsvis i området 0-40°C og særlig hensigtsmæssigt i området mellem 5°C og stuetemperatur. Ved udførelse af den angivne reaktion tilsættes der om nødvendigt et reaktionsstimulerende middel som fx trimetylamin, triætylamin, pyridin eller dicyklohexylkarbo-diimid. Under disse betingelser kan reaktionen fuldføres i løbet af 1-24 timer, som regel 3-12 timer.

Ved en foretrukken udførelsesform for forestringsreaktio-nen behøver det antibiotikum PS-5, der bruges til omsætningen med det reaktive derivat med den almene formel RY, hvor R er en trife-nylmetylgruppe, ikke nødvendigvis at være et isoleret renset præparat. Endog det dyrkede materiale eller det filtrerede næringsmedium efter fjernelse af mycelier fra det dyrkede materiale kan bruges til reaktionen såvel som det rå præparat af antibiotikum PS-5 som er blevet delvis renset ved de ovenfor beskrevne udvindings- og isoleringsprocesser. Eksempler på partielt renset præparat er: (a) et koncentreret eluat fra aktiveret kul ved hjælp af hvilket det filtrerede næringsmedium er blevet behandlet; (b) et koncentreret eluat fra en styren/divinylbenzenharpiks såsom "Diaion" HP-20, som det filtrerede næringsmedium har været udsat for; (c) et koncentrat afsaltet med aktiveret kul af et eluat vundet med en gradientkoncentration af natriumklorid i fosfatpuffer fra en ionbytter-harpiks som fx QAE-"Sephadex", hvorpå det ovennævnte koncentrerede eluat fra "Diaion" HP-20 er blevet adsorberet; (d) en koncentreret metylenkloridekstrakt i nærværelse af benzalkoniumklorid; (e) en koncentreret ekstrakt med kloroform i nærværelse af en kroneforbin-delse; og (f) en koncentreret butanolekstrakt ved pH 3,5 ved lav temperatur.

144098 21

Den således dannede tritylester af antibiotikum PS-5 blev isoleret fra reaktionsblandingen og renses på forskellige kendte måder. For eksempel kan man efter at reaktionen er fuldført først udhælde reaktionsblandingen i et vandigt medium for at fjerne de vandige urenheder såsom biprodukter og lignende.

Det foretrækkes at bruge en neutral puffer som vandigt medium for at holde pH nær ved neutralitet. Tritylesteren af antibiotikum PS-5 i denne blanding ekstraheres derefter med et mindre polært organisk opløsningsmiddel der ikke i væsentlig grad er blandbart med vand, fx ætylacetat, benzen eller kloroform. Under ekstraktionstrinnet kan man tilsætte et salt som fx natriumklorid eller ammoniumsuifat for at forøge effektiviteten af ekstraktionen.

Efter tørring af den organiske ekstrakt over vandfrit natriumsulfat kan tritylesteren isoleres fra opløsningsmidlet ved kendte metoder, fx gelfiltrering ved hjælp af "Bio-Beads S-X3" eller "Sephadex" LH-20; eller adsorptionskromatografi ved hjælp af en bærer som fx silikagel, aluminiumoxyd eller fullerjord, der kan bruges i en eller anden passende kombination eller om nødvendigt anvendes gentagne gange.

Tritylesteren kan renses yderligere ved krystallisation fra et opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler som fx benzen, toluen, xylen, ætylacetat, diætylæter, metylenklorid, kloroform, hexan eller petroleumsæter (kogepunktsområde 30 til 60°C).

Blandt de estere med den almene formel m, der frembringes på den ovenfor beskrevne måde, er tritylesteren af antibiotikum PS-5 med formlen s-ch2-ch2-nh-co-ch3 ch3-ch2 η—f^Y' 0 )-"—k i /T\ o COO - C-\ / 6 22 144098 karakteriseret som en af de mest nyttige estere i kraft af følgende egenskaber: esteren er mere stabil end antibiotikum PS-5 med formel n, hvorved isolationen bliver lettere og forbindelsen bevarer kraftig antibiotisk og 3-laktamase-inhiberende aktivitet, mens fx tritylesteren af kendte penicilliner ikke udviser nogen væsentlig antibiotisk aktivitet. Desuden er tritylesteren med formel Il-a meget betydningsfuld som en af de aktive estere og som et nyttigt mellemprodukt til syntese af andre farmaceutiske nyttige produkter, eftersom tritylgruppen kan fraspaltes.

Fysisk-kemisk og biologiske egenskaber af tritylesteren af antibiotikum PS-5 anføres detaljeret i det følgende.

Fysisk-kemiske egenskaber af tritylesteren af antibiotikum PS-5 A) Smeltepunkt

Tritylesteren smelter mellem 83 og 88°C.

Smeltepunktet er i dette tilfælde målt ved Kofler-meto-den med en temperaturstigningshastighed på 1°C per minut (apparat: smeltepunkt - testapparat type BY-1, Yazawa Scientific Mfg. Co. Ltd.).

B) UV-absorptionsspektrum λ max (CH-jOH) : 315,5 nm C) IR-absorptionsspektrum

De mest karakteristiske absorptionsmaksima i kloroformopløsning forekommer ved følgende bølgetal: 3430, 3100-3000, 2990, 2950, 1770, 1695, 1665, 1445, 1340, 1275 og 1139 cm"1.

D) Opløselighed

Esteren er i det væsentlige uopløselig i vand, hexan og petroleumsæter (kogepunkt 30-60°C); opløselig i benzen, ætylacetat, kloroform, acetone og dimetylsulfoxyd.

E) Farvereaktion

Reaktion med Ehrlich-reagens positiv

Trifenyltetrazoliumklorid-reaktion negativ

Ferriklorid-reaktion negativ

Jodplatinat-reaktion positiv

Hydroxylamin-ferriklorid-reaktion positiv

Reaktion med klor-tolidin-reagens positiv

Ninhydrin-reaktion negativ 14A098 23 F) Stoffets farve: farveløst G) Tyndlagskromatografi (TLC)

Rf-værdierne på nedennævnte plader og med de angivne opløsningsmidler er som følger: (a) "Chromagram Sheet Nr. 6065" fra Eastman Kodak Co.: Øvre lag af n-butanol/ætanol/vand 4:1:5 Rf=>0,56 i-propanol/vand 8:7 Rf-0,91 n-butanol Rf=l,0 i-propanol/vand 1:4 Rf=l,0 (b) Forovertrukne silikagelplader 60 F254 (E. Merck) benzen/acetone 2:1 Rf=Q,29 H) Proton-NMR-spektrum NMR-spektret ved 100 MHz af tritylesteren i CDClg viser følgende karakteristiske signaler: i) triplet centreret cirka ved 1,10 ppm med koblingskonstanter på cirka 7,0 Hz.

ii) singlet nær 1,86 ppm iii) multiplet ved cirka 7,0 til 7,67 ppm

De foran angivne fysisk-kemiske egenskaber stemmer med strukturen Il-a.

Navnlig bekræfter følgende kendsgerninger at tritylerings-produktet af antibiotikum PS-5 er en ester.

i) Den brede IR-absorption for -QOO0 ved cirka 1640-1540 cnT1, der foreligger i IR-spektret for natriumsaltet af antibiotikum PS-5, iagttages ikke i IR-spektret for tritylesteren. I stedet giver tritylesteren skarp absorption for en gruppe -co- i esterdelen ved cirka 1695 cm ii) Antibiotikum PS-5 kan ikke ekstrahere? i væsentlig grad med opløsningsmidler for neutrale eller svagt alkaliske opløsninger, men tritylesteren kan let ekstraheres.

III) UV-absorptionsmaksimet for antibiotikum PS-r5 er 301 nm, mens det for tritylesteren er 315,5 nm. Dette skifte er analogt med det som er tilfældet for N-acetyltienamycin-metylesterens vedkommende.

Biologiske egenskaber af tritylesteren af antibiotikum PS-5 (1) Antibiotisk spektrum

Tritylesteren af antibiotikum PS-5 har bredspektret anti- 24 144098 biotisk aktivitet og udviser specielt en meget kraftig aktivitet mod forskellige gram-positive bakterier hørende til sådanne slægter som Staphylococcus, Diplococcus, Steptococcus, Sarcina og Bacillus samt gram-negative bakterier hørende til sådanne slægter som Alcaligenes og Comamonas.

Tritylesteren af antibiotikum PS-5 udviser også god aktivitet mod gram-negative bakterier hørende til sådanne slægter som Escherichia, Klebsiella og Proteus.

En bemærkelsesværdig egenskab hos tritylesteren af antibiotikum PS-5 er dens kraftige aktivitet mod gram-negative bakterier som er resistente mod antibiotika med 3-laktam-ringstruktur og fx hører til slægterne Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella og Serratia.

(2) Forøgelse af den antibiotiske virkning af andre antibiotika mod β-laktamase-producerende bakterier

Tritylesteren af antibiotikum PS-5 har også evne til at forøge den antiotiske aktivitet af andre antibiotika, navnlig af β-laktam-antibiotika såsom penicilliner og cefalosporiner, mod β-laktamase-producerende bakterier som fx Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes og Serratia marcescens.

(3) Aktivitet in vivo

Tritylesteren af antibiotikum PS-5 udviser ved indgift hos mus inficeret med-patogene gram-positive bakterier udtalt terapeutisk virkning.

(4) Toxicitet

Tritylesteren fremkalder ikke død hos forsøgsdyrene ved intraperitoneal indgift til mus i en dosis på 500 mg/kg.

Anvendelsesmåde og farmaceutiske præparater af antibiotikum PS-5 og derivater deraf

Antibiotikum PS-5 og nævnte derivater, især tritylesteren, har aktivitet in vitro og in vivo mod gram-negative og gram-positive mikroorganismer og er derfor nyttige til at kontrollere og forhindre bakterieinfektioner hos forsøgsdyr og mennesker.

Præparater af antibiotikum PS-5 eller tritylesteren deraf kan indgives oralt, lokalt eller parenteralt (fx intravenøst, in- 144098 25 tramuskulært eller intraperltonealt) og kan anvendes i mange forskellige af de sædvanlige typer farmaceutiske præparater i afhængighed af indgiftmåden.

Når antibiotikum PS-5 og/eller tritylesteren deraf skal bruges til sådanne anvendelser som behandling af infektioner hos svin, køer, får eller fjerkræ kan præparatet have form af Intra-mammære præparater i langtidsvlrkende eller hurtigt afgivende grundlag eller som koncentrater til anvendelse som foderadditiver. De beskrevne farmaceutiske præparater kan indeholde antibiotikum PS-5 og/eller tritylesteren deraf som eneste virksomme bestanddel, eller denne kan være i kombination med andre terapeutisk virksomme stoffer.

