FI59813C - Foerfarande foer framstaellning av antibiotikumet ps-5 och salter daerav med en beta-laktamas inhiberande aktivitet - Google Patents

Description

Tri /m kuulutusjulkaisu _ λ ä Ma ™ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 5981 3

•S® c (45) r-: . 1 — ··;.· :: : : I

' (51) K*.ik?/Int.ci.3 σ 12 P 17/10, 11/00, C 07 D 487/04 SUOMI-FINLAND (21) Pu«nttlhak«mu< — Pattntantttknlng 780671 (22) Hakemltpllvi — Antdknlngtdtg 28.02.78 *' (23) Alkupllvf — Glltighttsdag 28.02.78 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offantllg 01.10.78 _ . . ^ , (44) NlhUviksIpsnon Ja kuuLJulkalsun prm. — . „

Patent- oeh registerstyrelsen ' Ansekan utlagd oeh utl.skriften publicarad 30.06.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird priority 31.03· 77 09.08.77 Japani-Japan (JP) 52-35375, 52-9^651 (71) Sanraku-Ocean Co. Ltd., Ajinomoto Building, 7, Takara-cho 1-Chome,

Chuo-ku, Tokyo lOl, Japani-Japan(JP), Panlabs Inc., P.O. Box 8l,

Fayetteville, Nev York 13066, USA(US) (72) Kazuhiko Okamura, Kanagava-ken, Shoji Hirata, Kanagava-ken,

Yasushi Okumura, Kanagava-ken, Yasuo Fukagava, Kanagava-ken,

Yasutaka Shimauchi, Kanagava-ken, Tomoyuki Ishikura, Kanagava-ken,

Kageaki Kouno, Tokyo, Japani-Japan(jP), Joseph Lein, Fayetteville,

Nev York, USA(US) (7^) Munsterhielm Ky' Kb (5M Menetelmä valmistaa antibioottia PS-5 ja sen suoloja, joilla on (3-laitamaa-sia estävää aktiviteettia - Förfarande för framställning av antibiotikumet PS-5 oeh salter därav med en β-laktamas inhiberande aktivitet Tämä keksintö koskee menetelmää uuden antibiootin, jolla on voimakas antibioottinen aktiviteetti ja /0 -laktamaasia estävä vaikutus, valmistamiseksi viljelemällä Streptomyces A271-kantaa aerobisesti.

Jo ennestään tunnetaan joitakin antibiootteja, joilla on /3--laktamaasia estävä aktiviteetti tai ^3-laktamaasia estäviä aineita. Esimerkiksi seuraavat aineet on esitetty: MC696-SY2-A ja -B, jotka on eristetty MC696-SY2:n liemiviljelmästä, joka on tuotettu Streptomyces--sukuun kuuluvalla kannalla (US-patentti 3 928 569: Derwent CPI 15846V), HIM50 tai MM13902, jotka on eristetty MM4550:n ja MM13902:n viljelyaineista, jotka on tuottanut Streptomyces-sukuun kuuluva kanta (DE-0S 2 513 855: Derwent CPI 67721W; DE-OS 2 513 854: Derwent CPI 6772ÖV.') ja klavulaanihappo, joka on eristetty Streptomyces clavuli gerus-kannan viljelyaineista, (DE-OS 2 517 316: Derwent CPI 72840V.'). Antibiootti tienamysiini, jolla on penisilliinin kaltainen kemial- 2 5981 3 linen rakenne, ja sen johdannaiset on myös esitetty julkaisuissa (QS-patentti 3 950 357? Derwent CPI 31696X; DE-OS 2 652 6?7:

Derwent CPI ι+02δ2ϊ; BE-patentti 8^8 3*+6: Derwent CPI 3*+505Y? BE-patentti 81+8 31+9¾ Derwent CPI 3*+507? DE-OS 2 652 680:

Derwent CPI 1+O283Y; DE-OS 2 652 675: Derwent CPI *+0280Y: DE-OS 2 652 67*+: Derwent CPI 1+0279Y? DE-OS 2 652 676: Derwent CPI >+028IY).

Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa uutta, antibioottista yhdistettä 3-j~2-asetyyliamina-etyylitiol.-6-etyyli-7Tokso--1-atsabisyklo^3.2,¾hept-2-eeni-2-karboksyylihappoa, jota nimitetään PS-5:ksi. jolla on voimakasta"antibioottista aktiviteettia, /i-laktamaasia estävä aktiviteetti ja kyky yhteisvaikutteisesti penisilliinien, kefalosporiinien ja näiden kaltaisten aineiden kanssa lisätä niiden antibioottista aktiviteettia (l -laktamaasin tuottajia vastaan, sekä sen suoloja, joilla myös on sekä voimakasta antibioottista aktiviteettia että /3 -laktamaasia estävää aktiviteettia.

Antibioottia PS-5 tuotetaan keksinnön mukaisesti käy-mismenetelmällä, johon sisältyy antibiootti PS-5:tä tuottavan mikro-organismin viljeleminen ravintoväliaineessa ja antibiootti PS-5in eristäminen..

Edellä mainittua antibiootti PS-5:tä tuottava kanta kuuluu Streptomyces-sukuun. Kanta eristettiin läheltä Eiheiji Temple'a Fukuin prefektin Yoshida-alueella Japanista kerätystä maanäytteestä ja sille annettiin kantanumero A271.

Kannan A 271 taksonomiset tunnusmerkit.

Streptomyces A271-kannan taksonomiset tunnusmerkit ovat seuraavat: 3 59813 1) Morfologiset tunnusmerkit

Itiöitä muodostavan ilmarihmaston haarautuminen: dikotomisesti haarautunut ilman kiehkuroita (without verticils). Itiöitä muodostavan ilmarihmaston muoto: ilmarihmaston päässä on koukkuja, silmukoita ja epätäydellisiä spiraaleja. Näiden on arveltu kuuluvan ryhmään Retina-culum-Apertum. Nämä muodot huomataan erityisesti silloin kun viljellään kaura-agarväliainee11a ja glyseroli-asparagiini-agarväliaineella, kun taas suora tai taipuisa muoto havaitaan silloin tällöin hiivauute--mallasuute-agarväliaineella. Itiöketjujen muoto ja lukumäärä: soikeita tai sylinterinmuotoisia itiöitä, jotka muodostavat ketjuja, joissa on yli 10 itiötä (tavallisesti 10-50). Itiöiden koko ja pintarakenne: 0,8 - l,o x 1,0 - 1,8 p., sileä pinta. Flagelloja ja itiöpesäkkeitä ei ole havaittu. Hyphae muodostuu ilmarihmastossa.

2) Viljelytunnusmerkit

Kannan A271 viljelytunnusmerkit on esitetty taulukossa l, jossa on esitetty havaitut tulokset 2 viikon kasvatuksen jälkeen 2ö°C:ssa ellei toisin ole mainittu. Värisävyn ilmaiseminen perustuu pääasiassa H.D. Tresner'in ja E.J. Backus'in menetelmään "System of color wheels for Streptomycete taxonomy" (katso Appi. Microbiol. 1J., 335, 1963) ja värisävykoodit perustuvat "Guide to Color Standard", jonka on julkaissut Japanin väri-instituuttilaitos (Japan Color Institute Foundation).

Taulukko 1 Väliaine Kasvu Ilmarihmaston väri Kasvualustan rih- Liukene- maston väri va pig mentti

Sakkaroosi- run- vaalean oranssin- vaaleankeltaisesta ei nitraatti-agar- sasta keltainen (3ea) (2fb) vaaleanorans- -väliaine sinkeltaisieen (3ea)

Glukoosi-aspa- run- erittäin vaalean vaalean keltainen ei rahiini-agar- sasta oranssinkeltaisesta (l£fb-2fb) -väliaine (3ca) vaalean orans sinkeltaiseen (3ea)

Glyseroli-as- run- erittäin vaalean vaalean keltaises- ei paragiini-agar- sasta oranssinkeltaisesta ta (2fb) jonkin ver- -väliaine (3ca) vaalean orans- ran kellertävään sinkeltaiseen (3ea) vaaleanpunaiseen (^gc) Tärkkelys-epä- run- erittäin vaalean vaalean oranssinkel- ei orgaaninen sasta oranssinkeltaisesta täisestä (3ea) vaa- suola-agar- (3ca) vaalean orans- lean keltaiseen -väliaine sinkeltaiseen (3ea) (2fb) m. 5981 3 Väliaine Kasvu Ilmarihmaston väri Kasvualustan rih- Liukene- maston väri va pig mentti

Tyrosiini- run- erittäin vaalean vaalean oranssin- ei -agar-väli- sasta oranssinkeltaisesta keltaisesta (3ea) aine (3ca) vaalean orans- ruskeahkon keltai- sinkeltaiseen (3ea) seen

Havinto-agar- run- tuskin muodostuu,· erittäin vaalean ei -väliaine sasta jos muodostuu, ver- keltainen (2db) rattain tummaa

Hiivauute- run- erittäin vaalean vaalean oranssin- ei -mallasuute- sasta oranssinkeltaisesta keltaisesta (3ea) -agar-väli- (3ca) vaalean orans- erittäin vaalean aine sinkeltaiseen (3ea) ruskeaan (^ie)

Kaura-agar- run- erittäin vaalean vaalean keltainen ei -väliaine sasta oranssista (3ca) (2fb) vaalean oranssinkeltaiseen (3ea)

Peptoni-hii- run- puuttuu vaalean keltai- ei vauute-rauta- sasta nen (2db) -agar

Kalsium-ma- kohtuil- erittäin vaalean vaalean keltainen ei laatti-agar lista oranssinkeltainen (ll/2fb) (3ea) 3) Fysiologiset tunnusmerkit 1) Kasvun lämpötila-alue; 10-lf0°C, optimi 20-30°C; 2) Kasvun pH-alue; kasvua esiintyy pHtssa 5-9; optimi pH 6-8; 3) Gelatiinin nesteytys (glukoosi-peptoni-gelatiiniväliaineessa): nesteyttää (viljelty 20°C;sessa) ; 1+) Tärkkelyksen hydrolyysi (tärkkeiys-epäorgaaninen suoia--agar-väiiaineessa): hydrolysoi; 5) Kuoritun maidon koaguloituminen ja peptonisoituminen; peptonisoi mutta koaguloitumista ei havaittu; 6) Nitraatin pelkistys; pelkistää; 7) Melanoidi-pigmentin muodostuminen; meianoidi-pigmenttiä ei muodostunut tyrosiini-agar-väiiaineeila eikä hiiva-rauta-agar-väli-aineella eikä tryptoni-hiivauute-lihaiiemessä; 8) Seuraavien eri hiililähteiden hyväksikäyttö (Pridham'in ja Gottlieb'in agar-väliaine): L-arabinoosi + D-ksyloosi + D-glukoosi + 5 59813 D-fruktoosi

Sakkaroosi +

Inositooli L-ramnoosi +

Raffinoosi D-mannitoli (+ : hyvä hyväksikäyttö, + : heikko hyväksikäyttö, - : erittäin heikko hyväksikäyttö tai ei hyväksikäyttöä ollenkaan).

Edellä esitetyistä tunnusmerkeistä ilmenee selvästi, että kanta A271 kuuluu Streptomyces-sukuun ja sillä on tunnusmerkkejä, jotka esiintyvät mikro-organismeilla, jotka kuuluvat ryhmään RA, koska rih-mastopinnan värisävy on keltainen tai punainen, itiön pinta on sileä eikä veteen liukenevaa pigmenttiä kuten melanoidi-pigmenttiä muodostu. Viljelmiä, joilla on tällaiset taksonomiset tunnusmerkit, etsittiin Waksman julkaisusta "The Actinomycetes" voi.2" (1961), E.B. Shirling'in ja D. Gottlieb'in julkaisuista International Journal of Systematic Bacterology voi. 18, sivut 69-189 (1968), sama lehti 279-892 (1968), sama lehti, voi. 19, 391-512 (1969), sama lehti, voi. 22, 265-39^ (1972), ja kirjasta Bergey's Manual of determinative Bacteriology, 8. painos (197^). Samanlaisia viljelmiä, jotka kuuluvat ryhmään RA, huomattiin olevan Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rut-gersensis, Streptomyces chryseus, Streptomyces helvaticus. Yhtenä näitä muistuttavana viljelmänä valittiin myös Streptomyces pluricolo-rescens, valinnan perustuessa sen morfologisiin tunnusmerkkeihin, vaikka se kuuluu ryhmään RF. Näiden 8 viljelmän, paitsi viimeisen Streptomyces pluricolorescens'in, ilmoitettiin kasvattavan ilmarihmastoa, jolla oli suora muoto tai silmukoita, vaihtelun ollessa riippuvainen viljelyolosuhteista. Edellä mainitun kahdeksan lajin tyyppiviljelmiä verrattiin tämän keksinnön kantaan A271, sen jälkeen kun näitä oli kasvatettu samoissa olosuhteissa. Tuloksissa kanta A271 erottuu selvästi näistä viljelmistä, eroten kasvussa, ilmarihmaston värissä ja kasvualustan rihmaston värissä ja lisäksi on huomattavia eroja hiililähtei-den hyväksikäytössä.

