NL7907191A

NL7907191A - Antibioticum sb-72310.

Info

Publication number: NL7907191A
Application number: NL7907191A
Authority: NL
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1978-10-03
Filing date: 1979-09-27
Publication date: 1980-04-09
Also published as: IT1193505B; BE879170A; JPS5549394A; ES484597A1; FR2449099A1; DE2939333A1; CH644871A5; US4225586A; JPS6133558B2; DE2939333C2; DK414079A; GB2032913B; IT7926201A0; DK148659C; GB2032913A; FR2449099B1; DK148659B

Description

*· Λ i *

? S 4001-220 Ρ & C

Antibioticum SB-72310.

De uitvinding heeft betrekking op antibioticum SB-72310, zouten daarvan en een werkwijze ter bereiding daarvan.

Ten einde nieuwe antibiotica te vinden werd een groot aantal micro-organismen uit bodemmonsters geïsoleerd en werden de door dergelijke micro-5 organismen gevormde antibiotica onderzocht. Dit onderzoek toonde aan, dat sommige van deze micro-organismen een nieuw antibioticum vormden, dat deze micro-organismen tot het genus Pseudomonas behoren en dat deze micro-organismen bij kweken in een geschikt cultuurmedium een antibioticum ophopen, dat remmend werkt op grampositieve en gramnegatieve bacteriën. Dit anti-10 bioticum werd geïsoleerd en op grond van zijn fysicochemische en biologische eigenschappen werd vastgesteld, dat dit antibioticum een nieuw antibioticum is. Dit antibioticum wordt aangeduid als antibioticum SB-72310.

De omstandigheden voor de vorming van antibioticum SB 72310 werden eveneens onderzocht en hierbij werd gevonden, dat de produktie van anti-15 bioticum SB-72310 aanzienlijk verhoogd kan worden door een geschikt micro-organisme te kweken in een cultuurmedium, waaraan een zwavelverbinding is toegevoegd, die het rnicro-organisme in staat is te benutten. Deze resultaten werden nog gevolgd door verder onderzoek en de uitvinding is gebaseerd op al deze onderzoekingen.

20 Hieronder wordt antibioticum SB-72310 soms kortweg SB-72310 genoemd.

De uitvinding heeft betrekking op: (1) Antibioticum SB-72310 en zouten daarvan; en (2) een werkwijze ter bereiding van antibioticum SB-72310, die tot kenmerk heeft, dat men een tot het genus Pseudomonas behorend micro-organisme, 25 dat in staat is antibioticum SB-72310 te vormen, kweekt in een cultuurmedium onder vorming van antibioticum SB-72310 en ophoping daarvan in de cultuurbouillon, waarna men het antibioticum wint.

Als antibioticum SB-72310 producerende stam, die volgens de uitvinding gebruikt wordt, kan men iedere bacteriestam van het genus Pseudomonas 30 gebruiken, mits deze in staat is antibioticum SB-72310 te vormen. Als een voorbeeld van een dergelijke stam valt te noemen Pseudomonas stam SB-72310 (hieronder kortweg "stam SB-72310" genoemd), die geïsoleerd werd uit bodemmonsters, die verzameld waren in Nishinomiya, Hyogo Prefectuur, Japan.

De bacteriologische eigenschappen van Pseudomonas stam SB-72310 zijn 35 als volgt; (a) Morfologie:

Na 2 dagen op een schuine cultuur van voedingsagar bij 28°C zijn de cellen staafvormig met een diameter van 0,8 - 1 pm. en een lengte van 7907191 % <s - 2 - 1,6 - 4,1 pm. Zij vertonen geen polymorfisme, zijn motiel en;bezitten po-, laire flagella of een polair flagellum. Zij zijn niet sporen-vormend; poly-β-hydroxyboterzuur wordt opgehoopt als intracellulaire koolstofreserve (R.Y. Stanier c.s.: Journal of General Microbiology 43, 159 (1966)). Zij 5 zijn gramnegatief en niet zuurbestendig.

(b) Kweekeigenschappen op verschillende media:

Er werd bij 28 ®C gekweekt en er werd gedurende 1-14 dagen waargenomen.

(1) Plaat voedingsagar: Cirkelvormige verhoogde kolonies met een dia-10 meter van 1 - 3 mm en volledige randen worden na 3 dagen gevormd; glad; ondoorschijnend; grijs-wit; geen diffuseerbaar pigment gevormd.

(2) Schuine cultuur van voedingsagar: Marige groei, draadvormig, ondoorschijnend en grijs.

(3) Voedingsbouillon: Troebele groei, praktisch met een geringe hoe-15 veelheid sedimentatie. Een vliesje verschijnt.

(4) Staaf voedingsgelatine: Wordt vloeibaar gemaakt.

(5) Lakmoesmelk: Peptonisatie.

