NO781076L - Antibiotikum ps-5 og derivater av dette med beta-laktamasehemmende aktivitet samt fremgangsmaate for dets fremstilling - Google Patents

Description

Antibiotikum PS-5 og derivater av dette med {3-laktamase-hetnmende aktivitet samt freiagangsmåter for dets fremstilling.

Det er kjent visse antibiotika med (3-laktamaseh.em-mende aktivitet eller det er også kjent 8-laktamasehemmende midler. For eksempel er følgende blitt angitt: MC696-SY2-A og B isolert fra kulturmediet av en MC696-SY2 produserende rase hørende til slekten Streptomyces (U.S. patent 3.981.788: Derwent CPI 19171X), MM4550 eller MMI3902 isolert fra dyrkede materialer av MM4550 eller MMI3902 fremstillende raser som bører til slekten Streptomyces (tysk patentsøknad DOS 2.513.855* Denvent CPI 67721W, tysk søknad DOS 2.513.85**, Derwent CPI 67720W), klavulanineyre isolert fra kultivert Streptomyces claculigerus (tysk søknad DOS 2.517.317: Derwent CPI 72840W) og lignende.

Det er også angitt et antibiotikum med navnet tienamycin som

har et penlcillin-lignende kjemisk skjelett og derivater av dette antibiotikum (U.S. patent 3.950.357: Derwent CPI 31696X, tysk søknad DOS 2.652.677: Derwent CPI 40282Y, belgisk patent 848.346: Derwent CPI 34505Y, belgisk patent 848.349* Derwent CPI 34507: tysk søknad DOS 2.652.680: Derwent CPI 40283Y, tysk , søknad DOS 2.652.675?Derwent CPI 40280Y: tysk søknad DOS 2.652.674: Derwent CPI 40279Y, tysk søknad DOS 2.652.676: Derwent CPI 40281Y).

Foreliggende oppfinnelse angår således nye antibiotika samt derivater av disse. Mer spesielt angår den et nytt antibiotikum definert som PS-5 og derivater av dette som har sterk antibiotisk aktivitet, p-laktamasehemmende aktivitet og evnen til synergistisk å, bedre den antibiotiske aktiviteten i penicilliner, cefalosporiner eller lignende mot 8-laktamase-fremstillende organismer. Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av disse nye antibiotika samt sammensetninger som inneholder nevnte antibiotika.

Den første hensikt ved foreliggende oppfinnelse er

å tilveiebring© det nye antibiotikum PS-5 som bar både sterk antibiotisk aktivitet og 8-laktamasehemmende aktivitet.

Det er videre en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å fremstille derivater, da spesielt tritylderivatet av nevnte antibiotikum PS-5 som også viser sterk antibiotisk aktivitet og B-laktamasehemmende aktivitet. Videre er det hensikt ved foreliggende oppfinnelse å viso at det nye antibiotikum PS-5

og dets tritylderivat også har evnen til synergistisk å bedre den antibiotiske aktiviteten i penicilliner, cefalosporiner og lignende mot 8-laktamasefr©mstillende resistente bakterier.

Videre er det en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for fremstilling av antibiotikumet PS-5 ved en fermenteringsprosess og tilveiebringe en ren-kultur av en mikroorganisme som er istand til å fremstille nevnte antibiotikum.

Videre er det en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for fremstilling av derivater av antibiotikumet PS-5, og da mer spesielt tritylderivatet.

Videre er det en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forebyggende og terapeutiske fremgangsmåter og sammensetninger av antibiotikumet PS-5 eller dets tritylderivat for bruk ved infeksjonssykdommer som forårsakes av gram-positive og gram-negative bakterier, og heri inngår synergistiske kombi-nasjoner med penicilliner, cefalosporiner og andre 8-laktamas©-følsomme antibiotika. Andre hensikter ved foreliggende oppfinnelse vil fremgår av den etterfølgende beskrivelse.

Antibiotikumet PS-5 kan fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter at man kultiverer en antibiotikum PS-5 fremstillende mikroorganisme i et næringsmedium og deretter isolerer nevnte antibiotikum.

Representative mikroorganismer for nevnt©antibiotikum PS-5 fremstillende raser hører til slekten Streptomyces. Som den mest egnede beskrives her en Stroptomyces-rase som blir isolert fra en jordprøve samlet nær Eiheiji-templet i Yoshida-distriktet i Fukui prefekturet i Japan og som ble gitt rase-nummeret A271.

Taksonomiske karakterer for rasen A271

De taksonomiske karakterer for rasen Streptomyces

A271 er følgendes

1) Morfologiske karakteregenskaper.

Grening av sporulerondo luf tiayceliuiaJ enkelt grenet. Form på sporulerende luftmycelium: toppen av luftmyceliet viser kroker, løkker og ufullstendige spiraler.

Man antar at dette hører til seksjon Retinaculum-Apertum. Disse former er spesielt lette å observere når man kultiverer organismen på et havremelsagarmedium og et agarmedium inneholdende glycerin-aspargin, mens man får en rett eller bølget form når man bruker et gjærekstrakt-maltekstrakt-medium. Form og antall i sporekjedene: ovale eller sylindriske sporer som danner en kjede på mer enn 10 (vanligvis fra 10 til 50) sporer. Størrelse og overflatestruktur på sporene: 0,8-1,0 x 1,0-1,8^u, glatt overflate. Verken flageller eller sporan-gium ble observert. Hyfe ble dannet på luftmyceliet.

2) Kulturegenskaper.

Kulturegenskapene for rasen A271 er vist i tabell 1, og egen-skapene ble observert etter 2 ukers kultivering ved 28°C hvis intet annet er angitt. Angivelse av fargetone er i vesentlig grad basert på fremgangsmåten til H.D. Tresner og E.J.Backu<*>"System of color wheels for Streptomycete taxonomy", (se

Appl.Microbiol. 11, 335, 1963) og fargetonekoden i "Guide to Color Standard" publisert av det japanske fargeinstitutt

Det fremgår av de ovennevnte egenskaper at rasen A271 hører til slekten Streptomyces og viser egenskaper som den deler med mikroorganismer som hører til seksjon RA, etter som fargetonen på mycelets overflate er gul eller rød, sporover-flåten er glatt og det dannes intet vannoppløselig pigment som f.eks. et malanoidpigment.

Kulturer med slike taksonomiske egenskaper ble lett etter i ¥aksman's "The Actinomycetes" vol.2" (1961), E.B. Shirling og D. Gottlieb<*>s artikler i International Journal of Systematic Bacteriology vol. 18, side 69-189 (1968) bid. side 270-892 (1968), ibid. vol. 19, side 391-512 (1969), ibid. vol 22, side 265-394 (1972) og Baragey<»>s Mannual of determinative Bacteriology, 8. utgave (1974). Lignende kulturer som hører til seksjon RA ble funnet å være Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus, Streptomyces helvaticus. Som en lignende kultur valgte man også Streptomyces pluricolorescens basert på morf olbgiskj© -egenskaper, skjønt den hører til seksjon RF. Disse 8 kulturer bortsett fra den siste Streptomyces pluricolorescens, er angitt å fremstille luftmycelium med rette former eller løkker, og variasjonen er avhengig av kulturbetingelsene. Typekulturer av de 8 artene ble sammenlignet med rase A271 ifølge foreliggende oppfinnelse etter kultivering under samme betingelser. Av de oppnådde resultater fremgår det klart at rase A271 skiller seg klart fra disse kulturer med hensyn til vekst, farge og luftmycel samt farge på substratmyceliet foruten den markerte forskjell med hensyn til anvendelse av karbonkilder.

1 tabellene 2,3 og 4 er det angitt resultater hvor man sammenlignet rase A2?l med de to kulturer som mest lignet den.

De følgende konklusjoner kan trekkes ut fra de resultater som er vist i de ovennevnte tabellers , Angående farge på luftmyceliet s Actinomyces flavidovirens er vanligvis hvitt men når det er gulaktig så er det grønnlig til gul og er klart forskjellig fra ras©A271 ifølge foreliggende oppfinnelse. Actinomyces cretneus viser vanligvis en svakere rødaktig tone til blekt orang til gult enn sammenlignet med det man finner i rase A271, og skiller seg klart fra denne.

Når det angår farven på substratmyceliet så viser Actinomyces flavidovirens en blekt gul farge mens Actinomyces cremeus viser en lyst orange til gulaktig farge i mange tilfeller, mens rase A271 generelt viser en lys gul farge. En detaljert sammenligning mellom eksperimentelle resultater oppnådd på forskjellige media viser dessuten at rase A271 er forskjellig fra de to andre kulturer. Rase A271 skiller seg fra Actinomyces cremeus ved anvendelse av D-fruktose og L-ramnose og fra Actinomyces flavidovirens ved anvendelse av D-fruktose og inositol.

Rasen A271 ifølge foreliggende oppfinnelse skiller seg følgelig klart fra de to kjente kulturer som mest ligner den.

Følgelig er rase A271 forskjellig fra alle kjente streptomycetarter og kan ansees å være en ny art som ér betegnet Streptomyces sp. A271. Kulturen er deponert ved the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hvor den er angitt kultur nr. FERM-P nr. 3984. En prøve av Streptomyces sp. A271 er også innlevert hos ATCC hvor den er

fått betegnelsen kolleksjon nr. 31358.

I foreliggende oppfinnelse kan man ikke bare bruke rase A271 1 seg selv, men også naturlig mutanter og kunstige mu tanter som kan induseres ved kjemisk eller fysisk behandling.

AntibiotikudPS-5 fremstillende organismer kan velges fra en rekke mikroorganismor sodikke er begrenset til en spe-siell slekt. En utvelgelse av mikroorganismer som fremstiller PS-5 kan utføres på følgende måte ved hjelp av en erfaren person. Filtrater av kulturmedier av mikroorganismer som er isolert fra jordprøver kan analyseres ved å bruke en bioprøveagarplate inokulert med en B-laktamømfintlig mikroorganisme og en annen agarplate som inneholder B-laktamase og inokulert med samme organisme. Mikroorganismer som gir filtrater som viser mindre hemmende soner på sistnevnte bioprøveplate enn på den førstnevnte velges for videre bearbeiding. Deretter blir de aktive kompo-nenter i kulturmediet i mikroorganismen utvalgt ved ovennevnte fremgangsmåte, adsorbert på aktivert karbon og så eluert. De konsentrerte eluater utvikles ved papirkromatografi eller tynnsjiktkromatografi som følges av en bioautografi med en 8-laktamfølsom mikroorganisme som prøveorganisme. Denne siktemetoden er mer konkret forklart ved det følgende eksempel. Comamonas bio-prøveplaten som vil bli beskrevet i det etterfølgende, brukes som bioprøveagarplate og inokuleres med en 8-laktamfølsom prøve--organisme. Comamonas CV bioprøveplate og Comani onas CM bioprøve-plate fremstilles ved å tilsettes nevnte Comamonas bioprøveplate det 8-laktamase som fremstilles av Proteus vulgaris P-5 og Citrobactør freundii E-9 henholdsvis.

Pappskiver med en diaaeter på 8 mm tilsettes sammen med filtratene av mikroorganismene som er isolert fra jord, og pla-seres på de nevnte bioprøveplater og platene inkuberes ved 35°C i 20 timer.

Etter inkuberingen blir de mikroorganismer hvis filtrat ga en hemmende sone på Comamonas bioprøveplater» og en mindre hemmende sone på Comamonas CV bioprøveplaten eller Comamonas CM bioprøveplaten valgt ut for videre bearbeiding.

Til filtratene av disse mikroorganismene tilsatter man 2$ (v/v) av aktivert karbon ("Tokusel Shirasagi", Takeda Chemical Industries,Ltd.), og røring utføres i 15 minutter hvoretter uoppløselig materiale oppsamles ved sentrifugering. Det uoppløselige materiale vaskes med destillert vann av samme volum som filtratet og igjen foretar man en oppsamling ved. sentrifugering. Det vaskede uoppløseligo materiale elusrasr ved å tilsette 50$ v/v vandig aceton i et halvt volum av filtratet' og utfører en røring ved romtemperatur i 30 minutter. Etter sentrifugering blir den overliggende væske fordampet ved 30-35°C ved å bruke en roterende fordamper slik at man får en 20-gangers konsentrert oppløsning sammenlignet med det brukte filtratet. Den konsentrerte oppløsningen underkastet fallende papirkromatografi med filtrerpapir (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.) ved en utvikling i 16 timer med 30$ acetonitril/ Tris EDTA oppløsningsmiddel (sammensatt av 120 ml acetonitril,

80 ml pH 7,5 1/10 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan-HCl buffer og 1 ml etylendiamintetraeddiksyrenatriumsalt-vandig oppløsning). Dette følges av en bioautografi med Comamonas terrigena B-996

som prøveorganisme.

De mikroorganismer isolert fra jord hvis biologiske aktive produkt gir en hemmende sone med samme vandringsdistanse (eller samme Rf verdi) som det man finner i antibiotikum PS-5 velges som kandidater for fremstilling av antibiotikum PS-5. Utvalgte mikroorganismer kan ytterligere undersøkes for å bekrefte deres evne til fremstilling av antibiotikum PS-5 ved ytterligere papir- og tynnsjiktkromatografi-undersøkelser.

Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåter kan en erfaren person velge andre organismer for fremstilling av nevnte antibiotikum PS-5 enn Streptomyces sp. A271 som er beskrevet ovenfor.

Ifølge en utforelse av oppfinnelsen kan antibiotikumet PS-5 fremstilles ved å inokulere sporer fra mycelet i en rase

som er istand til å fremstillo nevnte antibiotikum, f.eks. Streptomyces sp. A271, i et næringsmedium og deretter utføre

en aerob kultivering.

Som næringsstoffer kan man bruke mange typer, f.eks. karbohydrat, nitrogenkilder, uorganiske salter og lignende. Egnede næringsstoffer er f.eks. karbonkilder såsom karbohydrater,-f.eks. glucose, glycerin, maltoso, sukrose, melasse, dekstrin, stivelse eller lignende, eller oljer oller fett såsom soyaolje, jordnøttolje, talg ellei- lignende, nitrogenkilder såsom pepton, kjøttekstrakt, soyamel, bomullsfrøolje, tørket gjær, maisvæske9gjærekstrakt, kasein av skummet melk, natriuranitrat, ammonium» nitrat, ammoniumsulfat eller lignende, uorganiske salter som dikaliumfosfat, natriuoklorid, kalsiumkarbonat, magnesiumsulfat eller lignende, f.eks. kobolt, mangan eller lignende kan.tilsettes hvis det er nødvendig* I tillegg kan man anvende alle de næringsstoffer som kan anvendes av organismen for fremstilling av antibiotikum PS-5. For å hindre skumdannelse under varmo-aterilisering og fermentering, kan man tilsette antiskummidler såsom silikonolje, vegetabilsk olje eller lignende.

Forholdet mellom næringsstoffene er ikke begrenset

av den ovennevnte beskrivelse og kan variere innenfor et vidt område•

Den beste sammensetningen kan lett bestemmes ved

enkle eksperimenter som lett kan utføres av en erfaren person.

Mediet kan steriliseres før man utfører kultiveringen. pH i mediet justeres fortrinnsvis i området k til 9»fortrinnsvis i området fra 6 til S før eller etter sterilisering. Kultivering av den antibiotikum PS-5 frembringende rasen kan utføres på samme måte som man bruker ved fremstilling av antibiotika ved hjelp a<y>en Streptomycet-art. Kultivering under aerobe tilstander er vanligvis foretrukket, d.v.©. under røring og/eller gjennomluftning.