Som beskrevet udførligt foran vil det, fordi antibiotikum PS-5 og tritylesteren deraf har synergiatisk virkning på forskellige β-laktamaseproducerende bakterier 1 kombination med en β-lak-tam-forbindelse, være fordelagtigt at kombinere antibiotikum PS-5 eller tritylesteren deraf med β-laktamfprbindelser 1 farmaceutiske præparater. Som egnede eksempler på β-laktamforbindelser til dette formål kan nævnes penicillinderivater såsom benzylpenlcillin, fenoxymetylpenicillin, karbenicillin, ampicillin og amoxicillin; og cefalosporinderivater såsom cefalorldin, cefalotin, cefazolin, cefalexin, cefoxitin, cefacetril, cefamandol, cefapirin, cefra-din og cefaloglycin.

Forholdet PS-5 eller/og tritylesteren deraf på den ene side og den eller de kendte β-laktamforbindelser på den anden side er hensigtsmæssigt 20:1 til 1:150, fortrinsvis i området 10:1 til 1:100.

Nogle eksempler vil tjene til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I alle eksemplerne er de kvantitative og kvalitative bestemmelser af antimikrobiel aktivitet baseret på følgende metoder: (1) Bio-bestemmelse af antimikrobiel aktivitet

En natgammel kultur af Comamonas terrigena B-996 på en næringsagar-skråflade suspenderedes i næringssuppe til fremkaldelse af en optisk celletæthed på 0,040 ved 610 nm.

144098 26

Udsædssuspensionen sattes i en mængde på 1% til et smeltet agar-medium indeholdende Of8% Kyokuto næringssuppepulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og en 1,0% Bacto-agar (Difco Laba-ratories). Syv milliliter af det podede smeltede agarmedium fordeltes i en petriskål (9 cm i diameter) og bragtes til størkning. Dette præparat betegnes som Comamonas-bestemmelsespladen.

Staphylococcus aureus FDA 209P dyrkedes natten over i en næringssuppe i rystekultur og fortyndedes 50 gange i næringssuppe til tilvejebringelse af en udsædssuspension. En mængde på 1 rumfangs % af suspensionen blandedes godt med et smeltet agarmedium indeholdende 1% Kyokuto næringssuppepulver (Kuokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1% Bacto-agar (Difco Laboratories). Syv milliliter af det podede smeltede agar-medium udhældtes og bragtes til størkning i en petriskål (9 cm i diameter). Dette præparat betegnes som Staphylococcus-bestemmelsespladen.

På tilsvarende måde fremstilledes der en Alcaligenes-be-stemmelsesplade. En én nat gammel næringsagar-skråkultur af Alca-ligenes faecalis B-326 suspenderedes i næringssuppe for at tilvejebringe en udsædssuspension hvis cellekoncentration reguleredes til en optisk tæthed på 0,020 ved 610 nm. Et agarmedium bestående af 0,5% Kyokuto næringssuppepulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1,0% Bacto-Agar (Difco Laboratories) smeltedes ved tilladelig temperatur og podedes med 1,0% podemængde af udsædssuspensionen. Syv milliliter af det podede smeltede agarmedium fordeltes i en petriskål med 9 cm diameter og fik lov til at størkne. Dette benævnes en Alealigenes-bestemmelsesplade.

En 8 mm pulpskive blev som regel gennemvædet med den prøve-opløsning der skal bestemmes og anbringes derefter på et rent ark filtrerpapir i tilstrækkelig lang tid til at fjerne overskydende opløsning, hvorefter skiven overføres til en bestemmelsesplade. Efter inkubering ved 35°C i 20 timer måltes diameteren af den konstaterede inhiberingszone og sammenlignedes med standardopløsninger af cefaloridin. Den antimikrobielle virkning af antibiotikum PS-5 og beslægtede forbindelser udtrykkes som cefaloridin ækvivalent-enheder/ml.

144098 27

Specielt udtrykkes en opløsning af antibiotikum PS-5 eller en beslægtet forbindelse, der udviser samme diameter af inhiberings-zonen som 100 yg/ml cefaloridin, som 100 cefaloridin-enheder/ml.

På tilsvarende måde, hvis en fast prøve af antibiotikum PS-5 eller en beslægtet forbindelse ved en koncentration på 1 mg/ml udviser samme diameter som 1 yg/ml cefaloridin, så angives den specifikke aktivitet af den faste prøve som 1 cefaloridin-enhed/mg. Som velkendt for fagfolk varierer standardkurven for bestemmelsen i nogen grad i afhængighed af prøvemikroorganismens art. For at specificere prøveorganismernes arter er følgende enhedsudtryk anvendt: Comamonas-cefaloridin-enhed (forkortet CCU); Staphylococcus-cefa-foridin-enhed (forkortet SCU); og Alcaligenes-cefaloridin-enhed (forkortet ACU).

(2) Bio-autografi

Der tilberedtes en stor bestemmelsesplade som beskrevet under (1) foran, men med den forskel at 100 ml af det podede smeltede agarmedium udhældtes i en rektangulær skive på 32 x 24 cm i stedet for i en 9 cm stor petriskål.

Et papirkromatogram der skal bestemmes anbragtes .i 15 minutter på den store bestemmelsesplade. Efter at papiret var fjernet inkuberedes bestemmelsespladen ved 35°C i 20 timer for at afsløre inhibitionszonen eller -zonerne. Denne teknik tillader ikke blot at beregne Rf-værdierne (kvalitativ bestemmelse), men også at bestemme den antimikrobielle aktivitet (semi-kvantitativ bestemmelse) baseret på størrelsen af inhiberingszonen.

I tilfælde af at der anvendtes en TLC-plade blev der indskudt et ark tyndt papir mellem TLC-pladen og overfladen af bestemmelsespladen. En lignende metode udførtes til kvalitativ og semi-kvantitativ bestemmelse.

Eksempel 1

En 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende følgende pode-kultur-medium (SE-4) steriliseredes ved 120°C i 15 minutter. Til en vel sporuleret skråkultur af Streptonyces sp. A271, ATCC 31358 sattes der 10 ml af en 0,02% opløsning af "Tween-80" (et i Danmark indregistreret 28 U4&98 varemærke for et overfladeaktivt middel fra Atlas Powder Corp.)/ og opløsningen omrørtes en smule for at .frembringe en sporesuspension. Mediet i den 500 ml store Erlenmeyer-kolbe podedes med en milliliter af en sporesuspension som var rystedyrket ved 28°C i 48 timer på en roterende ryster (200 opm: cirkelradius 3,5 cm). Derefter podedes 2 ml af udsædskulturen i hver af seks 500 ml store Erlenmeyer-kolber der hver indeholdt 100 ml af de nedenfor beskrevne produktionsmedier , og der foretoges dyrkning ved rystekultur ved 28°C i 48 til 96 timer på en roterende ryster.

Podekulturmedium (SE-4) Kødekstrakt (Difco Laboratories) 0,3% v/r

Trypton-Bacto (Difco Laboratories) 0,5

Glukose 0,1

Opløselig stivelse 2,4 Gærekstrakt 0,5

Kalciumkarbonat 0,4

Affedtet soyamel 0,5 pH 7,5 før sterilisation, pH 7,1 efter sterilisation, pH 7,4 efter to døgns gæring.

Produktionsmedier (1) AG-1 medium

Glukose 1,5% v/r

Majsstivelse 2,5

Majsstøbevand 2,0 Tørgær 1,0 D, L-metionin 0,1

CoC12,6H20 0,00013 pH 7,2 før sterilisation, pH 6,1 efter sterilisation, pH 7,8 efter fire døgns gæring.

(2) AGA-2 medium

Glukose 1,5% v/r

Kartoffelstivelse 2,5

Maj sstøb evand 2,0 Tørgær 1,0

CoC12,6H20 0,00013 pH 6,5 før sterilisation, pH 5,8 efter sterilisation, pH 7,8 efter fire døgns gæring 144098 29 (3) AGB-1 medium

Maltose 3,0% v/r

Majsstøbevand 1,0 Tørgær 1,0 coci2,6h2o 0,0001 pH 6,5 før sterilisation, pH 5,9 efter sterilisation, pH 7,9 efter fire døgns gæring (4) AGB-41 medium

Maltose 5,0% v/r

Opløselig stivelse 1,0

Glycerol 0,3 Tørgær 2,5

NaCl 0,5 k2hpo4 0,05

MgS04,7H20 0,05

CaC03 0,3

CoC12,6H20 0,00013 pH 7,0 før sterilisation, pH 6,9 efter sterilisation, pH 7,9 efter fire døgns gæring (5) ML-19 medium

Glycerol 4,0% v/r

Pepton 0,5

Glukose 0,2

Kartoffelstivelse 0,2

Affedtet soyamel 0,5 Tørgær 0,5

NaCl 0,5

CaC03 0,2 pH 6,4 før sterilisation, pH 7,0 efter sterilisation, pH 7,0 efter fire døgns gøring 144098 30 (6) AGO-1 medium

Soyaolie 3,0% v/r Tørgær 2,0

NaCl 0,5 K2HP04 0,05

MgS04,7H20 0,05

CaC03 0,3

CoC12.6H20 0,00013 pH 7,0 før sterilisation, pH 7,2 efter sterilisation, pH 7,2 efter fire døgns gæring

Den antibiotiske styrke af suppefiltratet bestemtes ved skiveprøvemetoden som beskrevet foran under udnyttelse af Comamonas terrigena B-996, Staphylococcus aureus 209P og Alcaligenes faecalis B-326. De resultater der konstateredes 72 timer efter podningen var som følger: _____Tabel 5 _

Antibiotisk styrke

Medium_CCU/ml_SCU/ml_ACU/ml AG-1 105 1,1 420 AGA-2 72 1,1 420 AGB-1 105 0,9 340 AGB-41 185 8,9 440 ML-19 60 1,4 122 AG0-1 67 0,9 340

Eksempel 2

Et hundrede milliliter af en udsædskultur fremstillet som beskrevet i eksempel 1 overførtes til en 30 liter stor krukke-fermentor indeholdende 15 liter ML-19 medium, og der dyrkedes under tvungen luftning ved 28°C i 96 timer under 200 opm, idet der tilførtes steril luft med en hastighed på 7,5 liter pr. minut.

Der brugtes en silikonolie ("Silicone KM-75" fra Shin-Etsu Chemi- 31 144Q98 cal Industries Co., Ltd) som antiskumningsmiddel i en koncentration på 0,05%. Gæringssuppen opsamledes og centrifugeredes efter de i nedenstående tabel 6 angivne tidsrum. Den antibiotiske styrke af filtraterne var som ligeledes angivet i tabel 6.

Tabel 6

Tid Styrke (CCU/ml) pH

24 timer 19 7,0 48 48 7,2 72 72 7,1 96 59 7,0

Eksempel 3 På lignende måde som eksempel 1 dyrkes Streptomyces sp.

A271 i en 500 ml stor Erlenraeyer-kolbe indeholdende 100 ml SE-4 medium, og kulturen podedes derpå i en 30 liter stor krukke-fermentor indeholdende 15 liter SE-4 medium. Efter dyrkning ved 28°C i 24 timer under omrøring med 200 opm under tvungen luftning med 7,5 liter luft pr. minut udhældtes 1 liter af således opnåede udsædskultur i en 200 liter stor rustfri ståltank-fermentor indeholdende 100 liter ml-19 medium. Tankfermentpren luftedes under omrøring ved 28°C i 72 timer med en omrøringshastighed på 100 opm, og luftningshastigheden holdtes på 50 liter luft pr. minut.