(c) Fysiologische eigenschappen (I) Reductie van nitraten: Positief 20 (2) Denitrificatie: Negatief (3) Methylroodproef (MR): Negatief (4) Voges-Proskauer-proef (VP): Negatief (5) Vorming van indool: Negatief (6) Vorming van zwavelwaterstof: Negatief 25 (7) Hydrolyse van zetmeel: Negatief (8) Benutting van citraat: Positief (9) Benutting van anorganische stikstofbronnen (I) Kaliumnitraat: Positief (II) Ammoniumsulfaat: Positief 30 (10) Vorming van pigmenten: Geen (II) Urease: Positief (12) Oxidase: Positief (13) Katalase: Positief (14) Groeitraject 35 (I) pH: Groei bij pH 4,0 - 8,85 optimaal bij pH 4,5--7,0.

(II) Temperatuur: Groei bij 8® - 42 ®C; optimaal bij 24® - 36®C.

(15) Zuurstofbehoefte: Aëroob (16) Oxidatieve-fermentatieve (O-F)-proef (Hugh-Leifson-methode): Oxidatief 7907191 - 3 - * * (17) Vorming van zuur en gas uit suikers: Zwakke zuurproduktie/ maar geen gasproduktie wordt waargenomen in pepton-water, dat 1 % (gew./vol.) L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-fructose> D-galactose, maltose, saccharose, trehalose, D-sorbitol, D-mannitol, inositol of glycerol 5 bevat.

(18) Assimilatie van koolstofbronnen: De resultaten van kweekproeven gedurende 14 dagen in media met anorganische zouten (0,7 % (gew./vol.) di-kaliumwaterstoffosfaat, 0,3 % (gew./vol.) monokaliumdiwaterstoffosfaat, 0,1 % (gew./vol.) ammoniurnsulfaat, 0,1 % (gew./vol.) natriumchloride, 10 0,01 % (gew./vol.) magnssl-iimsnlfaat.7Η_^θ), die verschillende koolstofbron nen bevatten, zijn hieronder weergegeven in Tabel A. Daarin hebben de symbolen de volgende betekenissen: + = groei; jt = schaarse groei; - = geen groei.

TABEL A

15 Assimilatie van koolstofbronnen üiteindelijke concentratie,

KoolstQfbron _% (gew./vol.)_ Groei L-Arabinose 1 + D-Xylose 1 + 20 D-Glucose 1 + D-Mannose 1 + D-Fructose 1 + D-Galactose 1 +

Maltose 1 + 25 Saccharose 1 +

Lactose 1

Trehalose 1 + D-Sorbitol 1 + D-Mannitol 1 + 30 Inositol 1 +

Glycerol 1 +

Zetmeel 1 -

Raffinose 1 +

Citraat 0,3 + 35 Acetaat 0,3 + L-Anlanine 0,3 + β-Alanine 0,3 +

Succinaat 0,3 + 2-Ketogluconaat 0,3 + 40 L-Arginine 0,3 + * * - 4 - (19) Andere eigenschappen I) Benutting van malonaat: Positief II) Deaminering van fenylalanine: Negatief III) Decarboxylatie-activiteit 5 a) Arginine: Positief b) Lysine: Negatief c) Ornithine: Negatief IV) Arginine-dehydrolase-activiteit: Positief V) Hydrolyse van esculien: Positief 10 VI) Hydrolyse van polyoxyethyleen (20) sorbitanmono-oleaat .

(Tween 80): Positief VII) Guanine-cytosine (GC)-gehalte van DNA: 64,3 mol %.

Bij vergelijking van de bovengenoemde bacteriologische eigenschappen van stam SB-72310 met de beschrijving in Bergey's Manual of Determinative 15 Bacteriology, Ed. 7 & 8, blijkt, dat aangezien stam SB-72310 een gramnega-tieve, staafvormige, aerobe bacterie is, die motiel is met polaire flagella of een polair flagellum, terwijl hij voorts oxidase-positief en catalase-positief is, deze stam kennelijk tot de familie van de Pseudomonadaceae behoort.

20 Het feit, dat het organisme geen bijzondere voedingsbehoeften heeft, poly^-hydroxybutyraat als intracellulaire koolstofreserve ophoopt en arginine of betaine als enkele koolstofbron kan benutten, wijst erop, dat de stam betrekkelijk verwant is aan Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei of Pseudomonas caryophylli.

25 De stam SB-72310 verschilt echter van deze species in de volgende opzichten: Pseudomonas pseudoalcaligenes kan slechts fructose als koolstofbron benutten. De meeste stammen van Pseudomonas pseudomallei veroorzaken denitrificatie, hydrolyseren zetmeel en vertonen een specifieke assimilatie van voedingsbronnen. Pseudomonas mallei is niet motiel en veroorzaakt denitrificatie.

30 Pseudomonas caryophylli vormt een geel-groen, niet-fluorescerend pigment en veroorzaakt denitrificatie.

Derhalve wordt stam SB-72310 beschouwd als te behoren tot een nieuw species van het genus Pseudomonas. In verband met zijn eigenschap van een optimale groei bij een lage pH van 4,5 - 7,0, wat enigszins laag is voor 35 bacteriën van het genus Pseudomonas in het algemeen werd aan stam SB-72310 de naam gegeven Pseudomonas mesoacidophlla.

