JPS6029476B2 - シトフアギンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗生物質シトフアギン （Ｃ〆ｏｐｈａｇｎ）およびその製造法に関する。

本発明は、サィトフアガ属に属するある種の微生物が、
とくにグラム腸性菌に対して強い発育阻止作用を有する
物質を生産するという知見に基づくものである。この新
規抗生物質（本発明者によりシトフアギンと命名された
）を生産する能力を有する微生物は、本発明者によって
岐阜県琴水苑水場の土壌から採取され分離されたもので
ある。従って本発明の目的はシトフアギンおよびその製
造法を提供することにある。本発明により提供されるシ
トフアギンの理化学的性状は以下に示した通りである。

‘１’元素分析値：日 ６．９４％，Ｃ ４７．２２％
，Ｎ １３．２１％ 【２｝ 分子量：セフアデツクスＬＨ２０（ファーマシ
ア社製）によるゲル炉過の結果、１０００〜１５００と
推定される。

トリプトフアンによるＯＤ側の値から１３８０と計算さ
れ、アミノ酸分析の結果もこの値を支持している。‘３
｝ 融点：２１０ｄｏ付近より褐変し【まじめ２２０ｑ
ｏ付近で発泡分解する。

■ 比旋光度：〔Ｑ〕色５十５０（Ｃ＝１，ＤＭＳＯ）
｛５｝ 紫外線吸収スペクトル：第１図に示した通りで
ある。

【６１ 赤外線吸収スペクトル：第２図に示した通りで
ある。

‘７１溶剤に対する溶解性：酢酸、ジメチルスルホキシ
ドによく溶け、メタノール、エタノールにやや溶けるが
、水、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、エチルエ
ーテルにもとんど溶けない。

■ 呈色反応：ニンヒドリン反応、エールリツヒ反応、
ィサチン反応に陽性を示し、坂口反応、ポーリー反応、
ァニシジン反応に陰性を示す。

‘９１ 塩基性、酸性、中性の区別：炉紙電気泳動の結
果、中性物質の挙動を示す。００ 物質の色：寒色粉末 （１１）アミノ酸組成：３規定メタンスルホン酸で１１
ぴ０、２岬時間分解し、アミノ酸分析計で分析した結果
、リジン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、プロ
リン、グリシン、ロイシンおよびトリプトフアンが検出
され、ニンヒドリン発色により腸性な未同定の三つの化
合物（これらはアミノ酸と考えられる）が検出される。

分子量と構成アミノ酸の関係から、本物質はこれらのア
ミノ酸を各１分子含有することがわかる。（１２）シリ
カゲル薄層クロマトグラフィー〔シリカゲルとしてシリ
カゲルプレート５７２１（メルク社製）を用いる〕のＲ
ｆ値：ｎーブタノール：酢酸：水（１２：３：５）０．
２３シトフアギンの各種微生物に対する最小発育阻止濃
度は第１表に示した通りである。

第１表 第１表で示すようにシトフアギンはグラム陽性菌に対し
て強い発育阻止作用を有ししている。

また本物質の急性毒性についてマウスを用いて試験した
結果、腹腔内投与で２００ｍｐ／ｋ９で全例（２例）生
存した。従って本物質は抗菌剤および薬剤としての用途
が期待される。シトフアギンは前記したごと〈、１１種
類のアミノ酸から成るべプチド抗生物質である。

サィトファガ属が生産する抗生物質は現在まで報告され
ていない。またサイトフアガ属以外のバクテリアあるい
は放線菌が生産するべプチド抗生物質は多数知られてい
るが、とくにアミノ酸組成においていずれも本物質とは
異なる。以上の結果からシトフアギンは新抗生物質であ
ると判定した。次にシトファギンの製造法について説明
する。

シトフアギンはサィトフアガ属に属し、かつシトフアギ
ソ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にシ
トフアギンを蓄積させ、培養物からシトファギンを採取
することによって得ることができる。サィトフアガ属に
属するシトフアギン生産能を有する菌株の例は、実施例
記載のサィトフアガ属ＢＭＦ６９４−Ｎ３（徴工研菌客
第４８４６号）であるが、本菌株の変異株も使用するこ
とができる。

サィトフアガＢＭＦ６９４一Ｎ３の菌学的性状は下記の
通りである。（１）形態 肉汁寒天上で培養した細胞は０．２〜０．４×１．２〜
１２ミクロンの長菌である。

滑走（ｇｌｉｄｊｎｇ）により運動し、鞭毛はない。胞
子を作らず多形性も示さない。グラム染色性は陰性であ
る。（０）培養的性質 【１｝ 肉汁寒天平板培養：コロニーの形態は栄養源の
濃度によって著しく変化する。

富栄養寒天渚地（通常のべプトン１％を含む肉汁など）
ではコロニーは台状ないし半円状に盛り上がり周辺は全
縁（ｅｎｔｉｒｅ）であるが、ベプトン０．２％を含む
寒天培地などの栄養の乏しい培地ではコロニーは局平状
となり滑走（ｇｉｄｉｎｇ）により周囲に薄い拡がりを
もつようになる。

