La présente Invention concerne des antibiotiques
<EMI ID=1.1>
de sol et rechercher les antibiotiques produits par les'microorganismes dans le but d'explorer et de rechercher de nouveaux antibiotiques. Comme résultat de ces recherches, les auteurs de la présente Invention ont découvert que certains microorganismes pouvaient produire de nouveaux antibiotiques, que ces micro-organismes appartenaient au genre Streptomyces,
que la culture de ces micro-organismes dans un milieu de culture approprié entraîne une accumulation des antibiotiques dans le bouillon de culture et que lesdits antibiotiques ont une activité antimicrobienne vis-à-vis des bactéries Grampositives et Gram-négativea Les auteurs de la présente invention ont isolé les antibiotiques ci-dessus qui/sont confirmés être nouveaux d'après leurs propriétés chimiques et physiques et qui ont la formule suivante (I)
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
La présente invention concerne par conséquent :
(1) l'antibiotique C-19393S2 ou C-19393H2 représenté par la formule
<EMI ID=4.1>
(où R est -S03H ou de l'hydrogène),, et
<EMI ID=5.1>
<EMI ID=6.1>
Dans le contexte de la présente invention l'anti-
<EMI ID=7.1>
produisant ces antibiotiques et appartenant au genre Streptomyces est utilisé. Un exemple type de micro-organisme
<EMI ID=8.1>
rant une suspension d'un échantillon de sol, recueilli en Suède, dans de l'eau stérilisée, sur un milieu de culture
<EMI ID=9.1>
sulfate de magnésium, 5 ug/ml de bléomycine et de 2 % d'agar, ayant un pH de 7 et en purifiant d'une façon répétée
<EMI ID=10.1>
Les caractéristiques microbilogiques de la souche C-19393 de Streptomyces sp. sont les suivantes : a) caractéristiques morphologiques :
Le mycélium aérien ayant une largeur d'environ
<EMI ID=11.1>
est ramifié d'une façon monopode à partir de l'axe principal pour former des chaînes latérales. Des chaînes de spore droites ou légèrement flexueuses c'est-à-dire ce qu'on appelle "rectus flexibilis" 'désigné par la suite en abrégé par "RF") sont observées à l'extrémité de la chaîne latérale. Cha chaque spore est de formule cylindrique (0,35 à
<EMI ID=12.1>
ni organes spécifiques tels que sporanges sphériques et sclérotes ni spores susceptibles de se mouvoir.
b) Caractéristiques de culture :
Les caractéristiques de culture de la couche sur
-divers milieux sont Indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. Sauf indication contraire, les caractéristiques sont obser- <EMI ID=13.1>
Tableau 1
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
jaune grisâtre sont abondamment formés. Aucun pigment soluble n'est .produit.
c) Caractéristiques physiologiques
(1) 7one de température pour la croissance :
<EMI ID=16.1>
(2) Liquéfaction de la gélatine : positive
(3) Hydrolyse de l'amidon : positive
(4) Peptonisation du lait écrémé : positive
coagulation du lait écrémé ': négative
(5) Production de pigments mélanoldes
tyrosine-agar : négative
peptone-extrait de levure-fer-agar:négatlve .(6) Assimilation de sources de carbone (agar de PridhamGottlieb) :
est montré dans le tableau 2 ci-dessous Tableau 2
<EMI ID=17.1>
Note: -: croissance nulle
4 croissance Incertaine
+: croissance
D'après les diverses caractéristiques ci-dessus,
<EMI ID=18.1>
myces. Les auteurs de la. présente Invention ont recherché la position taxonomique de la souche C-19393 basée sur les observations ci-dessus à savoir : la souche développe le
<EMI ID=19.1>
la surface des spores est lisse, les pigments mélanoldes
et les pigments solubles ne sont pas produits dans le milieu, on/observe aucune couleur opposée définie et la couche n'utilise pas de mannitol, en se référant à la bibliographie suivante :
Référence 1. S.A. Walcsman, "The Actinomycetes",
Vol. 2, 1961
<EMI ID=20.1>
Bacteriology, 8th Edition, 1974
<EMI ID=21.1>
Toutefois, les auteurs de la présente Invention ntont trouvé aucune souche dans les références 1 à 3 qui possède toutes les caractéristiques ci-dessus de la souche
<EMI ID=22.1>
mais le Streptomyces rallier!, qui n'utilise pas le mannitol,' diffère de la souche C-19393 du fait que le premier ne se
<EMI ID=23.1>
suite par le nom "Czapek") et, du fait aussi que les types
<EMI ID=24.1>
sont souvent différents. Parmi les souches indiquées dans le
<EMI ID=25.1>
la souche C-19393 dans l'utilisation des sources de carbone autre que le mannitol, mais 11 diffère de la souche 1-19393 du fait eu* il produit des pigments solubles rouges à rose s .