Monsters van deze stamp SB-72310 zijn gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Chiba, Japan onder FERM-P No. 4653 bij het Institute for Fermentation, 40 Osaka (IFO), Japan, waar het toegankelijk is onder No. IFO 13884 en bij Tört 71 Q 1 - 5 -

American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, Verenigde Staten van Amerika, waar het toegankelijk is onder het nummer ATCC-31433.

De volgens de uitvinding gebruikte Pseudomonas-bacteriën zijn in het algemeen sterk variabel in hun eigenschappen en ondergaan gemakkelijk mu-5 tatie, wanneer zij onderworpen worden aan kunstmatige mutagene behandelingen, zoals bestraling met ultraviolette stralen of röntgenstralen of behandeling met chemische butagene middelen (bijvoorbeeld nitrosoguanidine, ethylmethaansulfonaat). Al dergelijke mutanten en varianten zijn echter geschikt voor de doeleinden van de uitvinding, mits zij het vermogen be-10 zitten en behouden het antibioticum van de uitvinding, SB-72310, te vormen. Voor het kweken van stam SB-72310 kan men koolstofbronnen gebruiken als glucose, saccharose, maltose, verbruikte melasse, glycerol, oliën en vetten (bijvoorbeeld soja-olie, olijfolie enz.), organische zuren (bijvoorbeeld citroenzuur, barnsteenzuur, gluconzuur enz.) en andere assimileerbare kool-15 stofbronnen. Als stikstofbronnen kan men organische en anorganische stik-stofhoudende verbindingen en materialen toepassen, bijvoorbeeld sojabloem, katoenzaadmeel, maisweekvloeistof, gedroogde gist, gistextract, vleesextract, pepton, ureum, ammoniumsulfaat, ammoniumnitraat, ammoniumchloride, ammonium-fosfaat enz. Bovendien kunnen de anorganische zouten, die gewoonlijk nodig 20 zijn voor het kweken van bacteriën, zoals natriumchloride, kaliumchloride, calciumcarbonaat, magnesiumsulf aat, monokaliumdiwaterstoffosfaat, dinatrium-monowaterstoffosfaat enz., op zichzelf of in een geschikte combinatie gebruikt worden. Het is gebleken, dat de opbrengst van het gewenst antibioticum verhoogd kan worden door een dergelijk medium aan te vullen met een 25 zwavelverbinding, die het SB-72310 producerende micro-organisme in staat is te benutten, dat wil zeggen anorganische zwavelverbindingen, zoals sulfaten (bijvoorbeeld ammoniumsulfaat), thiosulfaten (bijvoorbeeld ammoniumthio-sulfaat), sulfiten (bijvoorbeeld ammoniumsulfiet) enz. of organische zwavel-verbindingen, zoals zwavelhoudende aminozuren (bijvoorbeeld cystine, cys-30 teine, L-thiazolidine 4-carbonzuur), hypotaurine, zwavelhoudende peptiden (bijvoorbeeld glutathion) of mengsels daarvan. De concentratie van dergelijke zwavelverbindingen in het cultuurmedium bedraagt 0,01 - 1,0 % (gew./vol.) en bij voorkeur 0,02 - 0,5 % (gew./vol.). De toevoeging van een dergelijke zwavelverbinding aan het medium leidt tot een verhoogde produk-35 tie van SB-72310 en is derhalve commercieel van grote waarde.

Verder kan men naar behoefte zouten van zware metalen (bijvoorbeeld ferrosulfaat, kopersulfaat enz., vitaminen, bijvoorbeeld vitamine B^, biotine enz., en andere toevoegsels in het medium opnemen. Antischuimmid-delen en capillairactieve middelen, bijvoorbeeld polysiloxanolie, poly-40 alkyleenglycolether enz., kunnen ook worden toegevoegd. Uiteraard kunnen 70Π 71 0 Λ ' < - 6 - andere organische of anorganische materialen, die de groei van het micro-organisme ondersteunen en de vorming van SB-72310 bevorderen, eveneens in geschikte hoeveelheden worden toegevoegd. Het kweken van stam SB-72310 kan geschieden volgens overeenkomstige werkwijzen als worden toegepast voor de 5 produktie van antibiotica in het algemeen, waarbij men in een vaste of vloeibare cultuur kan werken. In het geval van een vloeibare cultuur kan men het kweken stationair, onder roeren, onder schudden of aëroob uitvoeren, hoewel aëroob kweken onder roeren bijzonder gewenst is. Het temperatuurstraject voor het kweken bedraagt bij voorkeur circa 15® - 35®C en de pH van het 10 kweekmedium kan circa 4-8 bedragen. Het kweken wordt gedurende circa 8 - 168 uren en bij voorkeur 24 - 144 uren voortgezet. Aangezien het gevormde antibioticum SB-72310 voor het grootste deel in de vloeistoffase van de fermentatiebouillon aanwezig is, is het voordelig de bouillon te centrifugeren of te filtreren om de bovenstaande vloeistof of filtraat te 15 scheiden van een cellenmassa en het SB-72310 in deze bovenstaande vloeistof of filtraat te zuiveren. Desgewenst is een direkte zuivering vanuit de fermentatiebouillon eveneens uitvoerbaar.