Skjønt man kan bruke enhver kultiveringsmotode valgt fra stasjonære kulturer, rystekulturer og nedsenkede kulturer, så er det siste å foretrekke. Anvendbare fermenteringstempera-turer er ikko spesielt begrensede»men velges vanligvis slik at man ikke får en hemming av den ønskelige organisme og slik at cen kan fremstille det ønskelige antibiotikum. Skjønt fermenterings temp era turen kan varieres med den rase man bruker, så vil vanligvis egnede temperaturer ligge i området fra 20 til k0°, fortrinnsvis 25 til 35°C.

pH i kulturmediet kan justeres under fermenteringen slik at man får en verdi i området fra k til 9, fortrinnsvis fra 6 til 8.

For fermentering i større skala er det foretrukket

å kultivere en passende forkultur og så inokulere naaringsmediet med nevnte forkultur.

Fermenteringen kan vanligvis fortsettes inntil en tilstrekkelig mengde av antibiotikumet er akkumulert. Fermentorings-tiden er vanligvis fra 30 til 90 timer, men vil variere med me-diets sammensetning, dets temperatur, den rase som brukes og lignende. De optimale fermenteringsbetingelsone kan lett bestem-mtt« ai- i- a- f mlrwiro olr cnarH m an tor. Hon nHfiinnil or+.o nnnirHfi av nn+. 4 » biotikumet PS-5 i fermenteringsmediet kan bestemmes ved en bio-prøvemetodo og bioautografi.

Ettersom det akkumulerte antibiotikum PS-5 i d©fer-menterte materialer er vannoppløselige og i alt vesentlig utenfor mycelet, er det foretrukket å fjerne mycelet etter fermenteringen på velkjent måte, f.eks. ved filtrering, sentrifugering, ekstraksjon eller lignende, og innvinne antibiotikumet fra filtratet, don overliggende væske, ekstraktet eller lignende.

Innvinningen av antibiotikumet kan utføres på forskjellige kjente måter. En spesielt foretrukken fremgangsmåte er den som ofte brukes for innvinning av antibiotika av karbok-eylsyretypen.

For eksempel kan følgende fremgangsmåter brukes uav-hengig av hverandre eller i kombinasjon eller etter hverandre for innvinning og isolering av antibiotikumet PS-5*(a) ekstraksjon ved lav pH med et oppløsningsmiddel såsom etylacetat, n-butanol eller lignende og tilbakeekstråksJon fra oppløsningsariddellaget over i ét vandig lag ved høyere pH; (b) ekstraksjon ved nøytral pH med oppløsningamidler såsom metylenklorid, kloroform eller lignende i nærvær av et lipofilisk kvaternært ammonlumsalt såsom benzalkoniumklorid, tetra-n-butylammohiumhydrogensulfat eller lignende, eller en såkalt kroneforbindelse såsom dicyklo-heksyl-l8-krone»6 og dicykloheksyl-15-krone-5" NISSO kroneetere (Nippon Soda Co.,Ltd.) og tllbakeekstråksJon fra oppløsnings-middellaget over i et nøytralt vandig lag inneholdende natrium-jodid, kaliumjodid eller lignende) (c) adsorbsjon på aktivert karbon eller høyporøse harpikser av typen styren/divinylbenzen såsom Amberlite XAD (Rohm & Haas Co.), Diaion HP-2Q (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) eller lignende og eluering med vandig metanol, vandig aceton eller lignende) (d) adsorbsjon og eluering med en Joneutbytningsharpiks såsom Dowex 1-X2 (Dow Chemical Co.) QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals AB) eller lignende; (e) gelfiltrering med Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals AB), Bio-Gel P-2 (Bio-Rad Laboratories), Bio-Beads S-X3 .

(Bio-Rad Laboratories) eller lignende; (f) kolonne eller tynnsjiktkromatografi med cellulose, Avicel SF (American Viseose Corp.), DEAE-Cellulose Vhatman DE-32 (Whatman Ltd.), DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals AB), silisiumdioksyd-

gel, aluminiumoksyd eller lignende; og (g) forsert utfeining ved tilsetning av oppløsningsmiddel såsom aceton etc. Hvor-dan antibiotikumet PS-5 opptrer under innvinning og isoleringen kan lett bestemmes ved en bioprøvemetode og en bioautografi-metode som vil bli beskrevet i det etterfølgende.

På den ovennevnte måte kan man oppnå et antibiotikum PS-5 med følgende egenskaper.

Fysiske- kjemiske egenskaper for antibiotikum PS- 5

(1) ' Qppløselighet

Antibiotikumet PS-5 or oppløselig i vann ved pH 6 til 9*Mer spesielt kan det angis at dette antibiotikum ikke bare er løselig i vann ved pH 7 men også i svakt sure vandige media justert til pH 6 eller høyere enn 6, f.eks. ved å tilsette salt-syre etc*, og i svakt alkaliske vandige medium justert til en pH lavere enn 9 ved f.eks. tilsetning av natriumhydrogenkarbo-nat, natriumhydroksyd etc.

Dette antibiotikum er i alt vesentlig uoppløselig

1 etylacetat og benzen ved pH over 4.

(2) Tynnsjiktkromatografi ( TLC)

Antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) gir følgende Rf-verdier når det ble prøvet med de følgende TLC plater og opp-løsningsmldler. Oppløsningsmiddelforholdene og blandingen av oppløsningsmidler som ble anvendt, er trykt i et volumforhold hvis intet annet er angitt.

(a) Avicel SF cellulose tynnsjiktplate

(Funakoshi Pharmaceutical Co.,Ltd.)

n-butanol/etanol/vanri (7/7/6) Rfo0,94.

i-propanol/vann(7/3) Rf»0,96

(b) Forstrøket silisiumdioksydgelplate ©0 ^ 25k (E,Kerck)

etanol/vann(7/3) Rf<a0,82

n-propanol/vann(7/3) RfssO,77

(3) Pap irkroma t ogra fi

Antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) gir følgende Rf-verdier når man brukte Toyo Filter Paper nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd*), og fallende papirkromatografi ble utviklet med følgende oppløsningsmidlert

n-propanol/vann Rf«0,68

n-propanol/i-propanol/vann

(7/7/6) Rf«0,70

acetonitril/vann (8/2) RfsO,36

aceton!tril/tris/EDTA (Bm.l) Rf«0,34

etanol/vann (7/3) Rfo0,63

Bemerkning lt Blandet oppløsningsmiddel bestående av 120 ml acetonitril, 30 ml pH 7,5 1/10 M tris«hy*droksy-motyl)-aminometan-saltsyrebuffer og 1 ml pH 7,5 1/10 M etylendiamintetraeddiksyrenatriumsalt.

(4) Høyspenningspaplrelektroforeso

De følgende resultater kunne observeres når antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) ble underkastet en elektroforese på Toyo filterpapir nr. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) ved å bruke

et høyspennlngspapirelektroforeseapparat (Savant Instruments Inc., High Voltage Power Supply HV 3000A, Flat Plate Elektropho-resis Chamber FP18A): ved minst 5 nim, vanligvis fra 10 - 40 mm vandring til anoden ved en ladning i 30 minutter på en potensial-gradient på 42 volt pr. cm 1 pH 8,6 buffer sammensatt av 3000 ml vann, 3,3 g barbital og 25,5 g barbitalnatrium.

(5) Surhet

Antibiotikumet PS-5 sr en monobasisk syre med en kar-boksylsyre i molekylet.

(6) UV absorbs. ionsspektrtun

Karakteristisk UV absorbsjonsmaksimum for antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) er følgende i

A<H>2° as301 nm

. max

(7) IR absorbsJonsspektrum

Karakteristiske IR absorbsjonemaksima for antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) målt ved en KBr tablettraetode er føl-gende)

Ca. 1750 cm-1 (-CO- i B-laktamring)

ca. 1650 cm»l (-C0- i amid)

ca. 1640-1540 cm-1 (-C00<d>)

(8) Proton NMR spektrum

Antibiotikumet PS-5 (natriumsalt) gir følgende karakteristiske signaler i 100 Mhz proton NMR spektrum målt i D^O

(i) en triplett sentrert omtrent ved 1,06 ppm med

koblingskonstanter på ca. 7,5HZ {CH^-CHg-)

(ii) en multiplett ca. ved 1,72-2,00 ppm (CHyCH^-) (ili) en skarp singlett ca. ved 2,05 ppm (CHyCO-) (iv) en multiplett ca. ved 2,88-3,58 ppm (CH„, -CH-)

(v) en multiplett ca. ved 3,92-4,20 ppm (-CH-

(9) Spesifik rotasjon

^37q<2>1,23 (C, 1,59, 0,01M pH 8 natriurafosfat-buffer).

(10) Molekylvekt og molekylformel

Molekylvekten er ca. 298 (beregnet ut fra resultatene ved høyoppløsningsmassespektrografi for metylesteren av antibiotikumet PS-5)« Molekylformelen eri

<C>13<H>18<N>2°4<S>

(11) Farversaka . 1 on

Ehrlich reagenereaksjoni positiv jod-klorplatininsyrereaksjon: positiv ninhy dr inreaksjon1 negativ Ved hjelp av de ovennevnte fysiske-kjemiske egenskaper

t

er det fastslått at gruppene CHyCH.,-, CH-CQ-, -CH2-, -CH- ,

N

-CH-,

, -NHCO- og C00 er tilstede i et molekyl for

antibiotikumet PS-5»(Natriumsalt).

Blémentæranalyse av tritylesteren av antibiotikumet PS-5 (eksempel IO) avslører at svovel er tilstede. Data på UV

absorbsjonsmaksimumet og minimum såvel som deres absorbsjonsfor-hold og ekstinsjonskoeffisienter understøtter et nærvær av et tienamycinskjelett i molekylet. Dette bekreftes ved at UV absorbsjonsmaksimumet forskyves fra 301 nm til 315 nm ved for-es t ring av karboksyldelen (l6th Intersclence Conference on Antimicrobial Agents & Cheraotherapy, Chicago, okt. 29, 1976).

På basis av de ovennevnte fakta antar man at antibiotikumet PS-5 har følgende molekylstruktur:

Dette understøttes ved andre bevis, f«eks. slik det or beskrevet i eksempel 9 at antibiotikumet PS-5 gir 13 signaler i "^C-NMR spektrumet og at deres kjemiske forskyvninger er i overensstem-melse med ovennevnte struktur når man sammenligner med data fra tienamycin.

Skjønt antibiotikumet PS-5 synes å være ustabilt når det f.eks. isoleres ved romtemperatur, så er det relativt stabilt ved lave temperaturer, f.eks. under 0°C, og spesielt under -10°C. Det er relativt stabilt i en vandig oppløsning omkring nøytral-ptxnkt eller ved én svak alkalisk pH. Minst 50$, vanligvis mer enn 70$ av den antibiotiske aktiviteten for nevnte antibiotikum PS-5 blir igjen etter minst 15 minutters oppvarming til 60°C i en vandig oppløsning omkring nøytralpunktet eller en svakt alkalisk pH under pH 9»

Biologiske egenskaper for antibiotikumet PS- 5

(1) Antibiotisk spektrum

Antibiotikumet PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse har et bredt spektrum med hensyn til antibiotisk aktivitet, og viser sterk aktivitet mot forskjellige bakterier, f.eks. gram-positive bakterier som hører til slektene Staphylococcus, Diplo-oo<g>cus, Streptococcus, Sarcina, Baolllus og lignende, og gram-negative bakterier som hører til slektene Alcaligenes, Comamonas og lignende. Antibiotikumet PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse viser også god aktivitet mot gram-negatlve bakterier som hører til slekter som Escherlchia, Slebsiella, Proteus og lignende.

Antibiotikumet PS-5 viser sterk aktivitet mot gram-negative bakterier som er resistente over for antibiotika med 6-laktamringstruktur, for eksempel bakterier som hører til slekter som Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia og lignende.

( z) Økende antibiotisk aktivitet for andre antibiotika laot B- laktamase- produserende bakterier.

Antibiotikumet PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse nar evne til å øke den antibiotiske aktiviteten for aidre antibiotika, da spesielt for f3-laktamantibiotika såsom penicilliner og cefalosporiner. mot P-laktamase-produserende bakterier som Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter åorogenea, Serratia marcescens og lignende. Aktlvitetsmønstret er synergistisk i de fleste tilfeller.

(3) Aktivitet in vivo

Antibiotikumet PS-5 ble tilført mus infisert med pathogeniske gram-positive bakterier, og man fikk en markert terapeutisk effekt.

( k) Toksitet

Antibiotikumet PS-5 fremmet ingen dødsfall i prøve-dyrene selv når detble tilført intraperitonalt til mus i en dose på 500 mg/kg kroppsvekt.

Derivater av antibiotikum PS- 5

Ettersom antibiotikumet PS-5 er noe labilt slik det er beskrevet ovenfor, må innvinning og isolering i de fleste tilfeller utføres under de mest nøyaktige forhold. Ettersom antibiotikumet generelt er mer stabilt i saltfonn enn som en fri syre, så er det foretrukket å anvende saltformen for.farmasøytisk bruk og når det brukes som et mellomprodukt for syntetisering av derivater og under isolering. Saltformen innbefatter f.eks. følgende alkalimetallsalter som natriumsaltet, kaliumsaltet, lltiumsaltet og lignende, joralkalimetallsalter som kalsiumsalt, magneslumsalt eller lignende, andre metallsalter som aluminium? salt ellor lignende, ammoniumsalt, salter med primære, sekundære eller tertiære aminer som monoetylamin, dimetylaiain, trietylamin, monoetanolamin, dietanolamin eller lignende; og salter med organiske baser som benzathin, prokain og/eller lignende. Egnede salter er farmasøytisk akseptable salter, d.v.s. salter med katjoner som ikke skader de farmakologiske og toksiologiske egenskaper i den frie syren. Spesielt egnede salter er alkalimetallsalter som natriumsalt, kallumsalt eller lignende.

Som nevnt ovenfor er antibiotikumet PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse en monobasisk syre med en karboksylsyre- gruppe i molekylet» Det er følgelig innlysende at forskjellige estere kan fremstilles fra antibiotikumet med forskjellige alko* holer, merkaptaner eller derivater av disse, hvorved man får fremstilt estere på samme måte som kjent i forbindelse med antibiotikaene clavulaninsyre eller thienamycin for eksempel. Oppfinnelsen Innbefatter således slike estere.

En egnet ester av antibiotikumet PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse, er en ester med følgende generelle formels

hvor R indikerer en lavere alkylgruppe eller en trifenylmetyl-gruppe. I ovennevnte formel (il) kan den lavere alkylgruppen være en rett eller grenet gruppe, f.eks. en alkylgruppe med mindre enn seks karbonatomer, mer spesielt en gruppe med fra 1 til k.karbonatomer, Eksempler er metyl, etyl, n-propyl, iso-prppyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, isopentyl, n-heksyl og lignende. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan estere med ovennevnte formel (II) fremstilles ved å reagere antibiotikumet PS-5 med formel (i) eller salter av dette, med forbindelser med føl-gende generelle formel (ill)

hvor R har samme betydning som angitt ovenfor, og Y indikerer et atom eller on gruppe som kan avspaltes, eller mod lavere, diazoalkaner.

Med hensyn til atomene eller gruppone Y i formel (ill), så kan man bruke enhver type atomer eller grupper som lett kan avspaltes når de bringes i kontakt med karboksylgruppen i antibiotikumet PS-5. Man kan f.eks. bruke halogenatomer som klor, brom eller jod, sulfonyloksygruppor, reaktive karbonyl-oksygrupper som -0-CO-CF^og lignende. Halogenatomer er spesielt foretrukket.

