DK148659B

DK148659B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotikum benaevnt isosulfazecin eller antibiotikum sb-72310 og mikroorganismekultur til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK148659B
Application number: DK414079AA
Authority: DK
Inventors: Akira Imada; Kazuhiko Kintaka; Konomi Haibara
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1978-10-03
Filing date: 1979-10-03
Publication date: 1985-08-26
Also published as: FR2449099A1; FR2449099B1; IT7926201A0; DK148659C; GB2032913A; US4225586A; NL7907191A; JPS5549394A; ES484597A1; DK414079A; BE879170A; GB2032913B; IT1193505B; DE2939333A1; CH644871A5; JPS6133558B2; DE2939333C2

Description

i 148659

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum benævnt isosulfazecin eller Antibiotikum SB-7.2310 og med formlen f H |H3 H OCH3 H02C - J - CH2 - GR, - C - N - j - C - N *+_.

nk2 0 fl 0 J J

^ ^SOgH

5 eller et salt deraf samt en mikroorganismekultur til udøvelse af fremgangsmåden.

Det har vist sig, at mikroorganismer hørende til en hidtil ukendt art,slægten Pseudomonas, er i stand til ved dyrkning i et egnet kulturmedium at akkumulere ovennævnte antibiotikum, 10 som er hæmmende over for gram-positive og gram-negative bakterier. Man isolerede dette antibiotikum, og baseret på dets fysisk-kemiske og biologiske egenskaber blev det konstateret, at dette antibiotikum er et hidtil ukendt antibiotikum. Man betegnede det følgelig Antibiotikum SB-72310.

15 Betingelserne for frembringelsen af Antibiotikum SB-72310 blev også studeret, og det viste sig, at produktionen af Antibiotikum SB-72310 kunne forøges signifikant ved at dyrke enhver af disse mikroorganismer i et kulturmedium suppleret med en svovlforbindelse, som mikroorganismen er i stand til at udnyt-20 te. Disse opdagelser blev efterfulgt af yderligere forskning, som kulminerede i den foreliggende opfindelse.

I den foreliggende tekst vil Antibiotikum SB-72310 undertiden blot blive benævnt som SB-72310.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af Anti-25 biotikum SB-72310 er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

148659 2

Som et eksempel på en stamme af arten Pseudomonas mesoacidophila kan nævnes stamme SB-72310 (IFO 13884, i det følgende undertiden benævnt som stamme SB-72310), som blev isoleret fra jordprøver opsamlet i Nishinomiya, Hyogo Prefecture, Japan.

5 Pseudomonas mesoacidophila SB-72310's bakteriologiske egenskaber er som følger.

(a) Morphologi:

Efter 2 dage på et skråstivnet næringssubstrat af agar-agar ved 28°C er cellerne stavformede med en diameter på 0,8-l,lym 10 og en længde på l,6-4,lym. Uden polymorphisms, bevægelig med polære flagella eller et polært flagellum. Ikke-sporedannende; poly-|3-hydroxysmørsyre akkumuleres som en intracellulær car= bonreserve (R.Y. Stanier et al: Journal of General Microbiology 43, 159(1966)). Gram-negativ, ikke-syreresistent.

15 (b) Dyrkningsegenskaber på forskellige medier:

Dyrket ved 28°C og observeret i 1-14 dage.

(1) Næringssubstratplade: Cirkulære, ophøjede kolonier med en diameter på 1-3 mm med klare afgrænsninger dannes efter 3 dage; glat; uigennemsigtig; gråhvid; der dannes 20 intet diffusionsdygtigt pigment.

(2) Skråstivnet substrat af agar-agar: Moderat vækst, trådformet, uigennemsigtig og grå.

(3) Næringssuppe: Uklar vækst, i hovedsagen med en ringe mængde sedimentation. Der viser sig en hinde.

25 (4) Næringsmediumgelatinestik: smeltning.