Den oprindelige pH-værdi var 7,0 og den sluttelige pH-værdi 7,1. Suppen blandedes med 5% (v/r) perlite (Topco Perlite, Topco Nr.

34, Toko Perlite Kogyo K.K.) og filtreredes gennem en filterpresse, hvorved der vandtes 80 liter suppefiltrat. Den antibiotiske styrke af den klare væske var 60 CCU/ml.

Eksempel 4

Fremstilling af et koncentrat fra aktive kul

Som beskrevet i eksempel 1 inkuberedes ti 500 ml store Erlenmeyer-kolber indeholdende hver 100 ml ML-19 medium under rystning i 72 timer. Til den kombinerede næringssuppe sattes 2% 144098 32 v/r perlite filterhjaelp ("Topco Perlite", Topco nr. 34 Toko Perlite Kogyo K.K), og der filtreredes gennem en Buchner-tragt til frembringelse af 800 ml suppefiltrat. Efter at det var bekræftet at pH var i området 7-8 tilsattes der 16 g aktive kul (Charcoal Activated, Shirasagij Takeda Chemical Industries, Ltd.) og der omrørtes i 15 minutter. De aktive kul opsamledes ved centrifugering, vaskedes med 800 ml destilleret vand og centrifugeredes på-ny. De på denne måde udvundne aktive kul elueredes med 400 ml 50% (rumfang) acetone under omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter. Den vundne ovenstående opløsning (eluatet; 52 CCU/ml) koncentreredes til 50 ml ved en temperatur på 30-35°C i en roterende evaporator. Antibiotikum-titeren i koncentratet var 800 CCU/ml.

Påfølgende forsøg udførtes for klart at bevise at det foreliggende antibiotikum PS-5 er forskelligt fra stoffet MM4550 (Complex), der er angivet som β-laktamase-inhibitor i DE-offentliggørelsesskrift nr. 2,513,855 og DE offentliggørelsesskrift nr. 2,513,854.

Tre stammer af Streptomyces olivaceus ATCC 31126 (=ATCC 21379/M3), ATCC 21380 og ATCC 21382, dyrkedes ved 28°C i 72 timer på en roterende ryster i en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml af følgende medium:

Soyamel ("ESSAN-M (Special grade) fra Ajinomoto Co., Ltd.) 1,0

Glukose 2,0

CaCOg 0,2

CoCl2,6H20 0,001 pH 7,0 før autoklavering-

Den antibiotiske aktivitet i den filtrerede suppe adsor-beredes på aktive kul, vaskedes med vand eluerede med 50% acetone. Det vundne eluat koncentreredes til et ringe rumfang under nedsat tryk og underkastedes papirkromatografering i nedløbende retning og under de nedenfor angivne betingelser: 14409$ 33

Filtrerpapir: Toyo Filter Paper Nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) Opløsningsmiddelsystem: 80% acetonitril/Tris/EDTA-system bestående af 120 ml acetonitril, 30 ml M/lO tris-(hydroxy-metyl)-aminometan-HCl(pH 7,5) og 1 ml m/10 tetranatrium-ætylendiamin-tetra-acetat (pH 7,5).

Rf-værdier fremgik ved bioautografisk undersøgelse under de nævnte betingelser med Comamonas terrigena B-996.

Parallelt med dyrkningen af de ovenfor anførte tre stammer af Streptomyces olivaceus, foretoges der gæring med den foreliggende stamme Streptomyces sp. A271 i et medium bestående af glycerol 4,0%, glukose 0,2%, pepton 0,5%, kartoffelstivelse 0,2%, affedtet soyamel 0,5%, tørgær 0,5%, NaCl 0,5% og CaC03 0,2% (pH 6,4 før autoklavering). Den påfølgende behandling og bestemmelse skete på samme måde som beskrevet foran.

De bio-autografiske prøver viste at antibiotikum PS-5, et produkt af dyrkning af den her omhandlede organisme Streptomyces sp. A271, er et hidtil ukendt produkt som adskiller sig fra produktet MM4550 (Complex) der er angivet i de to ovenfor nævnte tyske offent- . liggørelsesskrifter.

Eksempel 5

Fremstilling af et koncentreret "Diaion" HP2Q-eluat af antibiotikum PS-5 På den i eksempel 1 beskrevne måde gæredes 15 liter ML-19 medium i 150 kolber i 72 timer. Til den opsamlede suppe sattes der 100 mg dinatriumætylendiamin-tetraacetat og 2% v/r "Topco Perlite", Topco Nr. 34, og der filtreredes gennem en stor Buchner-tragt til frembringelse af 14,1 liter suppefiltrat med pH 7,9. Dette produkt anbragtes på en "DIAION" HP20 kolonne med størrelsen 7 x 50 cm (en højporøs styren- og difenylbenzen-copolymer i perleform og med makro-^ retikulær struktur, fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), vasket med 7 liter destilleret vand, hvorpå der elueredes med 50 rumfangs% metanol. Elueringsmønsteret med hensyn til antibiotisk aktivitet var som anført i tabel 7.

144098 34

Tabel 7 Påført aktivitet: 40 CCU/ml x 14000 ml

Eluat Nr. Rumfang ml Styrke (CCU/ml) 1 1000 0 2 500 0 3 500 0 4 50 19 5 50 37 6 50 72 7 50 150 8 50 270 9 50 850 10 50 870 11 50 300 12 50 270 13 50 230 14 50 200 15 50 170 16 50 125 17 50 105 18 50 87 19 50 75 20 50 60 21 50 48 22 50 38 23 50 27 24 50 18 25 50 14 26 50 10 27 50 0 28 50 0 29 50 0

Eluat nr. 8 til 14 kombineredes, koncentreredes til 100 ml ved en temperatur på 30°C i en roterende evaporator og frysetørredes derefter, hvorved der fremkom 2,6 g gulligbrunt pulver hvis styrke var 54 CCU/mg. Dette gulbrune pulver opløstes i de- 144098 35 stilleret vand til en koncentration på 500 CCU/ml.

Fosfat-pufferopløsninger med de nedenfor angivne pH-værdier fremstilledes ved regulering af M/15 dikaliumfosfat til den ønskede pH-værdi med 5N NaOH eller 5N fosforsyre. Til 1 milliliter af opløsningen af antibiotikum PS-5 sattes der 1 milliliter af vedkommende fosfatpuffer og om nødvendigt genreguleredes pH-værdien til den oprindelige værdi. Opløsningerne af antibiotikum PS-5 med forskellige pH-værdier holdtes på 60°C i 30 minutter i et vandbad, afkøledes i rindende vand og neutraliseredes til pH 7,0 med en ringe mængde 5N NaOH eller 5N fosforsyre» Et kontrolglas indeholdende en opløsning af antibiotikum PS-5 med pH 7,0 anbragtes i et isbad i 30 minutter. Den tilbageværende antimikrobielle aktivitet bestemtes på den foran beskrevne måde ved hjælp af Coma-monas terrlgena B-996 som testorganisme. Resultaterne er vist i nedenstående tabel og er beregnet som procent af kontrolprøven: pH__3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

Tilbageværende aktivitet, % 0 0 9,0 79,0 76,5 88,5 82,0 Μ * ι·ι·ρ·*ι"τ... — "’»' · r-·-!···—r—"r'i.in'f'Mi rw»am,"4pHl*!lj' -.pru 'ip π·.'«-,ir i ff '».—ι·ι j .i.

Disse resultater viser at det i nærværende eksempel vundne gulbrune pulver er ret stabilt véd pH-værdier i området 6,0 til 9,0 i 30 minutter ved 60°C. Desforuden synes stabiliteten af antibiotikum PS-5 at stige ved lavere temperatur, selv ved sur pH-værdi. Således konstateredes der stadig tilstedeværelse af mindst 30% af den oprindelige antibiotiske aktivitet efter at antibiotikum PS-5 havde været behandlet ved pH 3,0 i 5 minutter ved -17°C.

Eksempel 6

Ekstraktion ved lav temperatur med n-butanol

Et stort reagensglas indeholdende 20 ml destilleret vand, 12 ml n-butanol og 7 g natriumklorid afkøledes til -17°C uden frysning. Det gulbrune pulver af antibiotikum PS-5, vundet ifølge eksempel 5, fortyndedes til en koncentration på 200 mg/ml i destilleret vand og for-afkøledes. 1 ml af den kolde opløsning af antibiotikum PS-5 sattes til det ovenfor angivne reagensglas og reguleredes hurtigt til pH 2,75, pH 3,0 eller pH 3,25 med svovlsyre mens blandingens temperatur holdtes under -10°C. Efter om 144098 36 hyggelig gennemblanding opsamledes et lag af n-butanol og blandedes godt med 5 ml 0,5M fosfatpuffer (pH 6,8), hvorved den virksomme komponent overførtes til det vandige lag. Biobestemmelse af den vandige opløsning gav følgende ekstraherbarhed af antibiotikum ps-5 fra det gulligtbrune pulver: pH_Ekstraktionsprocent 2,75 35 3,00 32 3,25 16

Eksempel 7

Fremstilling af et "QAE-Sephadex"-pulver På samme måde som beskrevet i eksempel 5 vandtes der 27,7 g gulligbrunt pulver af antibiotikum PS-5 fra 100 liter suppefiltrat efter frysetørring. Dette pulver (specifik aktivitet 13,2 CCU/mg) opløstes i 30 ml 25mM fosfatpuffer (pH 6,8) og anbragtes på en kolonne af QAE-"Sephadex" A-25 (en fuldt kvaterniseret, stært basisk anionbyttérharpiks vundet ved indførelse af diætyl-2-hydroxy-propylammoniumgrupper i en dextrangel) med en størrelse på 3,3 x 25,0 cm og ækvilibreret i forvejen med samme puffer. Efter vask med.en ringe mængde af samme fosfatpuffer elueredes aktiviteten med samme puffer indeholdende natriumklorid, idet koncentrationen af natriumklorid ændredes lineært fra 0 til 0,5 M under elueringen. Den aktive fraktion, 300 ml, afkøledes til 0°C og behandledes med 6 g aktivt kul. Det aktive kul opsamledes, vaskedes med vand og elueredes med 50%s (rumfang) acetone. Efter at acetonen var blevet fjernet ved afdampning ved en temperatur under 30°C udvandtes 727 mg brunliggult pulver af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 ved frysetørring. Den specifikke aktivitet af dette præparat var 264 CCU/mg.