菌体は黄色を呈する。‘２１ 肉汁液体培養：塔地全体
が濁り特に液面付近の濁りが強い。

‘３１ 肉汁ゼラチン穿刺培養：液面付近より徐々に液
化される。

■ ミルク培養：変化なし。

（ｍ）生理的性質 （１’硝酸塩の還元：陰性 ‘２｝ 脱窒反応：陰性 ■ Ｍ旧テスト：陰性 ‘４｝ ＶＰテスト：陰性 ‘５｝ インドールの生成：陰性 【６｝ 硫化水素の生成：陰性 ‘７ー デンプンの加水分解：陽・性 ■ クエン酸の利用：陽性 ■ 無機窒素源の利用：アンモニウム塩を唯・一のの窒
素源として利用できる。

血 色素の生成：黄色の非水海性色素を生成する。

（１１）ゥレアーゼ：陰性 （１２）オキシターゼ：弱く陽性 （１３）カタラーゼ：陰性 （１４）生育の範囲：ｐＨ６〜１０，３５ｑ○以下で生
育（適温１５〜３０００）（１５）酸素に対する態度：
通性嫌気性 （１６）○−Ｆテスト：パラフィンシールの有無にかか
わらずゆっくりと酸を生成する。

（１７）糖の利用性：グルコース、フラクト−ス、シユ
ークロース、マルトース、ラクトース、マンノース、ト
レハロース、デキストリン、デンプンを利用できる。

ガラクトース、キシロース、アルビノー ス、ソルビツト、マンニツト、イノシツト、グリセリン
を利用できない。

糖の資化は振濠培養でははっきり認められるが、静層で
は非常にゆるやかである。

以上の菌学的性質を有するＢＭＦ６９４−Ｎ乳珠をパー
ジエース、マニュアル、オプ・デターミネイティブ・バ
クテリオロジー第８版（故て袋ｙ，ｓＮねｎ雌ｌ ｏｆ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｊｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ がｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９７４）と比較し以下の
結論を得た。

グラム陰性の長樟菌で細胞の長さは変化するが分枝、ラ
センあるいはさやを持つことはない。寒天培養において
コロニーは黄色を呈する。栄養源の少ない寒天塔地にお
いて滑走（ｇｊｄｉｎｇ）によりコロニーは周辺に薄い
広がりを持つ。上記の性質からこの菌はサィトフアガが
所属すると同定できる。本発明によるシトフアギン生産
菌の培養には、通常の微生物の発酵に用いられる各種の
培地が用いられる。

たとえば炭素源としてはグルコース、デキストリン、シ
ュークロース、マルトース等が、また窒素源としてはべ
プトン、コーンステイープリカー、大豆粕、硫酸アンモ
ニウム等が用いられる。

また食塩や炭酸カルシウム等の無機塩を併用することも
あり、必要により消泡剤を添加することもある。培養方
法としては振縁培養法、深部通気蝿梓培養等の液体培養
を使用するる方法が適当である。培養温度は１０〜３５
ｑ○の範囲で選択され、培養日数は２〜５日が適当であ
る。シトフアギンは主として培養液内に蓄積される。シ
トファギンの検定には、たとえば検定用培養基として普
通寒天塔地を用い、検定菌としてスタヒロコツカス・ア
ウレウス ２０■またはバチルス・ズブチリス ＰＣ１
２１９を用いる。

シトファギンは前記の理化学的性状を有するので、その
性状に従って常法により抽出、精製することが可能であ
り、たとえば以下に示す方法が効率的である。

有効成分を含む培養液をアンバーライトＸＡＤ−２（ロ
ームアンドハース社）を充填したカラムに通塔させると
有効成分は吸着される。

カラムを脱イオン水、５０％メタノール水で洗った後、
有効成分を５０％プロパノールだ熔出させる。溶出液を
濃縮し、生じた沈殿を酢酸に溶解し、酢酸エチルを添加
すると有効成分は沈殿する。沈殿を集め減圧乾間してシ
トフアギンの粗製品を得る。さらに精製するには、ゲル
炉過剤、イオン交換樹脂を使用したクロマトグラフィー
、ブタノール抽出あるいは沈殿法を組み合わせ、精製品
を得る。実施例 １ ５００の‘客三角フラスコ８０本１こガラクトース２％
、デキストリン２％、パクトソイトン（Ｄｉｆｃｏ社）
１％、コーンステイーブリカー０．５％、硫酸アンモニ
ウム０．２％、消泡用シリコン０．０３％を含む液体培
地を１１０の‘ずつ分注して綿栓を施し、１２０℃、１
８分加圧滅菌し、同培地に生育したサィトフアガＢＭＦ
６９４−Ｎ３（徴工研菌寄第４槌６号）を槍菌した。