Taulukoissa 2, 3 ja on esitetty tulokset verrattaessa kantaa A271 kahteen viljelmään, jotka läheisimmin muistuttivat sitä.

6 5981 3

Taulukko 2

Vertailu taksonomisesti läheisiin kantoihin Ilmarihmaston väri Väliaine Kanta A271 Actinomyces Actinomyces flavi- cremeus ISP 51^7 dovirens ISP 5150

Sakkaroosi- vaalean oranssin- tuskin muodostuu ei muodostu nitraatti- keltainen (3ea) agarväli- aine

Glukoosi- erittäin vaalean erittäin vaalean valkoinen (b) asparagiini- oranssinkeltaises- oranssinkeltainen agarväliaine ta (3ca) vaalean (3ca) oranssinkeltaiseen (3ea)

Glyseroli- erittäin vaalean erittäin vaalean tuskin muodostuu; asparagiini- oranssinkeltaises- oranssinkeltainen jos muodostuu, agarväliaine ta (3ca) vaalean (3ca) heikosti valkois- oranssinkeltaiseen ta (a) (3ea) Tärkkelys- erittäin vaalean erittäin vaalean ohuesti muodostu- epäorgaani- oranssinkeltaises- oranssinkeltainen nutta valkoisesta nen suola- ta (3ca) vaalean (3ca) (a) erittäin vaa- agarväliaine oranssiin (3ea) lean keltaiseen (2db)

Ravinto- tuskin muodostuu; valkoisesta (a) valkoista agarväliaine jos muodostuu, ver- erittäin vaalean rattain tummaa oranssinkeltaiseen (3ca)

Hiivauute- erittäin vaalean erittäin vaalean valkoisesta (b) mallasuute- oranssinkeltaises- keltainen (2db) erittäin vaalean agarväliaine ta (3ca) vaalean kellertävän vih- oranssinkeltaiseen reään Clcb) (3ea)

Kaura-agar- erittäin vaalean valkoisesta (b) valkoisesta (b) väliaine oranssinkeltaises- erittäin vaalean erittäin vaalean ta (3ca) vaalean oranssinkeltaiseen kellertävän vih- oranssinkeltaiseen (3ca) reään (lbd) (3ea) 7 59813

Taulukko 3

Vertailu taksonomisesti läheisiin kantoihin Kasvualustan rihmaston väri Väliaine Kanta A271 Actinomyces Actinomyces flavi- cremeus ISP 51^7 dovirens ISP 5150

Sakkaroosi- vaalean keltaises- vähäistä kasvua vähäistä kasvua nitraatti- ta (2fb) vaalean värittömästä vai- värittömästä val- agarväliaine oranssinkeltaiseen koiseen (b) koiseen (a) C3ea)

Glukoosi- vaalean keltainen vaalean oranssin- erittäin vaalean asparagiini- (l£fb-2fb) keltainen (3ea) keltainen (2db) agarväliaine

Glyseroli- vaalean keltaises- vaalean oranssin- harmahtavan kel- agaragiini- ta (2fb) jonkin keltainen (3ea) nen (3ec) agarväliaine verran kellertävän vaalean punaiseen O+gc) Tärkkelys- vaalean oranssin- kohtuullista kel- vaalean keltaista epäorgaani- keltaisesta (3ea) lertävän vaalean (2fb) nen suola- vaalean keltaiseen punaista C^+ea) agarväliaine (2fb)

Tyrosiini- vaalean oranssin- erittäin vaalean harmahtavan kel- agarväliaine keltaisesta (3ea) ruskea (U-ie) täistä (3ec) ruskehtavan keltaiseen

Ravinto- erittäin vaalean vaalean oranssin- erittäin vaalean agarväliaine keltainen (2db) keltainen (3ea) keltainen (2db)

Hiivauute- vaalean oranssin- vaalean oranssin- himmeän keltainen mallasuute- keltaisesta (3ea) keltaisesta (3ea) agarväliaine erittäin vaalean tumman keltaiseen ruskeaan (*+ie)

Kaura-agar- vaalean keltainen jonkin verran erittäin vaalean väliaine (2fb) kellertävän vaa- keltaisesta (2db) lean punaista erittäin vaalean (kgc) oranssinkeltaiseen t 8 5981 3

Taulukko *+

Vertailu taksonomisesti läheisiin kantoihin Hiililähteiden hyväksikäyttö

Hiililähteet Kanta A271 Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens tsp 5157 ISP 5150 L-arabinoosi + + + D-ksyloosi + + + D-glukoosi + + + D-fruktoosi + +

Sakkaroosi +

Inositoli + L-ramnoosi + +

Raffinoosi - D-mannitoli - 9 59813

Seuraavat seikat ilmenevät edellä mainituissa taulukoissa esitetyistä tuloksista; Ilmarihmaston väri: Actinomyces flavidovirens'llä on yleensä valkoinen, mutta kun se on keltainen se on vihertävän keltainen ollen selvästi erilainen kuin tämän keksinnön kannan A271 ilma-rihmasto ja Actinomyces cremeus'lla esiintyy yleensä heikompana punertava sävy erittäin vaalean oranssinkeltaisessa värissä kuin kannalla A271, ollen selvästi erottuva kannasta A271.

Verrattaessa kasvualustan rihmaston väriä; Actinomyces flavidovirens 'llä on erittäin vaalean keltainen väri ja Actinomyces cre-meus 'lla on vaalean oranssinkeltainen väri monessa tapauksessa, kun taas kannalla A271 on yleensä vaalean keltainen väri. Edelleen saatujen koetulosten yksityiskohtainen vertaileminen eri väliaineissa osoittaa selvästi, että kanta A271 eroaa kahdesta muusta viljelmästä. Kanta A271 eroaa Actinomyces cremeus 'sta d-fruktoosin ja 1-ramnoosin hyväksikäyttämisessä ja Actinomyces flavidovirens'stä d-fruktoosin ja inosi-tolin hyväksikäyttämisessä.

Näiden tulosten mukaisesti tämän keksinnön kanta A271 on selvästi erilainen kuin kaksi tunnettua viljelmää, jotka läheisimmin muistuttavat sitä.

Kanta A271 on erilainen kuin kaikki tunnetut Streptomyces lajit ja sen on osoitettu olevan uusi laji, joka on määritelty Streptomyces sp. A271:ksi. Tämä viljelmä on tallennettu Fermentation Research Institute'ssa, Agency of Industrial Science and Technology, jossa sille on annettu viljelynumero FERM-P No. 398^. Streptomyces sp. A271 näyte on myös tallennettu ATCC:ssä, jossa sille on annettu kokoel-manumero 31358.

Antibiootti PS-5:n tuottajat voidaan valita laajalta alueelta mikro-organismeja, jotka eivät rajoitu tiettyyn sukuun.

PS-5:ä tuottavien mikro-organismien valinta suoritetaan seu-raavaila menetelmällä.

Maanäytteestä eristettyjen mikro-organismien kasvatusliemien suodokset analysoidaan käyttämällä biokoe-agarlevyä, joka on ympätty /3-laktaami herkällä mikro-organismilla ja toista biokoe-agarlevyä, joka sisältää /3-laktamaasia ja on ympätty samalla organismilla. Mikro--organismit, joiden liemisuodoksilla on pienemmät estävät vyöhykkeet jälkimmäisellä biokoe-levyllä kuin edellisellä biokoe-levyllä, valitaan 10 5981 3 jatkotyöskentelyyn. Sen jälkeen aktiiviset komponentit edellä esitetyn menetelmän mukaan valittujen mikro-organismien viljelyliemessä adsorboidaan aktiivihiileen ja eluoidaan. Konsentroidut eluaatit kehitetään paperikromatografiällä tai ohutkerroskroraatografiällä, jota seuraa bio-autografia /3-laktaami herkän mikro-organismin ollessa koeorganismina. Seuraava esimerkki selittää konkreettisemmin tätä seulontamenetelmää. Comamonas biokoe-levyä, joka kuvataan myöhemmin, on käytetty biokoe-levyhä, joka on ympätty /3-laktaami herkällä koeorganismilla. Comamonas CV biokoe-levy ja Comamonas CM biokoe-levy on valmistettu lisäämällä edellä mainittuun Comamonas biokoe-levyyn /'3-laktamaasia tuottavia Proteus vulgaris P-5sä ja Citrobacter freundii E-9:ää vastaavasti.

Maanäytteestä eristettyjen mikro-organismien kasvatusliemien suodoksiin lisätyt 8 mm läpimittaiset tulppakiekot asetetaan edellä esitetyille biokoe-levyille ja levyjä inkuboidaan 35°C:sessa 20 tuntia. Inkuboinnin jälkeen valitaan mikro-organismit, joiden liemisuodos antaa estävän vyöhykkeen Comamonas biokoe-levyillä ja pienenunän estävän vyöhykkeen Comamonas CV tai Comamonas CM biokoe-levyllä.

Valittujen mikro-organismien liemisuodoksiin lisätään 2 $ (p./til.) aktiivihiiltä ("Tokusei Shirasagi", Takeda Chemical Industries, Ltd.) ja 15 minuutin hämmentämisen jälkeen liukenematon aine kerätään sentrifugoimalla. Liukenematon aine pestään samalla tilavuudella tislattua vettä kuin käytettiin liemisuodosta ja kerätään taas sentrifugoimalla. Pesty liukenematon aine eluoidaan lisäämällä puolet käytetyn liemisuodoksen tilavuudesta 50 %ista (til./til.) vesipitoista asetonia ja hämmennetään 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Sentri-fugoinnin jälkeen pinnalla oleva neste haihdutetaan 30-35°C:sessa käyttäen pyöröhaihdutinta, jolloin saadaan 20-kertainen konsentroitu liuos verrattuna käytettyyn liemisuodokseen. Konsentroitu liuos asetetaan suodatinpaperilla (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.) alas-laskeutuvalle paperikromatografialle, kehitetään 16 tuntia 80 %:sella asetonitriili/tris-EDTA-liuottimella (sisältäen 120 ml asetonitriiliä, 80 ml pH 7,5 1/10 M tris-(hydroksimetyyli)-araino-metaani-kloorivety-happo-puskuria ja 1 ml etyleenidiamiinitetraetikkahapon natriumsuolan vesiliuosta). Tämän jälkeen seuraa välittömästi bioautografia Comamonas terrigena B-996:n ollessa koeorganismina.

Maanäytteestä eristetyt mikro-organismit, joiden biologisesti aktiivinen tuote antaa estävän vyöhykkeen samalla migraatioetäisyydel-lä (tai samalla Rf-arvolla) kuin antibiootti PS-5:n aktiivinen tuote, valitaan ehdokkaiksi antibiootti PS-5:n tuottamiseen. Valittuja ehdokas 11 5 981 3 mikro-organismeja tutkitaan edeileen uusiila paperi- ja ohutkerroskro-matografia tutkimuksilla, jotta vahvistettaisiin niiden kyky tuottaa antibiootti PS-5:ä.

Tämän keksinnön mukaan antibiootti PS-5:ä voidaan tuottaa ymppäämällä ravintoväliaineeseen mikrobiologisen kannan, joka on kykenevä tuottamaan sanottua antibioottia, kuten Streptomyces sp. A271, rihmaston itiöitä ja viljelemällä sitä aerobisesti.