(5) Lakmusmælk: Peptonisering 148659 3 (c) Fysiologiske egenskaber (1) Reduktion af nitrater: Positiv (2) Denitrifikation: Negativ (3) MR (methylrød) test: Negativ 5 (4) VP (Voges-Proskauer) test: Negativ (5) Produktion af indol: Negativ (6) Produktion af hydrogensulfid: Negativ (7) Hydrolyse af stivelse: Negativ (8) Udnyttelse af citrat: Positiv 10 (9) Udnyttelse af uorganiske nitrogenkilder I) Kaliumnitrat: Positiv II) Ammoniumsulfat: Positiv (10) Produktion af pigmenter: Ingen (11) Urease: Positiv 15 (12) Oxidase: Positiv (13) Katalase: Positiv (14) Vækstområde I) pH: Vækst ved pH 4,0-8,85, optimal pH 4,5-7,0

II) Temperatur: Vækst ved 8-42°C, optimal 24-36°C

20 (15) Oxygenbehov: Aerobisk (16) O-F (oxidativ-fermentativ) test (Hugh-Leifson metode): Oxidativ (17) Produktion af syre og gas fra stikkerarter: Svag syreproduktion, men ingen gasproduktion bemærkes i pepton- 25 vand indeholdende 1 vægt/volumen% L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-fructose, D-galactose, maltose, sucrose, trehalose, D-sorbitol, D-mannitol, inositol eller glycerol.

(18) Assimilering af carbonkilder: Resultaterne af dyrkning 30 i uorganiske saltmedier (dikaliumhydrogenphosphat 0,7 vægt/volumen%, monokaliumdihydrogenphosphat 0,3 vægt/ volumen%, ammoniumsulfat 0,1 vægt/volumen%, natrium= chlorid 0,1 vægt/volumen%, magnesiumsulfat, 7^0 0,01 vægt/volumen%) indeholdende forskellige carbonkilder 35 i 14 dage er angivet i tabel 1.

4 148689

Tabel 1.

_Assimilering af carbonkilder_

Carbonkilde Slutkoncentration vagt/vo lunten % Vækst L-arabinose 1 + D-xylose 1 + D-glucose 1 + D-mannose 1 + D-fructose 1 + D-galactose 1 +

Maltose 1 +

Sucrose 1 +

Lactose 1

Trehalose 1 + D-sorbitol 1 + D-mannitol 1 +

Inositol 1 +

Glycerol 1 +

Stivelse 1

Raffinose 1 +

Citrat 0,3 +

Acetat 0,3 + L-alanin 0,3 + β-alanin 0,3 +

Succinat 0,3 + 2-ketogluconat 0,3 + L-arginin 0,3+

Betain 0,3 +

Bemærkninger: +: Vaskst. Kneben vækst. Ingen vækst.

(19) Andre egenskaber I) Udnyttelse af malonat: Positiv 5 1A8659 II) Deaminering af phenylalanin: Negativ III) Decarboxylaseaktivitet a) Arginin: Positiv b) Lysin: Negativ 5 c) Ornithin: Negativ IV) Arginindehydrolaseaktivitet: Positiv V) Hydrolyse af esculin: Positiv VI) Hydrolyse af "Tween 80": Positiv VII) GC (guanin-cytosin) indholdet af DNA: 64,3 mol%.

10 Sammenligning af stamme SB-72310's ovennævnte bakteriologiske egenskaber med beskrivelsen i Bergey's Manual of Determina= tive Bacteriology, Ed. 7 & 8, viser, at når henses til, at det er en gram-negativt stavformet aerobisk bakterie, som er bevægelig med polære flageller eller et polært flagellum 15 oxidase-positiv og katalase-positiv, hører stamme SB-72310 øjensynligt til familien Pseudomonadaceae.

Den kendsgerning, at den ikke har særlige ernæringsmæssige krav, akkumulerer poly-3-hydroxybutyrat som en intracellulær car= bonreserve og udnytter arginin eller betain som en simpel 20 carbonkilde, antyder, at stammen er forholdsvis nært beslægtet med Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei eller Pseudomonas caryophylli. Stammen SB-72310 adskiller sig imidlertid fra disse arter ud fra følgende synspunkter. Pseudomonas pseudoalcaligenes kan kun 25 anvende fructose som carbonkilde. De fleste stammer af Pseudomonas pseudomallei forårsager denitrifikation, hydrolyserer stivelse og har en specifik assimilation af næringsmiddelkilder; Pseudomonas mallei er ikke bevægelig og forårsager denitrifikation. Pseudomonas caryophylli danner gulgrønt 30 ikke-fluorescerende pigment og forårsager denitrifikation.

Stamme SB-72310 antages derfor at høre til en ny art af slægten Pseudomonas. Og når henses til det træk, at den optimale vækst-pH er 4,5-7,0, hvilket er noget lavt for bakterier af slægten Pseudomonas generelt, blev stammen SB- 6 148659 72310 benævnt Pseudomonas mesoacidophila SB-72310.

Prøver af denne stamme SB-72310 er henholdsvis blevet deponeret ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Chiba, Japan under 5 FERM-P nr. 4653 og ved Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan under accessionsnummeret IPO 13884, der er deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten, og ved American Type Culture Collection (ATOC), tferyland, U.S.A. under accessionsnummeret ATCC-31433.