Eksempel 8

Fremstilling af et DEAE-cellulose-pulver 727 mg af det. brunliggule pulver af antibiotikum PS-5, som vandtes i eksempel 7, opløstes i 1 ml 25mM fosfatpuffer (pH 6,8) og anbragtes på en 1,5x27,0 cm stor kolonne af "Bio-Gel P-2" 144098 37 (gelperler af en tværbundet syntetisk polymer baseret på en mety-len-bis-akrylamidcopolymer; fremstillet af SXO-RAD Laboratories) som var blevet ækvilibreret med samme fosfatpuffer. Ved fremkaldelse med samme fosfatpuffer vandtes den aktive fraktion, 15 ιηΐ,

Den vundne aktive fraktion anbragtes på en 2,5 x 28,0 cm stor kolonne af diætylaminoætylcellulose (DEAD-cellulose) DE32 (Whatman Ltd.) som var blevet ækvilibreret med samme fosfatpuffer. Elueringen udførtes med en lineær gradient af natriumklorid i samme fosfatpuffer fra 0-0,5M. Den udvundne aktive fraktion, 240 ml, adsorberedes på 4,5 g aktive kul ved en temperatur på 0°C. De aktive kul opsamledes ved filtrering, vaskedes med vand og elueredes

med 50 rumfangs%s acetone. Acetoneelueatet inddampedes ved en tern-under 30°C

peratur på / indtil der ikke længere kunne konstateres acetone, og derefter frysetørredes der til frembringelse af 120 mg brunligi-hvidt pulver af natriumsaltet af antibiotikum Ρβ-5. Den specifikke aktivitet af dette præparat var 600 CCU/mg.

Eksempel 9 Højrenset præparat af antibiotikum PS-5

To 200 liter store gæringstanke af rustfast stål fyldtes med hver 100 liter ML-19 medium indeholdende 2,5% affedtet so;jamel, hvorefter der autoklaveredes og podedes med Streptamyces sp. A271, ATCC 31358 på samme måde som beskrevet i eksempel 3 og gæredes i 72 timer under luftning og omrøring. Indholdet af de to gæringstanke forenedes; blandedes med 5% v/r "Topco Perlite", Topco nr. 34 (Topco Perlite Kogyo K.K.) og filtreredes gennem en filterpresse til frembringelse af 160 liter suppefiltrat, Antibiotikum-titeren af dette filtrat viste sig at være 235 CCU/ml. Dette suppefiltrat førtes gennem en kolonne af ionbytterharpiks "ΌΙΑΙΟΝ" PA-306 (en stærkt basisk anionbytterharpiks med tværbundet polystyrenmatrix og trimetylam-moniumkloriddele; fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries Ltd,; 10 x 52 cm, 4,5 liter i vådrumfanget) uden at blive tilbageholdt. Derefter adsorberedes den antibiotiske aktivitet, der var blevet ført gennem kolonnen, på en "DIAION" HP-20 kolonne (14 x 97 cm; 15 liter) og elueredes med 75%s metanol. Det opsamlede aktive eluat (2 liter; 9.854 CCU/ml) fortyndedes tre gange med 4 liter vand og anbragtes på en 2 liter stor kolonne (5,5 x 84 cm) af "DIAION" PA-306S. Efter vask med 500 ml vand elueredes den antibiotiske ak- U4098 38 tivitet med en 8 liters lineær natriumkloridgradient fra 0 til 3%, og der opsamledes fraktioner på hver 200 ml. De aktive fraktioner fra nr. 17 til nr. 31 forenedes, og der fremkom herved 2,8 liter aktivt eluat (4.120 CCU/ml). Dette eluat anbragtes på en 1 liter stor "DIAION" HP-20 kolonne (4,5 x 63 cm) og elueredes med 3 liter lineær gradient af acetone med en koncentration på 0 til 25¾. Rumfanget af hver fraktion var 30 ml. Det aktive eluat (390 ml, 27.220 CCU/ml) udvandtes ved kombinering af de antimikrobielt aktive fraktioner fra nr. 54 til nr. 66.

Efter at acetone var fjernet ved destillation under nedsat tryk førtes "DIAION" HP-20 eluatet gennem en 200 ml stor kolonne af QAE-"Sephadex" A-25 (2,5 x 41 cm). Den antimikrobielle aktivitet omsattes i 10 ml store fraktioner ved eluering med en 2 liter lineær natriumkloridgradient (0-1,5%). Fraktionerne nr. 68 til 81 forenedes som det aktive eluat; de udgjorde 140 ml med 42.120 CCU/ml.

Dette QAE-"Sephadex" A-25 eluat reguleredes omhyggeligt til pH 8,3 med 1% NaOH og anbragtes på en 200 ml stor kolonne af "DIAION" HP-2QAG (2,5 x 41 cm; Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). Der udførtes lineær gradienteluering med 1 liter vandig acetone fra 0 til 10%. Rumfanget af hver fraktion var 10 ml. Fraktionerne nr. 48-53 forenedes og gav 60 ml af det aktive eluat (45.000 CCU/ml). Frysetørring gav 249 mg gult pulver (8.000 CCU/mg).

Til yderligere rensning opløstes 150 mg af dette gule pulver i en ringe mængde 0,01M natriumfosfatpuffer pH 8,0 og førtes gennem en 130 ml stor kolonne (1,5 x 73 cm) af "Sephadex" G-10 (en perleformet dextrangel fremstillet ved tværbinding af dextran-fraktioner med epiklorhydrin). Antibiotikum PS-5 fremkaldtes med 0,01M natriumfosfatpuffer pH 8,0, og eluatet fraktioneredes i 2 ml portioner. Der vandtes 36 ml af det aktive eluat fra fraktionerne nr. 38-55 (65.800 CCU/ml).

Eluatet fra "Sephadex" G-10 underkastedes derefter søjle-kromatografering på en kolonne af QAE-"Sephadex" A-25 (100 ml, 2.0 x 32 cm) efterfulgt af lineær gradienteluering med 1 liter natriumkloridopløsning fra 0-1,5%. Rumfanget af hver fraktion var 10 ml. De fem aktive fraktioner fra nr. 48 til nr. 52 (50 ml, 22.000 CCU/ml) forenedes som det aktive eluat. Dette aktive eluat reguleredes omhyggeligt til pH 8,3 med 1% NaOH og anbragtes på en 50 ml stor kolonne af "DIAION" HP-20^J1^2 x 44 cm).

Natriumsaltet af antibiotikum/udvandtes i 5 ml store frak- 144098 39 tioner ved lineær gradienteluering med 400 ml vandig acetone fra 0-10%. De aktive fraktioner nr. 39-41 forenedes og frysetørredes, hvorved der fremkom 51 mg hvidt pulver (21.000 CCU/mg). Dette særlige præparatet af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 udviste følgende fysisk-kemiske egenskaber: 1) Farve: hvid.

2) Opløselighed: Opløseligt i vand og i det væsentligt uopløselig i acetone.

3) Sønderdelingspunkt: Ved måling i et Kofler-apparat BY-1 (Yazawa Scientific Mfg. Co., Ltd.) til mikro-smeltepunktbestemmel-se og med temperaturen hævet med en hastighed på l°C/minut udviste dette præparat ikke noget klart smeltepunkt. Det begyndte at blive gult ved ca. 148°C og blev gradvist blødgjort over 160°C. Ved ca. 203°C ændrede farvetonen af præparatet sig langsomt fra gul til brun. Ved 220°C var stoffet en brun harpiks.

4) Ultraviolet absorptionsspektrum: 60 ug af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 opløstes i 3,0 ml vand og måltes i et Hitachi Recording spektrofotometer model EPS-3T. Resultatet fremgår af tegningen. På denne viser fig. 1 UV-spektret for natriumsaltet af antibiotikum PS-5, fig. 2 IR-absorptionsspektret for samme, fig. 3 PMR-spektret for samme, fig. 4 hydrolyse af penicillin G i fravær af antibiotikum PS-5, fig. 5 UV-absorptionsspektrum for tritylesteren af antibiotikum PS-5, fig. 6 IR-absorptionsspektret for samme og fig. 7 PMR-spektret for samme.

Det ultraviolette absorptionsspektrum fremgår altså af fig. 1. Følgende karakteristiske værdier beregnedes: Amin (Η2θ)= ca. 246 nm (E,* = 82,0), Amax (H,0)= ca.301 nm (E?-% = 267,5).

l cm z 1 cm

Til en vandig opløsning af dette præparat (21.000 CCU/mg) i destilleret vand sattes der en hydroxylaminopløsning, pH 7,5, til frembringelse af en reaktionsblanding indeholdende 21,3 yg/ml antibiotikum PS-5-natriumsalt og 10 mM hydroxylamin. Efter 30 minutter ved 22°C havde reaktionsblandingen mistet ca. 94% af den oprindelige optiske tæthed ved 301 nm.

5) Infrarødt absorptionsspektrum: Fig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum for antibiotikum PS-5-natriumsalt i KBr, op- 40 m098 tegnet på et Hitachi infrarødt spektrofotometer, model 215. Følgende karakteristiske absorptionsmaxima konstateredes ved de angivne bølgetal: (i) ca. 1750 cm 1 (-CO- i β-laktamringen), (ii) ca.

1650 cm-1 (-CO- i amidbindingen), (iii) ca. 1640-1540 cm (-C00~).

6) Protonmagnetisk resonans spektrum; Den i fig. 3 viste kurve er det 100 MHz protonmagnetiske resonansspektrum for antibiotikum PS-5-natriumsalt i deuterovand, optegnet i et JEOL NMR-spektrometer JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.). Følgende karakteristiske signaler bekræftedes: (i) triplet som har centrum omkring 1,06 ppm (J = ca. 7,5 Hz; CH3-CH2-), (ii) . multiplet i området 1,72-2,00 ppm (CH^-CH^-), (iii) skarp singlet omkring 2,05 ppm (CH3-CO-), (iv) multipletter i området 2,88-3,58 ppm (-CH2-, -CH-), (v) multiplet i området 3,9-4,20 ppm (-CH-)

N

7) Farvereaktion: Ehrlich's reagens: positiv; jodplatinat: positivt; ninhydrin: negativ.

8) Specifik rotation: [a]^ = +77,3 (c = 1,59 i 0,01M, pH 8, natriumfosfatpuffer).

9) Tyndtlagskromatografi (TLC): Natriumsaltet af antibiotikum PS-5 underkastedes TLC under de nedenfor angivne betingelser. Rf-vaerdierne bestemtes ved bioautograf er ing.

a) "Avicel"/SF cellulose TLC-plade (American Viscose Corp.)

Opløsningsmiddelsystem (rumfang) n-butanol/ætanol/vand 7:7:6 Rf 0,94 isopropanol/vand 7:3 Rf 0,96 b) Silikagel TLC-plade (E. Merck, Darmstadt; forovertrukken silikagelplade 60 F254^ ætanol/vand 7:3 Rf 0,82 n-propanol/vand 7:3 Rf 0,77 10) Papirkromatografi: Natriumsaltet af antibiotikum PS-5 gav følgende Rf-værdier på Toyo filterpapir nr. 50 under de angivne betingelser:

Opløsningsmiddelsystem, rumfang Rf n-propanol/vand 7:3 0,68 n-propanol/isopropanol/vand 7:7:6 0,70 acetonitril/vand 8:2 0,36 acetonitril/tris-puffer/EDTA X 0,34 ætanol/vand 7:3 0,63 144098 41 x Opløsningsmiddelblanding sammensat af 120 ml acetonitril, 30 ml M/10 tris-(hydroxymetyl)-aminometan-saltsyrepuffer pH 7,5 og 1 ml M/10 ætylendiamintetraacetat pH 7,5.