Ravintoaineista ovat käyttökelpoisia monet ravintoaineet, joita Streptomycetes tavallisesti hyväksikäyttää, esimerkiksi hiililähde, typpilähteet ja epäorgaaniset suolat. Käyttökelpoisia hiiinähteitä ovat hiilihydraateista esimerkiksi glukoosi, glyseroli, maitoosi, sakkaroosi, melassi, dekstriini ja tärkkelys, ja öljyistä tai rasvoista sellaiset kuin soijapapuöljy, maapähkinäöljy ja silava; typpilähteik-si sopivat esimerkiksi peptoni, lihauute, soijapapujauho, puuvillan-siemenöljy, kuivattu hiiva, maissiuute, hiivauute, kuorittu maito-kaseiini, natriumnitraatti, ammoniumnitraatti tai ammcniumsulfaatti$ ja tarvittavia epäorgaanisia suoloja ovat esimerkiksi dikaliumfos-faatti, natriumkloridi, kalsiumkarbonaatti tai magnesiumsulfaatti; hivenmetalleja, esimerkiksi kobolttia tai mangaania, voidaan tarvittaessa lisätä viljelyliuokseen. Lisäksi käyttökelpoisia ravintoaineita ovat kaikki ne, joita antibiootti PS-5:ä tuottava organismi voi hyväksikäyttää. Kuohumisen estämiseksi kuumentamisen aikana steriloitaessa ja käymisen aikana voidaan lisätä kuohumista estäviä aineita kuten silikoniöljyä tai kasviöljyä.

Ravintoaineiden suhde koostumuksessa ei rajoitu edellä esitettyyn vaan voi vaihdella laajalla alueella.

Väliaine voidaan steriloida ennen viljelyä.

Väliaineen pH säädetään mieluimmin alueelle - 9, mieluimmin alueelle 6-8 ennen tai jälkeen steriloimisen.

Antibiootti PS-5:ä tuottavan kannan viljely voidaan suorittaa pääasiassa samanlaisella menetelmällä kuin mitä on käytetty yleensä Streptomycetes'n tuottamien antibioottien antibioottisessa tuotannossa. Viljeleminen tapahtuu yleensä mieluimmin aerobisissa olosuhteissa, toisin sanoen viljellään samalla hämmentäen ja/tai ilmastaen.

Mikä tahansa viljelymenetelmä kuten stationääriviIjely, ravis-tusviljely ja submerssiviljeiy on käyttökelpoinen, paras on kuitenkin submerssiviljely. Käyttökelpoinen käymislämpötila ei ole erityisesti rajoitettu, mutta yleensä se valitaan alueelta, jolla antibiootti P3-5:n tuottajan kasvu ei ole olennaisesti estynyt ja se voi tuottaa 12 5981 3 antibiootti P3-5:ä. Vaikka käymislämpötila voi vaihdella käytetyn tuot-tajakannan cnukaan sopiva lämpötila on yleensä alueella 20-LOoC, mieluimmin 25-35°C.

Viljelyliemen pH voidaan säätää käymisen aikana alueelle L--9, mieluimmin 6-Ö.

Suuren mittakaavan käymisessä, viljellään mieluimmin riittävää ymppiviljelmää ja sen jälkeen ympätään ravintoväliaine submerssivilje-lyä varten sanotulla ymppiviljelmällä.

Käyminen voi tavallisesti jatkua, kunnes tarvittava määrä antibiootti PS-5:ä on syntynyt. Käymisaika on tavallisesti 30-90 tuntia, mutta se vaihtelee väliaineen koostumuksen, käymislämpötilan, käytetyn tuottajakannan ja näiden kaltaisten seikkojen vaikuttaessa siihen. Käytettävät optimi-käymi solosuhteet voi alan ammatti-ihminen helposti määritellä. Antibiootti P3-5:n määrä käymisliemessä voidaan määrittää biokoe-menetelmällä ja bioautografialla.

Koska käymisliemeen syntynyt antibiootti P3-5 on veteen liukeneva ja sijaitsee pääasiassa rihmaston ulkopuolella, rihmasto poistetaan mieluimmin käymisen jälkeen tavallisesti tunnetulla erotusmenetelmällä kuten suodattamalla, sentrifugoimalla tai uuttamalla ja antibiootti otetaan talteen suodoksesta, sakan päällä olevasta nesteestä tai uutteesta. Antibiootin talteenottaminen voidaan suorittaa erilaisilla yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Erityisesti, hyvä menetelmä, jota voidaan soveltaa antibiootin talteenottamiseksi, on menetelmä, jota on toistuvasti käytetty talteenotettaessa karboksyylihapon tyyppisiä antibiootteja.

Esimerkiksi seuraavia menetelmiä voidaan käyttää itsenäisesti tai yhdistettyinä tai toistuvasti talteenotettaessa tai eristettäessä antibiootti PS-5:ä: (a) uuttaminen alhaisessa pH-arvossa, liuottimena esim. etyyliasetaatti tai n-butanoli ja takaisinuuttaminen liuotinker-roksesta vesipitoiseen kerrokseen korkeassa pH-arvossa; (b) uuttaminen neutraalissa pH-arvossa sellaisilla liuottimilla kuten metyleenikloridi tai kloroformi, lipofiilisen kvaternäärisen ammoniumsuolan kuten bents-alkoniumkloridin tai tetra-n-butyyli-aramoniumvetysulfaatin läsnäollessa tai crown-yhdisteen kuten disykloheksyyli-l8-crovn-6- ja l5-crown-5 -eettereiden läsnäollessa (Nippon Soda Co., Ltd.) ja takaisinuuttamalla liuotinkerroksesta neutraaliin vesipitoiseen kerrokseen, joka sisältää natriumjodidia tai kaliumjodidia; (c) adsorptio aktiivihiilellä, tai suuri huokoisella styreeni/divinyylibentseenihartseilia kuten Amberlite XAD :Uä(suuri huokoinen styreeni/divinyylibentseenihartsi, valmista ja

Rohm & Haas Co.) tai Diaion HP-20:llä (suuri huokoinen styreeni-kopoly- 13 5981 3 meeri, helmien muodossa, suuri makroverkkorakenne, valm. Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) ja eluointi vesipitoisella metanolilla tai vesipitoisella asetonilla; (d) adsorptio ja eluointi ioninvaihtohartsil la kuten Dowex 1-X2:lla (vahvasti emäksinen hartsi, joka s jäitää kvatei nääriryhmiä polystyreeniverkossa, sisältää 2# divinyylibentseeniä ris-tiinkytkevänä aineena, valm. Dow Chemical Co.) tai QAE-Sephadex A-25:ll· (täysin kvaternäärinen, vahvasti emäksinen anioni-ioninvaihtohartsi, jo ka valmistetaan liittämällä dietyyli-2-hydroksipropyyli-ammoniumryhmiä dekstraanigeeliin, valm. Pharmacia Fine Chemicals AB); (e) geelisuoda-tus Sephadex G-10:llä (heimenmuotoinen dekstraanigeeli, valmistetaan ristiinkytkemällä dekstraanifraktiot epikloorihydriinin kanssa, valm. Pharmacia Fine Chemicals AB), Bio-Gel P-2:lla (geelihelminen ristiinkytketty synteettinen polymeerikoostumus, perustana metyleeni-bis-ak-ryyliamiini-kopolymeeri, valm. BIO-RAD Laboratories) tai Bio-Beads S-X3:lla (huokoinen styreeni-divinyyli-bentseeni-kopolymeeri, helmet geelipermeaatioon, molekyylipaino noin 2000, valm. BIO-RAD Laboratories) (f) pylväs- tai ohutkerroskromatografia selluloosalla, Avicel SF:llä (selluloosa-TLC-levy, valmistaja American Viscose Corp.), DEAE-Cellu-lose Whatman DE-32.:lla (dietyyliamino-etyyli-selluloosahartsi, valmistaja Whatman Ltd.), DEAE-Sephadex A-25:llä (dietyyliaminoetyyli-poly-sakkaridiiaihartsi, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals AB), piihappo-geelillä tai alumiinioksidilla; ja (g) saostetaan lisäämällä liuotinta kuten asetonia jne.

Antibiootti PS-5:n käyttäytymistä talteenotto- ja eristysmene-telmissä voidaan tutkia määrittämällä antibiootti PS-5 biokoe-menetel-mällä ja bioautografiällä, jotka esitetään myöhemmin.

Edellä esitetyllä tavalla voidaan saada antibiootti PS-5:n tunnusmerkit, jotka on esitetty seuraavassa.

Antibiootti P3-5:n fysikokemialliset ominaisuudet (1) Liukoisuus

Antibiootti PS-5 on veteen liukeneva pH-arvossa 6-9· Tälle antibiootille on ominaista, että se ei ole ainoastaan veteen liukeneva pH-arvossa 7 vaan se liukenee myös heikosti happamaan vesipitoiseen väliaineeseen, jonka pH on säädetty 6:ksi tai korkeammaksi kuin 6 lisäämällä esimauiksi kloorivetyhappoa, ja se liukenee heikosti alkali-seen vesipitoiseen väliaineeseen, jonka pH on säädetty alle 9 lisäämällä 'esimerkiksi natriuravetykarbonaattia tai natriumhydroksidia.

Tämä antibiootti on pääasiassa liukenematon etyyliasetaattiin ja bentseeniin pH-arvon ollessa yli !+.

ib 5981 3 (2) Ohutkerroskromatografia (TLC)

Antibiootti PS-5 (natriumsuola) antoi seuraavat Rf-arvot kun sitä testattiin seuraavilla TLC-levyillä ja liuottimilla. Liuotin-seosten liuotinsuhteet, joita käytettiin, on esitetty tilavuus/tilavuus suhteena ellei toisin ole mainittu.

(a) Avicel® SF selluloosa-ohutkerroslevy (Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) n-butanoli/etanoli/vesi (7/7/6) Rf = 0,9^- i-propanolia/vesi (7/3) Rf = 0,96 (b) Esipäällystetyt piihappogeeli-levyt 60 F2^ (E. Merck) etanoli/vesi (7/3) Rf = 0,82 n-propanoli/vesi (7/3) Rf - 0,77 (3) Paperikromatografia

Antibiootti PS-5 (natriumsuola) antaa seuraavat Rf-arvot, kun käytetään Toyo suodatinpaperia No 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd) ja alaspäin kulkeva paperikromatografia kehitetään seuraavilla liuottimilla: n-propanoli/vesi (7/3) Rf = 0,68 n-propanoli/i-propanoli/vesi (7/7/6) Rf = 0,70 asetonitriili/vesi (8/2) Rf = 0,36

asetonitriili/tris/EDTA

(huomautus 1) Rf = 0,3^ etanoli/vesi (7/3) Rf = 0,63

Huomautus 1: Liuotinseos koostuu 120 ml:sta asetonitriiliä, 30 ml:sta pH 7,5 1/10 M tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani-kloorivety- happo-puskuria ja 1 ml:sta pH 7,5 1/10 M etyleenidiamiini-tetra-etik- kahapon natriumsuolaa.

(*+) Suurjänni tepaperi-elektroforeesi

Seuraava käyttäytyminen on havaittu, kun antibiootti PS-5:ä (natriumsuola) on tutkittu elektroforeesina Toyo-suodatinpaperilla No 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) käyttämällä suurjännitepaperi-elektro-foreesilaitetta (Savant Instruments Inc., High Voltage Power Supply HV 3000A, Flat Plate Electrophoresis Chamber FP18A): ainakin 5 mm:n, tavallisesti 10-^0 mm:n migraatio anodille kuormittamalla 30 minuutin ajan potentiaaligradientilla, jonka suuruus on M-2 volttia per cm pH--arvossa 8,6 puskurin koostuessa 3000 ml:sta vettä, 3,3 g:sta veronaa-lia ja 25,5 g:sta natriumveronaalia.

(5) Happamuus

Antibiootti PS-5 on yksiemäksinen happo, sillä on yksi karbok-syylihappo molekyylissä.

15 5981 3 (6) UV-absorptiospektri

Antibiootin PS-5 (natriumsuola) karakteristinen UV-absorptio-maksimi on seuraava: Λ H2° = 301 nm * raaks (7) IR-absorptiospektri

Antibiootti PS-5:n (natriumsuola) karakteristiset IR-absorptio-maksimit laskettu KBr-tablettimenetelmän mukaan, ovat seuraavat: noin 1750 cm-1 (-C0- /3-laktaamirenkaassa) noin 1650 cm"'*' (-C0- amidi) noin 16*40- 15^0 cra-^ (-C00®) (8) Protoni-NMR-spektri

Antibiootti PS-5 (natriumsuola) antaa seuraavat karakteristiset signaalit 100 Mhz:n protoni-NMR-spektrissä mitattaessa D20:ssa.