Onderzoek van de sterkte van het zo verkregen produkt kan worden uitgevoerd tegen Comamonas terrigena, IFO 12685, als proeforganisme en onder 20 toepassing van SB-72310 als standaard volgens de cilindermethode of de methode met de papierschijf, waarbij men TSA [trypticase-soja-agar (Baltimore Biologicals, Limites, U.S.A.)] gebruikt.

Antibioticum SB-72310 kan gewonnen worden met behulp van de verschillende methoden, die gewoonlijk worden toegepast voor het winnen van micra-25 biële metabolieten. Zo worden bijvoorbeeld de cellen door centrifugeren verwijderd, waarna het actieve produkt volgens gebruikelijke methoden uit de bovenstaande vloeistof wordt afgescheiden en gezuiverd. Zo kan men bijvoorbeeld de werkwijze, waarbij de oplosbaarheid of het oplosbaarheidsver-schil ten opzichte van een geschikt oplosmiddel benut wordt, de werkwijze, 30 waarbij het neerslaan of verschil in de snelheid van neerslaan van het antibioticum uit een oplossing benut wordt, de werkwijze, waarbij de karakteristieke adsorptie-affiniteit voor verschillende adsorbeermiddelen benut wordt, ionen-uitwisselende chromatografie op ionen-uitwisselaars, concentratie onder verlaagde druk, vriesdrogen, kristallisatie, herkristallisa-35 tie, drogen enz. afzonderlijk of in een geschikte combinatie en volgorde en/of herhaaldelijk toepassen.

Een representatieve werkwijze wordt hieronder beschreven. Na voltooien van het kweken wordt de fermentatiebouillon gefiltreerd en het verkregen filtraat wordt door een kolom geactiveerde houtskool gevoerd, waar- 7907191 - 7 - na het geadsorbeerde SB-72310 geëlueerd wordt met een hydrofiel organisch oplosmiddel. Als voorbeelden van hydrofiele organische oplosmiddelen zijn te noemen lage ketonen (bijvoorbeeld aceton, methylethylketon, methyl-isobutylketon enz.), lage alcoholen (bijvoorbeeld methanol, ethanol, iso-5 propanol, propanol, butanol enz.). Deze oplosmiddelen kunnen op zichzelf, gemengd of in combinatie met water worden toegepast. Wegens de zure aard van het SB-72310 kan men met voordeel anionen-uitwisselende harsen toepassen, bijvoorbeeld harsen in de Cl-vorm (Amberlite IRA-400 en 402, in de handel gebracht door Amberlite Co., U.S.A.; Dowex-1, Dow and Chemical co., 10 u.S.A.ï Diaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan). Het geadsorbeerde actieve produkt wordt geëlueerd, bijvoorbeeld met een'.waterige oplossing van natriumchloride. Om het eluaat te ontzouten wordt kolom-chromatografie uitgevoerd, opnieuw met geactiveerde houtskool. Het verkregen eluaat wordt daarna geconcentreerd, waarna bijvoorbeeld aceton wordt 15 toegevoegd; het verkregen neerslag wordt gewonnen door filtratie, met aceton, diethylether of dergelijke gewassen en onder verlaagde druk gedroogd, waarbij men een lichtbruin poeder wint. Om het poedervormige SB-72310 te zuiveren kan men met voordeel chromatografie over DEAE-Sephadex (Pharmacia, Zweden) toepassen. Zo wordt bijvoorbeeld een kolom 20 van DEAE-Sephadex A-25 met 0,01 M fosfaatbuffer (pH 6,6) gewassen, waarna men een waterige oplossing van het bovengenoemde poeder door de kolom voert en daaraan adsorbeert. De kolom wordt met dezelfde bufferoplossing als boven gewassen en er wordt geëlueerd met de buffer, die 0,5 % (gew./vol.) natriumchloride bevat. De actieve fracties worden samengevoegd, op pH 3,0 25 gebracht en weer door een kolom geactiveerde houtskool gevoerd. De kolom wordt achtereenvolgens met water en 20-procents (vol./vol.) waterige methanol gewassen. Daarna wordt geëlueerd met waterige aceton en nadat de actieve fracties verzameld zijn, worden zij onder verlaagde druk geconcentreerd. Aan het concentraat voegt men aceton toe, waardoor SB-72310 ver-30 kregen wordt. Het SB-72310 vormt metaalzouten en ammoniumzout. Als metaal-zouten zijn te noemen het natriumzout, kaliumzout, lithiumzout enz.

De fysicochemische eigenschappen van het hieronder volgens Voorbeeld I verkregen SB-72310 zijn als volgt;

1. Smeltpunt: Ten minste 110eC

35 2. Uiterlijk: Wit poeder 3. Elementairanalyse (na 6 uren drogen onder verlaagde druk bij 40ÖC boven fosforpentoxide) (%): 7907191 - 8 - C 34,40 34,18 (34,40+0,5) Η 5,56 5,54 ( 5,50 + 0,5) N 13,30 13,65 (13,45 + 0,5) S 7,56 7,75 ( 7,75 + 0,5) 5 (0 38,90 + 1,0) 4. Molecuulgewicht:

Titrometrie: 400 + 20

Aangenomen empirische formule (gebaseerd op de bovenstaande gegevens): C12H20N4S09‘^H2°^ 10 Berekend: C - 34,78 %; H = 5,35 %; N = 13,52 %; S = 7,74 % 23 5. Specifieke draaiing: [«] = +0,5® +_ 5® (c=0,93, H_0) 6. Ultraviolet absorptiespectrum:

Uitsluitend eindabsorpties (geen karakteristieke absorpties boven 210 nm).