11) Høj spændingspapirelektroforese: Natriumsaltet af antibiotikum PS-5 analyseredes ved højspaendings-papirelektroforese under de nedenfor angivne betingelser. Apparatet var fra Savant Instruments Inc. (High Voltage Power Supply, model HV 3000v og Flat Plate Electrophoresis, model nr. EP 18A). Det anvendte filtrerpapir til denne analyse var Toyo filterpapir nr. 50. De opnåede resultater er som følger: Når elektroforesen udførtes i 30 minutter under afkøling (under 4°C) ved et potentiale på 42V/cm i en puffer (pH 8,6) indeholdende 3,3 g barbital og 25,5 g barbitalnatrium i 3000 ml vand, vandrede antibiotikum PS-5 28 mm mod anoden.

13 12) c-Magnetisk resonansspektrum: Med dioxan som intern stan dard og under anvendelse af et Varian CFT-20 spektrometer jnåltes 13 det C-magnetiske resonanspsektrum for natriumsaltet af antibioti-kum PS-5 ved 20 MHz i deuteriumvand. Følgende karakteristiske signaler observeredes (udtrykt i ppm): (1) 184,04, (2) 174,96, (3) 169,29, (4) 141,11, (5) 130,40, (6) 67,39 (dioxan), (7) 60,19, (8) 55,63, (9) 40,41, (10) 40,00, (11) 31,49, (12) 22,62, (13) 22,46, (14) 11,36.

De foran beskrevne fysisk-kemiske egenskaber viser at molekylstrukturen af antibiotikum PS-5 kan gengives som /-v S-CH9-CH--NH-C0-CH, CH3-CH-

^COOH

Følgende biologiske egenskaber bekræftedes for natriumsaltet af antibiotikum PS-5, fremstillet i henhold til nærværende eksempel: 1) Antimikrobielt spektrum Værdierne for mindste inhiberende koncentration (MIC) for natriumsaltet af antibiotikum PS-5 bestemtes på forskellige patoger ne mikroorganismer, herunder resistente stammer, ved suppefortyndingsmetoden under anvendelse af et hjerne-hjerte-infusionsmedium ("Eiken", et i Danmark ikke indregistreret varemærke).

U4098 42

Natriumsaltet af antibiotikum PS-5 opløstes i hjerne-hjerte- infusionssuppe "Eiken" (pH 7,0) ved en koncentration i området 5-50 ug/ml, og her ud fra fremstilledes der passende fortyndingsserier i samme væskeformige medium. De i tabel 8 anførte mikroorganismer dyrkedes i 18 timer i hjerne-hjerte-infusionssuppe "Ei-ken" ved 28°C og podedes i de nævnte fortyndingsserier af antibio-tikum PS—5 til en sluttelig podegrad på 1 x 10 celler pr. ml. Kulturerne henstod ved 35°C i 20 timer og derefter aflæstes mikroorganismernes vækst ved hver af fortyndingerne af antibiotikum PS-5.

Den mindste inhiberende koncentration (MIC) repræsenterer den mindste koncentration af antibiotkum PS-5-natriumsalt, hvor der ikke visuelt kunne konstateres nogen formering af vedkommende mikroorganisme. Til kontrol opløstes to kendte 3-laktamr-antibiotika, cephalo-ridin og cefoxitin, i hjerne-hjerte-infusionssuppe ved pH 7,0 i koncentrationer fra 1 ug/ml til 100 ug/ml og fortyndedes derefter til fremstilling af flere fortyndingsserier i det nævnte væskeformige medium. Disse prøver behandledes som beskrevet ovenfor med hensyn til bestemmelser af MIC. I nedenstående tabel 8 er de vund-ne resultater summarisk angivet. Foruden MlC-værdierne for antibiotikum PS-5 er der i tabellen anført MIC-værdierne for cephaloridin og cefoxitin som referenceværdier.

_ . __Tabel 8 __

Mikroorganisme MIC, ug/ml

Antibiotikum Cephaloridin Cefoxitin ;___________________________________PS-5________________________

Staphylococcus aureus FDA 209 P 0,16 0,031 1,25

Smith 0,31 0,031 2,50

Russell 0,31 0,125 2,50

Bx-1633 0,16 0,031 1,25

DiplocQCCus pneumoniae type IIIXXXX 0,02 0,031 1,25

Streptococcus pyogenes ny-5xxxx 0,08 0,008 0,63

Bacillus subtilis ATCC 6633 0,16 0,031 1,25

Escherichia coli K 12 2,5 2,5 2,5

Alcaligenes faecalis B-326 0,78 6,25 1,56

Citrobacter freundii E~9X 3,13 >100 >100

Serratia marcescens S-18x 6,25 >100 50

Klebsiella pneumoniae K-2X 3,13 6,25 6,25 144098 43

Tabel 8 (fortsat)

Mikroorganisme MIC, yg/ml

Antibiotikum Cephaloridin Cefoxitin _PS-5_

Enterobacter sp. E-8X 3,13 3,13 12,5

Enterobacter cloacae E-16x 12,5 >100 >100

Enterobacter aerogenes E-19x 6,25 >100 >100

Proteus vulgaris P-5X 12,5 >100 12,5

Proteus mirabilis P-6XX 6,25 12,5 12,5

Proteus rettgeri p-7XXX 3,13 100 6,25

Proteus sp. P-22 6,25 >100 12,5

Providencia sp. P-8XX 6,25 >100 25,0 x β-laktamaseproducent xx resistent mod kanamycin, gentamicin og tobramycin xxx modstandsdygtig mod gentamicin og tobramycin xxxx mediet suppleret med 10% hesteblod 2) Potentiering af den antimikrobielle virkning af kendte β-laktam- forbindelser mod β-laktamresistente mikroorganismer_

A) 10 ml smeltet næringsagar indeholdende 50 yg/ml penicillin G

eller cephaloridin, 0,8% Kyokuto næringssuppepulver og 1,0% Difco Bacto-Agar (pH 7,0) blev podet med de i tabellerne 9 og 10 angivne β-laktamresistense,β-laktamaseproducerende mikroorganismer og udhældt i 9 cm store petriskåle til fremstilling af biobestemmelsesagarpladen. På denne agarplade anbragtes der 8 mm store pulpskiver indeholdende hver 25 yl antibiotikum PS-5-opløsninger med de angivne koncentrationer, og der inkuberedes ved 35°C i 18 timer før inhibitionszonernes størrelse aflæstes. Kontrolbestemmelsespladen blev fremstillet på tilsvarende måde, men uden penicillin G eller cephaloridin. Som referenceantibiotika bestemtes penicillin G, ampicillin, oxacillin og cefazolin på skiver under de samme betingelser. Tabellerne 9 og 10 viser de konstaterede resultater.

144098 44 _Tabel 9_ 3-Laktam-resistent Inhibitionszone, mm mikroorganisme Antibiotikum Uden peni- Med peni-

PS-5 cillin G cillin G

__yg/ml_

Proteus vulgaris P-5 318 16,0 26,6 159 14,0 24,5 100 10,3 22,2 _79,5_0_ 18,3

Enterobacter sp. E-8 318 20,1 20,0 159 17,2 17,5 100 13,8 13,8 ___79,5_11,0 11,0

Citrobacter freundii E-9 318 20,8 23,0 159 17,2 19,2 100 13,2 15,2 _ 79,5_10,4 13~, 1

Serratia marcescens S-18 318 21,3 22,1 159 17,8 22,0 100 13,0 16,1 __ 79,5_0 13,8

Proteus sp. P-22 318 13,6 21,4 159 11,7 18,2 100 0 13,8 ____ 79,5__0_____12,8

Tabel 10 3-Laktam-resistent Inhibitionszone, mm mikroorganisme Antibiotikum Uden cepha- Med cepha- PS-5 loridin loridin _ ug/mi_____

Enterobacter sp. E-18 318 21,0 21,9 159 18,2 19,4 100 16,1 18,0 _____ 79,5_15,1 17,6

Citrobacter freundii E-9 318 22,5 24,6 159 17,4 22,3 100 17,4 21,6 79,5 16,0 19,4 144098 45

Tabel 10 (fortsat) β-Laktam-resistent Inhibitionszone, mm mikroorganisme Antibiotikum Uden cepha- Med cepha- PS-5 loridin loridin __________pg/ml________________________

Serratia marcescens 318 21,0 26,1 159 17,0 24,8 100 16,8 23,3 _79,5__14,8_22^3_

Proteus vulgaris P-5 318 18,5 25,2 159 15,2 24,0 100 13,7 22,0 79,5___12,5 21,_8_

Penicillin G (pg/ml)

Proteus vulgaris P-5 10.000 14,9 14,5 2.500 0 0 625 0 0

Ampicillin (pg/ml)

Proteus vulgaris P-5 10.000 14,7 12,9 2.500 0 0 _ 625 0 0

Oxacillin (pg/ml)

Proteus vulgaris P-5 10.000 0 0 2.500 0 0 ___625__0_ 0

Cefazolin (pg/ml)

Proteus vulgaris P-5 10.000 14,6 12,0 2.500 0 0 _625_0 0

Som det ses af disse resultater så kunne der iagttages en inhiberingszone når penicillin G eller cephaloridin i en koncentration under den konstaterbare grænse blev kombineret med antibiotikum PS-5 ved en koncentration under tærskelværdien for skiveprøven, hvilket betyder at der sker potentiering af virkningen af penicillin G og cephaloridin med antibiotikum PS-5. I modsætning hertil kunne penicillin G, ampicillin, oxacillin og cefazolin ikke forøge den antimikrobielle aktivitet af cephaloridin.

14Å098 46 B) Nedenstående forsøg udførtes for at vise at den potentie- rende virkning af antibiotikum PS-5 var synergistisk.

På en prøveplade af næringsagar podet med en β-laktam-re-sistent stamme af Proteus vulgaris P-5 (β-laktamasedannende) anbragtes der to strimler af filtrerpapir indeholdende penicillin G eller cephaloridin og to strimler indeholdende antibiotikum PS-5, og således at der dannedes et kvadrat hvor strimler af samme antibiotikum kom i kontakt med hinanden i et hjørne. Den antimikrobiel-le aktivitet aflæstes efter inkubering i 18 timer ved 35°C. Når der valgtes passende koncentrationer af penicillin G eller cephaloridin og antibiotikum PS-5, konstateredes der kun inhibitionszoner ved hjørnerne hvor både antibiotikum PS-5 og penicillin G eller cephaloridin var til stede, men ikke ved de hjørner hvor antibiotikum PS-5, penicillin G eller cephaloridin var til stede alene. Denne kendsgerning kan forklares ved synergisme mellem antibiotikum PS-5 på den ene side og penicillin G eller cephaloridin på den anden side. Dvs. at når to slags forbindelser kombineredes ved koncentrationer som er så lave at de ikke gav inhiberingszone med den ene komponent alene, så skyldes den store inhibitionszone, der forekom ved kombinationen, synergisme.