Opfindelsen angår son nævnt også en mikroorganismekultur til anvendelse 10 . ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilken kultur er ejen dommelig ved, at det er en biologisk ren kultur af Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (IFO 13884). Pseudomonas bakterier muterer let, når de udsættes for kunstige mutageniske behandlinger såsom bestråling med ultraviolet lys eller røntgenstråler eller behandling 15 med kemiske mutagener (f.eks. nitrosoguanidin, ethylmethansul-fonat). Alle sådanne mutanter og varianter, som har væsentlig samme egenskaber som stamme SB-72310, og som derfor kan henregnes til arten Pseudomonas mesoacidophila, er imidlertid nyttige i forbindelse med den foreliggende opfindelse, hvis de 20 blot besidder og bevarer evnen til at opbygge SB-72310. Til dyrkningen af stamme SB-72310 kan der anvendes sådanne carbon-. kilder som glucose, sucrose, maltose, rest melasse, glycerol, oliér og fedtstoffer, (f.eks. sojabønneolier, olivenolie, etc.), organiske syrer (f.eks. citronsyre, ravsyre, gluconsyre, etc.) og andre 25 assimilerbare carbonkilder. Som nitrogenkilder kan anvendes organiske og uorganiske nitrogenholdige forbindelser og stoffer, såsom f.eks. sojabønnemel, bomuldsfrømel, majsstøbevæske, tørret gær, gærekstrakt, kødekstrakt, pepton, urinstof, ammo= niumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumchlorid, ammoniumphosphat, 30 etc.. Uorganiske salte, som normalt er nødvendige til dyrkningen af bakterier, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, calciumcarbonat, magnesiumsulfat, monokaliumdihydrogenphosphat, dinatriummonohydrogenphosphat, etc., kan yderligere anvendes enten enkeltvis eller i en egnet kombination. Det har vist 35 sig, at udbyttet af det ønskede antibiotikum kan forøges ved at supplere et sådant medium med en svovlforbindelse som SB-72310 -danneren er i stand til at udnytte, nemlig uorganiske 148659 7 svovlforbindelser, såsom sulfater (f.eks. ammoniumsulfat), thiosulfater (f.eks. ammoniumthiosulfat), sulfit (f.eks. ammoniumsulfit), etc. eller organiske svovlforbindelser såsom svovlindeholdende aminosyrer (f.eks. cystin, cystein, L-thia-5 zolidin-4-carboxylsyre), hypotaurin, svovlholdigt peptid (f.eks.

glutathion) eller en blanding deraf. Koncentrationen af sådanne svovlforbindelser i kulturmediet er hensigtsmæssigt 0,01-1,0 vægt/volumen% og fortrinsvis 0,02-0,5 vægt/volumen%.

Salte af tunge metaller såsom ferrosulfat, kobbersulfat etc., 10 vitaminer såsom vitamin B^, biotin, etc. og andre additiver kan desuden inkorporeres efter behov. Antiskumningsmidler og overfladeaktive midler såsom siliconeolie, polyalkylenglycol= ether, etc. kan også tilsættes. Andre organiske eller uorganiske stoffer, som ville fremme væksten af mikroorganismen 15 og fremme produktion af SB-72310, kan naturligvis også tilsættes i passende mængder. Dyrkningen af stamme SB-72310 kan gennemføres ved hjælp af fremgangsmåder, som svarer til dem, som anvendes til fremstillingen af antibiotika i almindelighed under anvendelse af en fast stofdyrknings- eller flyden-20 de dyrkningsmetode. I tilfældet med flydende kultur kan den være stationær, omrørt, omrystet eller aerobisk, selv om dyrkning under aerobisk omrøring er særlig ønskelig. Den foretrukne dyrkningstemperatur ligger i intervallet fra ca. 15-35°C, medens dyrkningsmediets pH-værdi kan variere fra 25 ca. 4 til 8. Dyrkningen gennemføres i ca. 8-168 timer, fortrinsvis i 24-144 timer. Da produktet Antibiotikum SB-72310 for det meste findes i fermentationssuppens flydende fase, er det fordelagtigt at centrifugere eller filtrere suppen for at fraskille overliggende væske eller filtrat fra en cel-30 lulær masse og rense SB-72310 i den overliggende væske eller filtratet. Direkte rensning fra fermentationssuppen er imidlertid også mulig om ønsket.