(i) tripletti, keskusta noin 1,06 ppm:n kohdalla, kytkeytyrais-vakio noin 7,5 Hz (CH^-CH^) (ii) multipletti noin 1,72-2,00 ppm (CH^-CH2-) (iii) terävä singletti noin 2,05 ppm (CH^-CO-)

J I

(iv) multipletti noin 2,88-3*58 ppm (CH0, -CH-) N ^ (v) multipletti noin 3,92—*+,20 ppm (-CH-) (9) Ominaiskierto — -22 I 0Λ + 77,3 (C, 1,59, 0,01 M pH 8 natriumfosfaatti-puskuri)

L JD

(10) Molekyylipaino ja molekyylikaava

Molekyylipaino on noin 298 (laskettu tuloksista, jotka on saatu korkean erotuskyvyn massaspektrometrillä antibiootti PS-5:n metyyli-esterille). Molekyylikaava on:

C13H18N2V

(11) Värireaktio

Erlich-reagenssi-reaktio positiivinen

Jodi-klooriplatinahappo-reaktio positiivinen

Ninhydriini-reaktio negatiivinen • Edellä esitettyjen fysikokemiallisten ominaisuuksien perusteella on tarkasti näytetty toteen, että ryhmät CH^-CH2-, CH^CO-, , 59813 16 I ? '-( -CH-2-, -CH-, -CH-, I , -NHCO- ja COO® esiintyvät antibiootin & ^ PS-5 (natriumsuola) molekyylissä.

Antibiootti PS-5in trietyyliesterin alkuaineanalyysi paljastaa rikin läsnäolon. UV-absorpticmaksimin ja -minimin arvot kuten myös niiden absorbanssisuhde ja ekstinktiokerroin tukevat tienamysiinirakenteen läsnäoloa molekyylissä. Tämän vahvistaa tosiasia, että UV-absorptio-maksimi siirtyy 301 nm:stä 315 nm:iin esteröitaessa karboksyyliosa (16th Interscience Conference on Antimicrobial Agent & Chemotherapy, Chicago, Oct. 29, 1976).

Edellä esitettyjen todisteiden perusteella on oletettavissa, että antibiootti PS-5:llä on seuraavanlainen molekyylirakenne:

,s-ch2-ch2-nh-co-ch, ch3-ch2-X J

S-N -'\ 0 ^ COOH >

Lisätodisteet tukevat tätä, kuten myöhemmin esitetään (esimerkki 9), antibiootti PS-5 antaa 13 signaalia ^C-NMR-spektrissä ja niiden kemialliset siirtymät ovat yhtäpitäviä edellä esitetyn rakenteen kanssa verrattaessa tienamysiinin arvoihin.

Vaikka antibiootti PS-5 on pysymätön, kun se eristetään huoneen lämpötilassa, se on melko pysyvä alemmassa lämpötilassa esimerkiksi alle 0°C:n, erityisesti alle -10°C:n. Se on melko pysyvä vesipitoisessa liuoksessa neutraalissa ja heikosti alkalisessa pH:ssa. Ainakin 50 % ja tavallisesti yli 70 % antibiootti PS-5:n antibioottisesta aktiviteetista on jäljellä vähintään 15 minuutin kuumentamisen jälkeen 60°C:ssa vesipitoisessa liuoksessa neutraalissa ja heikosti alkalisessa pHsssa, joka on alle 9.

Tienamysiini-tyyppiset tunnetut /3-laktaamiantibiootit yleensä eroavat antibiootista P3-5, koska niillä esiintyy hydroksyloitu funktio etyylisivuketjussa, joka joissakin tapauksissa on esteröity rikkihapolla. Lisäksi itse tienamysiinillä on amiinisivuketju deasetyloitu ja MM ^550:llä ja MM 13902:11a on systeamiininen sivuketju tyydyttämätön.

Antibiootti PS-5:n biologiset ominaisuudet (1) Antibioottinen spektri Tämän keksinnön antibiootti P3-5, jolla on laaja antibioottinen aktiviteettispektri,osoittaa hyvin voimakasta aktiviteettia eri bakteereita vastaan, esimerkiksi gram-positiivisia bakteereita vastaan, jotka kuuluvat sukuihin Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, 17 5981 3

Sareina ja Bacillus ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan, jotka kuu luvat sukuihii Alcaligenes ja Comamonas. Tämän keksinnön antibiootti PS-5: llä on myös hyvä aktiviteetti gram-negatiivisia bakteereita vastaan, jotka kuuluvat sukuihin Escherichia, Klebsiella ja Proteus.

Antibiootti PS-!? osoittaa voimakasta aktiviteettia gram-negatiivisia bakteereita vastaan, jotka ovat resistenttejä antibiooteille, joilla on ^/3-laktaamirengas-rakenne, esim. tällaisia bakteereita kuuluu sukuihin Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella ja Serratia.

(2) Synergistinen vaikutus muiden antibioottien antibioottiseen aktiviteettiin /3-laktamaasia tuottavia bakteereita vastaan Tämän keksinnön antibiootti PS-5:llä on kyky lisätä muiden antibioottien, erityisesti /3-laktaami-antibioottien kuten penisilliinien ja kefalosporiinien, antibioottista aktiviteettia /3-laktamaasia tuottavia bakteereita vastaan, joita ovat esimerkiksi Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes ja Serratia marcescens. Aktiviteettien yhdistämisellä on useimmissa tapauksissa tehostava vaikutus.

(3) Aktiviteetti in vivo

Antibiootti PS-5:llä on huomattava terapeuttinen vaikutus, kun sitä annetaan hiirelle, joka ori infektoitu patogeenisellä gram-positii-visella bakteerilla, joka esim. kuuluu sukuun Staphylococcus, Diplo-coccus, Streptococcus, Sareina tai Bacillus.

(*+) Myrkyllisyys

Antibiootti PS-5 ei aiheuta kuolemaa testieläimillä, kun sitä annetaan intraperitonaalisesti hiirelle annoksena, jonka suuruus on 500 mg/kg.

Antibiootti PS-5:n suolat

Koska antibiootti PS-5 on jonkin verran labiili, kuten edellä esitettiin, talteenotto- ja eristysmenetelmät on suoritettava huolellisesti. Koska antibiootti PS-5 on yleensä pysyvämpi suoiamuodossa kuin vapaana happona, käytetään mieluimmin suolamuotoa silloin, kun yhdistettä käytetään färmaseut-seen käyttöön, ja kun sitä käytetään välituotteena syntetisoitaessa johdannaisia ja eristysvaiheen aikana. Edellä esitettyyn suoiamuotoen sisältyvät esim. seuraa-vat: alkalimetallisucilat kuten natriumsuola, kaliumsuola tai litium suola; maa-alkälime-tallisuolat kuten telsiumsuola tai magnesiumsuola ; rmut metallisuolat kuten alumiini-suola; ammoniumsuda suolat primäärisen, sekundäärisen tai tertiäärisen amiinin kanssa kuten monoetyyliamiini, dimetyyliamiini, tiietyyliamiini, m one etanoli amiini tai di-etanoliamiini; ja suolat orgaanisen emäksen kanssa kuten bentsatiini tai prokaiini. Sopivia suoloja ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ts. suolat, joidai kationit eivät vaikuta epäedullisesti vapaan hapen farmakologisiin ja toksikologisiin ominaisuuksiin. Erityisen sopivia ovat alkalimetallisuolat kuten ratrium- tai kaliumsuolat.

3eu rasvat esimerkit -oivaavat ko. keksintöä. Niissä sntimikro öisen aktiviteetin kvantitatiivi- ja kvalitatiivikokeet perustuvat seuraaviin menetelmiin: 18 5981 3 (1) Antimikrobisen aktiviteetin biologinen määritys

Ravintoagarin pinnalla yön yli kasvatettua Comamonas terrigena B-996:a suspendoitiin ravintoliuokseen niin että saatiin optinen solu-tiheys, joka oli 0,0^0 610 nm:ssä.

Ymppisuspensiota lisättiin 1 %iiin nouseva määrä sulaan agar-väliaineeseen, joka sisälsi 0,8 % Kyokuto Nutrient Broth Powder'ia (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) ja 1,0 % Bacto-agaria (Difco Laboratories). Seitsemän millilitraa ympättyä sulaa agarväliainetta levitettiin petrimaljalle (9 cm halkaisijaltaan) ja annettiin jähmettyä. Täten valmistettiin Comamonas koelevy.

Staphylococcus aureus FDA 209P:tä kasvatettiin yön yli ravinto-liemessä ravistaen ja laimennettiin 50-kertaiseksi ravintoliemessä, jolloin saatiin ymppisuspensio. 1 % (til./til.) ymppisuspensiota sekoitettiin hyvin sulaan agarväliaineeseen, joka sisälsi 1 % Kyokuto Nutrient Broth Powder'ia (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) ja 1 % Bacto-agaria (Difco Laboratories). Seitsemän millilitraa ympättyä sulaa agarväliainetta kaadettiin petrimaljalle (9 cm halkaisijaltaan) ja annettiin hyytyä. Täten valmistettiin Staphylococcus koe-levy.

Samalla tavalla valmistettiin Alcaligenes koe-levy. Yön yli ravintoagarin pinnalla viljeltyä Alcaligenes faecalis B-326:a suspendoitiin ravintoliemeen, jolloin saatiin ymppisuspensio, solukonsen-traatio säädettiin optiseen tiheyteen, joka oli 0,020 610 nrarssä. Agarväliaine, joka muodostui 0,5 $:sta Kyokuto Nutrient Broth Powder'ia (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) ja 1 $:sta Bacto-agaria (Difco Laboratories), sulatettiin sopivassa lämpötilassa ja ympättiin 1 $:lla ymppisuspensiota. Seitsemän millilitraa ympättyä sulaa agarväliainetta jaettiin 9 cm:n petrimaljalle ja annettiin hyytyä. Näin valmistettiin Alcaligenes koe-levy.

8 mm tulppakiekko, joka tavallisesti imeytettiin tutkittavalla näyteliuoksella, jätettiin puhtaalle suodatinpaperille joksikin aikaa ylimääräisen liuoksen poistamiseksi ja sen jälkeen se siirrettiin koe--levylle. Inkuboitiin 35°C:sessa 20 tuntia, jonka jälkeen havaittu estovyöhyke mitattiin ja sitä verrattiin kefaloridiinin standardiliuok-siin. Antibiootti PS-5:n ja siitä saatavien yhdisteiden antimikrobinen aktiviteetti on ilmaistu kefaloridiini-ekvivalenttiyksikköinä/ml.

Erityisesti tämän keksinnön antibiootti PS-5:n ja siitä saatavien yhdisteiden liuos, jolla on sama halkaisija estovyöhykkeellä kuin 100 ^ig/ml kefaloridiinia on ilmaistu 100 kefaloridiini-yksikköä/ml Samalla tavoin kun tämän keksinnön antibiootti PS-5:llä tai siitä saatavien yhdisteiden kiinteällä näytteellä on konsentraatiolla 1 mg/ml sama halkaisija kuin 1 jag/ml kefaloridiinia, kiinteän näytteen spesi- 19 5981 3 finen aktiviteetti on esitetty 1 kefaloridiini-yksikköna/mg. Kuten alan ammatti-ihmiset hyvin tietävät, koe-standardikäyrät vaihtelevat jossain määrin riippuen koe-mikro-organismin lajista. Koe-mikro-organismien lajien erittelemiseksi käytettiin seuraavaa yksikkö ilmaisutapaa: Comamonas-kefaloridiiniyksikkö (lyhennetty CCU); Staphylococcus-kefa-loridiini-yksikkö (lyhennetty SCU) ja Alcaligenes-kefaloridiini-yksikkö (lyhennetty ACU).

(2) Bio-autografia

Suuri koelevy valmistettiin kuten edellä esitettiin (1) paitsi, että 100 ml ympättyä sulaa agarväliainetta kaadettiin suorakulmaiseen maljaan 32 x 2b cm 9 cm:n petrimaljan sijasta.

Tutkittava paperikromatogrammi asetettiin 15 minuutiksi mainitulle suurelle koelevylle. Sen jälkeen, kun paperi oli poistettu, koe-levyä inkuboitiin 35°C:sessa 20 tuntia, jolloin estovyöhyke (-vyöhykkeet) ilmaantui. Tällä tekniikalla voidaan laskea Rf-arvo(t) (kvalitatiivinen koe) sekä myös määrittää antimikrobinen aktiviteetti (puoli-kvantitatiivinen koe) kehän koon perusteella.

Käytettäessä TLC-levyä, ohut paperiarkki asetettiin TLC-levyn ja koelevyn pinnan väliin. Samanlaista menetelmää käytettiin kvalitatiivisessa ja puoli-kvantitatiivisessa kokeessa.