3) Aktivitet in vivo

Den terapeutiske virkning af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 undersøgtes ved intraperitoneal behandling af mus inficeret med 5 x 10^ celler af Staphylococcus aureus Smith pr. mus. Snart efter infektionen blev der subkutant injiceret en vandig opløsning af natriumsaltet af antibiotikum PS-5. Hos han-ddy-mus (Shizuoka) viste EDj-q af dette præparat at være 2,45 mg/kg.

4) Toxicitet

En vandig opløsning af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 blev indgivet intraperitonealt til han-ddy-mus (Shizuoka) i en dosis på 500 mg/kg. Der indtrådte ingen dødsfald.

5) β-Laktamase-inhiberende virkning

Den β-laktamase-inhiberende virkning af antibiotikum PS-5 undersøgtes med hensyn til hydrolyse af penicillin G af β-laktama-se fra Proteus vulgaris P-5 på følgende måder: A) Reagens: 1) Substrat: kaliumsaltet af penicillin G, 1 ymol/ml (372,3 yg/ml) i 25 mM fosfatpuffer pH 6,8 2) β-laktamase: inducerbar β-laktamase fra Proteus vulgaris 144098 47 P-5, renset ved søjlekromatografi på CM-cellulose.

3) Inhibitor: præparatet af natriumsaltet af antibiotikum PS-5, 0,6 ymol/ml (192 yg/ml) 4) 25 mM, pH 6,8 fosfatpuffer.

B) Reaktionssammensætning og prøvebetingelser: Substratet (penicillin G), inhibitoren (antibiotikum PS-5) og pufferen blandedes godt ved 30°C i de i nedenstående tabel 11 angivne mængder.

Reaktionen sattes straks igang ved tilsætning af de angivne mængder fj-laktamase ved 30°C.

Tabel 11 __(I) (II) (III)__(XV)

Enzym- Enzym- Inhibering Inhibering standard standard med anti- med antibio-(H) (L) biotikum tikum PS-5 ___PS-5 (H) (L)_ (1) Penicillin G 2,5 mol 2,5 mol 2,5 mol 2,5 mol 1 ymol/ml__(2,5 ml) (2,5 ml) (2,5 ml) (2,5 ml)

(2) Antibiotikum PS-5 0 0 0,105 molx 0,06 molXX

0,6 ymol/ml__(0,175 ml) (0,100 ml) (3) Fosfatpuffer, (0,5 ml) (0,5 ml) (0,325 ml) (0,40 ml) 25 mM, pH 6,8_ (4) β-laktamase (0,040ml)(0,020ml)(0,040 ml) (0,040 ml)

Molforhold substrat til inhibitor: x 24:1 xx 42:1

Hydrolysen af penicillin G konstateredes ved måling af nedgangen i den optiske tæthed ved 240 nm, idet det antoges at den differentielle molære extinktion af penicillin G ved 240 nm var 556, en værdi der var fremgået af flere forudgående forsøg.

C) Resultater

Fig. 4 viser tidsforløbet af hydrolyse af penicillin G i fravær af inhibitoren (antibiotikum PS-5) under de ovenfor anførte betingelser. En stærk inhibering af Proteus vulgaris-penicillinase, fremkaldt af antibiotikum PS-5 ses meget tydeligt i fig. 4f dvs. at når en 1/42 ækvivalent af antibiotikum PS-5 var til stede i penicillin G som substrat, så blev mere end 50% af aktiviteten af Proteus vulgaris P-5 β-laktamaseinhiberet.

48 UÅ098

Eksempel 10

Fremstilling af tritylesteren af antibiotikum PS-5 160 liter suppefiltrat fremstillet som beskrevet i eksem-pel 3 behandledes på den i eksempel 4 beskrevne måde til frembringelse af 30,0 g gulligbrunt frysetørret pulver af natriumsaltet af antibiotikum PS-5 (specifik aktivitet 27 CCU/mg). Dette pulver opløstes i 100 ml dimetylformamid og der tilsattes 3,0 g triætyl-amin. Under afkøling med is sattes der 9,0 g tritylklorid til reaktionsblandingen mens opløsningens temperatur holdtes under 5°C. Efter omrøring i 12 timer ved 5°C var al aktivitet af antibiotikum PS—5 omdannet til trityleringsproduktet. Reaktionsopløsningen ud-hældtes i 1000 ml 0,5M fosfatpuffer pH 6,8 og ekstraheredes derefter med 3 x 1000 ml ætylacetat. Ætylacetatekstrakterne forenedes, tørredes over vandfrit natriumsulfat og inddampedes til tørhed under nedsat tryk. Inddampningsremanensen opløstes i 20 ml benzen og førtes gennem en kolonne på 4,5 x 60,0 cm af "Bio-Beads" S-X3 (en porøs styren-divinylbenzen-copolymer i perleform til gelpermeering, fremstillet af BIO-RAD Laboratories; udelukkelsesgrænse; molekylvægt 2000) som i forvejen var præækvilibreret med benzen. Kolonnen fremkaldtes med benzen. Den aktive fraktion som viste antibiotisk aktivitet af Comamonas-prøvepladen koncentreredes til tørhed under nedsat tryk. Den vundne remanens opløstes i 1 ml benzen og anbragtes på en kolonne på 25 g, 1,5 x 24,0 cm, af silikagel (silikagel 60; 70 - 230 mesh ASTM; E. Merck, Darmstadt). Efter vask med en blanding af benzen/ætylacetat 10:1 for at fjerne tilbageværende reagenser elueredes aktiviteten med en blanding af benzen/ætylacetat 1:2. Det aktive eluat inddampedes til tørhed under nedsat tryk og opløstes påny i 0,5 ml benzen. Benzenopløsningen påførtes en neutral kolonne af aluminiumoxyd på 20 g, 0,9 x 22,0 cm (Aluminium Oxide Woelm neutral; M. Woelm) og fremkaldtes med en blanding af benzen og ætylacetat i forskellige blandingsforhold (10:1; 6:1; 4:1; 3:1; 2:1 og 1;1). Aktive eluater forenedes og inddampedes til tørhed under nedsat tryk. Inddampningsremanensen opløstes i 0,3 ml benzen og anbragtes på en silikagelkolonne af samme art som ovenfor beskrevet og på 10 g, 0,9 x 22,0 cm. Efter at urenheder var fjernet med en blanding af benzen og ætylacetat 10:1 elueredes aktiviteten med en blanding af benzen og ætylacetat 1:2, og det resulterende materiale koncentreredes til et fast pulver under nedsat tryk. Det vundne pulver opløstes i 0,5 ml benzen 144098 49 og rensedes på en kolonne på 1,2 x 96 cm af "Bio-Beads" S-X3 med benzen som fremkaldelses-opløsningsmiddel. Den aktive effluent inddampedes til tørhed i vakuum.

Det vundne tørre pulver opløstes i 0,5 ml acetone og underkastedes gelfiltrering med en kolonne af "Sephadex" LH-20 (en perleformet dextrangel fremstillet ved tværbinding af dextrankæder ved hydroxypropylering); kolonnen var på 1,2 x 96,0 cm og var forkvældet i acetone. Den aktive fraktion inddampedes til tørhed og gav 23 mg hvidt pulver. Omkrystallisation af dette pulver fra en blanding af benzen og hexan gav 12 mg farveløst krystallinsk pulver af produktet, 10800 CCU/mg. Det farveløse krystallinske pulver af det ønskede produkt, nemlig tritylesteren af antibiotikum PS-5, havde følgende fysisk-kemiske egenskaber: 1) Farve: Farveløst.

2) Opløselighed: Opløseligheden af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 bestemtes ved at man under rystning opløste portioner på 5 mg af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 i 0,1 ml af hvert af test-opløsningsmidlerne ved 20°C. Resultaterne var som følger: I det væsentlige uopløselig i vand, n-hexan og petroleumsæter (kogepunktsområde 30 - 60°C).

Let opløselig i benzen, ætylacetat, kloroform, metanol, ætanol, acetone, dimetylformamid (DMF) og dimetylsulfoxyd (DMS0).

3) Stabilitet: Tritylesteren af antibiotikum PS-5 opløstes i §t rumfang metanol og fortyndedes derefter med 9 rumfang destilleret vand så hurtigt som muligt for at tilvejebringe en opløsning indeholdende 125 CCU/ml. 1/10 Molær opløsning af dikaliumfosfat reguleredes med 5N fosforsyre eller 5N natriumhydroxyd til de i tabel 12 nedenfor angivne pH-værdier i området 3 - 9.

Til én milliliter af hver af fosfatpufferne tilsattes der en milliliter af opløsningen af tritylesteren af antibiotikum PS-5 og om nødvendigt genreguleredes blandingens pH-værdi med fosforsyre eller natriumhydroxyd til den ønskede pH-værdi. Opløsningen af blandingen holdtes i et vandbad ved 60°C i 30 minutter, afkøledes med rindende vand og neutraliseredes til pH 7,0 med en ringe mængde fosforsyre eller natriumhydroxyd.

Kontrolopløsningen (pH 7,0) holdtes i et isbad i forsøgsperioden. Den tilbageværende antibiotiske aktivitet bestemtes ved 144098 50 den rutinemæssige skive-bestemmelsesmetode med Comamonas terrigena B-996 som testorganisme. Aktiviteten af de varmebehandlede opløsninger, udtrykt som procent af aktiviteten af kontrolopløsningen er vist i tabel 12.

Tabel 12 pH 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

Tilbageværende ak- 0 0 6,5 79,0 100 100 100 tivitet (%)

Af disse resultater ses det tydeligt at tritylesteren af antibiotikum PS-5 er stabil i vandig opløsning ved 60°C i 30 minutter i pH-området 6,0 - 9,0.

Desuden konstateredes der ikke noget væsentligt tab af aktivitet efter at en vandig opløsning af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 havde været inkuberet ved pH 7,5 i 90 minutter ved 60°C.

4) Smeltepunkt: Det måltes i et Kofler mikrosmeltepunktsappa-rat BY-1, idet temperaturen hævedes med en hastighed på l°C/min. Trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 smeltede ved 83,5 -85,5°C og blev gradvist brunt over 140°C.

5) Ultraviolet absorptionsspektrum: Det ultraviolette absorptionsspektrum for trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 optegnedes på et Hitachi Recording Spectrqahotometer model EPS-3T

i en koncentration på 128 yg/3ml metanol (figur 5).