148659 8

Undersøgelse af styrken af det således opnåede produkt kan gennemføres mod Comamonas terrigena IFO 12685 som testorganismen og.under anvendelse af SB-72310 som standarden ved hjælp af cylindermetoden eller papirskivemetoden under an-5 vendelse af TSA (trypticase soja-agar (Baltimore Biologicals, Limited, U.S.A.)).

Antibiotikum SB-72310 kan udvindes ved hjælp af de forskellige fremgangsmåder, som normalt anvendes til udvindingen af mikrobielle metaboliter. Cellerne fjernes således f.eks. ved 10 centrifugering,og det aktive produkt skilles fra den overliggende væske og renses ved hjælp af de sædvanlige metoder. Fremgangsmåden, som gør brug af opløseligheden eller opløse-- lighedsforskellen i forhold til et egnet opløsningsmiddel, fremgangsmåderi, som udnytter udfældningen eller forskelle i 15 i hastighederne af udfældning af antibiotikummet frå en opløsning, fremgangsmåden, som udnytter dets karakteristiske absorptive affinitet over for forskellige adsorbenter, ionby tterkromatograf i på ionbyttere, koncentrering under reduceret tryk, frysetørring, krystallisation, omkrystallisation, 20 tørring, etc. kan f.eks. anvendes enten enkeltvis eller i en egnet kombination og række eller/og i gentagelse.

En typisk fremgangsmåde kan beskrives nedenfor. Efter endt dyrkning filtreres fermentationssuppen, det resulterende filtrat sendes gennem en søjle af aktiveret trækul, Og det ad-25 sorberede SB-72310 elueres med et hydrofilt organisk opløsningsmiddel. Som eksempler på det hydrofile Organiske opløsningsmiddel kan nævnes lavere ketoner (f.eks. acetone, me= thy lethy Ike ton, methylisobutylketon, etc.) og lavere alkoholer (f.eks. methanol, ethanol,risopropanol, propanol, butanol, 3D etc.). Disse opløsningsmidler kan anvendes alene.eller som. en blanding i kombination med vand. På grund af SB-72310's sure karakter kan der med fordel anvendes anioniske bytterharpikser såsom Cl-formharpikser (Amberlite IRA-400 & 402, fremstillet af Amberlite Co., U.S.A.j Dowez-1, Dow and Che-35 mical Co., U.S.A.y Diaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Indu- U8659 9 stries, Ltd., Japan). Det adsorberede aktive produkt elueres f.eks. med en vandig opløsning af natriumchlorid. For at af-salte eluatet gennemføres søjlekromatografi igen med aktiveret trækul. Det opnåede eluat koncentreres derpå, acetone 5 tilsættes f.eks., og det resulterende bundfald udvindes ved filtrering, vaskes med acetone, diethylether eller lignende og tørres under reduceret tryk til udvinding af lysebrunt pulver. For at rense SB-72310 i pulveret, kan søjlekromatografi på DEAE-Sephadex (Pharmacia, Sverige) anvendes med for- il 10 del. En søjle af DEAE-Sephadex A-25 vaskes således med jqq-phosphatpuffer (pH 6,6)(og en vandig opløsning af de ovennævnte pulvere ledes gennem søjlen og adsorberes derpå. Søjlen vaskes med den samme pufferopløsning som ovenfor, og elu-ering gennemføres med pufferen indeholdende 0,5 vægt/volumen% 15 natriumchlorid. De aktive fraktioner forenes, indstilles til pH-værdi 3,0 og ledes igen gennem en søjle af aktiveret trækul. Søjlen vaskes med vand og derpå med 20 volumen/volumen% vandig methanol. Eluering gennemføres så med vandig acetone, og derpå forenes de aktive fraktioner, og der koncentreres 20 under reduceret tryk. Acetone sættes til koncentratet, hvorved der opnås SB-72310. SB-72310 danner metalsalte og ammo= niumsalt. Som metalsaltene kan nævnes natriumsaltet, kalium= saltet, lithiumsaltet, etc..

De fysisk-kemiske egenskaber af det i eksempel 1 nedenfor opnåede 25 SB-72310 er som følger.

1. Smeltepunkt: Ikke under 110°C

2. Udseende: Hvidt pulver 3. Elementar-analyse: (efter tørring under reduceret tryk over phosphorpentoxid ved 40°C i 6 timer) (%).