Representative eksempler på forbindelser med formel (III) er følgendet metylalkohol, metyljodid, dimetylaulfonat, metylmerkaptan, etanol, etylbromid, etyljodid, otylmerkaptan, n-propylklorid, n-propyljodid, propylalkohol, isopropylalkohol, isopropylbro-mid, n-butylalkohol, n-butylbromid, n-butyljodid, n-pentylalko-hol, n-pentylklorid, n-pentylbromid, n-pentyljodid, n-heksyl-alkohol, n-heksylbromid, n-heksyljodid, tritylalkohol, trityl-merkaptan, tritylklorid, tritylbromid og lignende*

Som representative eksempel på lavere diazoalkaner som kan brukes for fremstilling av nevnte estere, er diazometan.

Reaksjonen mellom nevnte antibiotikum PS-5 og forbindelser med formel (ill) eller med en lavere diazoalkan, kan utføres på kjent måte for forestring. For eksempel kan reaksjonen mellom antibiotikumet og forbindelser med formel (III) eller en lavere diazoalkan fortrinnsvis utføres i et inert flytende medium, skjønt den kan Også utføres i et fravær av nevnte medium. Egnede inerte medie kan f*eks. velges, fra føl-gende grupper: (a-) hydrokarboner såsom benzen, toluen, n-heksan, cykloheksan eller lignende, (b) halogen-hydrokarboner som kloroform, metylenklorid eller lignende, (c) amider såsom dimetylformamid, heksametyl-fosfotriamid eller lignende, (d) dimetylsulfoksyd, (e) etere som dietyleter, diisopropyleter, di-n-butyleter, tetrahydrofuron, dioksan eller lignende, (f) estere som etylacetat, n-butylacetat eller lignende, eg (g) ketoner som aceton, metylotylketon eller lignende. Disse-oppløsnings-midler kan brukes enkeltvis eller som en blanding av to eller flere.

Reaksjonstemperaturen er ikke kritisk og kan forandres alt etter hva slags forbindelser med formel (ill) man bruker, eller type av lavere diazoalkan eller type av væskemediura eller lignende. Reaksjonstemperaturen kan velges i et område hvor nevnte antibiotikum ikke i vesentlig grad dekomponeres, og egnede temperaturer er vanligvis under 60°C, fortrinnsvis fra O til 40°C, og enda mer foretrukket fra 5°C til romtemperatur. Ved gjennomføring av nevnte reaksjon kan man bruke en stimulerende forbindelse såsom trimetylamin, trietylamin, pyridln, dicyklo-heksylkarbodiimid eller lignende. Under slike betingelser vil reaksjonen være fullstendig i løpet av fra 1-24 timer, vanligvis fra 3-12 timer.

Ifølge en foretrukken utførelse av oppfinnelsen kan det antibiotikum PS-5 som brukes for en reaksjon med ot reaktivt derivat med formel III hvor R er trifenylmetyl, ikke nødvendig-vis være et isolert renset preparat. Endog det kultiverte materiale eller mediumet etter fjerning av mycel fra kulturen kan brukes for reaksjonen såvel som et råpreparat av antibiotikumet PS-5 som delvis er renset ved innvinning og isolering på kjent måte. Eksempler på delvis rensede preparater er følgende: (a) et konsentrert eluat med aktivert karbon med hvilket det filtrerte medium er blitt behandlet; (b) et konsentrert eluat fra en etyren/divinylbenzenharplks såsom Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) som er blitt behandlet med det filtrerte medium; (c) et avsaltet konsentrat med aktivert karbon av et eluat fremstilt ved en gradlentkonåentrasjon av natriumklorid i fosfatbuffer fra en joneutbytningsharpiks såsom f.eks. QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) hvorpå man har adsorbert det ovennevnte konsentrerte eluat fra Diaion HP-20; (d)

et konsentrert metylenklorldekstrakt i nærvær av bensalkonium-klorid; (e) et konsentrert ekstrakt med kloroform i nærvær av såkalte kroneforbindelser; og (f) et konsentrert butanolekstrakt ved pH 3,5 ved lav temperatur.

Den således dannede antibiotikum PS-5 tritylestor kan isoleres fra reaksjonsblandingen og renses på forskjellige kjente måter. For eksempel kan man etter at reaksjonen er ferdig først helle reaksjonsblandingen over 1 et vandig medium for å

fjerne vandige urenheter såsom biprodukter eller lignende.

Det er foretrukket å bruke en nøytral buffer som det vandige medium for å holde pH så nær som mulig til nøytral!totspunktet. Antibiotikum PS-5 tritylesteren i blandingen blir så ekstrahert med et mindre polart organisk oppløsningsmiddel som ikke vesentlig er blandbart med vann, f.eks. etylacetat, bensen, kloroform eller lignende. Under eketråksjonen kan man tilsette et salt såsom natriumklorid, ammoniumsulfat eller lignende for å bedre ekstraksjonen.

Etter tørking av det organiske ekstrakt over vannfritt natrlumsulfat, kan tritylesteren isoleres fra oppløsnings*

midlet på kjent måte, f.eks. ved gelfiltrering ved å bruke Bio-Beads S-X3 (Bio-Rad Laboratories), Sephadex LH-20 (Pharmacia

Fine Chemicals AB) eller lignende, eller ved hjelp av adsorb-sjonskromatografi idet man bruker et bærestoff som silisiumdioksydgel, aluminiumoksyd, ruller's earth (Florldin Co*) eller lignende, og disse fremgangsmåter kan brukes i kombinasjon og hvis det er nødvendig, så kan de gjentas en til flere ganger.

Tritylesteren kan ytterligere renses ved utkrystalli-sering fra et oppløsningsmiddel eller blandinger av oppløsnings-midler såsom benzen, toluen, xylen, etylacetat, dietyleter, metylenklorid, kloroform, heksan, petroleter (kokeområde fra 30 til 60°C) eller lignende.

Blant estere med formel (Xl) som kan fremstilles ved ovennevnte fremgangsmåter, er antibiotikum PS-5 tritylesteren med følgende formel (ll-a)

karakterisertsom en av de mest anvendbare på grunn av følgende egenskapen esteren er mer stabil sammenlignet med antibiotikumet PS-5 med formel (i) slik at Isoleringen blir lettere og det beholder en sterk antibiotisk og g-laktamase-hemmende aktivitet, mens tritylesteren av kjente penicilliner for eksempel, ikke

viser vesentlig antibiotisk aktivitet. Videre er nevnte tritylester med formel (ll-a) meget viktig som en av mange aktive estere og kan brukes som mellomprodukter for syntese av andre farmasøytisk verdifulle produkter ettersom tritylgruppen lett kan avspaltes*

Fysiske-kjemiske og biologiske egenskaper for tritylesteren av antibiotikum PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse, er detaljert gitt i det etterfølgende.

Fysiske-kjemisko egenskaper for tritylesteren av antibiotikum Eåz2

A) Smoltepunkt

Tritylesteren smelter mellom 83 og 88°C.

Smeltepunktet er i dette tilfelle målt ved Kofler-metodon hvor temperaturen stiger med en hastighet på 1°C pr. min.

(apparat: Smeltepunktspreveapparat type BY-1, Yazawa Scienti-fik Mfg. Co.Ltd.).

Bl) Ultrafiolett absorbs . jons sp ek trum

C) Infrarødt absorbs. lons spektrum

De mest karakteristiske absorbsjonsmaksima i kloro-formoppløsnlng opptrer ved følgende bølgetall: 3430, 3100*3000.2990, 2950, 1770, 1695, 1665, 1445»1340, 1275 og 1139 cm<*1>.

D) Oppløselighet

Esteren er i alt vesentlig uoppløselig i vann, heksan og petroleter (kokepunkt: 30 - 60°C)j oppløselig i benzen, etylacetat, kloroform, aceton og dimetylsulfoksyd.

E) Farvereaksjon

F) Farve på stoffet: farvéløst

6) Tynnsjiktkromatografi ( TLC)

Rf-verdiene på de plater og de oppløsningsmidler som ble anvendt, er angitt på følgende måte: (a) "Chromagram Sheet no* 606511 (Eastman Kodak Co.)

Øvre lag av n-butanol/otanol/vann (4/1/5) Rf=0,56 i-propanol/vann (8/7) Rf=0,91

n-butanol Rfal,0 i-propanol/vann (l/4) Rfa=l,0

(b) Forbelagte silisiumdioksydgelplater 60 F^,.^

(E. Merck) benzen/aceton (2/l) Rf=0,29

H) Protonkjearemagnetisk resonansespektrum

NMR-spektrumet ved 100 MHz for tritylesteren i CDCl^ eir

følgende karakteristiske signaler:

(i) en triplett sentrert omkring 1,10 ppm med koblings*

konstanter på ca. 7*0 Hz.

(ii) en'singlett nær 1,86 ppm.

(lii) en multiplett ved ca. 7,0 til 7,67 ppm

De ovennevnte fysieke-kjemiske egenskaper er i over-ensstemmelse med den struktur som er gitt ovenfor i form av formel (ll-a).

Spesielt vil følgende fakta definitivt bekrefte at trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 «f «n ester. (i) en bred IR-absorbsjon av -C00<®>ved ca. 1640 - 15^0 cm"<1>som opptrer 1 IR-spektrumet av antibiotikum PS-5 (natriumsalt) kan ikke observeres i IR-spektrumet av tritylesteren. Istedenfor får man 1 tritylesteren en skarp absorbsjon av gruppen -CO- i en estergruppe ved ca. 1695 cm"<1>. (ii) antibiotikumet PS-5 kan i vesentlig grad ikke ekstraheres med et oppløsningsmiddel fra nøytrale eller svakt alkaliske vandige oppløsninger, mons tritylesteren lett kan ekstraheres på denne måte. (iil) UV absorbsjonsmaksimumet for antibiotikum PS-5©r 301 nm, mens man for tritylesteren har et maksimum ved 315,5 nm. Denne forskyvning ér analog til det man finner i N-acetyl-tien&mycin* metylestere. Biologiske egenskaper for tritylesteren av antibiotikumet PS- 5 (1) Antibiotisk spektrum Tritylesteren av antibiotikum PS-5 har en bredspektret antibiotisk aktivitet og viser spesielt meget sterk aktivitet mot forskjellige gram-positive bakterier som hører til slektene Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina, Bacillus og lignende samt gram-negatlve bakterier som hører til slekter som Alcaligenes, Comamonas og lignende.

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5 viser også god aktivitet mot gram-negatlve bakterier fra slektene Escherichia, Klebsiella, Proteus og lignende.

En bemerkelsesverdig egenskap man har i tritylesteren av antibiotikumet PS-5©r dens aktivitet mot gram-negatlve bakterier som ellers er resistente overfor antibiotika med en 8-laktamringstruktur og f.eks. hører til slektene Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia og lignende.

(2) Økning av den antibiotiske aktivitet i andre antibiotika mot 8- laktamaseproduserende bakterier

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5 har også evnen til å øke den antibiotiske aktiviteten for andre antibiotika, ola spesielt for p-laktamantibiotika som penicilliner og cefalosporiner, mot,8-laktamaseproduserende bakterier som Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens og lignende.

(3) Aktivitet ln vivo

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5 ble tilført mus infisert med en patogenisk gram-positiv bakterie, og tritylesteren ga en markert terapeutisk effekt.

( k) Toksitet

Tritylesteren ga ingen dødsfall hos prøvedyrene når esteren ble tilført intraperitonalt i mus i en dose på 500 mg/kg kroppsvekt.

Anvendelsesmetode samt fremgangsmåter for fremstilling av farma-søytiske preparater inneholdende antibiotikumet PS-5 og dets derivater.

Antibiotikumet PS-5 og dets derivater kan angis ved følgende generelle formels

hvor R^representerer hydrogen, lavere alkyl og trlfenylmetyl og innbefatter salter av forbindelsen hvor er hydrogen.

X ovennevnte formel er begrepet "lavere alkyl" definert på samme måte som for symbolet R i forbindelse med formel IX som representerte estere av antibiotikumet PS-5. Med ut-trykket "salter av forbindelse hvor R^er hydrogen" forståes salter av antibiotikumet PS-5 slik disse er definert ovenfor under de avsnitt som angir derivater av nevnte antibiotikum, og innbefatter selvsagt også farmasøytisk akseptable salter av nevnte antibiotikum.

Antibiotikumet PS-5 og dets derivater, da spesielt tritylesteren, viser både in vitro og in vivo aktivitet mot gram-negatlve og gram-poeitive mikroorganismer og er derfor meget verdifullt ved bekjempelse av bakterielle infeksjoner.

Antibiotikumet PS-5 eller dens tritylester og sammensetninger med disse antibiotika kan tilføres oralt, topikalt eller parenteralt (intravenøst, lntramuskulært, intraperitonalt etc), og kan brukes i en rekke forskjellige farmasøytiske preparater alt avhengig av tilførselsveien* For eksempel kan nevnte antibiotika opparbeides med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff, fortynningsmiddel eller lignende i faste former (f. eks. tabletter, kapsler, pulvere, granulater, sukker-belagte tabletter, pulver-sprpyer, suppositorier etc), semi-faste former (f.eks. salver, kremer, semi-faste kapsler etc), eller i flytende form (f.eks. som væskeoppløsninger, emulsjoner, suspensjoner, siruper, oppløsninger for Injeksjoner, væskefor-støvninger etc).

Et enhétsdosepreparat inneholdende antibiotikumet PS-5 eller dens tritylester kan inneholde fra 0,1 til 99 vekt-# av den aktive komponent i en hver form.

Representative additiver med hensyn til fyllstoffer, bærestoffer, fortynningsmidler eller lignende som kan brukes for fremstilling av disse preparater samt fremgangsmåter for selve fremstillingen er ytterligere beskrevet i det etterfølgende.

Tabletter og kapsler for oral tilførsel kan fremstilles i enhetsdoseform og kan inneholde bindemidler, f.eks. sirup, akasia, gelatin, sorbitol, tragakant, polyvinylpyrroli-don og lignende, fyllstoffer som f«eks. laktose, sukrose, stivelse, kalsiumfosfat, sorbitol, glyein eller lignende, amøremid-ler som f.eks. magnesiumstearat, talkum, polyetylenglycol, sili-siumdioksyd eller lignende, nedbrytningsmidler som f.eks. potet-stlvelse eller lignende, samt fuktemldler som natriumlaurylsul-fat eller lignende* Tablettene kan belegges ifølge velkjente fremgangsmå t er•

Flytende preparater for oral anvendelse kan være i form av oljeaktige eller vandige suspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper etc, og kan tilveiebringes som tørkede produkter som kan opparbeides med vann eller andre egnede væsker før bruk. Nevnte væskepreparater for oral anvendelse kan dessuten inneholde følgende farmasøytisk akseptable ingrediensen suspenderingsmidler (f.eks* metylcellulose, sorbitolsirup, sukker-sirup, hydroksyetylcellulose, gelatin, karboksymetyl-cellulose, aluminiumstearatgol, hydrogenert fett og hydrogénerte oljer), emulgeringsmidler (f.eks* akacien lecitin, sorbitan-monooleat), ikke»vandige væsker (f.eks. etylalkohol, propylen-glycol, oljeaktigo estere, fraksjonert kokoeolje, mandelolje); konserveringsmidler (f.eks. metyl-p-hydroksybenzoat, prbpyl-p-hydroksybenzoat, sorbinsyre etc.)*

Suppositorier kan dessuten inneholde vanlige suppo-sitoriestoffer som kakaosmør og forskjellige glycerider.