Esimerkki 1 500 ml:n erlenmeyerpullo, jossa oli seuraavaa ymppikasvatusväli-ainetta (SE-1*), steriloitiin 120°C:sessa 15 minuuttia. Hyvin itiöitä muodostavaan Streptomyces sp. A271 pintaviljelmään lisättiin 10 ml 0,02 %:st& Tween-80:tä (pinta-aktiivista ainetta Atlas Power Corp.) ja seosta sekoitettiin varovasti jolloin saatiin itiösuspensio. 500 ml:n erlenmeyerpullo ympättiin yhdellä millilitralla itiösuspensiota ja ravistusviljeltiin 28°C:sessa ^8 tunnin ajan pyörivässä ravisteli-jassa (200 kierrosta/minuutti; ympyrän säde 3,5 cm). Sen jälkeen 2 ml ymppiviljelmää siirrostettiin jokaiseen kuuteen 500 ml:n erlenmeyer-pulloon, jossa jokaisessa oli 100 ml alla esitettyä tuotantoväliai-netta ja ravistusviljeltiin 28°C:sessa *+8 - 96 tuntiin pyörivässä ravisteli jassa .

Ymppiviljelyväliaine (SE-^f)

Lihauutetta (Difco Laboratories) 0,3 % (p./til.)

Bacto-tryptonia (Difco Laboratories) 0,5

Glukoosia 0,1

Liukenevaa tärkkelystä' - 2,*+

Hiivauutetta 0,5 20 oy o \ 5

Kalsiumkarbonaattia 0,*+ %

Rasvatonta soijapapujauhoa 0,5 pH 7,5 ennen sterilointia; pH 7,1 steriloinnin jälkeen; pH 7»*+ kahden päivän käymisen jälkeen.

Tuotantantoväliaine (1) AG-1 väliaine

Glukoosia 1,5 $ Cp./til.)

Maissitärkkelystä 2,5

Maissiuutetta 2,0

Kuivaa hiivaa 1,0 D,L-metioniinia 0,1

CoCl2-6H20 0,00013 pH 7,2 ennen sterilointia; pH 6,1 steriloinnin jälkeen; pH 7,8 neljän päivän käymisen jälkeen (2) AGA-2-väliaine

Glukoosia 1,5 % Cp./til.) perunatärkkelystä 2,5

Mallasuutetta 2,0

Kuivaa hiivaa 1,0

CoCl2-6H20 0,00013 pH 6,5 ennen sterilointia; pH 5,8 steriloinnin jälkeen; pH 7,8 neljän päivän käymisen jälkeen (3) AGB-1-väliaine

Maltoosia 3,0 % Cp./til.)

Mallasuutetta 1,0

Kuivaa hiivaa 1,0

CoC12-6H20 0,0001 pH 6,5 ennen sterilointia; pH 5,9 steriloinnin jälkeen; pH 7,9 neljän päivän käymisen jälkeen (U·) AGB-^-l-väliaine

Maltoosia 5,0 % Cp./til.)

Liukenevaa tärkkelystä 1,0

Gyserolia 0,3

Kuivaa hiivaa 2,5

NaCl 0,5 Κ2ΗΡ0^ 0,05

MgS01+-7H20 0,05

CaC03 0,3

CoCl2-6H20 0,00013 21 5981 3 pH 7,0 ennen sterilointia; pH 6,9 steriloinnin jälkeen; pH 7,9 neljän päivän käymisen jälkeen (5) ML-19-väliaine

Glyserolia ^,0 % (p./til.)

Peptönia 0,5?

Glukoosia, 0,2

Perunatärkkelystä 0,2

Rasvatonta soijapapujauhoa 0,5

Kuivaa hiivaa 0,5

NaCl 0,5

CaC03 0,2 pH 6,H- ennen sterilointia; pH 7,0 steriloinnin jälkeen pH 7,0 neljän päivän käymisen jälkeen (6) AGO-l-väliaine

Soijapapuöljyä 3,0 % (p./til.)

Kuivaa hiivaa 2,0

NaCl 0,5 κ2ηρο^ 0,05

MgS01+*7H20 0,05

CaC03 0,3

CoC12-6H20 0,00013 pH 7,0 ennen sterilointia; pH 7,2 steriloinnin jälkeen; pH 7,2 neljän päivän käymisen jälkeen.

Liemisuodoksen antibioottinen aktiviteetti määritettiin edellä kuvatulla kiekkokokeella, jossa käytettiin kantoja Comamonas terrigena B-996, Staphylococcus aureus 209P ja Alcaligenes faecalis B-326. Havaitut tulokset 72 tunnin kuluttua siirroksesta olivat seuraavat:

Taulukko5

Antibioottinen teho Väliaine_CCU/ml_SCU/ml_ACU/ml___ AG-1 105 1,1 *+20 AGA-2 72 1,1 *+20 AGB-1 105 0,9 3^0 AGB-^l 185 8,9 ^*+0 ML-19 · 60 1, *+ 122 AGO-1 67 0,9 3^0 5981 3 22

Esimerkki 2

Sata millilitraa ymppiviljelmää, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 1, siirrostettiin 30 litran käymisastiaan, joka sisälsi 15 litraa ML-19-väliainetta (esim.l) ja jota viljeltiin 2Ö°C:ssa samalla pai-neilmastaen 96 tuntia pyörimisnopeuden ollessa 200 kierrosta minuutissa, steriiliä ilmaa johdettiin liuokseen 7,5 litraa/minuutti. Siliko-niöljyä (Silicone KM-75, Shin-Etsu Chemical Industries Co. Ltd.) käytettiin kuohumista estävänä aineena konsentraatiossa 0,05 %· Kaymis-liemi kerättiin ja sentrifugoitiin alla esitettyinä aikoina. Liemi-suodoksen antibioottinen teho oli seuraava:

Taulukko 6

Aika Teho (CCU/ml) pH-arvo 2b tuntia 19 7,0 1+8 1+8 7,2 72 72 7,1 96 59 7,0

Esimerkki 3 Käyttäen esimerkissä 1 kuvattua menetelmää, viljeltiin Strepto-myces sp. A271 kantaa 500 ml:n erlenmeyerpullossa, jossa oli 100 ml SE-,-i+-väliainetta (esim. 1)T ja tämän jälkeen siirrostettiin 30 litran käymisastia joka sisälsi 15 litraa SE-^-väliainetta. Viljeltiin 28°C:sessa 2b tuntia, nopeudella 200 kierrosta/minuutti, samalla paineilmastaen 7,5 litraa/minuutti, yksi litra tätä ymppiviljelmää kaadettiin 200 litran ruostumattomaan teräksiseen käymisaltaaseen, jossa oli 100 litraa ML-19-vä-liainetta. Käymisallasta ilmastettiin samalla ravistaen 28°C:sessa 72 tuntia 100 kierrosta/minuutti, ilmastusnopeus oli noin 50 litraa/ minuutti. Alussa pH oli 7,0 kun se lopussa oli 7,1· Liemeen sekoitettiin 5 % (p./til.) perliittiä (Topco Perlite, Topco No. 3*+, Toko Perlite Kogyo K.K.) ja suodatettiin suodatuspuristimen läpi, jolloin saatiin 80 litraa liemisuodosta. Kirkkaan nesteen antibioottinen teho oli 60 CCU/ml.

Esimerkki b

Aktiivihiilellä puhdistetun antibioottikcnsentraatin valmistaminen Esimerkin 1 mukaisesti inkuboitiin kymmentä 500 ml:n erlenmeyer-pulloa, joissa jokaisessa oli 100mlHL-19-väliainetta (esim. 1), 72 tuntia samalla ravistellen. Yhdistettyyn liemeen lisättiin 2 % (p./til.) per-liittiTsuodatusainetta (Topco Perlite, Topco No 3*+, Toko Perlite 23 5981 3

Kogyo K.K.) ja suodatettiin btichnersuppilon läpi, jolloin saatiin 800 tai liemisuodosta. Sen jälkeen, kun oli varmistuttu siitä, että pH oli alueella 7-8, lisättiin 16 g aktiivihiiltä (Charcoal Activated, Shirasagi; Takeda Chemical Industries, Ltd.) ja sekoitettiin 15 minuutin ajan. Aktiivihiili kerättiin sentrifugoiraalla; pestiin 800 ml;11a tislattua vettä, jonka jälkeen sentrifugoitiin. Käin talteen saatu aktiivihiili eluoitiin U-00 ml; 11a 50 $:sta (til./til.) asetonia samalla sekoittaen huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Näin saatu sakan yläpuolella oleva liuos (eluaatti)(52 CCU/ml) konsentroitiin 50 ml:ksi lämpötilan ollessa 30-35°C pyöröhaihduttimessa. Konsentraatin antibioottinen tiitteri oli 800 CCU/ml.

Seuraavat kokeet suoritettiin, jotta osoitettaisiin, että tämän keksinnön antibiootti PS-5 on erilainen kuin MMU-550 (kompleksi), joka on todettu beta-laktamaasi-inhibiittoriksi julkaisuissa FI-pat. 55 351 ja 55 352.

Kolmea kantaa Strepmyces olivaceus ATTCC 31126;ta (= ATCC 21379/M3), ATCC 2138Ο;tä ja ATCC 213Ö2;ta viljeltiin 28°C;ssa 72 tuntia pyörivässä ravistelijassa 500 ml:n erlenmeyerpullossa, jossa oli 100 ml seuraavanlaista väliainetta;

Soijapapujauhoa (ESSAN-M (Special grade);

Ajinomoto Co., Ltd.) 1,0 %

Glukoosia 2,0

CaCO^ 0,2

CoC12*6H20 0,001 pH 7»0 ennen sterilointia.

Suodatetun liemen antibioottinen aktiviteetti adsorboitiin aktiivihiileen, joka pestiin vedellä ja eluoitiin 50 $;lla asetonilla. Näin saatu eluaatti konsentroitiin pieneen tilavuuteen alennetussa paineessa ja pantiin alaslaskeutuvalle paperikromatografille alla esitetyissä olosuhteissa:

Suodatinpaperi: Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Kaisha • Ltd.)

Liuotinsysteemi; (80$ asetonitriili/tris/EDTA-systeemi) asetonitriiliä : 120 ml 2lf 5981 3 M/10 tris(hydroksimetyyli)-aminome- taani-kloorivetyhappoa (pH 7,5) : 30 ml M/10 tetra-natrium-etyleenidiamiini- -tetra-asetaattia (pH 7,5) : 1 ml R^-arvot saatiin bio-autografiällä edellä mainituissa olosuhteissa Comamonas terrigena B-996:lla.

Samalla tavalla kuin edellä mainittuja kolmea Streptomyces olivaceus-kantaa, viljeltiin tämän keksinnön kantaa Streptomyces sp. A271 väliaineessa, jossa oli glyserolia *+,0 glukoosia 0,2 peptonia 0,5 %, perunatärkkelystä 0,2 rasvatonta soijapapujauhoa 0,5 %, kuivaa hiivaa 0,5 %, NaCl 0,5 % ja CaCO^ 0,2 % (pH 6,^ ennen sterilointia). Jälkikäsittely ja kokeet olivat samat kuin edellä esitettiin.

Bio-autograafiset kokeet osoittivat, että antibiootti PS-5, tämän keksinnön Streptomyces sp. A271:n tuote, on uusi tuote, joka eroaa R^-arvonsa perusteella MMlf550:sta (kompleksi), joka oli julkaistu edellä mainituissa FI-patenteissa.

Esimerkki 5 DIAION HP20:llä saadun, konsentroidun antibiootti P3-5:n eluaatin valmistaminen

Esimerkin 1 mukaisesti käytettiin 15 litraa ML-19-väliainet-ta 150 pullossa 2 tuntia. Kerättyyn liemeen lisättiin 100 mg· dinatrium-etyleenidiamiini-tetra-asetaattia ja 2 % (p./til.) Topco Perlite'ä, Topco No 3^, ja suodatettiin suuren biichnersuppilon läpi, jolloin saatiin 1^,1 litraa liemisuodosta (pH 7,9). Tämä kaadettiin DIAION HP20--pylvääseen, 7 x 50 cm, (suuri huokoinen styreeni ja divinyylibentsee-ni-kopolymeeri helmien muodossa, jolla on suuri makroverkkorakenne, valmistaja Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) pestiin 7 litralla tislattua vettä ja eluoitiin 50 #:lla (til./til.) metanolilla. Antibioottisen aktiviteetin eluointi tapahtui seuraavasti (taulukko 7)’ 25 5 9 8 1 3

Taulukko 7

Liemisuodoksen aktiviteetti : *+0 CCU/ml x l*+,000 ml

Eluaatti no Tilavuus (ml) Teho (CCU/ml) 1 1,000 0 2 500 0 3 500 0 1+ 50 19 5 50 37 6 50 72 7 50 150 8 50 270 9 50 850 10 50 870 11 50 300 12 50 270 13 50 230 ib 50 200 15 50 170 16 50 125 17 50 105 18 50 87 19 50 75 20 50 60 21 50 b8 22 50 38 23 50 27 2b 50 18 25 50 1^ 26 50 10 27 50 0 28 50 0 29 50 0

Eluaatit 8 - 1^ yhdistettiin, konsentroitiin 100 ml:ksi lämpötilan ollessa alle 30°C pyöröhaihduttimessa ja sen jälkeen pakaste--kuivattiin, jolloin saatiin 2,6 g kellertävän ruskeata jauhetta, jonka teho oli 5b CCU/mg.