15 7. Infrarood absorptiespectrum (fig. 1)

Dominante pieken (KBr) (cm S: 3440(s), 2920(m) , 2850(m), 2600(z), 1770(s), 1650(s), 1530(s), 1458(m), 1390(z), 1340(z), 1280(sch), 1240(s), 1210(sch), 1180(m), 1118(a),.. 1043(s), 792(z), 632(s).

20 (s, m, z en sch betekenen resp, sterk, matig, zwak en schouder.) 8. Oplosbaarheid in oplosmiddelen:

Onoplosbaar in petroleumether, hexaan, diethylether, benzeen, ethyl-acetaat, chloroform; weinig oplosbaar in ethanol, pyridine, aceton; oplosbaar in methanol, dimethylsulfoxide; gemakkelijk oplosbaar in 25 water.

9. Kleurreacties:

Positieve ninhydrienreactie en kaliumpermanganaatreactie; negatieve ferrichloride-kaliumferricyanidereactie, Sakaguchi-reactie en Molisch-reactie; twijfelachtig positieve Ehrlich-reactie.

30 10. Basiciteit, neutraliteit of aciditeit: Zuur 11. Kernmagnetisch resonantiespectrum (in dimethylsulfoxide, 100 MHz): 3,31 ppm (s, een chemische verschuiving toe te schrijven aan O-CH^).

12. Stabiliteit:

Stabiel in waterige oplossing in een pH-traject van 3-7 bij 60®C 35 bij 10 minuten verwarmen; instabiel boven pH 8,5.

De fysicochemische eigenschappen van het hieronder volgens Voorbeeld II verkregen natriumzout van SB-72310 zijn als volgt: 1. Smeltpunt: Ten minste 110®C.

2. Uiterlijk: Wit poeder 7907191 - 9 - 3. Elementairanalyse (na 6 uren drogen onder verlaagde druk bij 40 °C boven fosforpentoxide) (%): C 31,75 31,68 H 5,19 5,11 5 N 12,68 12,57 S 7,16 7,10

Na 5,01 4,95 4. Molecuulgewicht: Aannemende dat 1 mol Na in het molecuul aanwezig is.

Titrometrie: 438 5 10 Aangenomen empirische formule (op basis van de bovenstaande gegevens): C12H19H4S°9Na*2H2°

Berekend: C = 31,72 %,- H = 5,10 %; N = 12,33 %; S = 7,06 %; Na = 5,06 % 5. Specifieke draaiing: [a] = +8,5°+_5°(c=0,91, Β^,Ο) 6. Ultraviolet absorptiespectrium: 15 Uitsluitend eindabsorpties.

7. Infrarood absorptiespectrum (fig. 2)

Dominante pieken (KBr)(cm S: 3430 (s), 3250(sch), 3.000 (m), 1770(s), 1640 (s), 1530 (s), 1450(z), 1405(z), 1343(z), 1280(sch), 1245(s), 1180(z), 1118(z), 1050(s), 20 820(z), 785(z), 632(s).

(Hierin betekenen s, m, z en sch resp. sterk, matig, zwak en schouder.) 8. Oplosbaarheid in oplosmiddelen:

Onoplosbaar in petroleumether, hexaan, diethylether, benzeen, ethyl-acetaat, chloroform, aceton; weinig oplosbaar in methanol, ethanol, 25 pyridine; oplosbaar in dimethylsulfoxide; gemakkelijk oplosbaar in water.

9. Kleurreacties:

Positief: ninhydrienreactie en kaliumpermanganaatreactie; negatief: ferrichloride-kaliumferricyanide-reactie, Sakaguchi-reactie en Molisch-30 reactie; twijfelachtig positief: Ehrlich-reactie.

10. Stabiliteit:

Stabiel in waterige oplossingen met een pH van 3-7 bij 10 minuten verwarmen op 60°C; instabiel boven pH 8,5.

Om de vrije zuurvorm van SB-72310 om te zetten in een zout, bijvoor-35 beeld natriumzout, kan men ongeveer een molequivalent natriumhydroxide aan een waterige oplossing van het vrije zuur toevoegen en het systeem vriesdrogen.

Om een zout van SB-72310 in de vrije zuurvorm om te zetten kan men bijvoorbeeld aan een waterige oplossing van bijvoorbeeld het natriumzout 790 71 9 1

ν' V

- 10 - van SB-72310 circa In zoutzuur toevoegen tot de oplossing een pH heeft van 3,0 en de oplossing vervolgens ontzouten met behulp van geactiveerd houtskool.