Sammensetninger for injeksjon kan fremstilles i enhet sdosef orm ved ampuller eller flerdoeebeholdere sammen med et konserveringsmiddel* De kan være i form av.suspensjoner, opp-løsninger og emulsjoner i oljeaktigo eller vandige væsker, og kan dessuten hvis det er nødvendig, inneholde forskjellige andre stoffer såsom suspenderingsmidler, dlspergeringsmidler og sta-biliseringsmidler. Alternativt kan antibiotikumet ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles i pulverform som kan kombi-neres med pyrogenfritt, sterilt vann før bruk.

Sammensetninger som inneholder antibiotikumet PS-5 eller dens tritylester kan tilveiebringes i forskjellige former som er egnet for absorbsjon gjennom slimhinnen i nesen, halsen eller bronkiene. Således kan formen være et pulver eller en væskeforstøvning, inhalleringsmidler, etc., så kan være fordelaktig for dette formål. For behandling av ører og øyne kan antibiotikumet ifølge foreliggende éppfinnelse/iifremstilles som individuelle kapsler, som dråper eller som væske eller semi-ifaet form etc. I tillegg så kan man for topikal anvendelse opparbeide preparatet i hydrofiliske eller hydrofobe basisstof-fer som pulvere, kremer, salver og lignende.

Hvis det er ønskelig kan man i tillegg til et bærestoff også tilsette andre ingredienser, f.eks. konserveringsmidler, antioksydasjonsmidler, smøremidler, viskositetsmidler, smaksmidler, suspenderingsmidler, bindemidler, stabiliserings-midler og lignende.

Når antibiotikumet PS-5 og/eller dets tritylester skal brukes for behandling av infeksjoner i svin, kuer, sauer, kyl-linger og lignende, kan preparatene opparbeides som intramammære preparater med langtvirkende eller rasktfrigjérende stoffer, eller som et konsentrat tilsatt næringsstoffene. De ovennevnte beskrevne farmasøytiske preparater Ifølge foreliggende oppfinnelse kan Inneholde antibiotikumet PS-5 og/eller dens tritylester som eneste aktive ingrediens eller kan brukes i kombinasjon med andre terapeutisk effektive ingredienser.

Som nevnt tidligere, fordi antibiotikumet PS-5 og

dets tritylester har en synergistisk effekt på forskjellige 8-laktamasefremstillende bakterier i kombinasjon med 8-laktamforbindelser, vil det være fordelaktig å kombinere dem med nevnte 8-laktamforbindelser i farmasøytiske preparater. Som egnede eksempler på 8-laktamforbindelser kan nevnes penicillin-derivator såsom benzylpenicillin, fenoksymetylpenicillin, karbe-nicillin, arapieillin og amoxicillin, samt cefalosporinderivater såsom cefaloridin, cefalotin, cefazolin, cefaleksin, cefoxitin, cefacetril, cefamandol, cefapirin, cefradin og cefaloglycin.

Når antibiotikumet PS-5 og/eller dens tritylester blir kombinert med en eller flere midler av det som er nevnt ovenfor, så er kombineringsforholdet ikke kritisk men kan variere innenfor et vidt område. Av rent praktisk grunner vil det imid-lertid være fordelaktig å bruke et forhold mellom antibiotikumet ifølge foreliggende oppfinnelse og kjente (3-laktamf orbindelser i området fra 20 j 1 til 1 : 150»fortrinnsvis 10 i 1 til 1 : 100.

Ved behandling av bakterieinfeksjoner hos pattedyr, vil dosen av antibiotikumet PS-5 og/eller dens tritylester variere alt avhengig av det individ som skal behandles, kroppsvekten, typen og graden av infeksjoner, samt måten og antall tilførsler etc. For oral eller parenteral tilførsel vil det være fordelaktig å bruc© daglige doser i området fra 0,05 mg/kg til 500 mg/ kg, fortrinnsvis 0,5 mg/kg til 200 mg/kg, fortrinnsvis i oppdelte doser. Det er klart at man kan bruke doser utenfor det ovennevnte anbefalte området, noe avhengig av de individuelle tilstander hos den pasient som skal behandles.

Antibiotikumet PS-5 og/eller dens tritylester kan

ikke bare brukes i farmasøytiske preparater slik det er nevnt ovenfor, men kan også tilsettes direkte eller som et konsentrat i næringsstoffer som skal brukes til forskjellige typer dyr, I tillegg kan antibiotikumet brukes som en aktiv ingrediens i

konserveringsmidler for mat eller i desinfeksjonsmidler.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse* X alle eksempler er den kvantitative og kvalitative bedømnlngen av den antimikrobielle aktiviteten basert på føl-gende fremgangsmåter:

(l) Bioprøve på antimikrobiell aktivitet

En kultur som var dyrket over natten av Comamonas terigena B-996 på en ekråagar ble suspendert i et næringsmedium slik at man fikk en optisk celletetthet på 0,04Q ved 610 nm.

Denne bakteriesuspensjonen ble tilsatt i en mengde på 1$ til et smeltet agarmedium inneholdende 0,8$ Kyokuto nærlngsmediumspulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1,0$ Baeto-Agar (Difco Laboratories). Det smeltede agarmedium med nevnte bakterier ble i en dybde på 7 mm fordelt i en Petri-skål med en diameter på 9 cm og hensatt for stivning. Denne platen ble definert som en Comamonas-prøveplate.

Staphylococcus aureus FDA 209P ble kultivert over natten i et næringsmedium under rysting og fortynnet 50 ganger i næringsmedium slik at man fikk en tilsetningssuspensjon.En 1 volura-$'s mengde av denne suspensjonen ble blandet med smeltet agar inneholdende 1$ Kyokuto nærlngsmediumspulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1$ Bae to-Agar (Dif co Laboratories). 7 ml av hvert medium ble så fordelt ut i en Petri-

skål på en diameter på 9 cm. Denne platen ble definert som en Staphylococcus-prøveplate.

På lignende måte ble det fremstilt en Alcaligenes plate. En. skråagarkultur som var 12 timer gammel av Alcaligenes faecalis B-326 ble suspendert i et næringsmedium slik at man fikk en såkalt frøsuspensjon, og cellekonsentrasjonen ble justert til en optisk tetthet på 0,020 ved 610 nm. Agarmedium sammensatt av 0,5$ Kyokuto nærlngsmediumspulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1,0$ Baeto-Agar (Difco Laboratories) ble smeltet ved en passexide temperatur og tilsatt 1,0$ inokulum av nevnte suspensjon. 7 ml av det smeltede agarmedium ble så helt ut i en Petri-skål på 9 cm og hensatt for størk-ning. Denne platen ble definert som en Alcaligenos-prøveplate.

,En pappsklve på 8 mm ble vanlig dynket med en prøve-oppløsning som skulle bedømmes, og den ble hensatt på et rent

filtrerpapir i tilstrekkelig langt tidsrom til å fjerne over-skudd av oppløsningen og så overført til en prøveplate. Etter inkubering ved 35°C i 20 timer målte man diameteren på den observerte hemningssonen og sammenlignet denne med en standard-oppløsning av cefaloridin. Den antimikrobielle aktiviteten for antibiotikumet PS-5 og tilsvarende forbindelser ble uttrykt som cefaloridin-ekvivalente enheter/ml.

Mer spesielt ble en oppløsning av antibiotikumet PS-5 og nærstående forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som har samme diameter på hemningssonen som for 100yig/ml cefaloridin, uttrykt som 100 cefaloridinenheter/ml. Hår en fast prøve av antibiotikumet PS-5 og tilsvarende forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse ved en konsentrasjon på 1 yag/ml viste samme diameter som 1yug/ml av cefaloridin, så ble på tilsvarende måte den spesifike aktiviteten for den faste prøven angitt som 1 cefaloridin-enhot/mg. Det tør være velkjent at en prøve-standardkurve viser noe variasjon avhengig av den art som er prøveorganismen. For å spesifisere de arter som ble brukt som prøveorganiamor, ble følgende enhetsuttrykk anvendt: Comamonas-cefaloridin-enhet (forkortet CCU), Staphylococcus—cefaloridin-enhet (forkortet som SCU), og Alcaligenes-cefalorldin-enhet (forkortet som ACU).

(2) Bio- autografi

En stor prøveplate ble beskrevet som under avsnitt (l) ovenfor, bortsett fra at £00 ml av det inokulerte smeltede agarmedium ble helt over i en rektangulær skål på 32 x 24 cm istedenfor i en 9 cm's Petri-skål.

Et papirkromatogram som skulle prøves ble plasert

i 15 minutter på nevnte store prøveplate. Etter at papiret var fjernet ble prøveplaten inkubert ved 35°C i 20 timer slik at man kunne observere eventuelle hemningssoner. Denne teknikk mulig-gjør ikke bare en beregning av Rf-verdiene (kvalitativ prøve)

men også en mulighet for å bestemme den antimikrobielle aktiviteten (semi-kyantitativ prøve) basert på størrelsen på ringen* 1 de tilfeller hvor man brukte.en TLC plate, ble et

ark av tynt papir plasert mellom TLC-platen og overflaten av prøveplaten. En lignende fremgangsmåte ble utført for kvalitative og semi-kvantitative prøver.

Eksempel 1

En 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende følgende inokuleringsmedium (SE-4) ble sterilisert ved 120°C i 15 minutter. En vel sporulert skråkultur av Streptomyces sp. A271» 10 ml 0.02$ Tween-80 (ovorflateaktivt middel Atlas Polder Corp.) ble tilsatt, og blandingen ble rørt svakt for å få en s<p>oresus<p>en— sjon. En 500 ml's Erlenmeyer-kolbe ble så inokulert med 1 ml av sporesuspensjonen og rystekultivert ved 28°C i k& timer på

en roterende rystemaskin (200 omdr./rain., radius ca» 3,5 cm). Deretter ble 2 ml av inokuleringskulturen tilsatt hver av de

6 600 ml's Erlenmeyor-kolbene som hver inneholdt 100 ml produk-sjonsmedlum slik det er beskrevet nedenfor, og disse ble dyrket, ved 28°C i fra kB til 96 timer i et roterende risteapparat• Inokuleringskulturmedium ( SE- 4)

Produkajonsmedium

pH 7,2 før sterilisering, pH 6,1 etter sterilisering, pH 7,8 etter k døgns fermentering.

(2) AGA-2 medium

pH 6,5 før sterilisering, pH 5,8 etter sterilisering,

pH 7,8 etter 4 døgns fermentering.

(3) AGB-1 medium

pH 6,5 før sterilisering, pH 5,9©tter sterilisering, pH 7,9 etter 4 døgns fermentering.

(4) ÅGB-41 medium

pH 7,0 før sterilisering, pH 6,9 etter sterilisering, pH 7,9 etter 4 døgns fermentering.

(5) ML-19 medium

pH 6,4 før sterilisering, pH 7,0 etter sterilisering, pH 7,0 etter 4 døgns fermentering. i(*6) AOO-l medium

pH 7,0 før sterilisering, pH 7|2 etter sterilisering,

pH 7,2 etter k døgns fermentering.

Den antibiotiske virkningen for næringsfiltratet ble bestemt ved den sk&veprøve som er beskrevet ovenfor, idet man brukte Comamonas terrigena B-996, Staphylococcus aureus 209P

og Alcaligenes faécalis B-326. Han fikk følgende resultater 72 timer etter inokulering:

Eksempel 2

Et hundrede milliliter av inokuleringskulturen fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble overført til et 30 l's fermenteringskar inneholdende 15 1 ML-19 medium og dyrket under forsert gjennomlufting ved 28°C i 96 timer ved 200 omdr./min*, ildet steril luft ble tilført 1 en mengde på 7,5 l/min. En sillkonolje (Silicone KM-75, Shin-Etsu Chemical Industries Co., Ltd.) ble brukt som antiskumningsmiddel ved en konsentrasjon på 0,05$.

Næringsmodiet ble oppsamlet og sentrifugert ved de angitte tidspunkter. Man fant følgende antibiotisk virkning i det filtrerte næringsmedium:

Eksempel 3

Ved å bruke samme fremgangsmåte som beskrevet 1 eksempel 1*ble Streptomyces sp. A271 kultivert i en 500 ml's Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml SE-4 medium og så inokulert i et 30 l's fermenteringskar inneholdende 15 1 SE-4 medium. Etter kultivering ved 28°C i 24 timer ved 200 omdr./tain. under kraftig gjennomluf ting på 7,5 l/min., ble 1 liter av denne inokuleringskultur helt over i en 2tqo 1's fermenterings tank av rustfritt stål inneholdende 100 1 ML-19 medium. Tankfermen-teringskaret ble gjennomluftet under røring ved 28°C i 72 timer ved 100 omdr./min*, og gjennomluftningen var 50 1 pr. min. Begynnende pH var 7,0 mens slutt-pH var 7,1*Næringsmeglet ble blandet mod 5$ (v/v) med perlitt (Topco Perlite, Topcoi nr. 34, Toko Perlite Kogyo K.K.) og filtrert gjennom-en fiiterpresse slik at man fikk 80 ml filtrat. Den antibiotiske aktiviteten i den klare væsken var 60 CCU/ml.

Eksempel 4

Fremstilling av aktivt karbonkonaentrat1

Som beskrevet 1 eksempel 1 ble ti 500 ml Erlenméyer-kolber inneholdende hver 100 ml ML-19 modium inkubert under rysting i 72 timer. Det samlede medium ble tilsatt 2$ (v/v)

perlitt-filterhjelpemiddel (Topco Perlite, Topco nr. 34 Toko Perlite Kogyo K.K.), og det hele ble filtrert gjennom en Buchner-trakt slik at man fikk 800 ml filtrat. Etter at pH var bekreftet å være i området fra 7-8 tilsatte man 16 g aktivt karbon (Charcoal Actlvated, Shirasagi, Takeda Chemical Industries, Ltd.), og det hole ble rørt i 15 minutter. Det aktive karbon ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket med 800 ml destillert vann og så sentrifugert. Det aktive karbon ble så eluert med 400 ml 50$ (v/v) aceton under røring ved romtemperatur i 0,5 time. Den oppnådde klare oppløsningen (eluatet) (52 CGU/ml) ble konsentrert til 50 ml ved en temperatur på 30-35°C i et roterende fordampningsapparat. Den antibiotiske styrken på konsentratet var 800 CCXJ/ml.

De følgende eksperimenter ble utført for å bevise åt antibiotikumet PS-5 ifølgo foreliggende oppfinnelse er forskjellig fra MM4550 (Complex) som er beskrevet som en 8-laktamase-hemmer i tysk patentsøknad DOS 2,513,855 og DOS 2,513*854.

Tre raser av Streptomyces ollvaceus ÅTCC 31126 (=

ATCC 21379/M3), ATCC 21380 og ATCC 21382 ble ved 28^0 i 72 timer dyrket i et roterende rysteapparat i en 500 ml* a Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml av dot følgende medium:

pH 7,0 før autoklavering

Den antibiotiske styrken på filtratet blé absorbert over på aktivt karbon, vasket med vann og eluert med 50$ aceton. Det oppnådde eluat ble konsentrert til et lite volum under redusert trykk og underkastet fallende papirkromatografi under de følgende betingelser:

Rf-verdiene ble fastslått ved bio-autografi under de nevnte betingelser på Comamonas terrigena B-9°6..