Näin saatu kellertävän ruskea jauhe liuotettiin tislattuun veteen konsentraatioon 500 CCU/ml.

Fosfaattipuskuriliuokset, joilla oli tarvittavat pH-arvot, voitiin valmistaa säätämällä M/15.dikaliumfosfaattia haluttuun pH-arvoon. 5 N natriumhydroksidilla tai 5N fosforihapolla. Yhteen millilitraan antibiootti, PS-5:n liuosta lisättiin 1 ml fosfaattipuskuria, tarvittaessa pH-arvo säädettiin uudelleen alkuarvoon. Antibiootti PS-5:n liuoksia, joilla oli eri pH-arvot, pidettiin 60°C:sessa 30 minuuttia 26 5981 3 vesihauteessa, jäähdytettiin juoksevan veden alla ja neutraloitiin pH-arvoon 7,0 pienellä määrällä 5 N natriumhydroksidia tai 5 N fosfo-rihappoa.

Koeputki, jossa oli antibiootti PS-5:n liuosta, jonka pH oli 7,0., laitettiin jäähauteeseen 30 minuutin ajaksi, jäljelle jäänyt anti-mikrobinen aktiviteetti määritettiin edellä esitetyllä tavalla, käyttäen Comamonas terrigena B-996:ta koemikro-organismina. Tulokset, jotka on esitetty seuraavassa taulukossa, laskettiin,· vertaamalla alkuperäiseen aktiivisuuteen: pH 3,0 »f,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Jäljellä oleva ak- 0 0 9,0 79,0 76,5 88,5 82,0 tiviteetti (*) Nämä tulokset osoittavat, että tässä esimerkissä saatu kellertävän ruskea jauhe on melko pysyvä pH-arvossa 6,0 - 9,0 30 minuutin ajan 60°C:sessa. Lisäksi antibiootti PS-5:n pysyvyys näyttää kasvavan alemmassa lämpötilassa jopa happamassa pH:ssa. Esimerkiksi sen jälkeen kun antibiootti PS-5:ä oli käsitelty pH-arvossa 3,0 5 minuutin ajan -17°C:sessa, ainakin 30 % alkuperäisestä antibioottisesta aktiviteetista oli yhä havaittavissa.

Esimerkki 6

Uuttaminen alhaisessa lämpötilassa n-butanolilla

Suuri koeputki, jossa oli 20 ml tislattua vettä, 12 ml n-buta-nolia ja 7 g natriumkloridia, jäähdytettiin -17°C:sessa, jäädyttämättä. Esimerkissä 5 saatua antibiootti PS-5:n kellertävän ruskeaa jauhetta laimennettiin konsentraatioon 200 mg/ml tislatussa vedessä ja esijääh-dytettiin. Yksi millilitra antibiootti PS-5:n kylmää liuosta lisättiin edellä mainittuun koeputkeen ja nopeasti säädettiin pH-arvoon 2,75, 3,0 tai 3,25 rikkihapolla samalla seoksen lämpötila pidettiin alle -10°C:sen. Sen jälkeen, kun seos oli sekoitettu kunnolla, n-butanoli-kerros otettiin talteen ja sekoitettiin hyvin 5 ml:n kanssa 0,5 M fosfaattipuskuria (pH 6,8), jolloin aktiivinen komponentti siirtyi vesipitoiseen kerrokseen. Vesipitoisen liuoksen bio-kokeesta saatiin seuraavanlainen uutettavuus antibiootti PS-5:lle, joka oli saatu kellertävän ruskeasta jauheesta: 27 5 981 3 pH uuttoprosentti 2,75 35 % 3,00 32 3,25 16

Esimerkki 7 QAE-Sephadex-käsittelyllä saadun jauheen valmistaminen

Samalla menetelmällä kuin esimerkissä 5, saatiin 27,7 g antibiootti PS-5:n kellertävän ruskeata jauhetta 100 litrasta liemisuodos-ta pakaste-kuivaamisen jälkeen. Tämä jauhe (spesifinen aktiviteetti 13,2 CCU/mg) liuotettiin 30 ml:aan 25 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8) ja laitettiin QAE-Sephadex A-25-pylvääseen (täysin kvaternäärinen vahr vasti emäksinen anioni-ioninvaihtohartsi, joka valmistettiin liittämällä dietyyli-2-hydroksipropyyli-ammoniumryhmiä dekstraanigeeliin; valmistaja Pharmacia Fine Chemicals AB) (3,3 x 25,0 cm), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Sen jälkeen kun se oli pesty pienellä määrällä samaa fosfaattipuskuria, aktiviteetti eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi natriumkloridia, natriumkloridikonsentraatio muuttui lineaarisesti nollasta 0,5 H eluoinnin aikana. Aktiivinen fraktio (300 ml) jäähdytettiin 0°C:seen ja käsiteltiin 6 g aktiivi-hiiltä. Aktiivihiili kerättiin, pestiin vedellä ja eluoitiin 50 (til./til.) asetonilla. Sen jälkeen, kun asetoni oli poistettu haihduttamalla lämpötilassa, joka oli alle 30°C, 727 mg ruskehtavan keltaista antibiootti PS-5:n natriumsuolajauhetta otettiin talteen lyo-filisoimalla. Tämän valmisteen spesifinen aktiviteetti oli 26^ CCU/mg. Esimerkki 8 DEAE-selluloosalla puhdistetun PS-5-jauheen valmistaminen

Esimerkissä 7 saatu ruskehtavan keltainen antibiootti PS-5:n jauhe (727 mg) liuotettiin 1 ml:aan 25 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8) ja kaadettiin Bio-Gel P-2-pylvääseen (1,5 x 27,0 cm) (geelihelminen ristiinkytketty synteettinen polymeerikoostumus, perustana metyleeni-bis-akryy-liamiini-kopolymeeri; valmistaja BI0-RAD Laboratories), joka oli tasa-painoitettu samalla fosfaattipuskurilla. Kehittämällä samalla fosfaattipuskurilla, saatiin aktiivinen fraktio (15 ml).

Näin saatu aktiivinen fraktio laitettiin sen jälkeen dietyyli-aminoetyyli(DEAE)selluloosa-(DE32) pylvääseen (Whatman Ltd.) (2,5 x 28,0 cm), joka oli tasapainoitettu samalla fosfaattipuskurilla. Elu-ointi suoritettiin natriumkloridin lineaarisella gradientilla samassa 28 5981 3 fosfaattipuskurissa, nollasta 0,5 M:iin. Talteenotettu aktiivinen fraktio (2^0 ml) adsorboitiin *+,5 g:lla aktiivihiiltä lämpötilassa 0°C. Aktiivihiili kerättiin suodattamalla, pestiin vedellä ja eluoitiin 50 itsellä (til./til.) asetonilla. Asetonieluaatti haihdutettiin alle 30°.C:ssa, kunnes ei enää havaittu asetonia ja sen jälkeen lyofilisoi-tiin, jolloin saatiin 120 mg ruskehtavan valkoista antibiootti PS-5:n natriumsuolajauhetta. Tämän valmisteen spesifinen aktiviteetti oli 600 CCU/mg.

Esimerkki 9

Hyvin puhdistetun antibiootti PS-5:n valmistaminen

Kaksi 200 litran ruostumatonta terästä olevaa käymisallasta täytettiin kumpikin 100 litralla ML-19-väliainetta, joka sisälsi 2,5 % rasvatonta soijapapujauhoa, steriloitiin, ympättiin Streptomyces sp. A271:llä samalla tavalla kuin esitettiin esimerkissä 3? ja annettiin käydä 72 tuntia samalla ilmastaen ja ravistaen. Näiden kahden käymis-altaan sisällöt yhdistettiin, sekoitettiin joukkoon 5 % (p./til.)

Topco Perlite'ä, Topco No. 3^ (Topco Perlite Kogyo K.K.) ja suodatettiin suodatuspuristimen läpi, jolloin saatiin 160 litraa liemisuodos-ta. Tämän suodoksen antibioottinen tiitteri oli 235 CCU/ml.

Tämä liemisuodos laskettiin, pidättelemättä läpi ioninvaihtohart-sipylvään DIAION PA-306 (vahvasti emäksinen anioni-ioninvaihtohartsi, jossa on ristiinlytketty polystyreendrunko ja trimetyyliammctiium kloridi osat; valmistaja Mitsubishi Chemical Industries Ltd., 10 x 52 cm; M-,5 litraa liuotintilavuus). Sen jälkeen kun aktiviteetti oli laskettu mainitun pylvään läpi, se adsorboitiin DIAION HP-20-pylvääseen (1*+ x 97 cm, 15 litraa) ja eluoitiin 75 %:sella metanolilla. Kerätty aktiivinen eluaatti (2 litraa: 9.85*+- CCU/ml) laimennettiin kolme kertaa U· litralla vettä ja kaadettiin 2 litran DIAION PA-306S-pylvääseen (5,5 x 8^ cm). Sen jälkeen, kun oli pesty 500 ml:lla vettä, antibioottinen aktiviteetti eluoitiin 8 litralla lineaarista natriumkloridi-gradient-tia nollasta 3 $:iin ja kerättiin 200 ml:n fraktioihin. Aktiiviset fraktiot numerot 17 - 31 yhdistettiin 2,8 litraksi aktiivista eluaat-tia (*+.120 CCU/ml). Tämä eluaatti kaadettiin sen jälkeen 1 litran DIAION HP-20-pylvääseen (*+ ^5 x 83 cm) ja eluoitiin 3 litralla asetonin lineaarista gradlenttia nollasta 25 %:iin. Jokaisen fraktion tilavuus oli 30 ml. Aktiivinen eluaatti (390 ml: 27.220 CCU/ml) otettiin talteen yhdistämällä antimikrobisesti aktiiviset fraktiot numerot 5^ - 66.

Sen jälkeen, kun asetoni oli poistettu tislaamalla alennetussa 29 '5981 3 paineessa, DIAION HP-20-eluaatti laskettiin 200 millilitran QAE--Sephadex A-25-pylvään läpi (2,5 x *+1 cm). Antimikrobinen aktiviteetti kerättiin 10 ml fraktioihin eluoimalla 2 litralla lineaarista natrium-kloridi-gradienttia (0 - 1,5 %)· Fraktiot, numerot 68 - 8l, yhdistettiin aktiiviseksi eluaatiksi (l^t-O ml; ^2.120 CCU/ml).

Tämän QAE-Sephadex A-25-eluaatin pH säädettiin varovasti arvoon 8,3 1 %·. sella natriumhydroksidilla ja kaadettiin 200 millilitraan DIAION HP-20AG-pylvääseen (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.; 2,5 x ^1 cm). Lineaarinen gradientti-eluointi suoritettiin 1 litralla vesipitoista asetonia nollasta 10 $:iin. Jokaisen fraktion tilavuus oli 10 ml. Fraktiot, numerot *+8 -53, yhdistettiin, jolloin saatiin 60 ml aktiivista eluaattia (^5.000 CCU/ml). Pakaste-kuivattaessa saatiin 2^9 mg keltaista jauhetta (8.000 CCU/mg).

Edelleen puhdistettaessa 150 mg mainittua keltaista jauhetta liuotettiin pieneen määrään 0,01 M natriumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja laskettiin 130 millilitran Sephadex G 10-pylvään läpi (1,5 x 73 cm) (helmenmuotoinen dekstraanigeeli, joka !an valmistettu ristiinkyt-kemällä dekstraanifraktiot epikloorihydriinin kanssa;'Pharmacia Fine Chemicals AB). Antibiootti PS-5 kehitettiin natriumfosfaattipus-kurilla, joka oli 0,01 M ja jonka pH oli 8,0, eluaatti fraktioitiin 2 ml:n määriin. 36 millilitraa aktiivista eluaattia saatiin fraktioista numerot 38 - 55 (65.800 CCU/ml).