30 C 34,40 34,18 (34,40 - 0,5) H 5,56 5,54 ( 5,50 - 0,5) N 13,30 13,65 (13,45 ± 0,5) S 7,56 7,75 ( 7,75 ± 0,5) (O 38,90 - 1,0) 148659 ίο 4. Molekylvægt:

Titrometri: 400 - 20

Antaget empirisk formel (baseret på ovennævnte data): C12H20H4SO9>(H20) 5 Beregnet: C, 34,78; H, 5,35; N, 13,52, S, 7,74 (%) 5. Specifik drejning: [a]^+0,5° - 5° (c=0,93, H2O) 6. Ultraviolet absorptionsspektrum:

Kun endeabsorptioner (ingen karakteristiske absorptioner over 210 nm) .

10 7. Infrarødt absorptionsspektrum (fig. 1), dominerende spidser (KBr) (cm : 3440 (s), 2920 (m), 2850 (m) , 2600 (w), 1770 (s), 1650(s), 1530 (s), 1458(m), 1390 (w), 1340 (w), 1280(sh), 1240 (s), 1210(sh), 1180(m), 1118(w), 1043(s), 792 (w) , 632 (s) 15 (s, m, w og sh betegner henholdsvis kraftig, middel, svag absorption og skulder) 8. Opløselighed i opløsningsmidler:

Uopløselig i petroleumsether, hexan, diethylether, benzen, ethylacetat, chloroform; tungtopløselig i ethanol, pyri= 20 din, acetone; opløselig i methanol, dimethylsulfoxid; let opløselig i vand.

9. Farvereaktioner:

Positiv ninhydrin- og kaliumpermanganatreaktion-negativ ferrichlorid-kaliumferricyanid-, Sakaguchi- og 25 Molisch reaktion; tvivlsom positiv Ehrlich-reaktion.

10. Basicitet, neutralitet eller aciditet: sur.

11. Kernemagnetisk resonansspektrum: (i dimethylsulfoxid, 100 MHz) δ 3/31 ppm (s, et kemisk skift, der kan tilskrives O-CH^).

30 12. Stabilitet:

Stabil i vandig opløsning i området fra pH 3 til 7 ved 60°C i 10 minutters opvarmning; ustabil over pH 8,5.

De fysisk-kemiske egenskaber af det i det efterfølgende eksempel 2 opnåede SB-72310 natriumsalt er som følger: 148659 11 1. Smeltepunkt: Ikke lavere end 110°C.

2. Udseende: Hvidt pulver.

3. Elementaranalyse (efter tørring under reduceret tryk over phosphorpentoxid ved 40°C i 6 timer) (%): .5 C 31,75 31,68 H 5,19 5,11 N 12,68 12,57 S 7,16 7,10

Na 5,01 4,95.

10 4. Molekylvægt: Det antages, at der i molekylet indgår 1 mol

Na.

Titrometri: 438 - 5

Antaget empirisk formel (baseret på de ovennævnte data): C12H19N4S09Na'2H2° 15 Beregnet: C, 31,72; H, 5,10; N, 12,33; S, 7,06; Na 5,06; 5. Specifik drejning: [a]22 + 8,5°-5°(c=0,91, E^O) 6. Ultraviolet absorptionsspektrum:

Kun endeabsorptioner.

-20 7. infrarødt absorptionsspektrum (fig. 2).

Dominerende spidser (KBr) (cm ^): 3430 (s), 3250 (sh), 3000 (m) , 1770 (s), 1640 (s), 1530 (s), 1450(w), 1405(w), 1343(w), 1280(sh), 1245(s), 1180(w), 1118(w), 1050 (s), 820(w), 785 (w) , 632 (s).

25 (s, m, w og sh betyder henholdsvis kraftig, middel og svag absorption og skulder).

8. Opløselighed i opløsningsmidler:

Uopløselig i petroleumsether, hexan, diethylether, ben= zen, ethylacetat, chloroform og acetone, tungtopløselig 30 i methanol, ethanol, pyridin, opløselig i dimethylsulf= oxid, letopløselig i vand.

9. Farvereaktioner:

Positiv: ninhydrinreaktion og kaliumpermanganatreaktion; negativ: ferrichlorid-kaliumferricyanidreaktion, Sakagu= 35 chireaktion og Molisch-reaktion, tvivlsom positiv: Ehr- 148659 12 lich-reaktion.

10. Stabilitet:

Stabil i vandig opløsning i området fra pH 3 til 7 ved 60°C ved 10 minutters opvarmning; ustabil over pH 8,5.

5 Til omdannelse af den fri syreform af SB-72310 til et salt, kan natriumsaltet f.eks. opnås ved at tilsætte ca. et molærækvivalent natriumhydroxid til en vandig opløsning af den fri syre og frysetørre systemet.