På samme måte som de ovennevnte raser av Streptomyces olivaceus, ble Streptomyces sp. A271 ifølge foreliggende oppfinnelse fermentert i et medium sammensatt av 4$ glye©rin, 0,2$ glucose, 0,5$ pepton, 0,2$ potetstivelse, 0,5$ avfettet soyamel, 0,5$ tørrgjær, 0,5$ NaCl og 0,2$ CaCO^(pH 6,4 før autoklavering) . Den etterfølgende behandling og prøvo var som beskrevet ovenfor.

De bio-autografiske prøver viste at antibiotikumet PS-5 som er ot produkt av Streptomyces sp. A271 ifølgo foreliggende oppfinnelse, er et nytt produkt forskjellig fra MM 4550 (Complex) slik dette er beskrevet i ovennevnte tyske patentsøk-nader.

Eksempel 5 Fremstilling av konsentrert diaion og HP20 eluat av antibiotikum PS- 5

Som beskrevet i eksempel 1 ble 15 1 ML-19 medium fermentert i 150 kolber i 72 timer. Det samlede medium ble tilsatt 100 mg dinatriumetylendiamin-tetraacetat og 2$ (v/v) Topco Perlite, Topco nr. 34, og det hele bie filtrert gjennom en stor Buchner-trakt slik at man fikk 14,1 1 filtrert medium (pH 7,9). Det hele ble tilsatt en Diaion HP20 kolonne på 7

x 50 cm (en høyporøs styren og divinylbenzen-saiapolymer i perleform med makroretikulær overflate og fremstilt av Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), vasket med 7 i destillert vann og eluert med 50$ (v/v) metanol. Eluoringsmønstret med-hensyn til antibiotisk aktivitet var følgende (tabell 7)*

Eluat fra nr. 8 til og med nr. 14 ble slått sammen, konsentrert til 100 ml ved en temperatur under 30°C i et roterende fordampningsapparat og så frysetørret til 2,6 g av et gulbrunt pulver hvis styrke var 54 CCU/mg. Nevnte gulaktige til brunlige pulver ble oppløst i destillert vann til en konsentrasjon på 500 CCU/ml.

Fosfatbufferoppløsningor med de angitte pH-v©rdier ble fremstilt ved å justere M/15 dikaliumfosfat til den forønskede pH med 5K NaOH eller 5N fosforsyre. 1 ml av den antibiotiske

PS-5 oppløsning, 1 ml av fosfatbufferen ble så tilsatt, og hvis nødvendig ble pH-verdien igjen justert til den opprinnelig®verdi. De antibiotiske PS-5 oppløsninger med varierende pH ble holdt

ved 6o^C i 3© minutter i et vannbad, avkjølt i rennende vann og nøytralisert til pH 7,0 med en mindre mengde 5N NaOH eller 5N fosforsyre. fåt kontrollrør som inneholdt antibiotikumet PS-5

i oppløsning ved pH 7,0 ble så satt ned i et isbad i 30 minutter. Den gjenværende antimikrobielle aktiviteten ble bestemt som beskrevet ovenfor, idet man brukte Comamonas terrigena B-996

som prøveorganisme. Man fikk de følgende resultater beregnet som prosent av kontrolleni

Disse resultater viser at det gulbrune pulver fremstilt i dette eksempel er relativt stabilt ved en pH fra 6,0 til 9,0 i 30 minutter ved 60°C. I tillegg til dette synes det som om stabiliteten for antibiotikumet PS-5 øker ved en lavere temperatur selv ved en sur pH. Når f.eks. antibiotikumet PS-5 ble behandlet véd pH 3,0 i 5 minutter ved -17°C, så kunne man enda påvise minst 30$ av den opprinnelige antibiotiske aktiviteten.

Eksempel 6

Ekstraksjon ved en lav temperatur med n- butanol

Et stort prøverør inneholdende 20 ml destillert vann, 12 ml n-butanol og 7 g natriumklorid ble avkjølt til -17°C uten

frysing. Det gulbrune pulveret av antibiotikum PS-5 fremstilt som angitt i eksempel 5, ble fortynnet til en konsentrasjon på 200 mg/ml i destillert vann og kjølt på forhånd. 1 ml av den kalde oppløsningen av antibiotikumet ble tilsatt nevnte prøve-rør og raskt justert til pH 2,75, pH 3,0 eller 3*25 med svovel-syre samtidig som blandingens temperatur ble holdt under -10°C.

Etter skikkelig blanding ble n-butanollaget tatt ut og blandet med 5 ml 0,5M fosfatbuffer (pH 6,8), hvorved den aktive komponent gikk over i det vandige lag. En bio-prøve av den vandige oppløsningen ga de følgende ekstraheringsverdier for antibiotikumet PS-5 fra det gulbrune pulveret»

Eksempel 7

Fremstilling av QAE- Sephadex pulver

Ved samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 5*ble 27,7 g gulbrunt pulver av antibiotikum PS-5 oppnådd fra 100 1 filtrert næringsmedium etter frysetørking. Dette pulver med en spesifik aktivitet på 13,2 CCU/mg ble oppløst i 30 ml 25 mM fosfatbuffer pH 6,8 og påsatt en kolonne av QAE-Sephadex A-25 (en fullkvaternerisert sterkt basisk anjonisk utbytnings-harpiks fremstilt ved å tilsette dietyl-2-hydroksypropylammo-niumgrupper til en dekstrangel, fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals AB) (3,3 * 25,o cm), som var ekvilibrert med den samme bufferen. Etter vasking med en mindre mengde av samme fosfatbufferen ble aktiviteten eluert med samme buffer inneholdende natriumklorid, idet konsentrasjonen av det nevnte klorid ble lineært forandret fra 0 til 0,5M under eluering. Den aktive fraksjon på 300 ml ble avkjølt til 0°C og behandlet med 6 g aktivt karbon. Det aktive karbon ble oppsamlet, vasket med vann og eluert med 50$ (v/v) aceton. Etter at acetonen var fjernet ved fordampning ved en temperatur under 30°C fikk man 727 mg brungult pulver av antibiotikumet PS-5 som et natriumsalt, og dette ble innvunnet ved lyofilisering.

Den spesiflke aktivitet på dette preparat var 26k CCU/mg. Eksempel 8 Fremstilling av DEAE- cellulosepulver

727 mg gulbrunt pulver av antibiotikum PS-5 fremstilt som beskrevet i eksempel 7, ble oppløst i 1 ml 25 mM fos-fatbuf f er pH 6,8, og tilsatt en kolonne på 1,5 x 27,0 cm Bio-

Gel P-2 (en gel sammensatt av tverrbundet syntetisk polymer-sammensetning basert på metylen-bis-acrylamidsampolymer fremstilt av BIO-RAD Laboratories), som var ekvilibrert med samme fosfatbufferen. Ved utvikling med samme fosfatbuffer fikk man 15 ml aktiv fraksjon.

Denne fraksjon ble så påsatt en kolonne på 2,5 x 28,0 cm dietylaminoetyl (DEAE) cellulose DE32 (Whatman Ltd.), som var ekvilibrert med den samme fosfatbufferen. Eluering ble utført med en lineær gradient av natriumklorid i samme fosfat* buffer fra 0 til 0,5M. Den innvunne aktive fraksjon på 240 ml ble absorbert på 4,5 g aktivt karbon ved 0°C. Det aktive karbon ble oppsamlet ved filtrering, vasket med vann og eluert med 50$ (v/v) aceton. Acetoneluatet ble fordampet under 30°C inntil ingen aceton kunne påvises, og så lyofllisert hvorved man fikk 120 mg brunlig til hvitt pulver av antibiotikum PS-5 som et natriumsalt. Den spesifike aktivitet på dette preparat var 600 CCU/mg.

Eksempel 9

Høyrenset preparat av antibiotikum PS- 5

To 200 l<*>s fermenteringstanker av rustfritt stål ble hver fylt opp med 100 1 ML-19 medium inneholdende 2,5$ avfettet soyamel, autoklavert, inokulert med Streptomyces sp. A271 på samme måte som beskrevet i eksempel 3, og så kultivert i 72 timer under gjennomluftning og røring. Innholdet 1 de to fermenterings tank ene ble slått sammen, blandet med 5$ (v/v) Topco Perlite, Topco nr. 34 (Topco Perlite Kogyo K.K.) og filtrert gjennom en filterpresse hvorved man fikk I60 1 filtrert medium. Den antibiotiske styrken på dette filtrat var 235 CCU/ml. Filtratet ble ført gjennom en joneutbytningsharpikskolonne DIAION PA-306 (en sterkt basisk anjonutbytnlngsharpiks med tverrbundet poly-st yrenma tri se og trimetylammoniumkloridgrupper, fremstilt av Mitsubishi Chemical Industries Ltd., 10 x 52 cm, 4,5 1 i våt-volum) uten å bli holdt tilbake. Den aktivitet som passerte nevnte kolonne ble så absorbert på en DIAION HP-20-kolonne (14 x 97 cm, 15 l) og eluert med 75$ metanol. Det oppsamlede aktive eluat på 2 1, 9854 CCU/ml ble fortynnet tre ganger med 4 1 vann og påsatt en 2 l's kolonne (5,5 x 84 cm) av DIAION PA-306S. Etter vasking med 500 1 vann ble den antibiotiske aktiviteten eluert med en 8 l's lineær natriumkloridgradient fra O til 3$ og oppsamlet i 200 ml<*>s fraksjoner. De aktive

fraksjoner fra nr. 17 til nr. 31 ble slått sammen til 2,8 1 aktivt eluat (4120 CCU/ml). Dette eluat ble så tilsatt en 1-liters DIAION HP-20-kolonne (4,5 x 63 cm) og eluert med en 3-liters lineær gradient av aceton fra 0 til 25$. Volumet av hver fraksjon var 30 ml. Det aktive eluat på 390 ml inneholdende 27220 CCU/ml ble innvunnet ved å slå sammen de antimikrobielt aktive fraksjoner fra nr. 54 til og med nr. 66.

Etter at acetonen var fjernet ved destillasjon under redusert trykk, ble DIAION HP-20 eluatet ført gjennom en 200 ml's kolonne av QAE-Sephadex A-25 (2,5 x 41 cm). Den antimikrobielle aktiviteten ble oppsamlet i IO ml's fraksjoner ved éulering med en 2 l's lineær natriumkloridgradient (0 - 1*5$)*Fraksjonene nr. 68 til 81 ble slått sammen som et aktivt eluat (140 ml, 42120 CCU/ml).

Dette QAE-Sephadex A-25 eluat ble forsiktig justert til pH 8,3 med 1$ NaOH, og tilsatt en 200 ml<*>s DIAION HP-20AG (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., 2,5 x 4l cm) kolonne. Lineærgradienteluering ble utført med 1 1 vandig aceton fra

0 til 10$. Volumet av hver fraksjon var 10 ral. Fraksjonene nr. 48 til og med 53 ble slått sammen, og man fikk 60 ml aktivt eluat (4500O CCU/ml). Frysetørring ga 249 mg av et gult pulver (8000 CCU/mg).

For ytterligere rensing ble 150 mg av nevnte gule - pulver oppløst 1 en mindre mengde 0,01M natriumfosfatbuffer (pH 8,0) og ført gjennom en 130 ml's kolonne (l,5 x 73 cm) Sephadex G-10 (en dekstrangel fremstilt ved å tverrbinde deks-tranfraksJoner med epiklorhydrid,Pharmacia Fine Chemicals AB). Antibiotikumet PS-5 ble eluert med 0,01M, pH 8,0, natriumfosfatbuffer, og eluatet ble fraksjonert i en 2 ml's mengd© Man fikk ialt 36 ml aktivt eluat fra fraksjon nr. 38 til 5-(658OO CCU/ml).

Sephadex G-10 eluatet ble underkastet kromatografi på en kolonne av QAE-Sephadex A-25 (100 ral, 2,0 x 32 cm) fulgt av en lineær gradienteluering med 1 1 natriumklorldoppløsning fra 0 til 1,5$. Fraksjonsvolumet var 10 ml. Fem aktive fraksjoner fra nr. 48 til 52 (50 ml, 22000 CCU/ml) ble slått sammen som det aktive eluat.

Dette aktive eluat ble sorsiktig justert til pH 8,3 med 1 $ NaOH og tilsatt en 50 ml'a DIAION HP-20 kolonne (l,2 x kk cm).

Antibiotikumet PS-5 natriumsaltet ble innvunnet i 5 ml<r>s fraksjoner ved en lineær gradienteluering med kOO ml vandig aceton fra O til 10$. De aktive fraksjoner nr. 39 til kl ble slått sammen og lyofilisert, hvorved man fikk 51 mg hvitt pulver (21000 CCU/mg).

Dette spesielle preparat av antibiotikum PS-5 natriumsalt viste følgende fysiske og kjemiske egenskaper: 1) Farge hvitt 2) Oppleselighet oppløselig i vann og i alt vesentlig uoppløselig i aceton.

3) Dekomponeringspunkt

Når dotte ble målt i et Kofler-mlkrosmøltningspunktapparat BY-1 (YAZAWA Scientific Mfg. Co.,Ltd) fovor temperaturen ble hevet med 1°C pr. minutt, viste dotte preparat intet klart smeltepunkt. Det begynte å bli gult omkring l48°C, ble gradvis mykt over ca. 160°C. Omkring 203°C skiftet farven lang-somt fra gult til brunt, og ved 220°C var det en brun harpiks. k) Ultrafiolett absorbsjonsspektrum

60 mikrogram av antibiotikum PS-5 natriumsalt ble oppløst i

3,0 ml vann og målt i en Hitachi Eecording Spreetrophoto-meter Model EPS-3T (Hitachi Ltd.). Det oppnådde diagram er vist på fig. 1. Man beregnet de følgende karakteristiske

.verdier:

Én vandig oppløsning av dette preparat (21000 CCU/mg) i destillert vann ble tilsatt en hydroksylaminoppløsning (pH 7,5), hvorved man fikk én reaksjonsblanding inneholdende 21,3

^ng/ml av antibiotikum PS-5 natriumsalt og IO mM hydroksyl-amin. Etter 30 minutter ved 22°C hadde reaksjonsblandingen tapt ca. 94$ av sin opprinnelige optiske tetthet ved 301 nm.

5) Infrarødt absorbsjonsspektrum

Fig. 2 viser det infrarøde absorbsjonsspektrumet for antibiotikum PS-5 natriumsalt i KBr slik det ble målt på en Hitachi

infrarødtspektrom©ter model 215 (Hitachi*Ltd.). Man fikk de følgende karakteristiske absorbsjonsmaksima med de følgende angitte bølgetall:

(i) ca. 1750v cm"<1>(-C0- i 8-laktamringen)

(ii) ca. 1650 cm<*1>(-C0- i amidbindingen)

(iii) ca. 1640 - 1540 cm"<1>(-C00<G>)

6) Protonmagnetiske resonansspektrum

Det vedlagte diagram fig. 3©r et 100 Mhz protonmagnetisk resonansspektrum av antibiotikum PS-5 natriumsalt i deutero-vann målt i en JEOL NMR-spektrometer JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co.Ltd.). De følgende karakteristiske signaler ble bekreftet: (i) triplett som har et senter omkring 1,06 ppm (J a ca. 7t5 Hz)( CH3-CHg) (ii) multiplett i området fra ,1,72-2,00 ppm (CH^-CH-f

(iii) skarp singlett omkring 2,05 ppm (CH^-CO-)

(iv) multiplett i området 2,88 - 3»58 ppm (-CH2-, -CH-

(v) multiplett i området 3,9 - 4,20 ppm (-CH-

t

N

7) Farvereaks. Ion

8) Spesifik rotas. i on

/S722 + 1,23 (c 1,59, 0,01 M, pH 8, natriumfosfatbuffer) c2' D

9) Tynnsjiktkromatografi ( TLC)

Natriumsaltet av antibiotikum PS-5 ble underkastet tynnsjiktkromatografi under de angitte betingelser. Rf-verdiene ble bestemt ved bio-autografi.