Sen jälkeen Sephadex G-10-eluaatti laitettiin QAE-Sephadex A-25-pylvääseen (100 ml; 2.0 x 32 cm) jota seuraa lineaarinen gradientti-eluointi 1 litralla natriumkloridiliuosta nollasta 1,5 /6:iin. Fraktiotilavuus oli 10 ml. Viisi aktiivista fraktiota numerosta *+8 numeroon 52 (50 ml; 22.000 CCU/ml) yhdistettiin aktiiviseksi eluaatiksi. Tämän aktiivisen eluaatin pH säädettiin varovasti pH-arvoon 8,3 1 %:sella natriumhydroksidilla ja eluaatti kaadettiin 50 millilitran DIAION HP-20-pylvääseen (1,2 x Mt cm).

Antibiootti PS-5:n natriumsuola otettiin talteen 5 ml:n fraktioissa lineaarisella gradientti-eluoinnilla, joka suoritettiin UOO ml:lla vesipitoista asetonia nollasta 10 $:iin. Aktiiviset fraktiot, numerot 39 - *+1, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 51 mg valkoista jauhetta (21.000 CCU/mg).

Tällä antibiootti PS-5:n natriumsuolan valmisteella on seuraa-vat fysikokemialliset ominaisuudet: 1) Väri Valkoinen 30 5 9 8 1 3 2) Liukoisuus

Liukenee veteen ja on melko liukenematon asetoniin 3) Hajoamispiste

Mitattaessa Kofler'in mikrosulamispistelaitteella BY-1 (YAZAWA Scientific Mfg. Co., Ltd.) lämpötilan kohotessa nopeudella l°C/minuutti, tällä valmisteella ei ollut selvää sulamispistettä. Se alkoi muuttua keltaiseksi noin lif8°C:sessa ja pehmeni asteittain yli l60°C:n. Noin 203°C:sessa valmisteen värisävy hitaasti muuttui keltaisesta ruskeaksi. 220°C:sessa se oli ruskea hartsi.

M-) Ultraviolettiabsorptiospektri 60 mikrogrammaa antibiootti PS-5:n natriumsuolaa liuotettiin 3,0 mitään vettä ja mitattiin spektrofotometrillä Hitachi Recording Spectrophotometer Model EPS-3T (Hitachi Ltd.). Saatu taulukko on esitetty kuvassa 1. Seuraavat tunnusomaiset arvot laskettiin: \ H2° = noin 2k6 nm (E^ = 82,0) / v maks "X H2° = noin 301 nm (E^ = 267,5) / ^ maks Tämän valmisteen vesipitoiseen liuokseen (21.000 CCU/ml) tislatussa vedessä, lisättiin hydroksyyliamiiniliuosta (pH 7,5), jolloin muodostui reaktioseos, jossa oli 21,3 /ig/ml antibiootti PS-5tn natrium-suolaa ja 10 mM hydroksyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua 22°C:sessa reaktioseos menetti noin 9*+ % alkuperäisestä optisesta tiheydestä 301 nmtssä.

5) Infrapuna-absorptiospektri

Kuvassa 2 on esitetty antibiootti PS-5:n natriumsuolan infrapuna--absorptiospektri KBrtssä, rekisteröity spektrofotometrillä Hitachi Infrared Spectrophotometer Model 215 (Hitachi Ltd.). Seuraavat tunnusomaiset absorptiomaksimit paikallistettiin seuraavilla aaltoluvuilla: (i) noin 1750 cm"1, (-C0- beta-laktaamirenkaassa) (ii) noin 1650 cm ^ (-C0- amidi-sidoksessa) (lii) noin 16^0 - 15^0 cm"^ (-C00^) 6) Protoni-NMR-spektri

Kuva 3 on antibiootti PS-5:n natriumsuolan 100 MHz:n protoni-- NMR-spektri deuteroidussa vedessä, spektri on rekisteröity JE0L NMR spektrometrillä JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.). Seuraavat tunnusomaiset signaalit todettiin: 3i 5981 3

Ci) tripletti, jonka keskus on noin 1,06 ppm:ssä (J = noin 7,5 Hz) (CH^-CH^) (ii) multipletti, alueella 1,72 - 2,00 ppm (CH^-CH^) (iii) terävä singletti, noin 2,05 ppm (CH-^-CO-) (iv) multipletti, alueella 2,88 - 3,58 ppm (-CH2~, -CH-) (v) multipletti, alueella 3,9 - ^,20 ppm (-CH-)

N

7) Värireaktio

Erlich-reagenssi positiivinen

Jodiplatinaatti positiivinen

Ninhydriini negatiivinen 8) Ominaiskierto fof| + 77,3 (c. 1,59, 0,01M, pH 8, natriumfosfaattipuskuri)

1--1 D

9) Ohutkerroskromatografia (TLC)

Antibiootti PS-5:n natriumsuolaa kromatografoitlin TLCillä alla esitetyissä olosuhteissa. Rf-arvot määritettiin bio-autografisesti.

(a) AVICEL/SF -selluloosa-TLC-levy (American Viscose Corp.)

Liuotin-systeemi Rf n-butanoli/etanoli/vesi 7/7/6 (til./til./til.) 0,9^ isopropanoli/vesi 7/3 (til./til.) 0,96 (b) Piihappogeeli-TLC-levy (E. Merck, Darmstadt; esipäällystetty piihappogeeli-levy 60 F^^)

Liuotin-systeemi Rf etanoli/vesi 7/3 (til./til.) 0,82 n-propanoli/vesi 7/3 (til./til.) 0,77 10) Paperikromatografia

Antibiootti PS-5sn natriumsuola antoi seuraavat Rf-arvot Toyo suodatinpaperilla No 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) alla esitetyissä olosuhteissa:

Liuotin-systeemi Rf n-propanoli/vesi 7/3 (til./til.) 0,68 n-propanoli/isopropanoli/vesi 7/7/6 (til./til./til.) 0,70 32 5981 3 asetonitriili/vesi 0,3β 8/2 (til./til.) asetönitriili/tris-puskuri/

EDTA

(katso alahuomautusta) 0,3^ etanoli/vesi 7/3 (til./til.) 0,63 (liuotinseos muodostuu 120 ml:sta asetonitriiliä; 30 ml:sta H/10 tris-(hydroksimetyylDaminometaani-kloorivetyhappopuskuria (pH 7,5) ja 1 ml:sta M/10 etyleenidiamiini-tetra-asetaattia (pH 7,5)).

11) Suurjännitepaperi-elektroforeesi

Antibiootti PS-5:n natriumsuola analysoitiin suurjännitepaperi--elektroforeesilla alla esitetyissä olosuhteissa. Laite oli Savant Instrument Inc.:n valmistama (High Voltage Power Supply, Model No.

HV 3000V ja Flat Plate Electrophoresis, Model No. EP l8A). Tähän analyysiin käytetty suodatinpaperi oli Toyo suodatinpaperi No. 50.

Saadut tulokset olivat seuraavat: Kun elektroforeesi suoritettiin 30 minuutin aikana samalla jäähdyttäen (alle ^°0) potentiaalilla b2V/cm puskurissa (pH 8,6), jossa oli 3,3 g veronaalia ja 25,5 g natriumvero-naalia 3000 ml:ssa vettä, antibiootti PS-5 liikkui 28 mm anodille.

12) 13C-NMR-spektri Käytettäessä dioksaania sisäisenä standardina mitattiin antibiootti PS-5:n natriumsuolan 20 MHz:n ^3C-spektri deuteroi-dussa vedessä Varian CFT-20 spektrometrillä. Saatiin seuraavat tunnusomaiset signaalit: (1) 18^-,0^- ppm (2) 17^,96 (3) 169,29 (b) 1*+1,11 (5) 130,^+0 (6) 67,39 (dioksaani) (7) 60,19 (8) 55,63 (9) ^0,tfl (10) t+0,00 (11) 31,^9 (12) 22,62 (13) 22,b6 (1*0 11,36

Edellä esitetyt fysikokemialliset ominaisuudet osoittavat, 33 5981 3 että antibiootti PS-5:n molekyylirakenne voidaan esittää seuraavasti: XN S-CH2-CH2-NH-C0-CH3 CH3-CH2-/ -N-^

o COOH

Seuraavat biologiset ominaisuudet vahvistettiin tämän esimerkin antibiootti PS-5:n natriumsuolavalmisteella: 1) Antimikrobinen spektri

Antibiootti PS-5:n natriumsuolan MIC-arvot määritettiin erilaisilla patogeenisillä mikro-organismeilla, joihin kuuluivat resistentit kannat, käyttäen liemi-laimennusmenetelmässä aivo-sydän-infuusio- lientä "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.).

Antibiootti PS-5:n natriumsuola liuotettiin aivo-sydän-infuu-sioliemeen "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) (pH 7?0) konsentraation ollessa 5-50 ^g/ml, tästä valmistettiin sopivat laimennussarjat samaan nestemäiseen väliaineeseen. Taulukossa 8 esitettyjä mikro-organismeja viljeltiin 18 tuntia aivo-sydän-infuusioliemi-väliaineessa "Eiken" 280; Cjssa ja siirrostettiin mainitut antibiootti PS-5:n laimennussarjät, lopullisen siirrossuuruuden ollessa 1 x 10^ solua/ml. Viljelmien annettiin seistä 35° C:ssa 20 tuntia, jonka jälkeen mikro--organismien kasvu luettiin jokaisesta antibiootti· PS-5:n laimennoksesta. Pienin estävä konsentraatio (MIC) edustaa antibiootti PS-5:n (natriumsuola) pienintä konsentraatiota, jossa ei visuaalisesti todettu k.o. mikro-organismin lisääntymistä. Tarkistukseksi liuotettiin aivo-sydän-infuusioliemeen pH-arvossa 7,0 kahta tunnettua beta-'-laktaamiantibioottia kefaloridiinia ja kefoksitiinia konsentraatioiden vaihdellessa 1 μ g/tai - 100 μ g/tai ja sen jälkeen laimennettiin, jolloin saatiin useita laimennossarjoja, edellä mainitussa nestemäisessä väliaineessa. Näitä näytteitä käsiteltiin samalla tavalla kuin edellä esitettiin MIC:tä määritettäessä. Taulukkoon 8 on kerätty saadut tulokset. Antibiootti PS-5:n MIC-arvojen lisäksi on esitetty vertailun vuoksi myös kefaloridiinin ja kefoksitiinin MIC-arvot.

3lt 5981 3 • »>> *·Η *3 H β . co

S -H

\'Hir\OOU>lr\ro\r\vO lr\ lr\ g Μ-P OJlAlAOiOivO ΟΙΙΛΙΛ OJ ΙΓΝ 1Λ (M ΙΛ o Cd «f_| «*> *·» v» c* «» r>· £_| CO rHNWHHOH(\IHOO\OWOOW(\lvD(\llf\ Jd O ,id O 1UN r-IOOr—If—I i—IC\J o

-1—I O rH i—I rH -P

-p 'ρ ΑΛΑ n) <u /x r\'\ <d CÖ Jsi 'r-3

P

-P CU

β *H i—|

0) Ö H

CO ·Η rH (—I UC*N rH rH 00 rH -H

G Ή rOrOCMnOrOOoniTN Un CO C

O Ό OOr—IOOOOUtnCM CNJrH Un -H

Ti OOOOOOOCnjnOOOnOooOOO<^JOOO m

:cd O OO OOOr-HOOO-H

> rH rHr—I rH f—I 1—t I—I rH rH S

2 £ Λ Λ Λ A a A A S

CO CU ö a> ,id a> ω β *H ·*

β CD

ω -H rH

•H -P rH

Ά -P -H

o β

oun u)hhu)Wco\o oo ro u\ ro m un un m un un -h •HI HfOrOHOOHUNNHWHHUNWUNWrHajCI -H

ζβ «n r» r» r» #n r> r· r< r» fN «s r> «% r> r> r\ *> r, •H Oh OOOOOOOCMOrONQromCNjNOCMsOOHNONQ >» ao -p rH i—t g cu

β cd rH

cd β H

o cd ή X β

rid -H

•H -H

jy -P CO β

+J >, O

β β g Φ cu cd w rH -P p ® CO ,Ω Φ β -H O ö CO -P Ή cd ai cd β β Ή

Eh -is γ-ι *υ icd

Tl· CU >

C\J rH rH

-H +0

„ β β -P

fk *r3 -H CCd

J· cd -H M

-P CO ,H

CU M -P ·Η rH

UH* OS

ON H Hj- „ β β Cd o h co '-r- -p -p -p

CM jC <U NO CD UN ro On ·Η β P

P co H Pu I ro \0 4. y yfc -iTr-H co φ cu <j-hcoi>5>h\o cm /f tk cm \Oi ^ cd ω ?> q s β x επ s \o pooncoi rH ta -τ ., β £

Cu, CO 05 CQ I I rH ia I CM i s -H (U

(DCOU CQMI „ W 01 co * cd p en

CO cd CU CJ CM CQ dl-f (U-^nO CM P P O

β ·Η β EH rH CO ·Η cd CO CU β UN I Ο- ^β?»