λ max (metanol) = 315,5 nm (E?-0 = 156) i cm 6) Infrarødt absorptionsspektrum: Figur 6 viser det infrarøde absorptionsspektrum for trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 (4,5 mg) i 0,6 ml kloroform optegnet på en Hitachi Infrared Spectrophotometer model 215. De karakteristiske absorptionsmaksima blev iagttaget ved følgende bølgetal: 144098 51 3430, 3100 - 3000 (C-H i fenylgruppe), 2990, 2950 1770 (C=0 i β-laktamring) 1695 (-CO— i amidbindingen) 1665 (-C0-0 i esterbindingen) 1445 1340 1275 1130 cm-1 7) Protonmagnetisk resonansspektrum: Fig. 7 viser det protonmagnetiske resonansspektrum ved 100 MHz for antibiotikum PS-5-trityles-ter registreret med 4,5 mg af tritylesteren i 0,3 ml deuterokloro-form under anvendelse af et JE0L kernemagnetisk resonansspektrome-ter JMN PS-100 (fra Japan Electron Optics Laboratory CO., Ltd.).

De mest karakteristiske signaler er følgende: triplet omkring 1,10 ppm (J = ca. 7,0 Hz) singlet ved 1,86 ppm multiplet i området fra 7,10 - 7,56 ppm (protoner i trityl-gruppens benzenring).

8) Elementær-analyse: 3 1/2 mg af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 tørredes ved stuetemperatur i 4 timer under nedsat _2 tryk på 1 x 10 mm Hg og underkastedes elementær-analyse hvorved der vandtes følgende analysedata:

Fundet: C 61,89% H 5,78% N 4,48% S 4,62% 9) Farvereaktion:

Ehrlich reagens : positiv

Trifenyltetrazoliumklorid : negativ

Ferriklorid : negativ

Ferriklorid/jod : negativ

Jodplatinat : positiv

Hydroxylamin/ferriklorid : positiv

Klorin/tolidin : positiv

Ninhydrin : negativ 144098 52 10) Tyndtlagskromatografi (TLC): Tritylesteren af antibiotikum PS-5 gav følgende Rf-værdier under de angivne betingelser. Vandrings-stedet afsløredes ved bioautograf i på Comajnonas terrigena ¢-996.

(a) Silikagel TLC

Plade: Forudbelagt silikagelplade 60 F 254, E. Merck, Darmstadt Opløsningsmiddelsystem: benzen/acetone (2:1)

Rf: 0,29

(b) Cellulose TLC

Plade: Eastman Chromagram Sheet 13254 cellulose med fluorescent Indikator (nr. 6065)

Opløsningsmiddel;___Rf: øvre fase af n-butanol/ætano1/vand(4:1:5) 0,56 n-butanol 1,0 isopropano1/vand (8:7) 0,91 isopropano1/vand (1:4) 1,0

Molekylstrukturen for antibiotikum PS-5 og de ovenfor specificerede fysisk-kemiske egenskaber underbygger følgende struktur for tritylesteren af antibiotikum PS-5.

/ s-ch9-ch9-nh-cq-ch, CHs o o' coo - c—C y 6

De biologiske egenskaber af tritylesteren af antibiotikum PS-5 fremgår af det følgende: 1) Åntimikrobisk spektrum: MIC-værdierne (mindste inhiberende koncentration) for forbindelsen bestemtes på forskellige patogene mikroorganismer indbefattet flere resistente stammer under anvendelse af suppefortyndingsmetoden i Brain Heart Infusion Broth (hjer- 144098 53 ne-hjerte-infusionsmedium) "Eiken".

Nærmere bestemt opløstes tritylesteren af antibiotikum PS-5 i en lille mængde metanol og fortyndedes så hurtigt som muligt i Brain Heart Infusion Broth "Eiken" (pH 7,0) indtil koncentrationen af tritylesteren af antibiotikum PS-5 var i området fra 40 - 20 yg/ml. Metanolkoncentrationen i den færdige opløsning overskred ikke 10%. Denne opløsning fortyndedes i en tofoldig geometrisk række. De i tabel 13 opstillede mikroorganismer dyrkedes i 18 timer ved 28gC i Brain Heart Infusion Broth "Eiken" og podedes i fortyn-dingsrækker til en sluttelig podningsgrad på 1 x 10 celler/ml. Resultaterne aflæstes efter inkubering ved 35°C i 20 timer. Værdierne for den mindste inhiberende koncentration (MIC) betyder den laveste koncentrationsenhed for trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 hvor der ikke blev iagttaget vaskst af den tilsvarende mikroorganisme under de ovenfor beskrevne betingelser. Som kontrolantibiotika fremstilledes der opløsninger af ampicillin og cephalori-din i Brain Heart Infusion Broth "Eiken" (pH 7,0) i en koncentration på 100 yg/ml og disse prøver behandledes på samme måde som de omhandlede prøveforbindelser.

Tabel 13 sammenfatter MIC-værdierne for tritylesteren af antibiotikum PS-5 sammen med værdierne for ampicillin og cephaloridin som kontrolantibiotika.

Det fremgår af tabel 13 at tritylesteren af antibiotikum PS-5 udviser et bredt antimikrobiotisk spektrum og navnlig har en kraftig antibiotisk virkning på forskellige |3-laktam-resistente (β-laktamase-producerende) mikroorganismestammer.

Tabel 13

Mikroorganisme _MIC (yg/ml) __

Trityl- Ampicil- Cephalo- PS-5 lin ridin

Staphylococcus aureus FDA 209p 0,17 0,20 0.04

Staphylococcus aureus Smith 0,27 0,20 0,04

Diplococcus pneumoniae type III 0,08 0,04 0,01

Streptococcus pyogenes NY-5 0,17 0,02 0,01

Sarcina lutea S-19 0,27 0,05 0,05

Escherichia coli K12 5,37 3,13 2,5

Alcaligenes faecalis B-326 1,25 0,25 6,25 144098 54

Mikroorganisme MIC (yg/ml)

Trityl- Ampicil- Cephalo- PS-5 lin_ ridin

Citrobacter freundii E-9 5,0 >100 >100

Serratia marcescens S-18 10,Q 50 >100

Klebsiella pneumoniae K-2 10,7 >100 10,0

Enterobacter sp. E-8 10,0 >100 >100

Enterobacter cloacae E-16 10,0 >100 >100

Enterobacter aerogenes E-19 8,7 >100 >100

Proteus vulgaris P-5 21,5 >100 >20,0

Proteus mirabilis P-6 21,5 3,13 10,0

Proteus rettgeri P-7 10,0 50,0 50,0

Pseudomonas aeruginosa P-1 >43,0 50,0 >20,0 2) Antibiotikum PS-5-tritylesterens potentierende virkning på penicillin- og cephalosporlnforbindelsers antibiotiske virkning mod resistente mikroorganismer.

(A) Analysepetriskåle med en diameter på 9 cm indeholdende resistente mikroorganismer fremstilledes ved at lægge et lag på 10 ml smeltet næringsagar podet med β-laktam-resistente (β-laktamase-producerende) mikroorganismer ovenpå et fast grundlag af næringsagar (pH 7,0; 15 ml) indeholdende 50 yg/ml penicillin G eller cephaloridin. Som tidligere beskrevet blev de antibiotiske opløsninger som skulle afprøves påført i en mængde på 25yl på en 8 mm pulpskive Og anbragt ovenpå de ovennævnte analyseskåle. Efter inkubering i 18 timer ved 35°C måltes inhiberingsringene og sammenlignedes med resultaterne på tilsvarende prøveskåle indeholdende hverken penicillin G eller cephaloridin. Resultaterne er sammenfattet i tabel 14.

Det fremgår meget klart af resultaterne i tabel 14 at kombinationen af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 ved en koncentration der ligger under den nedre grænse for skiveprøven med penicillin G eller cephaloridin i en koncentration under denne grænse gav en tydelig inhiberingsring. Denne kendsgerning viser tydeligt potentie-ringen af penicillin G's eller cephaloridins antibiotiske virkning med trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5.

144098 55

Tabel 14 3-laktam-resistent inhiberingsring (mm) mikroorganisme -—----— -

Trityl Kontrol Penicillin G

PS-5 tilsat pg/rai

Proteus vulgaris P-5 42 O 27,0

Kontrol Cephaloridin tilsat

Proteus vulgaris P-5 50 0 15,0 100 11,0 18,0

Proteus sp. P-22 50 0 11,5 100 0 13,5

Citrobacter freundii E-9 50 13,0 15,5 100 16,0 18,0 (B) Som et andet bevis på potentieringen blev trityleringspro-duktet af antibiotikum PS-5's antimikrobiotiske synergisme med cephaloridin fastslået ved suppefortyndingsmetoden på en 3-laktam-resistent stamme af Proteus vulgaris. For det første fremstilledes fem stam-opløsningsprøver indeholdende cephaloridin og tritylesteren af antibiotikum PS-5 i de varierede koncentrationer som er angivet i tabel 15 under anvendelse af Brain Heart Infusion Broth "Eiken" (pH 7,0) som opløsningsmiddel.

Tabel 15

Stamopløsning Tritylester af Cephaloridin

Nr. antibiotikum PS-5 1 100 ug/ml 0 ug/ml 2 75 500 3 50 1000 4 25 1500 5 0 2000 144098 56

Fra hver stamopløsning fremstilledes tre prøver af under-stam-opløsninger ved fortynding i forholdet 1:2, 2:5 og 3:10 i det nævnte hjerne-hjerte-infusionsmedium. Ialt vandtes 15 under-stamopløs-ningsprøver. Med hver under-stamopløsning gennemførtes 15 trin to-foldig fortynding i hjerne-hjerte-infusionsmediet. Til hver af de 15 fortyndinger indpodedes Proteus vulgaris P-5 til en slutkoncen-tration på 1 x 10^ celler/ml og inkuberedes ved 35°C i 20 timer. Den mindste inhiberende fortynding aflæstes i hver stamopløsning. De vundne resultater er sammenfattet i tabel 16.

Tabel 16 — — —

Stamopløsning Trityl-PS-5: Trityl-PS-5 : CER Samlet mængde

Nr. cephaloridin antibiotika 1 100 : 0(ug) 10 + 0 (ug) 10,0 (ug) 2 75 : 500 3,75 + 25 28,75 3 50 : 1000 1,88 + 37,5 39,38 4 25 : 1500 1,25 + 75 76,25 5 0 : 2000 0 + 1000 1000 (x) cephaloridin

Skønt synergismen kan forstås udfra tabel 16 vil det være lettere at indse den synergistiske virkning af tritylesteren af antibiotikum PS-5 overfor cephaloridin når MIC-resultaterne er udtrykt udfra den relative værdi i forhold til MIC for hver antibiotikum alene. Tabel 17 viser tydeligt synergismen mellem de to antibiotiske forbindelser, hvor MIC-værdierne for hver antibiotikum alene er udtrykt som 100.

Tabel 17

Stamopløsning nr. Trityl-PS-5: Relativ MIC-værdi .

cephaloridin (Trityl-PS-5 + CER = total) 1 100 : 0 (ug) 100 + 0 100 2 75 : 500 37,5 + 2,5 = 40 3 50 : 1000 18,8 + 3,75 = 22,55 4 25 : 1500 12,5 + 7,5 = 20 5 0 : 2000 0 + 100 = 100

Tabel 17 ovenfor viser at tritylesteren af antibiotikum PS-5's synergistiske virkning på cephaloridin er ganske udtalt. Det vil sige at når Proteus vulgaris P-5 som er resistent overfor β-laktam-for- 144098 57 binderser på grund af β-laktamase-produktion anvendtes som prøveorganisme hæmmes prøveorganismens vækst af en kombination af 7,5 % af MIC for cephaloridin med 12,5 % af MIC for tritylesteren af antibiotikum PS-5.