(a) AVICEL/SF cellulose TLC plate (American Viscose Corp.)

(b) Silisiuaidioksydgel TLC plate (E. Merck. Darmstadt, for-belagt silisiumdioksydgelplate 60 ^ g*^)

10) Papirkromatdgraf1

Natriumsaltet av antibiotikum PS-5 ga følgende Rf-verdier på Toyo filtrerpapir nr. 50 (Toyo Roshi kaisha Ltd.) under de angitte betingelser:

(en oppløsningsmiddelblandlng bestående av 120 ml acetonitril, 30 ml M/10 tris(hydroksymetyl)aminometan-B.gi<lltsyrebuffer

(pH 7,5) og 1 ml M/10 etylendiamintetraacetat (pH 7,5))

11. Høyspenningspapirelektroforese

Natriumsaltet av antibiotikum PS-5 ble analysert ved høy-spenningspapirslektrofores© under de angitte betingelser. Apparatet var et produkt fra Savant Instruments Inc. (Høy-spenningstilførselsapparat, model nr. HV 3000V og Flate

Plate Electrophoresis, model nr. EP 18A). Det filtrerpapir som ble anvendt for denne analyse, var Toyo filtorpapir nr.

50. Man fikk de følgende resultater:

Når elektroforesen ble utført i 30 minutter under avkjøling (under 4°C) med en spenning på 42 V/cm i en buffer (pH 8,6) inneholdende 3,3 g barbital og 25,5 g barbitalnatrium i 3000 ml vann, beveget antibiotikumet PS-5 seg 28 mm til anoden.

12)<13>C- magnetiSk resonansespektrum

13 Man brukte dioksan som en intern standard, og 20 MHz C-magnetisk resonansespektrum for antibiotikum PS-5 natriumsalt i deuteriumvann ble målt i et Varian CFT-20 spoktro-meter. Man fikk de følgende karakteristiske signaler:

De fysiske og kjemiske egenskaper som er beskrevet ovenfor, viser at molekylstrukturen på antibiotikum PS-5 kan angis på følgende måte:

De følgende biologiske egenskaper ble bekreftet med antibiotikum PS-5 natriumsaltpreparatet fra dette eksempel:

l) Antlmikrobielt spektrum

MIC-verdiene for antibiotikum PS-5 natriumsalt blo bostemt på forskjellige patogeniske mikroorganismer heri inngår resistente raser, ved den såkalte fortynningsmetodo som er brukt

av BRAIW HEART INFUSION BROTH "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO.,LTD.)

Antibiotikum PS-5 natriumsalt bie oppløst i BRAIN HEART INFUSION BROTH "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO.,LTD.) (pH 7,p) ved en konsentrasjon varierende fra 5-50 ^ag/ml hvorfra man utførte passende fortynningsprøver i samme vrøskemedium. De mikroorganismer som er angitt i tabell 8 ble dyrket i IS timer i samme medium som nevnt ovenfor ved 28°C og inokulert i nevnte fortynningseerie av antibiotikum PS-5 til en sluttinokuluras-størrelse på 1 x 10^ celler/ml. Kulturene ble hensatt ved 35°C i 20 timer og deretter ble vekten av mikroorganismene avlest for hver fortynning av antibiotikumet PS-5*Den minimumshemmende konsentrasjon (MIC) representerer den minste konsentrasjon av antibiotikumet hvor man ikke kunne påvise noen visu-ell formering av den relevante mikroorganisme. Sem kontroll brukte man to kjente Ø-laktamantibiotika, nemlig cefaloridin og cefoxitin, som ble oppløst iævnte medium ved pH 7,0 i konsentrasjoner som varierte fra 1^»g/ml til 100 ^ng/ml og så ble disse fortynnet til flere fortynningsserier på ovennevnte måte* Disse prøver ble behandlet som beskrevet ovenfor for nevnte bestemmelser for den angitte minimumshemmende konsentrasjon. Tabell 8 angir de oppnådde resultater. X tillegg til verdiene for antibiotikum PS-5 har man også inntatt verdiene for cefaloridin og cefoxitin som en referanse.

2) Styrken på den antimikrobielle aktiviteten for kjente beta-laktamforbindelser mot beta-lakatam-resistente raikriorganis-mer»(a) 10 ml smeltet næringsagar inneholdende 50 ^ag/ml penicillin G eller cefaloridin, 0,8M Kyokuto nærlngsmediumspulver og 1,0$ Difco Baeto-Agar (pH 7,0) ble inokulert med de beta-laktam-resistente, beta-laktamase-produserende mikroorganismer som er angitt i tabllene 9 og 10, og helt over i

en 9 cm's Pétrlskål slik at man fikk en bio-prøve agarplate.

På denne agarplaten plaserte man 8 mm'a papirskiver inneholdende 25 ^il av antibiotikum PS-5 oppløsninger ved de angitte konsentrasjoner, og platene ble så Inkubert ved 35°C i 18 timer før man avleste inhiberingssonene. Kontrollprøveplaten ble fremstilt på lignende måte uten penicillin G eller cefaloridin.

Som referanse prøvet man antibiotikaene penicillin G, ampicillin, oksacillin og cefazolin under samme betingelser. Tabellene 9

og 10 oppsummerer de oppnådde resultater.

Det fremgår av de ovennevnte resultater at når penicillin 6 eller cefaloridin ved en konsentrasjon under den påvis-bare grense blir kombinert med antibiotikumet PS-5 ved en konsentrasjon under terskelen som man fant ved sklveprøven, så kunne man observere en hemningssone noe som gjorde at man fikk en forsterkning av aktiviteten i penicillin G og cefaloridin med antibiotikum PS-5*I motsetning til dette så ville penicillin G, ampiclllin, oksacillin og cefazolin ikke øke don antimikrobielle aktiviteten på cefaloridin.

(B) Det etterfølgende eksperiment ble utført for å bevise at den forsterkende effekt av antibiotikumet PS-5 var synergistisk*

På en prøveplate av næringsagar inokulert med en beta-laktam-resistent rase av Proteus vulgaris P-5 (beta-laktamase-produserende mikroorganisme) ble det plasert to filtrerpapir-striper inneholdende penicillin G eller cefaloridin og to striper inneholdende antibiotikum PS-5»slik at de dannet en firkant hvor to striper med samme antibiotikum var i kontakt i ett hjør-ne* Den antimikrobielle aktivitet ble avlest etter inkuberlng i 18 timer ved 35°C. Når man valgte egnede konsentrasjoner av penicillin G eller cefaloridin og antibiotikum PS-5»så kunne hemningssonene bare observeres i hjørnene hvor både antibiotikum PS-5 og penicillin G eller cefaloridin var tilstede, men ikke

i de hjørner hvor antibiotikum PS-5»penicillin G eller cefaloridin alene var tilstede* Dette kan kun forklares ut fra en synergistisk effekt mellom antibiotikum PS-5 og penicillin G eller

cefaloridin. Man har altså her et tilfelle hvor to typer forbindelser blir kombinert ved konsentrasjoner som hver enkeltvis er så lav at den Ikke gir en nemningssone når den brukes alene, men hvor man får en stor nemningssone når man kombinerer de to antibiotika.

3) In vivo aktivitet

. Den terapeutiske aktiviteten av antibiotikum PS-5 natriumsalt ble studert ved å behandle mus intraperltonalt infisert med 5 x. IO celler/mus av Staphylococcus aureus Smith. Rett etter infeksjonen injisorto man subkutenøst en vandig opp-løsning av antibiotikum PS-5 natriumsalt. I hannlige ddy mus (ShizuOka), fant man at en 50$ helbredende dose av dette preparat var 2,45 mg/kg. kroppsvekt.

4) Toksltet

En vandig oppløsning av antibiotikum PS-5 natriumsalt ble intraperltonalt tilført hannlige ddy mus (Shizuoka) 1 en dose på 500 mg/kg kroppsvekt. Man fikk ingen dødsfall blant prøvedyrene.

5) Beta- laktamase- hemmende aktivitet

Den beta-laktamase-hemmende aktiviteten for antibiotikum PS-5 ble undersøkt på hydrolysen av penicillin G ved hjelp av beta-alktamase fra Proteus vulgaris P-5 på følgende måtet (a) Reagens (1) Substratt penicillin G kaliumsalt l^i mol/ml (ts 372,3^ug/ml) i 25 mM fosfatbuffer (pH 6,8)

(2) Beta-laktarnase t induserbar beta-laktamase av

Proteus vulgaris P-5 som var renset ved. CM-cellulose-kolonnekromatografi (3) Inhibitor t antibiotikum PS-5 natriumsaltpreparat 0,6mol/ml (= 192^ug/ml)

(4) 25 mM, pH 6,8 fosfatbuffer

(B) Reaksjonssammensetning og prøvebetingelser

Substrat (» penicillin G), inhibitor antibiotikum

PS-5 og bufferen ble blandet ved 30°C i de mengder, som er angitt i den etterfølgendo tabell. (Tabell ).

Reaksjonen ble startet med en gang ved å tilsette den angitte mengde av beta-laktamase ved 30°C.

Hydrolysen av penicillin G ble fulgt ved å måle senkningen i den optiske tettheten ved 240 nm»idet man forut-satte at den differensielle molare ekstingsJon av penicillin G ved 240Cnm var 556 noe som var påvist ved flere preliminære eksperimenter,

(c) Resultater

Fig. 4 viser utviklingen av hydrolysen av penicillin G i fravær av inhibitoren (antibiotikum PS-5) under de ovonfor angitte betingelser. En sterk hemming av Proteus vulgaris peni-cillinase ved antibiotikum PS-5 fremgår meget klart i fig. 4, d.v.s. at når 1/42 ekvivalent av antibiotikumet PS-5 var tilstede i penicillin G som substratet, så ble mer enn 50$ av aktiviteten av Proteus vulgaris P-5 beta-laktamase hemmet.

Eksempel 10

Fremgangsmåte for fremstilling av tritylesteren av antibiotikum PS-5

l60 1 filtrert næringsmedium fremstilt som beskrevet

1 eksempel 3 ble behandlet som beskrevet i eksempel 4, hvorved man fikk fremstilt 30,0 g gulbrunt lyofylisert pulver av antibiotikum PS-5 natriumsalt (spesifik aktivitet 27 CCU/mg). Dette pulver ble oppløst i 100 ml dimetylformamid, og man tilsatt®3,0 g trietylamin. Under avkjøling med is tilsatte man 9»0 g tritylklorid mens temperaturen ble holdt under 5°C. Etter rør-ing ved denne temperatur i 12 timer, var all aktiviteten i antibiotikum PS-5 overført til tritylerlngsproduktet. ReaksJoneopp-løsningen ble helt over i 1000 ml 0,5^ fosfatbuffer (pH 6,8), og deretter ekstrahert tre ganger med 1000 ml etylacetat. Etyl-acetatekstraktene ble slått sammen, dehydrert over vannfritt natriumsulfat og fordampet til tørrhet under redusert trykk. Fordampningsreslduumet ble oppløst 1 20 ml benzen og ført gjennom Bio-Beads S-X3 (en porøs styren-divinylbenzensampolymer i form av kuler for gelgjennomtrengning, molekylvcktutelukkelses-grense: 2000, fremstilt av BIO-RAD Laboratories) kolonne på

4,5 x 60 cm som var ekvilibrert på forhånd med benzen. Kolonnen ble så utviklet med benzen. Den aktive fraksjonen som viste en antibiotisk aktivitet på on Comamonas prøveplate, ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. - Det oppnådde resi-duum ble oppløst i 1 ml benzen og tilsatt en silisiumdioksyd-

gelkolønne (silisiumdioksydgel 60, 70 - 230 raesh ASTM, E.

Merck, Darmstadt) (25 g, 1,5 x 24,0 cm). Etter vasking med

en bensin-etylacetatblanding (10 : l) for å fjerne residuale reagenser, ble aktiviteten eluert med en benzen-etylacetatblanding (l : 2). Det aktive eluat ble fordampet til tørrhet under redusert trykk og igjen oppløst i 0,5 ml benzen. Benzenoppløs-ningen ble påsatt en nøytral alumlniumoksydkolonne ( aluminiumoksyd Woelm nøytral, M. Woelm 20g, 0,9 x 22,0 cm) og eluert med en benzen-etylacetatblanding ved forskjellige blandeforhold (10 i 1, 6 t 1, 4 i 1, 3 t 1, 2 i 1 og 1 t i). Aktiveceluater ble slått sammen og fordampet til tørrhet under redusert trykk. Fordampningsresiduumet ble oppløst i 0,3 ml benzen og tilsatt

en silisiumdioksydkolonne (lOg, 0,9 x 22,0 cm) (beskrevet ovenfor). Etter at urenheter var fjernet med en benzen-etylacetatblanding (10 l), ble aktiviteten eluert med en benzen-etylacetatblanding (l t 2) og konsentrert til et fast pulver under redusert trykk» Det oppnådde pulveret ble oppløst i 0,5 ml benzen og renset på en Bio-Beads S-X3kolonne (l,2 x 96 cm) med benzen som elueringsmiddel. Den aktive fraksjon ble fordampet til tørrhet i vakuum»

Det oppnådde tørre pulver ble oppløst i 0,5 ml aceton og underkastet gelfiltrering på en Sephadex LH-20 kolonne( en dråpeformet dekstrangel fremstilt ved å tverrbinde dekstran-kjeder med hydroksyprapyleiring, fremstilt av Pharmacia Fine Chemical AB) (l,2 x 96,0 cm), som på forhånd var svellet 1 aceton. Den aktive fraksjonen ble fordampet til tørrhet, og ga 23 mg hvitt pulver. Omkrystallisering av dette pulver i en benzen-heksanblanding ga 12 mg farveløst krystallinsk pulver av produktet (10.800 CCU/mg). Dette farveløse krystallinske pulver hadde det forønskede produkt, d.v.s. tritylesteren av antibiotikum PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse, hadde følgende fysiske-kjemiske egenskapers^1) Farge farveløst

2) Qppløselighet

Oppløseligheten av trityleringsproduktet åv antibiotikum PS-5 ble bestemt ved at produktet ble oppløst under rysting av 5 mg i 0,1 ml av hver av prøveoppløsningsmidlene ved 20°C. Resultat ene er vist nedenfor: I alt vesentlig uoppløselig i vann, n-heksan eg petroleter (kokepunkt i området fra 30 - 60°C).

Lett oppløselig i benzen, etylacetat, kloroform, metanol, etanol, aceton, dimetylformamid (DMF) og dimetylsulfoksyd

(DMSO).

3) Stabilitet

Tritylesteren av antibiotikum PS-5 ble oppløst i et volum metanol og så fortynnet med 9 volumer destillert vann så snart som mulig, hvorved man fikk en oppløsning på 125 CCU/ml. 1/10 molar dikaliumfosfatoppløsning ble justert med 5N fosforsyre eller 5N natrlumhydroksyd til de angitte pH-verdier i området fra 3-9.