CU β Φ <d ·Η ·Η CO ·Η I cd CU I CU I OOcdOCU

P οω ^ΗΌββΗΟΜΟ, Cu I H P .β β SOco cd β ω O te o co Chico Λ β >> ·Η ·Η O β O S · O P CO ·Η -H CM Cd-H^

•H ΦΛι-Ηι—ΙΦΦΜββιι—I CU ·Η ,—I F-t CNJ · P CO

S CO β -HOcdPCUCUCOOCdP-HCUIfteUiUO

CO β Ρ,ΦΡΟΡΡιΟβ cdU2tU)(X,C0 U Ch H

•H o β US PCHPPPMcdP

β o co o β cd co p cd oocDrHPP’cdcjC^/ cd o βoco·H¢ucuscdPP-pβ·HOft·H ^ # ω o oo x! β p rHooooSpcno en Λ p o oocnooocdrHcdcdcd β 0 rH OOO-HMrt-HOUOXiaiCOCOCOCOa) 1 >> ΟΡΓΗΡ·ΗΧ>Ρ·ΗθΟΟββββτ3

O SC OPUrHOirHOcdcnPPPCUCUCDCU-H

p O, rHCU-HX!cdPPXI<UCUCUPPPP> S

ud cd p.pooopp<upppooooo o •H +-> •HPcdCOrH-HCUrHCOXPPPPP β S en QcncQW<docn^dWcdc£icucucucua,cd 35 5981 3 2)'Tunnettujen beta-laktaamiyhdisteiden antimikrobisen aktiviteetin tehostaminen beta-laktaami-resistentteja mikro-organismeja vastaan · (A) Kymmenen millilitraa sulaa ravintoagaria, joka sisälsi 50 ug/jnl penisilliini G:tä tai kefaloridiinia, 0,8 % Kyokuto Nutrient Broth Powder'ia ja 1,0 % Difco Bacto-agaria (pH 7,0) ympättiin beta-laktaami-resistenteillä, beta-laktamaasia-tuottavilla mikro-organismeilla, jotka on esitetty taulukossa 9 ja 10 ja kaadettiin 9 cm petri-maljalle, jolloin saatiin bio-kokeen agarlevy. Tälle koelevylle asetettiin 8 mm tulppakiekkoja, jotka sisälsivät 25 jil antibiootti PS-5:n liuosta esitetyissä konsentraatioissa ja inkuboitiin 35°C:sessa 18 tuntia ennenkuin luettiin estovyöhykkeet. Tarkistuskoelevy oli valmistettu samalla tavalla ilman penisilliini G:tä tai kefaloridiinia. Vertailun vuoksi antibiooteille penisilliini G, ampisilliini, oksasilliini ja kefatsoliini tehtiin kiekkokoe samoissa olosuhteissa. Taulukkoihin 9 ja 10 on kerätty saadut tulokset.

36 5 981 3

Taulukko 9 estävä vyöhyke (mm) beta-laktaami-resistentti antibiootti ilman pen. pen. G:n mikro-organismi PS-5 G:tä kanssa (jig/ml)

Proteus vulgaris P-5 318 16,0 26,6 159 IM 2*+, 5 100 10,3 22,2 79.5 0 18,3

Enterobacter sp. E-8 318 20,1 20,0 159 17,2 17,5 100 13,8 13,8 79.5 11,0 11,0

Citrobacter freundii E-9 318 20,8 23,0 159 17,2 19,2 100 13,2 15,2 79.5 10,*+ 13,1

Serratia-marcescens S-l8 318 21,3 22,1 159 17,8 22,0 100 13,0 16,1 79.5 0 13,8

Proteus sp. P-22 318 13,6 21, 159 11,7 18,2 100 0 13,8 79.5 0 12,8 37 5981 3

Taulukko 10 estävä vyöhyke (mm) beta-laktaami-resistentti antibiootti ilman kefalo- kefaloridii-mikro-organismi PS-5 ridiiniä nin kanssa (jig/ml)

Enterobacter sp. E-18 318 21,0 21,9 159 18,2 19Λ 100 16,1 18,0 _ 79,5_15^1_17,6

Citrobacter freundii E-9 318 22,5 2*+,6 159 17 Λ 22,3 100 17 Λ 21,6 _ 79,5_16^0_19,*+

Serratica marcescens 318 21,0 26,1 159 17,0 2*+,8 100 16,8 23,3 _ 79,5 1^,8_22,3

Proteus vulgaris P-5 318 18,5 25,2 159 15,2 21+,0 100 13,7 22,0 _ 79,5_12^5_21,8

Proteus vulgaris P-5 penisilliini G (/ig/ml) 10.000 l*+,9 1*+, 5 2.500 0 0 625 0 0

Proteus vulgaris P-5 ampisilliini (pg/ml) 10.000 11+,7 12,9 2.500 0 0 _625 0 0

Proteus vulgaris P-5 oksasilliini (jig/ml) 10.000 0 0 2.500 0 0 625 0 0

Proteus vulgaris P-5 kefatsoliini (jig/ml) 10,000 11+,6 12,0 2.500 0 0 _625 0 0 38 5981 3

Edellä esitetyistä tuloksista ilmenee, että kun penisilliini G:tä tai kefaloridiinia konsentraatiossa, joka oli alle havaittavissa olevan rajan,yhdistettiin antibiootti PS-5:n kanssa, konsentraatiossa, joka oli alle kiekkokokeen kynnyksen, saatiin estovyöhyke, joka merkitsi penisilliini G:n ja kefaloridiinin aktiviteetin tehostumista antibiootti PS-5:n avulla. Verrattaessa penisilliini G:hen, ampi-silliiniin, oksasilliiniin ja kefatsoliiniin, nämä eivät pystyneet lisäämään kefaloridiinin antimikrobista aktiviteettia.

(B) Seuraava koe suoritettiin, jotta todistettaisiin, että antibiootti PS-5:n tehostava vaikutus johtuu synergismistä.

Ravintoagarkoelevylle, joka oli ympätty beta-laktaami-resisten-tillä Proteus vulgaris P-5 -kannalla (beta-laktamaasituottaja), asetettiin kaksi suodatinpaperinauhaa, joissa oli penisilliini G:tä tai kefaloridiinia ja kaksi nauhaa, joissa oli antibiootti PS-5:ä, nauhat asetettiin siten, että ne muodostivat neliön, jossa yhdessä kulmassa saman antibiootin kaksi nauhaa olivat kosketuksessa. Antimikrobinen aktiviteetti luettiin 18 tunnin inkuboimisen jälkeen 35°C:sessa. Kun sopivat penisilliini G:n tai kefaloridiinin ja antibiootti PS-5:n kon-sentraatiot oli valittu, estoalueet saatiin vain kulmissa, missä molemmat antibiootit PS-5 ja penisilliini G tai kefaloridiini olivat läsnä, mutta ei kulmissa, missä antibiootti PS-5, penisilliini G tai kefaloridiini olivat yksin läsnä. Tämän tosiasian voi selittää antibiootti PS-5:n ja penisilliini G:n tai kefaloridiinin välillä vallitseva synergism! .

3) In vivo aktiviteetti

Antibiootti PS-5:n natriumsuolan terapeuttista aktiviteettia tutkittiin hiirillä, jotka oli intraperitonaalisesti infek-toitu Staphylococcus aureus Smith'llä 5x10^ solua/hiiri. Pian infektion jälkeen antibiootti PS-5:n natriumsuolan vesipitoista liuosta injektoitiin hiiriin subkutaanisesti. Uros(ddy)-hiirillä (Shizuoka) tämän vaimisteen 50 $:sesti parantava annos, DC^q, oli 2,*+5 mg/kg.

*0 Myrkyllisyys

Antibiootti PS-5:n natriumsuolan vesipitoista liuosta annettiin intraperitonaalisesti uros (ddy)-hiirille (Shizuoka) annoksen ollessa 500 rag/kg. Kuolemantapauksia ei havaittu.

« 39 5 9 8 1 3 5) Beta-laktamaasia estävä aktiviteeti

Antibiootti PS-5:n beta-laktamaasia estävää aktiviteettia tutkittiin penisilliini G:n hydrolyysillä käyttäen Proteus vulgaris P-5:n indusoimaa beta-laktamaasia, seuraavilla tavoilla: (A) Reagenssi (1) Substraatti: penisilliini G kaliumsuola 1 u mooli/ml (372,3 pg/ml) 25 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8) (2) Beta-laktamaasi: Proteus vulgaris P-5:n indusoima beta--laktamaasi, joka puhdistettiin CM-selluloosa-pylväskro-matografiällä (3) Inhibiittori: antibiootti PS-5:n natriumsuolavalmiste 0,6 ja moolia/ml (= 192 μg/ml) (U·) 25 mM, pH 6,8 fosfaattipuskuri (B) Reaktiokoostumus ja koeolosuhteet

Substraatti (=penisilliini G), inhibiittori (antibiootti PS-5) ja puskuri sekoitettiin hyvin 30° Csssa ainemäärissä, jotka on esitetty jäljempänä olevassa taulukossa (taulukko 11). Reaktio aloitettiin heti lisäämällä esitetyt määrät beta--laktamaasia 30° C:ssa* 5981 3 1+0 * •H Cti ^ ^

Ρ β _ι rn cd ·Η I—t ·'' H

-Ρ ·· 5 Η ·Η Η 8 I—I ε ^ ^ o 2 m i—i i—i o ε

> O O n il OS OO . O

H -H nS O εθ * O -±

"" p \rs S_, ε In H J- O

+j ta 5> ia cm oo o o β cu ·* ^ ~ w w ^ cd ^ oj o cd rl .H ^-n ^

-P (rt t/1 Cd rH H H |H

p β S 3 h *-> οε ε ε

0 ·· .2 +J rl H O

"N O ^ o d o S S xrs lr\ o M ,rl K n id O O' CM J-

H P jj Cl S ΙΛ ΙΛ H rO O

I—I ·Η 1Λ H (j ~ O *- r

w 4J | -S g \TN CM rHO O O

β to i ~ w ~ ^ w w cd a. ^ cm o O ^

'-'cd H

1 -H H ε

•H 'O rH i—I rH

s f-t o e So

r—' >» cd O CM

rH M >, Ό 8 O uo O

rH H-1 en β r- ·* ·*

^ p cd uo cm O O

β P - ^ w w

O CU M CM

P

/-N

^ S rr! Cj —' cd rH ·· ^ I ·Η H r—' ^ S β

•H Tl rH rH rH -H

rH r^gin οε εο·Η H t>, Cd Q J" f-r

3 w >» Ό SO O Ps OO

en 0 ** r r P

cd Ped o ai OOP

β P r ^ '— '— ·Η H a) en cm ·η p

•H

p β

•H

CU

T* Ä d

♦H rH rH rH

✓—n O ·· ··

ITS rH *H ' N O

r-N I ε H00 H S J- CM

Oh en \ β·' en cm i S O, -h PO cd β •H \* i—I tn O h .

β -h ho d K S p 'i if •H H PO ft P* cd cd •HO Ρ ε H P cd '/ HO O Ρ P Ph o h ε o ^ p s cd ρ •h h cd S i—i en en β„ PO cd i p •H H r' P ir\ cd d βΗ PO tn cm p en o '-r β ^ o ^ <u a, cd h p H CM Hi ? ^ 59813

Penisilliini G:n hydrolyysi määritettiin mittaamalla optisen tiheyden pieneneminen 2*+0 nm:ssä, olettaen, että penisilliini G:n differentiaalinen, molaarinen ekstinktio 2^+0 nmsssä on 556, joka on saatu useista aikaisemmin suoritetuista kokeista, (C) Tulokset

Kuva M- osoittaa penisilliini G:n hydrolyysin aikakäyrän, silloin kun inhibiittoria (antibiootti P3-5) ei ole läsnä, edellä määrätyissä olosuhteissa. Proteus vulgaris'in penisillinaasin voimakas estyminen, jonka aiheuttaa antibiootti PS-5, on hyvin selvä kuvassa k·; tämä merkitsee sitä, että kun l/U-2 ekvivalenttia antibiootti PS-5:ä oli läsnä penisilliini G:ssä, joka oli substraatti, yli 50 % Proteus vulgaris P-5:n beta-laktamaasin aktiviteetista oli estynyt.