３ぴ０、４日間振濠培養してシトフアギン５０〆ｇ／の
‘を含む培養液６そを得た。

この培養液（ｐＨ７．７）をアンバーライトＸＡＤ一２
（ロームアンドハース社）ＩＺを充填した塔に通過させ
ると有効成分は樹脂に吸着される。この塔を水、ついで
メタノール：水（１：１）で洗浄後ｎ−プロパノール：
水（１：１）で有効成分を溶出させ、減圧濃縮すると有
効成分は沈殿する。この沈殿を酢酸５０の‘に溶解し、
不落物を炉別後、５００叫の酢酸エチルを加えると有効
成分は再び沈殿する。この沈殿物を酢酸５０の‘に溶解
し、水５００の上とｎ−ブタノール５００の‘を加え振
縁すると有効成分はｎ−ブタノールに抽出される。水層
から５００叫のｎーブタノールでさらに２回抽出を行な
い、ｎーブタノール抽出液を合併し、減圧濃縮乾固する
。有効成分を酢酸２０の‘に溶解し、２００の‘の酢酸
エチルを加えて沈殿させる。沈殿を遠心分離によって集
め、減圧下、濃縮乾固し、純度約９０％のシトフアギン
３５の２を得た。実施例 ２ デキストリン２％、糠糖２％、Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ
ｌ％、コーンステイープリカー０．５％、硫酸アンモニ
ウム０．２％、塩化カリウム１％、消泡用シリコン０．
０３％を含む培養基を１１０机【ずつ、５００の‘客三
角フラスコ７０本に分注し、１２０ｑ○、１５分加圧滅
菌する。

同培地に生育したサィトフアガＢＭＦ６９４−Ｎ３を楯
菌し、２８００、４日振縁培養を行ない、シトフアギン
１２０仏ｇ／地を含む培養液５夕を得た。この培養液の
アンバーライトＸＡＤ−２（ロームアンドハース社）１
そを充填した塔に通過させると有効成分は樹脂に吸着さ
れる。この塔を水、ついでメタノール：水（１：１）で
洗浄後、有効成分をメタノール：水：酢酸（１：１：０
．１）で溶出させ、活性区分を減圧下、濃縮し油状物質
を得る。ジメチルスルホキシド２０泌を加え不溶物を除
去後、メタノール：水（１：１）２００泌を加え、苛性
ソーダでｐＨを６．０に調整する。この液を予めメタノ
ール：水（１：１）で充填したＤＥＡＥーセフアロース
ＣＬ（ファーマシア社）２００の‘の塔を通過させると
有効成分は吸着せず通過する。通過液を凍結乾燥後、１
０の‘の酢酸に溶解し、予めメタノール：水：酢酸（１
：１：０．２）で充填したセフアデックスＬＨ２０（フ
ァーマシア社）１００机上の塔にかけ同じ組成の液で展
開し、活性区分を減圧下、濃縮乾固する。再び酢酸５の
【に溶解し、酢酸エチル５０の【を加えて活性物質を沈
殿させる。沈殿を遠心分離して集め、減圧下、濃縮乾固
して、シトフアギンの純品４４雌（純度９５％）を得た
。

【図面の簡単な説明】

第１図はシトフアギンの紫外線吸収スペクトルで、シト
フアギンを２５〃ｇ／叫の濃度にメタノールに溶解して
測定したものである。 第２図はシトフアギンの赤外線吸収スペクトルで、臭化
カリウム錠として測定したものである。第１図 図 Ｎ 縦

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新規抗生物質シトフア
   ギン（ａ） 元素分析値 Ｃ４７．２２％，Ｈ６．９４％， Ｎ１３．２１％ （ｂ） 分子量 １０００〜１５００（ゲル濾過法による）（ｃ） 融点 ２１０℃付近より褐変しはじめ２２０℃付近で発泡する
   。 （ｄ） 比施光度 〔α〕＾２＾５＿Ｄ＋５°（Ｃ＝１，ＤＭＳＯ）（ｅ）
   紫外線吸収スペクトル第１図に示す通り。 （ｆ） 赤外線吸収スペクトル 第２図に示す通り。 （ｇ） 溶剤に対する溶解法 酢酸、ジメチルスルホキシドによく溶 け、メタノール、エタノールにやや溶け るが、水、クロロホルム、アセトン、酢 酸エチル、エチルエーテルにはほとんど 溶けない、 （ｈ） 呈色反応 ニンヒドリン反応 陽性 エールリツヒ反応 陽性 イサチン反応 陽性 坂口反応 陰性 ポーリー反応 陰性 アニシジン反応 陰性 （ｉ） 塩基性、酸性、中性の区別 中性 （ｊ） 性状 無色粉末 （ｋ） アミノ酸組成 ３規定のメタンスルホン酸で１１０℃、２４時間分解
   し、アミノ酸分析計で分析した結果、少なくともリジン
   、アスパラギ ン酸、スレオニン、セリン、プロリン、 グリシン、ロイシン、トリプトフアンの アミノ酸がそれぞれ１分子検出される。 （１） シリカゲル薄層クロマトグラフイー〔シリカゲ
   ルとして、シリカゲルプレート５７２１（メルク社製）
   を用いる〕のＲｆ値 〔ｎ−ブタノール：酢酸：水（１
   ２：３：５）〕０．２３（２） サイトフアガ属に属し
   、かつシトフアギン生産能を有する微生物を培地に培養
   し、培養物中にシトフアギンを蓄積させ、培養物からシ
   トフアギンを回収することを特徴とするシトフアギンの
   製造法。