Til 1 ml hver av fosfatbufferne, ble det tilsatt 1 ral av nevnte oppløsning, av tritylesteren av antibiotikum PS-5, og hvis nødvendig, så ble pH-verdien på blandingen igjen justert med fosforsyre eller natrlumhydroksyd til den forønskede pH-ver»„ di. Oppløsningen- ble så holdt i et vannbad ved 60°C 1 30 minutter, avkjølt med rennende vann og nøytralisert til pH 7,0

med en mindre fosforsyre eller natrlumhydroksyd.

Kontrolloppløsningen (pH 7,0) ble holdt i et isbad i den angitte eksperimentperiode. Den gjenværende antibiotiske aktivitet ble bedømt ved den rutinemessige skiveprøvemetoden med Comamonas terrigena B-996 som prøveorganisme. Prosent aktivitet i de varraebehandlede oppløsninger i forhold tii kontroll-oppløsningene er vist i tabell 12.

Det fremgår klart av disse resultater at tritylesteren av Antibiotikum PS-5 or stabil i vandig oppløsning ved 60°C i 30 minutter med en pH-verdi i området fra 6,0 - 9,0.

I tillegg så kunne man ikke påvise noen vesentlig tap av aktivitet etter at en vandig oppløsning av tritylerings produktet av antibiotikum PS-5 var inkubert ved pH 7,5 i 90 minutter ved 60°C.

4) Smeltepunkt

Dette ble målt i et Kofler-mlkrosmeltepunktsapparat BY-1 (Yazava Scientific Mfg. Co.Ltd.), hvor temperatureable hevet med en hastighet på l°C/minutt. Trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 smeltet ved 83,5 - 85,5°C og ble gradvis brunt omkring 140°C.

5) Ultrafiolett absorbsjonsspektrum

Det ultrafiolette absorbsjonsspektrum av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 ifølge foreliggende oppfinnelse ble opptatt på et Hitachi Recording Spectrophotometer Model EPS-3T (Hitachi,Ltd.) ved en konsentrasjon på 138^ag/3ml metanol (fig. 5).

6) Infrarødt absorbsjonsspektrum

Den vedlagte fig. 6 viser det infrarøde absorbsjonsspektrumet for trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 (4,5 mg) i 0,6 ml kloroform slik man fikk det på et Hitachi infrarødt spektrofotometer model 215 (Hitachi,Ltd.). Man fikk karakteristiske absorbsjonsmaksima ved de følgende bølgetallt 3430

3100 - 3000 (C-H i fenylgruppen)

2990

2950

1770 (C»0 1 beta-laktam-ringen)

1695 (-C0- i amidbindingen)

1665 (-CO-O- 1 esterbindingen) 1445

1340

1275

II30 cm"1

7) Protonmagnetiek resonansespektrum

Den vedlagte fig. 7 viser 100 MHz protonmagnetisk resonansspektrura for antibiotikum PS-5 tritylester slik dette ble målt med 4,5 mg av nevnte tritylester i 0,3 ml deutero-kloroform, idet man brukte en JEOL NMR spektrometer JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co.Ltd.). De mest karakteristiske signaler er følgende:

triplett omkring 1,19PP™ (J ca. 7,0 Hz)

singlett ved 1,86 ppm

multiplett i området 7,10 - 7,56 ppM

(protoner i benzenringen i tritylgruppen).

8) Elementæranalyse

3»5æg av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 ble tørket ved romtemperatur i 4 timer ved et redusert trykk

„ -2

på 1 x IO mm Hg, og deretter underkastet en elementæranalyse med følgende resultat:

funnet:

t

C 61,89 $

H 5,78 #

N 4,48-$

S 4,62 $

9) FarvereaksJ on s

10) Tynnsjiktkromatografi ( TLC)

Tritylesteren av antibiotikum PS-5 ga følgende Rf-verdler under de angitte betingelser. Selve Rf-punktet ble fastslått ved bio-autografi på Comamonas terrigena B-996.

(a) Silisiumdioksydgel TLC

Plate: For-belagte silislumdioksydgelplate 60 F2ih* E»Merck,

Darmstadt Oppløsningsmiddelsystem: benzen/aceton (2/l)

Rf : 0,29

(b) Cellulose. TLC

Platet EASTMAN CHROMAGRAM Sheet 13254 cellulose med fluoresaens-middel. Molekylstrukturen for antibiotikum PS-5 og de ovennevnte angitte fysiske og kjemiske egenskaper understøtter den følgende struktur for tritylesteren av antibiotikum PS-5»

De biologiske egenskaper for tritylesteren av antibiotikum PS-5©r vist i det følgende}

i) Antimikroblelt spektrum»

De mlnimumshemmende konsentrasjonsverdier for forbindelsen ble bestemt på forskjellige patogene mikroorganismer deri-blant flere resistente raser idet man brukte den velkjente for-tynningsmetoden i BRAIN HEART INFUSION BROTH "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO.,Ltd.).

Mer spesielt ble tritylesteren av antibiotikum PS-5 oppløst i en mindre mengde metanol og fortynnet så raskt som

mulig i nevnte BRAIN HEART INFUSION BROTH "Eiken" (EIKEN CHEMICAL CO.,Ltd.) , inntil konsentrasjonen av tritylesteren av antibiotikum PS-5 var i området fra kO^g/ml til 20 ^tg/ml. Konsentrasjonen av metanol i sluttoppløsningen oversteg ikke 10$. Denne oppløsning ble fortynnet i en to-veis geometrisk serie. De mikroorganismer som er angitt i tabell 13, ble kultivert i 18 timer ved 28°C 1 samme medium og inokulert i en serie fortynninger til én sluttinokulumstørrelse på 1 x lo celle/ml.

Resultatene ble avlest etter inkubering ved 35°C i 20 timer. Den minimumshemmende konsentrasjon betyr den laveste konsentra-sjonsenhet av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 hvor man ikke kunne påvise noen vekst av den tilsvarende mikroorganisme under de ovenfor angitte betingelser. Som kontrollantibiotika brukte man oppløsninger av amicillin og cefaloridin fremstilt i nevnte medium ved pH 7*0 i en konsentrasjon på 100 ^ag/ml og behandlet på samme måte.

Tabell 13 angir MIC-verdier for tritylesteren av antibiotikum PS-5 sammen med de tilsvarende verdier for ampicillin og cefaloridin som kontrollantibiotika.

Det fremgår av tabellen at tritylesteren av antibiotikum PS-5 har et bredt antimikrobielt spektrum, og har spesielt sterk antibiotisk aktivitet på forskjellige beta—laktam-resistente (beta-laktamase-fremstillende) raser av mikroorganismer.

2) Forsterkende effekt av tritylesteren av antibiotikum PS-5

på den antibiotiske aktivitet av penicillin og cefalosporin forbindelser mot resistente mikroorganismer:

(4) Prøve Petri-skler (9 cm i diameter) inneholdende resistente mikroorganismer ble fremstilt ved at man over 10 ml smeltet næringsagar inokulert med beta-laktam-resistente (beta-laktamase- f r ems ti Ilende) mikroorganismer, et fast lag av næringsagar (pH 7,0, 15 ml) inneholdende 50^og/ml av penicillin 6 eller cefaloridin. Som beskrevet tidligere ble de antibiotiske opp-løsninger som skulle prøves, påsatt 1 en mengde på 25 ^al 1 en 8 mm'e pappskive og plasert på nevnte prøveplater. Etter inkubering i 18 timer ved 35°C ble inbiberingsringene målt og sammenlignet med de tilsvarende plater som ikke inneholdt verken penicillin G eller cefaloridin. Tabell 14 angir resultatene. Bet fremgår meget klart at kombinasjojaen av tritybringsproduktet av antibiotikum PS-5 ved en konsentrasjon som ligger under den nedre grense for prøveskiven, med penicillin eller cefaloridin, ved en konsentrasjon under nevnte grense, ga en tydelig hemningssone. Dette faktum viser klart at man får en forsterkning av den antibiotiske aktiviteten i penicillin G eller cafloridin med trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5.

(b) Som et annot bevis på en forsterkning ble den antimikrobielle synergisme for trityleringsproduktet av antibioti-

kum PS-5 taed cefaloridin bekreftet ved en fortynningsmetode på en 8-laktam-resistent rase av Proteus vulgaris. Først ble det

fremstilt fem prøver av lageroppløsninger inneholdende cefaloridin og tritylesteren av antibiotikum PS-5 ved forskjellige konsentrasjoner slik dette er angitt i tabell 15»idet man brukte den tidligere refererte BRAIN HEART INFUSION BROTH "eiken"

(PH 7,0).

Fra hver lageroppløsning.tok man ut tre prøver til underlageroppløsninger ved fortynninger i forholdet 1 t 2, 2 s 5 og 3 : 10 i nevnte medium. Totalt fikk man da 15 prøver av disse underoppløsninger. Ved hver underoppløsning foretok man 15 trinn av en 2-trinns fortynning i nevnte medium. Til hvor av de 15 fortynningene inokulerte man Proteus vulgaris P-5 i en s lut tkons entra sjon på 1 x 10 5 cellør/taS: og foretokkon inkubering ved 35°C i 20 timor. Den minimumshemmende fortynning ble avlest for hver oppløsning. De oppnådde resultater er angitt i tabell 16.

Skjønt synergismen fremgår av tabell 16, så er det lettere å bevise den synergistisk©effekt av tritylesteren av antibiotikum PS-5 på cefaloridin når MIC-resultåtene er uttrykt som den relative verdi i forhold til MIC for hvert antibiotikum alene. Tabell 17 viser synergismen mellom to antibiotiske forbindelser hvor MIC-verdiene for hvert antibiotikum alene er uttrykt som 100.

Tabell 17 viser klart den synergistiske effekten av tritylesteren av antibiotikum PS-5 på cefaloridin. Når Proteus vulgaris P-5 som er resistent over^orrbeta-laktam-forbindelser på grunn av beta-laktamase-fremstilling, ble brukt som proveorga-nisme, så ga kombinasjonen av 7,5$ av MIC—verdien for cefaloridin og 12,5$ av MIC-verdien for tritylesteren av antibiotikum PS-5, on hemning av veksten av nevnte prøveorganisme.

3) In vivo aktivitett

In vivo aktiviteten av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 ble målt 1 mus intraperltonalt infisert med 5 x 10^ «i celler/mus av Staphylococcus aurens Smith. Tritylesteren av antibiotikum PS-5 ble subkutenøst injisert like etter infeksjonen.

Den 50$ helbredende dose i hannlige ddy mus (SHOZUOKA) var 2,55 mg/kg (27.5^0 CCU/kg).

k) Beta- laktamase- hemmende aktivitet

(A) Prøvemetode

CEU

I^q verdien for hydrolyse av cefaloridin ved beta-laktamase i 10 minutter (fra ett minutt til ti minutter etter at inkuberingen var startet). Hydrolysehastigheten for cefaloridin ble målt ved å måle senkningen av den optiske tettheten ved 225 mn. For rutinehemningsprøver brukte man beta-laktamase fra Citrobactor freundii E-9 og Proteus vulgaris P-5 etter rensing ved affinitetskromatografi med cefaleksln-sefarose #B.

B) Reagens

Buffer» 0,1M fosfatbuffer (Na-K fosfat) (pH 6,8)

Substrat» 0,05 mikromol/ml i fosfatbuffer Beta-laktamase» Enzymet ble fortynnet tilstrekkelig til at man fikk et fall på ca. 0,1 optisk tetthetsenhet pr. 10 minutter ved 255 mn i fravær av en hemmer (Apparat» Hitachi spektrofotometer UV-VIS 139, Hitachi,Ltd.)

(Dette apparat kan holde en kontroll-kuvette og tre prøve*~ kuvetter. Man brukte 4 1 cm's kvarts kuvetter med et

volum på 3 ml» Temperaturen var 30°C under forsøket). Inhibitor» Fortynning ble utført i 0,1M fosfatbuffer (pH 6,8)

eller i dimetylsulfoksyd (DMSO).

Kontrollkuvetten inneholdt samme mengde av den fortynnende

oppløsningen uten inhibitor.

ReaksJonsbetingelser» Enzym-inhibitorblandingen med den følgende sammensetning ble for-inkubert i 15 minutter ved 30°C. fosfatbuffer 100 pl enzym 0,5 - 2,0yul inhibitor 0,5 - 40ytl

Etter for-inkuberingen ble substratoppløsningen som var forvarmet til 30°G og hadde et volum på 3,0 ml, tilsatt, og raskt blandet for å starte reaksjonen. Reaksjonen ble fulgt ved å måle forandringen av den optiske tettheten ved 255 mu i IO minutter ved 30 C. Verdien for I^q (jag/ml) ble bestemt ved å fortynne inhibitoren inntil fortynningen ga 50$ av hydrolysehastigheten for cefaloridin slik denne kunne måles i en kontroll uten hemmer i 10 minutter (fra 1 minutt til 11 minutter etter at substratet var tilsatt).

(c) Resultater

Under de ovennevnte beskrevne betingelser fikk man

CER

følgende I-Q verdier med tritylesteren av antibiotikum PS-5*

Således ble 50$ av hydrolysen av cefaloridin hemmet med 0,060^ug/ml og .0,80^ug/ml av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 ved en prøve ved hjelp av beta-laktamase fra Proteus vulgaris P-5 og Citrobacter freundii E-9 henholdsvis, under de angitte betingelser.

5) Toksltet

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5 ga ingen dødsfall hos hannlige ddy mus (Shizuoka) når det ble tilført i en intra-perl toneal dose på 500 mg/kg.

Eksempel 11

Fremgangsmåte for fremstilling av trityleringsproduktet av antibiotikum PS- 5.,

Det gulbrune saltpulveret av antibiotikum PS-5 (715 mg, 235 CCU/mg) fremstilt som beskrevet i eksempel 7, ble oppløst i 3,5 ml heksametylfosforamid (HMPA). Etter tilsetning av 70 mg trietylamin under avkjøling med is, ble 250 mg tritylbromid tilsatt blandingen ved en temperatur under 10°C. Temperaturen var 10° og blandingen ble rørt i 7 timer for å få en fullstendig trityleringsreaksjon. Reaksjonsblandingen ble helt over i 50 ml isvann og hensatt inntil isen smeltet.

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5.ble ekstrahert tre ganger med 15 ml benzen og behandlet som beskrevet i eksempel 10, hvorved man fikk 9,4 mg farveløst krystallinsk pulver av det forønskede produkt. De fysiske og kjemiske egenskaper av. dette preparat var praktisk talt identisk med de som er angitt i eksempel 10.

Eksempel 12

Fremstilling av trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 1 nærvar av en såkalt krone- eter.

Det urene hvitbrune lyofiliseringspulveret (10,1 g) fremstilt som beskrevet i eksempel 5, ble suspendert i 200 ml metylenklorld og oppløst under røring og under tilsetning av 1 ml 15-krone-5 (Nippon Soda Co.,Ltd.). Mens temperaturen på oppløsningen ble holdt under 5° ved hjelp av is, ble 8,5 g tritylklorid tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og rørt i 3 timer. Etter filtrering ble filtratet fordampet til tørrhet under redusert trykk. Residuumet ble opp-last i 10 ml benzen en gang, filtrert og renset ved samme frem gangsmåte som beskrevet i eksempel 10, hvorved man fikk 7,3 mg av et farveløst,' krystallinsk pulver. Dette pulver hadde samme fysiake-kjemiske egenskaper som produktet fra eksempel 10.

Eksempel 13

Fremgangsmåte for fremstilling av trityleringsproduktet av antibiotikum PS- 5 i nærvær av et kvaternært ammoniumsalt.