Til omdannelse af et salt af SB-72310 til den fri syreform 10 kan sidstnævnte opnås f.eks. ved at tilsætte ca. IN salt= syre til en vandig opløsning af natriumsaltet af SB-72310, til at bringe opløsningens pH-værdi på 3,0 og af-saltning af opløsningen ved hjælp af aktiveret trækul.

SB-72310's biologiske egenskaber er som følger. De anti-15 mikrobielle spektra af SB-72310 og dets natriumsalt over for forskellige mikroorganismer er vist i tabel ‘2.

Som det fremgår af denne tabel, er Antibiotikum SB-72310 virksom mod gram-positive og gram-negative bakterier.

Den akutte toksicitet af natriumsaltet af Antibiotikum 20 SB-72310 er lav, idet der ikke ses dødsfald, når 500 mg/kg af saltet administreres til mus ad intravenøs vej.

Tabel 2.

Antimikrobielle spektre af SB-72310 (hæmningsdiameter (mm) ved hjælp af papirskivemetode) (25 yl af testopløsning af 25 10 mg/ml absorberes i papirskiver med en diameter på 8 mm) 148659 13

Testorganisme Hæmningsdiameter (mm)

Pseudomonas fluorescens IFO 3081 12,5

Escherichia coli NIHJ JC-2 14,5

Serratia marcescens IFO 12648 17 5 Alcaligenes faecalis IFO 13111 23

Proteus mirabilis IFO 3849 19

Proteus vulgaris IFO 3045 18

Salmonella typhimurium IFO 12529 18,5

Klebsiella pneumoniae IFO 3318 12,5 10 Comamonas terrigena IFO 12685 25

Staphylococcus aureus FDA 209P 18,5

Sarcina lutea IFO 3232. 23

Bacillus subtilis IFO 3513 22

Bacillus cereus IFO 3466 14,5 15 Bemærkning: Medium = Trypticase-soja-suppe-agar.

Som det fremgår af det ovennævnte antimikrobielle spektrum, er SB-72310 hæmmende over for gram-negative og gram-positive bakterier. Det kan derfor anvendes ved behandlingen af infektioner med de ovennævnte bakterier i pattedyr (f.eks. mus, 20 rotter, hunde og mennesker) og fugle, der holdes som husdyr (f.eks. fjerkræ og ænder).

Når SB-72310 anvendes som middel mod Escherichia coli in- fektioner, opløses det f.eks. i fysiologisk saltvand og administreres parenteralt, f.eks. subkutant eller intramusku-25 lært,i en dosismængde på 15-60 mg/kg legemsvægt daglig.

Til oral brug blandes Antibiotikum SB-72310 med f.eks. lactose, indkapsles og administreres ved dosismængder på 60-400 mg (som SB-72310)/kg legemsvægt daglig.

SB-72310 kan også anvendes som germicid eller desinfektions-30 middel. SB-72310 opløses f.eks. i destilleret vand til fremstilling af en opløsning indeholdende 0,1-1,0 vægt/volumen% 14 U8659 SB-72310 eller tilberedes med en salvebasis, såsom vaseline eller lanolin,til fremstilling af en salve indeholdende 15-60 mg SB-72310 pr. gram, og nævnte opløsning eller salve overføres til poter, ben, øjne, ører eller andre dele af de 5 ovennævnte dyr som et desinfektionsmiddel.

Sammenligning af Antibiotikum SB-72310 med de kendte anti= biotika har givet følgende oplysninger. Som antibiotika, der er opløselige i vand og er sure og indeholder svovl kan der nævnes penicilliner og cephalosporiner. Ved at 10 SB-72310 imidlertid ikke absorberer i spektrets ultraviolet- te område, afviger det fra cephalosporiner. Den kendsgerning, at det kernemagnetiske resonansspektrum giver et kemisk skift, som kan tilskrives O-methylprotoner, og den kendsgerning, at det giver anledning til glutaminsyre ved syre-15 hydrolysejer desuden tegn på, at SB-72310 er forskellig fra enhver af de naturligt forekommende penicilliner og cepha= losporiner.

Der er på den anden side mange kendte antibiotika opbygget ved hjælp af bakterier af slægten Pseudomonas, men 20 ingen af disse er et vandopløseligt antibiotikum, som er sure og indeholder svovl. SB-72310 er desuden forskellig fra ethvert af de kendte antibiotika, som dannes ved hjælp af andre mikroorganismer end Pseudomonas-stammer, når henses til dets enestående fysisk-kemiske og biologiske egen-25 skaber.