De biologische eigenschappen van SB-72310 zijn als volgt. Het anti-5 microbiële spectrum van SB-72310 en zijn natriumzout tegen verschillende micro-organismen is weergegeven in Tabel B.

Uit deze tabel blijkt, dat antibioticum SB-72310 actief is tegen gram-positieve en gramnegatieve bacteriën.

De acute toxiciteit van het natriumzout van antibioticum SB-72310 is 10 gering; er werden geen sterfgevallen waargenomen bij intraveneuze toediening van 500 mg/kg van het zout aan muizen.

TABEL B

Antimicrobieel spectrum van SB-72310 (diameter van remmingszone in mm volgens de papierschijfmethode) (25 μΐ van een proefoplossing van 10 mg/ml wordt ge-15 absorbeerd in papierschijven met een diameter van 8 mm)

Proef organisme Diameter van remmingszone (mm)

Pseudomonas fluorescens IFO 3081 12,5

Escherichia coli-NIHJ JC-2 14,5

Serratia marcescens IFO 12648 17 20 Alcaliqenes faecalis IFO 13111 ..... 23

Proteus mirabilis IFO 3849 19

Proteus vulgaris IFO 3045 18

Salmonella tvphimurium IFO 12529 18,5

Klebsiella pneumoniae IFO 3318 12,5 25 Comamonas terriqena IFO 12685 25

Staphylococcus aureus FDA 209P 18,5

Sarcina lutea IFO 3232 23

Bacillus subtilis IFO 3513 22

Bacillus cereus IFO 3466 14,5 30 Opmerking: Medium = Trypticase-soja-bouillon-agar.

Zoals uit het bovenstaande antimicrobiële spectrum blijkt, heeft het SB-72310 van de uitvinding een remmende werking op gramnegatieve en gram-positieve bacteriën. Derhalve kan het toegepast worden bij de behandeling van infecties van zoogdieren (bijvoorbeeld muis, rat, hond en mens) en ge-35 vogelte (bijvoorbeeld kippen en eenden) door de bovengenoemde bacteriën.

Om SB-72310 als geneesmiddel tegen infecties door Escherichia coli te gebruiken lost men het bijvoorbeeld op in fysiologische zoutoplossing en dient het parenteraal, bijvoorbeeld subcutaan of intramusculair toe in een dosering van 15 - 60 mg per kg lichaamsgewicht en per dag.

7907191 - 11 -

Voor orale toepassing mengt men antibioticum SB-72310 met bijvoorbeeld lactose, brengt het mengsel in capsules en dient het toe in een dosis van 60 - 400 mg (als SB-72310) per kg lichaamsgewicht en per dag.

SB-72310 kan ook toegepast worden als germicide of desinfecteermiddel.

5 Zo kan men bijvoorbeeld SB-72310 in gedestilleerd water oplossen ter bereiding van een oplossing, die 0,1 - 1,0 % (gew./vol.) SB-72310 bevat of het met een zalfbasis, bijvoorbeeld vaseline of lanoline samenstellen tot een zalf, die 15 - 60 mg SB-72310 per g bevat. Deze oplossing of deze zalf lean men als desinfecteermiddel aanbrengen op de poten, benen, ogen, oren 10 of andere lichaamsdelen van de bovengenoemde dieren.

SB-72310 is een bijzonder veelbelovende verbinding, aangezien het geschikt is als tussenprodukt voor de synthese van nieuwe farmaceutische stoffen.

Bij vergelijking van antibioticum SB-72310 met de bekende antibiotica 15 bleek het volgende. In de eerste plaats zijn als antibiotica, die oplosbaar in water zijn, zuur reageren en zwavel bevatten, penicillinen en cefalospo-rinen te noemen. Aangezien SB-72310 echter niet absorbeert in het ultraviolette deel van het spectrum, verschilt het duidelijk van cefalosporinen. Bovendien tonen het feit, dat het kernmagnetische resonantiespectrum een 20 chemische verschuiving te zien geeft, die toe te schrijven is aan O-methyl-protonen en het feit, dat het bij zure hydrolyse glutaminezuur doet ontstaan, aan dat SB-72310 verschilt van elk van de natuurlijk voorkomende penicillinen en cefalosporinen.

Anderzijds zijn er verscheidene antibiotica bekend, die gevormd worden 25 door bacteriën van het genus Pseudomonas, maar geen daarvan is een in water oplosbaar antibioticum, dat zuur is en zwavel bevat. Bovendien is SB-72310 op grond van zijn bijzondere fysicochemische en biologische eigenschappen niet gelijk aan een van de bekende antibiotica, die door andere micro-organismen dan stammen van Pseudomonas gevormd worden.

30 Antibioticum G-6203 werd verkregen door kweken van een micro-organisme, dat tot het genus Pseudomonas behoort, in een cultuurmedium en winnen van het antibioticum uit de cultuurbouillon (dit was werk van een van de onderhavige uitvinders samen met twee andere uitvinders).