Antibiotikumet PS-5 ble ekstrahert fra 48 1 filtrert næringsmedium (li,7 CCU/ml) to ganger med 15 1 dlklormetan inneholdende 0,05$ cetyldimetylbenzylammoniumklorid (aktivitet på diklormetanekstraktet: 24,0 CCU/ml, aktivitet på brukt filtrat. 5,7 CCU/ml). Diklormetanekstraktet ble tørket over 400 g vannfritt natriumsulfat og fordampet til 500 ml under redusert trykk i en roterende fordamper. Konsentratet (450CCU/ml) ble dehydrert først over 10 g vannfritt natriumsulfat og etter filtrering med 5 S av en molekylær sil 4A (Union Carbide Corp.)

Den tørre oppløsningen ble tilsatt 4,5§tritylklorid ved en temperatur under 5°, og blandingen ble rørt i 5 timer ved 5°. Etter fjerning av dlklormetan ved fordampning ved romtemperatur, ble residuumet oppløst i 15 ml benzen og renset på samme måte som beskrevet i eksempel 10, hvorved man fikk 8 mg vannfritt krystallinsk pulver av tritylesteren av antibiotikumet PS-5.

De fysiske-kjemiske egenskaper for dette preparat var de samme som beskrevet for preparatet fra eksempel 10.

Eksempel 14 Antibiotikum PS- 5 met<y>lester 90 mg av antibiotikum PS-5 natriumsaltet fremstilt som beskrevet i eksempel 9 (8000 CCU/mg) ble suspendert i 3 ml tørr dimetylformamid, hvoretter man tilsatte 50 mg trietylamin og 0,3 ml metyljodid. Etter røring i 2,5 time ved romtemperatur ble 100 ml benzen tilsatt og blandet for ekstraksjon. Benzen-laget ble utskilt, vasket med 100 ml 0,1M, j»H 6,8, fosfatbuffer og så tørket over vannfritt natriumsulfat. Den tørre benzenopp-løsning ble konsentrert til et lite volum under redusert trykk og påsatt en Bio-Beads S-X3 (BIO-RAD Laboratories) kolonne (1,2 x 90 cm).

Metylesteren ble eluert med benzen. EluatfraksJoner som inneholdt esteren ble slått sammen, fordampet til tørrhet undervredusert trykk og man fikk en fargeløs olje. Det olje aktige materialet ble oppløst i en mindre mengde aceton og kro-matografert på on Sephadex LH-20 (1,2 x 90 cm) kolonne med aceton som elueringsmiddel, Eluatfraksjoner som inneholdt metylesteren av antibiotikumet ble oppsamlet og fortørret til tørr-het, hvorved man fikk 11,2 mg antibiotikum PS-5 metylester. Metylesteren hadde følgende fysiske og kjemiske egenskaper:

(1) Tynnsjiktkromatografi

Rf a 0,45 (Silisiumdioksydgel 60 F,.», plate: benzentacøton a

(2) Ultrafiolett absorbsjonsmaksimum i metanol

<CH>30H315,<5>nm

f\ f max

(3) Infrarødt absorbsjonsmaksima i kloroform 3430, 1766, 1660 cm"<1>(4) Signaler i protonmagnetisk resonansespektrum i deuterioklo-roform (|p

1,05 (3H, t, J*7,5 Hz)

1,7 2,0 (2H,m)

2,00(2H,s)

2,8 - 3,65(7H,m)

3.83 (3H,s)

3.84 - 4,06 (lH,m)

(5) Molekylvekt (høyoppløsningsmassespektrometri)

312,1131 (funnet)

312,1143: beregnet for C^H^NgO^S

Den følgende struktur ble gitt metylesteren av antibiotikum PS-5 på basis av de tidligere beskrevne strukturer og de ovennevnte angitte fysiske og kjemiske egenskaper:

Den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 14 ble gjentatt med etyljodid, isopropyljodid, isobutyljodid, n-pentyl-jodld eller n-heksyljodid istedenfor metyljodid, og man fikk

følgende ester© henholdsvis*

antibiotikum PS-5 etylester

antibiotikum PS-5 isopropylester

antibiotikum PS-5 isobutylester

antibiotikum PS-5 n-pentylester

antibiotikum PS-5 n-heksylester

Dannelsen av disse estere kunne bekreftes ved tynnsjiktkromatografi, infrarød absorbsjonsspektrum©tri, protonmagnetisk resonansespektrometri og massespektrometri.

Som nevnt tidligere kan prepratet eller sammensetningen inneholdende antibiotikum PS-5 og/eller tritylesteren av nevnte antibiotikum tilføres i forskjellige enhetsdoseformer enten dette er i fast eller flytende form* Nevnte enhotsdose enten den er fast eller flytende kan Inneholde den aktive ingrediens i mengde på fra 0,1 til 99$, fortrinnsvis fra 10 - 60$. Mengden av den aktive ingrediens i sammensetningen vil være avhengig av doseringsformen og den totale vekt på preparatet, men vil vanligvis ligge i området fra 10 til 1000 mg, fortrinnsvis 100 til 1000 mg.

Ved parenteral tilførsel vil enhetsdosen vanligvis være rent eller meget sterkt renset antibiotikum PS-5, et farmasøytisk akseptabelt salt og/eller trityleringsproduktet av antibiotikum PS-5 i en steril vannoppløsnlng eller i form av et oppløselig pulver som skal brukes for en slik oppløsning.

Representative preparater inneholdende antibiotikum PS-5 og/eller trityleringsproduktet av nevnte antibiotikum kan fremstilles på følgende måte:

Eksempel A : Kapsler

Den aktive forbindelsen og fortynningsmidlene blandes skikkelig slik at man får en jevn blanding. 200 mg av blandingen fylles i en nr. 3 hard gelatlnkapsel*

Eksempel B t Tabletter

X ovennevnte sammensetning eller preparat blir den aktive komponenten blandet med laktose og halvparten av mais* stivelsen.

Blandingen blir granulert med 10$ av den nevnte mengde av maisstivelsespasta og deretter siktet. Resten av maisstivel* sen og magnesiumstoåratet blir tilsatt, og blandingen blir pres* set til tabletter med en diameter på ca. 1 cm, og som hver veier 500 mg.

Eksempel C i Lyoform for injeksjon

Den aktive komponent blir oppløst i sterilt vann for injeksjon, filtrert og så sterilisert. Oppløsningen blir så oppdelt i sterile ampuller, og vannet blir aseptisk fjernet ved lyofilisering. Ampullene vil så inneholde et sterilt fast stoff som vil være aseptisk lukket.

Forlå få et preparat for parenteral tilførsel, kan 2 ml steril fysiologisk saltoppløsning tilsettes innholdet av en am* pulle.

Eksempel D t Tabletter

Antibiotikum PS-5 og cefaloridinet blandes med de andre ingrediensene og presses til tabletter som beskrevet i eksempel B. Tablettene dekkes først med et sukkerbelegg og så mod et enterisk belegg.

Eksempel E » Tabletter

Tablettene inneholdende antibiotikum PS-5 og amino-benzylpenicillin fremstilt på samme måte som beskrevet i eksempel B.

Eksempel F i Kapsler

Den aktive ingrediens og fortynningsmidlene blandes til en homogen blanding. Ca. 200 mg av blandingen fylles i en nr. 3 hard kapsle.

Eksempel G t Tabletter

X ovennevnte eksempel blir de aktive ingredienser blandet med laktosen og halvparten av maisstlvelsen i den angitte forhold. Blandingen granuleres med 10$ av den angitte mengde malsstivelse og siktes. Magnesiumstoaratet og resten av mais* stivelsen tilsettes, og blandingen presses til tabletter på en cm i diameter og som veier 500 mg. Tablettene belegges først med et sukkerbelegg og så med et enterisk belegg.

Eksempel H i Lyoform for injeksjon

Den aktive komponent oppløses i sterilt destillert vann for injeksjon og steriliseres ved filtrering. Oppløsningen blir så oppdelt i ampuller og aseptisk frye©tørket. Ampullene vil inneholde et sterilt fast stoff som vil være aseptisk inne* lukket.

Ved injeksjon tilsetter man 2 ml sterilt 70$ M*{beta-hydrpksyetyl)*laktamid til innholdet av ampullen.

Eksempel I t Tabletter

Tritylesteren av antibiotikumet PS-5 og cefaloridinet blandes på samme måte som beskrevet i eksempel G og presses så til tabletter som kan belegges.

Eksempel J 9 Tabletter

De aktive ingredienser blandes og bearbeides på samme måte som beskrevet i eksempel X.

Beskrivelse av tegningene!

Fig. 1 er et ultrafiolett absorbsjonsspektrum av na-trlumsaltet av antibiotikum PS-5, fremstilt som beskrevet i eksempel 9. Fig. 2 er et infrarødt absorbsjonsspektrum av antibiotikum PS-5 natriumsalt. Fig. 3 er et protonmagnetisk resonansspektrum av natriumsalt et av antibiotikumet PS-5*

Fig. k viser nedbrytningen av penicillin G ved hjelp

av beta-laktamase fra Proteus vulgaris P-5, og som viser den hemmende aktiviteten av antibiotikum PS-5 fremstilt som angitt 1 eksempel 9*

Fig. 5 or det ultrafiolette absorbsjonsspektrumets. av tritylesteren av antibiotikum PS-5 fremstilt som beskrevet i eksempel 10. Fig. 6 or det infrarøde absorbsjonsspektrumet av nevnte tritylester av antibiotikum PS-5*Fig. 7 or det protonmagnetiske resonansspektrumet av nevnte tritylester av antibiotikum PS-5*

Claims (1)

1. Forbindelse, karakterisert ved forme-len . ■ ■

hvor R^ representerer hydrogen, laver© alkyl og trifenylmetyl, samt salter av forbindelsene hvor R^ er hydrogen.

2. Forbindelse Ifølge krav 1, karakterisert ved at er hydrogen.

3« Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at er trifenylmetyl.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R^© r metyl.

5. Forbindelse Ifølge krav 1, karakterisert ved å> være et farmasøytisk akseptabelt salt av den angitte forbindelse hvor R^ er hydrogen.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved å være natriumsaltet av forbindelsen hvor R, er hydrogen.

7. Natriumsaltet av antibiotikum PS-5»karakterisert ved å være i en i alt vesentlig ren form.

8. Antibiotisk effektiv sammensetning, karakterisert ved å innbefatte et egnet farmasøytisk bærestoff eller fortynningsmiddol og som aktiv ingrediens en forbindelse med formel A

hvor R^ representerer hydrogen, lavere alkyl og trifenylmetyl, Og heri inngår salter av forbindelsene hvor R^ er hydrogen.

9. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at den aktive ingrediens er et farmasøytisk akseptablet salt av forbindelsen hvor R^© r hydrogen.

10. Sammensotning ifølge krav 8, karakterisert ved at den aktive ingrediens er forbindelsen hvor R er trifenylmetyl.

1

11. Sammensetning ifølge krav 8 til IO, karakterisert v o d at den aktive ingrediens er tilstede i en antibiotisk effektiv mengde.

12» Antibiotisk aktiv sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at forbindolsen A blandes med et beta-laktamase-følsomt antibiotikum i en tilstrekkelig mengde til at man får en synergistisk effekt for antibiotika som or følsomme overfor beta-laktamase*fremsti11ende bakterier» 13» Sammensetning ifølge krav 12.karakterisert ved at forbindelsen med formel A velges fra farma-søytisk akseptable salter av forbindelsen hvor R. er hydrogen og forbindelser hvor, R.^ er trif enylmetyl. lk. Sammensetning ifølge krav 12, karakterisert ved at det beta-laktamase-følsomme antibiotikum velges fra gruppen bestående av penicillin og cefalosporinderi-vator.

15» Sammensetning Ifølge krav 12, karakterisert ved at forholdet mellom forbindelsen med formel A og det beta-laktamase-følsomme antibiotikum varier fra 10 t til 1 i 100.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med følgende formol

hvor R^ representerer hydrogen, lavere alkyl og trifenylmetyl samt salter av forbindelsene hvor er hydrogen, karakterisert ved at man aerobt kultiverer i et næringsmedium en mikroorganisme som er istand til å fremstille den antibiotiske aktiviteten i forbindelsen med formel A hvor JEt, er hydrogen, isolerer nevnte aktivitet fra næringsmediet og omdanner forbindelsen med formol A hvor R^ er hydrogen eller salter av denne til en forbindelse med formel A hvor R^ er lavere alkyl eller trif© nyImetyl med en reaksjon mod et lavere diazoalkan ellor on forbindelse med formel RY hvor R or lavere alkyl eller trifenylmetyl og Y representerer et atom oller en gruppe som lett kan avspaltes.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den anvendte mikrobe velges fra Streptomyces A271, dens naturlige og kunstige mutanter som er istand til å fremstill® nevnte antibiotiske aktivitet.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte mikrobe er Streptomyces A271.

19* Fremgangsmåte Ifølge krav 16, karakterisert ved at fermenteringen utføres ved eh temperatur mellom 20 og 40°C, ved on pH mellom 4 og 9 og i et tidsrom fra 30 til 90 timer.

20. Fremgangsmåt© lfølg© krav 14, k a r a k t o r i-s e r t v e d at isoleringen av det antibiotisk aktive fer-ment eringsprodukt utføres ved hjelp av en kjent fremgangsmåte som vanligvis brukes for innvinning av antibiotika av karbokøyl- syretypen fra deres fermenteringsmedlum.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den antibiotiske aktiviteten isoleres som natriumsaltet av forbindelse med formel A hvor er hydrogen.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den antibiotiske aktivitoten hvor B.^ ©r hydrogen eller et salt av denne, omdannes til on forbindelse med formel A hvor Rj er lavere alkyl eller trityl ved on reaksjon mod en forbindelse med formel RY hvor R er lavere alkyl eller tri- . fenylmetyl, og Y representerer et atom eller on gruppe som lett kan avspaltes.

23. Fremgangsmåte for bekjempelse eller hindring av en bakterieinfeksjon hos pattedyr, karakterisert ved at man tilfører en antibiotisk effektiv mengde av en forbindelse med formel Å

hvor R^ representerer hydrogen, lavere alkyl og trifenylmetyl eller salter av forbindelsene hvor R^ er hydrogen* 24. Fremgangsmåte for bekjempelse eller hindring av bakterieinfeksjon hos pattedyr, karakterisert ved at man tilfører ei* forbindelse med formel A

hvor R^ representerer hydrogen, laver© alkyl og trifenylmetyl eller salter av forbindelsene hvor R^ er hydrogen, i kombina sjon med et beta-laktamase-følsomt antibiotikum i en totalt antibiotisk effektiv mengde. 25• Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert v edd at forbindelsen er et farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelsen med formel A hvor R^ er hydrogen.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 23, k a r a k t© r i-s e r t ved at forbindelsen er on forbindelse med formel A hvor Rjl er trif enylmetyl.

27* Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at forbindelsen med formel A velges fra farma-søytisk akseptable salter av forbindelsen hvor R^ er hydrogen og forbindelser hvor R^ er trifenylmetyl og det beta-laktamase-følsomme antibiotikum velges fra gruppen bestående av penicillin og c© falosporinderivator. 28. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at produktot med formel A og det beta-laktamase-følsomme antibiotikum brukes i et mengdeforhold, varierende fra 101 1 til 1 s 100. 29. Biologisk ren kultur, karakterisert ved å være av bakteri© rasen Streptomyces A271.