Antibiotikum G-6302, jf. beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 5849/78, og det foreliggende Antibiotikum SB-72310 kan med hensyn til molekylforme1, infrarøde absorptionsspektre, kernemagnetiske resonansspektra, farvereaktioner, sta- 148659 15 bilitet, etc. ikke skelnes fra hinanden. Men de kan helt klart skelnes specielt ved specifik drejning, ved at værdien af [a]j^ af den fri form af Antibiotikum G-6302 er +94°+10° (c-0,35, H2O), hvorimod værdien for den fri form af Antibiotikum 5 SB-72310 er +0,5°+5° (c.0,93, H20).

Det foreliggende Antibiotikum SB-72310 er en epimer isomer af Antibiotikum G-6302, D-alanin i G-6302 er erstattet med L-alanin i SB-72310.

På basis af de ovennævnte kendsgerninger kan det konklude-10 res, at SB-72310 er en hidtil tikendt forbindelse.

De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere.

I eksemplerne er delene vægtdele, medmindre andet er anført, og forholdet mellem dele og volumendele svarer til forholdet mellem gram og milliliter, og % er baseret på 15 vægt/volumen, medmindre andet er anført.

Eksempel 1.

Cellerne af Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (FERM-P nr. 4653; IFO 13884; ATCC-31433) dyrket på et skråstivnet næringsmedium af agar-agar blev anvendt til inokulere 2 x 20 10 volumendele Sakaguchi-kolber, hver indeholdende 500 volumendeie af et medium sammensat af 1% glucose, 0,5% polypepton (fremstillet af Daigo Nitritive Chemical Co.,

Japan), 0,5% kødekstrakt, 0,5% natriumchlorid (pH 7,0), og hver kolbe blev inkuberet på et frem- og tilbagegående 25 rysteapparat ved 28°C i 48 timer. Den resulterende kultur blev anvendt som podekultur.

3

En gæringsbeholder af rustfri stål på 200 x 10 volumen- 3 16 148659 dele blev fyldt med 120 x 10 volumendele af et medium sammensat af 1,5% sucrose, 0,3% gærekstrakt, 0,2% ammoniumsul= fat, 0,6% kaliumdihydrogenphosphat, 0,3% dikaliumhydrogen= phosphat, 0,05% magnesiumsulfat, 0,05% NaCl og steriliseret 5 med damp ved 120°C i 20 minutter. Den steriliserede beholder blev så inokuleret med den ovennævnte podekultur og inkuberet ved en temperatur på 28°C med udluftning med en has-tighed på 120 x 10 volumendele pr. minut, og ved en omrøring på 180 omdrejninger pr. minut i 78 timer. Den resulterende 10 suppe blev så centrifugeret med en Sharpies centrifugalseparator til fjernelse af cellerne, hvilket efterlod 110 x 3 10 volumendele overliggende væske. Væsken blev indstillet 3 til pH-værdi 4,2 og sendt gennem en søjle på 15 x 10 volumendele aktiveret trækul (kromatografisk kvalitet SHIRASAGI, 15 fremstillet af Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) for at få aktivt stof adsorberet derpå.

3 Søjlen blev skyllet med 45 x 10 volumendele vand,, og elu= 3 ering blev derpå gennemført med 45 x 10 volumendele 50 volumen/volumen% vandig acetone, idet eluatet blev opsamlet 3 20 i 10 x 10 volumendele fraktioner. Fraktionerne blev bestemt over for Comamonas terrigena IFO 12685. Fraktionerne

O

nr. 2 og nr. 3 blev forenet, 20 x 10 volumendele vand blev tilsat, og blandingen blev ledt gennem en søjle pakket med 3 10 x 10 volumendele Dowex-1 (Cl-form) (Dow and Chemical 3 25 Industries, U.S.A.). Søjlen blev skyllet med 25 x 10 volu= mendele vand og eluering blev gennemført med 50 x 10^ volu= mendele af en 5% vandig natriumchloridopløsning. De aktive fraktioner blev forenet, indstillet til pH-værdi 4,0 og 3 igen sendt gennem en sø]le af aktiveret trækul (8 x 10 3 30 volumendele). Søjlen blev vasket med 24 x 10 volumendele vand og eluering blev gennemført med 20 volumen/volumen% vandig methanol. De aktive fraktioner blev forenet og koncentreret til 50 volumendele under reduceret tryk. 200 volumendele acetone blev derpå tilsat, og det resulterende 35 bundfald blev filtreret fra, vasket med 50 volumendele acetone og 100 volumendele diethylether, efterfulgt af tør- 148659 17 ring under reduceret tryk. Ved den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået 12 dele råprodukt.