3) Aktivitet in vivo; Aktiviteten in vivo ^f trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 måltes hos mus intraperitonealt inficeret 3 med 5 x 10 celler/mus af Staphylococcus aureus Smith, Tritylesteren af antibiotikum PS-5 indsprøjtedes subkutant lige efter infektionen. Den 50 %'s helbredende dosis hos han ddy-mus (Shozuoka) var 2,55 mg/kg (27540 CCU/kg).

4) β-Laktamase-inhiberende virkning: (A) Analysemetode I^q -værdien for hydrolyse af cephaloridin med β-laktamase i 10 minutter (fra et minut til ti minutter efter inkuberingen starte-des). Hydrolysehastigheden for cephaloridin måltes ved den nedsatte optiske tæthed ved 225 ιημ. Til rutineinhiberingsanalyser anvendtes β-laktamase fra Citrobacter freundii E-9 og Proteus vulgaris P-5 efter rensning ved affinitetskromatografi med cephalexin/sepharose 4b.

(B) Reagenser

Puffer: 0,1 M fosfatpuffer (Na-K-fosfat) (pH 6,8)

Substrat:0,05 mikromol/ml i fosfatpuffer β-laktamase: Enzymet fortyndedes tilstrækkeligt til at give et fald på ca. 0,1 optisk tæthedsenhed pr. 10 minutter ved 255 mu i fravær af inhiberingsmidlet. (Apparat: Hitachi Spectrophotometer UV-VIS 139 leveret af Hitachi, Ltd.).

(Dette kan holde en kontrolkuvette og tre prøvekuvetter.

Der anvendtes fire 1 cm kvartskuvetter med et rumfang på 3 ml. Temperaturen blev holdt på 30°C under reaktionen. Inhiberingsmiddel: Fortynding udførtes i 0,1 M fosfatpuffer (pH 6,8) eller dimetylsulfoxyd (DMS0).

Kontrolkuvetten indeholdt samme mængde fortyndingsopløsning som prøvekuvetten men uden inhiberingsmiddel. Reaktionsbetingelser: Blandingen af enzym og inhiberingsmiddel med følgende sammensætning for-inkuberedes i 15 minutter ved 30°C. fosfatpuffer 100 μΐ enzym 0,5 - 2,0 μΐ inhiberingsmiddel 0,5 - 40 μ1 144098 58

Efter for-inkuberingen blev substratopløsningen (forvarmet til 30°C, 3,0 ml) tilsat og hurtigt blandet for at starte reaktionen. Reaktionen fulgtes ved at registrere forandringen i den optiske tæthed ved 225 πιμ i 10 minutter ved 30°C.

ρρ·ρ Værdien af (yg/ml) bestemtes ved fortynding af inhibe-ringsmidlet indtil fortyndingen gav 50% af hydrolysehastigheden for cephaloridin registreret i den ikke-inhiberings-middel indeholdende kontrol i 10 minutter (fra i, minut til 11 minutter efter tilsætningen af substratet), (C) Resultater

Under de ovenfor beskrevne reaktionsbetingeIser vandtes føl-

CER

gende Ι^0 -værdier med tritylesteren af antibiotikum PS-5:

CER

β-laktamase fra: I5o (yg/ml)

Proteus vulgaris P-5 0,060

Citrobacter freundii E-9 0,80 Således inhiberedes 50% af hydrolysen af cephaloridin ved 0,060 yg/ml og 0,80 yg/ml af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 ved prøver med β-laktamaser fra henholdsvis Proteus vulgaris P-5 og Citrobacter freundii E-9, under de ovenfor beskrevne betingelser.

5) Toxicitet: Tritylesteren af antibiotikum PS-5 fremkaldte ingen dødsfald hos han-ddy-mus (Shizuoka) når den blev indgivet i in-peritoneal dosis på 500 mg/kg.

Eksempel 11

Fremstilling af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5

Det brungule pulver af 715 mg (235 CCU/mg) antibiotikum PS-5-natriumsalt fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 7 opløstes i 3,5 ml hexametylfosfortriamid (HMPA). Efter tilsætning af 70 mg triætylamin under afkøling med is sattes 250 mg tritylbromid til blandingen ved en temperatur under 10°C. Blandingen omrørtes ved 10°C i 7 timer for at fuldende trityleringsreaktionen. Reaktionsblandingen udhældtes i 50 ml isvand og fik lov at stå indtil den faste is smeltede.

Tritylesteren af antibiotikum PS-5 ekstraheredes tre gange med 15 ml benzen hver gang og behandledes som beskrevet i eksempel 10 hvorved der vandtes 9,4 mg farveløst krystallinsk pulver af 144098 59 det ønskede produkt. De fysisk-kemiske egenskaber af dette produkt var praktisk taget identiske med dem der vandtes ifølge eksempel 10.

Eksempel 12

Fremstilling af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 i nærværelse af en kroneæter 10,1 g råt brunlighvidt frysetørret pulver fremstillet ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 5 suspenderedes i 200 ml metylenklorid og opløstes under omrøring under tilsætning af. 1 ml dicyklohexyl-15-krone-5(Nippon Soda Co., Ltd.). Mens opløsningens temperatur holdtes under 5°C med is tilsattes 8,5 g tritylklorid. Reaktionsblandingen opvarmedes til stuetemperatur og omrørtes i 3 timer ved denne temperatur. Efter filtrering inddampedes filtratet til tørhed under nedsat tryk. Remanensen opløstes i 10 ml benzen med det samme, filtreredes og rensedes ved den samme procedure som den der er beskrevet i eksempel 10 hvorved der vandtes et farveløst krystallinsk pulver i en mængde på 7,3 mg. Dette pulver havde de s^mme fysisk-kemiske egenskaber som vist i eksempel 10.

Eksempel 13

Fremstilling af trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 i nærværelse af et kvaternært ammoniumsalt

Antibiotiket PS-5 ekstraheredés fra 48 liter dyrkningssuppefiltrat (11,7 CCU/ml) to gange hver gang med 15 liter diklormetan indeholdende 0,05% cetyldimetylbenzylammoniumklorid (diklormetaneks-traktens aktivitet: 24,0 CCU/ml; det brugte dyrkningssuppefiltrats aktivitet: 5,7 CCU/ml). Diklormetanekstrakten tørredes over 400 g vandfri natriumsulfat og inddampedes til 500 ml under nedsat tryk i en roterende fordamper. Koncentratet(450 CCU/ml) dehydreredes først over 10 g vandfri natriumsulfat og derpå efter filtrering med 5 g molekylsigter 4A (Union Carbide Corp.).

Til denne tørre opløsning sattes 4,5 g tritylklorid ved en temperatur under 5°C og blandingen omrørtes i 5 timer ved 5°C. Efter fjernelse af diklormetan ved afdampning ved stuetemperatur opløstes remanensen i 15 ml benzen og rensedes på en tilsvarende måde som beskrevet i eksempel 10 hvorved der vandtes 8 mg vandfrit krystallinsk pulver af tritylesteren af antibiotikum PS-5. De fysisk- T4A098 60 kemiske egenskaber ved denne fremstilling var næsten de samme som dem der er beskrevet i eksempel 10.

Eksempel 14

Antibiotikum PS-5-metylester 90 Milligram antibiotikum PS-5-natriumsalt vundet i eksempel 9 (8000 CCU/mg) suspenderedes i 3 ml tørt dimetylformamid hvortil der sattes 50 mg triætylamin og 0,3 ml metyljodid. Efter omrøring i 2 1/2 time ved stuetemperatur tilsattes der 100 ml benzen og blandedes grundigt til ekstraktion. Benzenlaget skiltes fra, vaske-des med 100 ml 0,1 M, pH 6,8, fosfatpuffer og tørredes derpå over vandfrit natriumsulfat. Den tørre benzenopløsning koncentreredes til et lille rumfang under nedsat tryk og sattes til en Bio-Beads S-X3 (Bio-Rad Laboratories) kolonne (1,2 x 90 cm).

Metylesteren fremkaldtes med benzen. Eluatfraktioner indeholdende esteren forenedes og inddampedes til tørhed under nedsat tryk hvorved der vandtes en farveløs olie. Det olieagtige materiale opløstes i en lille mængde acetone og kromatograferedes på en Sepha-dex LH-20 (1,2 x 90 cm) kolonne med acetone som fremkaldelsesmiddel. Eluatfraktioner indeholdende metylesteren af antibiotikum PS-5 opsamledes og inddampedes til tørhed hvorved der vandtes 11,2 mg antibiotikum PS-5-metylester. Metylesteren udviste følgende fysiske og kemiske egenskaber: (1) Tyndlagskromatografi

Rf = 0,45 (Silicagel 60 F254"Pla<^e: benzen/acetone =1:1) (2) -Ultraviolet absorptionsmaksimum i metanol

Amax(metanol) = 315,5 nm (3) Infrarøde absorptionsmaksima i kloroform 3430, 1766, 1660 cm-1 (4) Signaler i det protonmagnetiske resonansspektrum i deuterio-kloroform (6) 1,05 (3H, t, J=7,5 Hz);l,7 - 2,0 (2H, m); 2,00(3H, s); 2,8 -3,65 (7H, m); 3,83 (3H, s); 3,84 - 4,06 (IH, m) (5) Molekylvægt (højopløsnings-massespektrometri)

Beregnet for C]_4H2oN2°4S: 312,1143

Fundet : 312,1131 U4098 61 Følgende struktur tilskrives metylesteren af antibiotikum PS-5 på grundlag af den tidligere beskrevne struktur af antibiotikum PS-5 og de ovenfor specificerede fysisk-kemiske data: ch3-ch2--|^y-s-ch2-ch2-nh-co-ch3 j—n k COO-CH3

Som beskrevet ovenfor kan præparater indeholdende antibiotikum PS-5 og/eller tritylesteren af antibiotikum PS-5 indgives i forskellige enhedsdosisformer såsom i faste eller flydende oralt indgivelige dosisformer. Dette præparat kan hvad enten det er fast eller flydende pr. enhedsdosis indeholde det aktive materiale i en mængde på 0,1 - 99%, fortrinsvis 10 - 60%. Mængden af den aktive ingrediens i præparatet kan variere i afhængighed af dosisformen og præparatets samlede vægt og den ligger sædvanligvis på mellem 10 mg og 1000 mg, fortrinsvis 100 mg til 1000 mg.

Ved parenteral indgift er enhedsdosen sædvanligvis den rene eller i høj grad rensede antibiotikum PS-5, et farmaceutisk acceptabelt salt deraf og/eller trityleringsproduktet af antibiotikum PS-5 i steril vandopløsning eller i form af et opløseligt pulver beregnet til opløsning.