Antibioticum G-6302 en het onderhavige antibioticum SB-72310 zijn niet 35 van elkaar te onderscheiden voor wat betreft molecuulformule, infrarode absorptiespectra, kernmagnetische resonantiespectra, kleurreacties, stabiliteit enz. Zij zijn echter duidelijk te onderscheiden in het bijzonder 23 voor wat betreft de specifieke draaiing, aangezien de waarde van [a]^ van de vrije vorm van antibioticum G-6302 +94o+10o(c=s0,35, E^Q) bedraagt, waar- 790 7 1 9 1 - 12 - tegenover die van de vrije vorm van antibioticum SB-72310 +0,5 °+59(c-0,93, H20) bedraagt.

Derhalve wordt geconcludeerd, dat het onderhavige antibioticum SB-72310 \ verschilt van antibioticum G-6302.

5 Uit de bovengenoemde feiten valt te concluderen, dat SB-72310 een nieuwe verbinding is.

De onderstaande voorbeelden lichten de uitvinding toe. Hierin verhouden gewichtsdelen en volumedelen zich als g tot ml en tenzij anders vermeld zijn alle percentages betrokken op gewicht/volume.

10 VOORBEELD I

Men gebruikt de cellen van Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (FERM-P No. 4653; IFO 13884; ATCC-31433),'die op een schuine cultuur van voedingsagar gekweekt waren, voor het enten van twee Sakaguchi-kolven van 2 x 10^ vol.dln. Deze bevatten elk 500 vol.dln van een medium, dat 1 % glu-15 cose, 0,5 % Polypepton (handelsprodukt van Daigo Nutritive Chemicals Co., Japan), 0,5 % vleesextract en 0,5 % natriumchloride (pH 7,0). Iedere kolf werd gedurende 48 uren.bij 28°C op een heen- en weergaande schudinrichting geincubeerd. De verkregen cultuur werd als entcultuur gebruikt.

3

In een roestvrij stalen fermenteervat van 200 x 10 vol.dln bracht men 20 120 x 10^ vol.dln van een medium, bevattende 1,5 % saccharose, 0,3 % gist- extract, 0,2 % ammoniumsulfaat, 0,6 % kaliumdiwaterstoffosfaat, 0,3 % di-kaliumwaterstoffosfaat, 0,05..% magnesiumsulfaat en 0,05 % NaCl en men steriliseerde gedurende 20 minuten met stoom bij 120®C. Het gesteriliseerde vat werd daarna met de bovengenoemde entcultuur geënt en gedurende 78 25 uren bij een temperatuur van 28°C geincubeerd, waarbij men beluchtte met 3 een hoeveelheid van 120 x 10 vol.dln/min. en roerde met 180 toeren per minuut. De verkregen bouillon werd met een Sharples-centrifugaalafschelder 3 gecentrifugeerd om de cellen te verwijderen, waarbij 110 x 10 vol.dln bovenstaande vloeistof overbleef. Deze vloeistof werd op pH 4,2 gebracht 30 en door een kolom van 15 x 10^ vol.dln geactiveerde houtskool (chromato- grafiekwaliteit Shirasagi, handelsprodukt van Takeda Chemical Industries,

Ltd., Japan) gevoerd om de actieve stof daaraan te absorberen. De kolom 3 werd met 45 x 10 vol.dln water gewassen en daarna werd geëlueerd met 3 45 x 10 vol.dln 50-procents (vol./vol.) waterige aceton; het eluaat werd 3 35 in fracties van 10 x 10 vol.dln opgevangen. De fracties werden onderzocht op hun werking tegen coitiamonas terrigena IFO 12685. De fracties No. 2 en 3 3 werden samengevoegd; men voegde 20 x 10 vol.dln water toe en voerde het 3 mengsel door een kolom, die gevuld was met 10 x 10 vol.dln Dowex-1 (Cl-vorm). (Dow and Chemical Industries, U.S.A.). De kolom werd met 7907191 - 13 - 3 3 25 x 10 vol.dln water gewassen en men elueerde met 50 x 10 vol.dln van een 5-procents waterige natriumchloride-oplossing. De actieve fracties werden samengevoegd/ op pH 4,0 gebracht en opnieuw door een kolom geacti- 3 3 veerde houtskool (8 x 10 vol.dln) gevoerd. De kolom werd met 24 x 10 vol.

5 dln water gewassen en er werd geëlueerd met 20-procents (vol./vol.) waterige methanol. De actieve fracties werden samengevoegd en onder verlaagde druk tot 50 vol.dln geconcentreerd. Daarna voegde men 200 vol.dln aceton toe. Het ontstane neerslag werd door filtratie gewonnen, met 50 vol.dln aceton en 100 vol.dln diethylether gewassen en vervolgens onder verlaagde 10 druk gedroogd. Met deze werkwijze verkreeg men 12 gew.dln ruw produkt.