I 500 volumendele M/100 phosphatpuffer (pH 6,6) blev der opløst 10 dele af det ovennævnte råprodukt og opløsningen 5 blev sendt gennem en søjle af 200 volumendele DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Sverige) forud pufret med den samme pufferopløsning som nævnt. Søjlen blev vasket med 400 volumendele af den samme pufferopløsning, og eluering blev derpå gennemført med den samme puffer, hvortil der var sat 0,5% 10 natriumchlorid. De aktive fraktioner blev forenet, indstil let til pH-værdi 3,2 med IN HC1 og sendt gennem en søjle på 60 volumendele aktiveret trækul. Søjlen blev vasket med 200 volumendele vand og 100 volumendele 20 volumen/volumen% vandig methanol,efterfulgt af eluering med 50 volumen/volu= 15 men% vandig acetone. De aktive fraktioner blev forenet, koncentreret under reduceret tryk og opløst i 5 volumendele methanol. Efter tilsætning af 100 volumendele acetone fik opløsningen lov til at henstå i kulden. Det resulterende bundfald blev filtreret fra, vasket med diethylether og .20 tørret under reduceret tryk over phosphorpentoxid ved 40°C i 6 timer. Ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået 3,8 dele pulver. Det infrarøde spektrum af dette produkt er angivet i fig. 1.

Elementæranalyse: C, 34,40; H, 5,56; N, 13,30; S, 7,56 25 (vægt/vægt%).

Eksempel 2.

I 45 volumendele vand blev der opløst 2,0 dele af den fri syre af SB-72310 opnået i eksempel 1, og under afkøling blev der tilsat ca. 4,5 volumendele IN vandig natrium= 30 hydroxid. Dette blev efterfulgt af tilsætningen af en yderligere mængde IN natriumhydroxid, idet opløsningens pH-værdi blev fulgt, indtil der blev opnået en pH-værdi på 6,5. Opløsningen blev frysetørret, hvorved der blev 148659 18 opnået 2,1 dele SB-72310 mononatrlumsalt som et hvidt pulver. Det infrarøde absorptionsspektrum af dette produkt efter tørring under reduceret tryk og ved 40°C i 6 timer er vist i fig. 2.

5 Elementaranalyse: C, 31,75; H, 5,19; N, 12,68; S, 7,16;

Na, 5,01 (vægt/vægt%).

Eksempel 3.

Cellerne af Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 (FERM-P nr.

4653, IFO 13884, ATCC-31433) dyrket på et skråstivnet næ-10 ringsmedium af agar-agar blev anvendt til at inokulere en 200 volumendele konisk kolbe indeholdende 40 volumendele af et medium sammensat af 3% glycerol, 0,1% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% kødekstrakt og 0,5% natriumchlorid (pH 6,5), og den inokulerede kolbe blev inkuberet på et rote-15 rende rysteapparat ved 28°C i 48 timer for at fremstille en podekultur.

Koniske kolber, hver på 200 volumendele, blev hver fyldt med 40 volumendele af et medium svarende til det ovennævnte indeholdende forskellige svovlforbindelser.

20 Hver kolbe blev så inokuleret med 1 volumendel af den ovennævnte podekultur og inkuberet på et roterende rysteapparat ved 28°C i 96 timer. Som det vil fremgå af den følgende tabel, blev produktionen af SB-72310 forøget udpræget ved tilsætningen af svovlforbindelser.

Claims

148659 Tabel 3. Produktionsmængde af SB-72310 Koncen- Produktions- Tilsat forbindelse tration mængde 5 (vægt/volumen%) (yg/ml) Ingen - 21 Ammoniumsulfat 0,25 47 Ammoniumsulfit 0,25 68 Ammoniumthiosulfat 0,25 90 10 Cystein 0,25 54 Cystin 0,25 68 L-thiazolidin-4-carboxylsyre 0,25 90 Hypotaurin 0,25 47 Glutathion 0,25 38 15 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum benævnt isosulfazecin eller Antibiotikum SB-7231Q og med formlen & H SH3 H °ch3 H02C _i"CH2_CH2-C"N-r-C_N —I NH~ 0 Η 0 N 2 /?- \ NS03H eller et salt deraf, kendetegnet ved, at 20 en stamme af arten Pseudomonas mesoacidophila dyrkes i et kulturmedium, hvorpå det dannede antibiotikum udvindes fra dyrkningsmediet, om ønsket i form af et salt deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Pseudomonas mesoacidophila SB-72310 25 (IFO 13884).