In 500 vol.dln 0,01 M fosfaatbuffer (pH 6,6) loste men 10 gew.dln van het bovengenoemde ruwe produkt op en men voerde de oplossing door een kolom van 200 vol.dln DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Zweden), die vooraf gebufferd was met dezelfde bufferoplossing als hierboven genoemd. De kolom werd met 15 400 vol.dln van dezelfde bufferoplossing gewassen en daarna werd geëlueerd met dezelfde buffer, waaraan 0,5 % natriumchloride was toegevoegd. De actieve fracties werden samengevoegd, met ln zoutzuur op pH 3,2 gebracht en door een kolom van 60 vol.dln geactiveerde houtskool gevoerd. De kolom werd met 200 vol.dln water en 100 vol.dln 20-procents (vol./vol.) waterige me-20 thanol gewassen en vervolgens geëlueerd met 50-procents (vol./vol.) waterige aceton. De actieve fracties werden samengevoegd, onder verlaagde druk geconcentreerd en opgelost in 5 vol.dln methanol. Na toevoeging van 100 vol. dln aceton liet men de oplossing in de koude staan. Het ontstane neerslag werd door filtratie gewonnen, met diethylether gewassen en gedurende 25 6 uren onder verlaagde druk bij 40°C boven fosforpentoxide gedroogd. Men verkreeg zo 3,8 gew.dln poedervormig produkt. Het infrarode absorptie-spectrum van dit produkt is weergegeven in fig. 1.

Elementairanalyse in % (gew./gew.).: C = 34,40; H = 5,56; N = 13,30; S = 7,56

VOORBEELD II

30 In 45 vol.dln water loste men 2,0 gew.dln van het volgens Voorbeeld I

yerkregen vrije zuur van SB-72310 op. Onder koelen voegde men circa 4,5 vol.dln In natronloog toe. Hierna voegde men onder bewaken van de pH een verdere hoeveelheid In natronloog toe tot een pH van 6,5 bereikt was. De oplossing werd gevriesdroogd en men verkreeg zo 2,1 gew.dln mononatriumzout 35 van SB-72310 in de vorm van een wit poeder. Het infrarode absorptiespectrum van dit produkt na 6 uren drogen onder verlaagde druk bij 40®C is weergegeven in fig. 2.

Elementairanalyse, % (gew./gew.); C = 31,75; H = 5,19; N = 12,68; S = 7,16; ..... Na = 5,01 790 71 9 1 v~ V· - 14 -

VOORBEELD III

Men gebruikte cellen van Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (FERM-P No. 4653; IFO 13884; ATCC-31433), die gekweekt waren op een schuine cultuur van voedingsagar, voor het enten van een conische kolf van 200 vol.dln.

5 Deze kolf bevatte 40 vol.dln van een medium, dat 3 % glycerol., 0,1 % glucose, 0,5 % Polypepton, 0,5 % vleesextract en 0,5 % natriumchloride bevatte (pH 6,5). Na het enten werd de kolf 48 uren op een roterende schudmachine bij 28°C geincubeerd, waarbij een entcultuur verkregen werd.

Daarna voegde men conische kolven van 200 vol.dln elk met 40 vol.dln 10 van een overeenkomstig medium als hierboven, waarbij echter verschillende zwavelverbindingen aan de kolven werden toegevoegd.

Daarna werd iedere kolf geënt met 1 vol.dl van de bovengenoemde entcultuur en op een roterende schudmachine gedurende 96 uren bij 28°C geincubeerd. Zoals uit de onderstaande tabel blijkt, werd de produktie van 15 SB-72310 duidelijk verhoogd door de toevoeging van zwavelverbindingen.

TABEL C

Geproduceerde hoeveelheid SB-72310

Toegevoegde verbinding Concentratie, Geproduceerde % (gew./vol.) hoeveelheid, 20 ----- ---------- jug/ml

Geen - 21

Ammoniumsulfaat 0,25 47

Ammoniumsulfiet 0,25 68

Ammoniumthiosulfaat 0,25 90 25 Cysteine 0,25 54

Cystine 0,25 68 L-Thiazolidine 4-carbonzuur 0,25 90

Hypotaurine 0,25 47

Glutathion 0,25 38 790 7 1 9 1

Claims

1. Antibioticum SB-72310 met de in de beschrijving genoemde eigenschappen.

2. Werkwijze ter bereiding van antibioticum SB-72310, met het kenmerk, 5 dat men een micro-organisme, dat tot het genus Pseudomonas behoort en in staat is antibioticum SB-72310 te produceren, in een cultuurmedium kweekt tot antibioticum SB-72310 in de cultuurbouillon is opgehoopt en het antibioticum wint.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men als micro-10 organisme Pseudomonas mesoacidophila kiest.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men als micro-organisme Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (IFO 13884) kiest.

5. Werkwijze volgens conclusies 2-4, met het kenmerk, dat men in het cultuurmedium een zwavelverbinding opneemt, die geassimileerd wordt door 15 het micro-organisme.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men als zwavelverbinding ammoniumsulfaat, ammoniumsulfiet, ammoniumthiosulfaat, cysteine, cystine, L-thiazolidine 4-carbonzuur, hypotaurine of glutathion kiest.

7. Praktisch zuivere cultuur van het micro-organisme behorende tot het 20 genus Pseudomonas en met eigenschappen, die identificeerbaar zijn met die van IFO 13884, welke cultuur in staat is om in een kweekjnedium, dat een assimileerbare koolstofbron en een verteerbare stikstofbron bevat, een winbare hoeveelheid antibioticum SB-72310 te produceren. 790 7 1 9 1