Parmi les 41 souches Indiquées dans le tableau
<EMI ID=26.1>
le Streptomyces canescens n'utilise pas le mannitol mais <EMI ID=27.1>
ne se, développe que légèrement sur le Czapek et, de plus, n'utilise pas de xylose et de rhamnose. Des souches similaires à la souche c-19393 dans l'utilisation des sources de carbone autres que le mannitol sont décrites ci-dessous, mais chacune
<EMI ID=28.1>
indices entre parenthèses. La couleur du mycélium aérien et la production de pigments solubles sont directement comparés entre la scuche C-19393 et les souches typiques des espèces respectives. Streptomyces chrysomallus (coloration du mycélium aérien et production de pigments solubles), Streptomyces citreofluorescens (couleur du mycélium aérien et production
<EMI ID=29.1>
pement sur le Czapek), Streptomyces globisporus (grand diamètre des spores, faible utilisation de l'amidon), Streptomyces globisporus subsp. vulgaris (faible croissance sur le Czapek), Streptomyces griseinus (faible croissance sur le Czapek et coagulation du lait écrémé), Streptomyces par vus
(production de pigments solubles et grand diamètre de spores!
<EMI ID=30.1>
où
Project" (ISP) décrites dans la référence 3,/il y a en tout
34 souches caractérisées par un mycélium aérien blanc à jaune,
<EMI ID=31.1>
opposée définie, ne produisant pas de pigment soluble et possédant des chaînes de spore RF et une surface de spore lisse, sont directement comparées et examinées par rapport aux références 1, 2 et 3 et si nécessaire par rapport aux originaux 'de ces références., en cultivant la souche sur un "milieu T" sur lequel la souche C-19393 montre des propriétés de culture
<EMI ID=32.1>
une propriété caractéristique distincte du fait qu'elle ne peut pas assimiler le mannitol lequel peut être assimilé par la plupart des espèces appartenant au genre Streptomyces qui possèdent un mycellium aérien blanc à jaune et, par conséquent, <EMI ID=33.1>
-espèce et la désigne par le' nom streptomyces sp. C-19393. Cette souche a été déposée au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,, Tsukuba, Japon" avec le numéro de dépôt : FERM-P n[deg.] 4774; à <EMI ID=34.1>
on sait que diverses, propriétés de Streptomyces ne sont pas définies et sont susceptibles de subir des mutations spontanées ou artificielles. Donc la souche qui peut être utilisée dans la présente invention comprend toute souche qui appartient au genre Streptomyces et peut produire les antibiotiques C-19393S2 et/ou C-19393H2..
La culture selon le procède utilisé pour la production de l'antibiotique de la présente invention peut être réalisée en faisant croître la souche ci-dessus dans un milieu de culture contenant des produits nutritifs assimilables par les micro-organismes. Les sources de carbone comme composant du milieu peuvent être par exemple: le glucose, l'amidon, la glycérine,' 18 dextrine, le saccharose, la gelée de millet, les mélasses, etc. Comme exemple de sources d'azote on peut citer : l'extrait de viande, la levure séchée, l'extrait de levure, la farine de soja, la liqueur de macéra-' tion du mats, les germes de blé, la farine de graines de coton, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, etc.
Si nécessaire des sels minéraux tels que carbonate de. calcium, chlorure de sodium, chlorure de potassium, sel de l'acide phosphorique, etc. ainsi que des substances organiques et minérales facilitant la croissance du micro-organisme et fa-
<EMI ID=35.1>
priées..
Egalement, des sels de métaux lourds, tels que le sulfate ferreux, le sulfate de cuivre, etc. et des vitamines <EMI ID=36.1>
au milieu si nécessaire, En outre, des produits anti-mousses et des tenslo-actifs tels qu'une huile de silicone, un polyalkylèneglycoléther, etc. peuvent être ajoutés au milieu. D'autres substances organiques. et minérales facilitant la croissance
<EMI ID=37.1>
appropriées.
La culture peut être effectuée par les procédés classiques utilisés généralement pour la production des anti-
<EMI ID=38.1>
culture en milieu liquide. La culture en milieu liquide peut être effectuée en culture stationnaire, culture agitée, culture. secouée ou culture aérobie, mais elle est de préférence effectuée en culture.agitée sous aération. La culture est effectuée
<EMI ID=39.1>
à un pH d'environ 4 à environ 8, pendant environ 8 heures à environ 168 heures, et de préférence pendant 24 à 144 heures.
<EMI ID=40.1>
principalement d'une façon extracellulaire dans lé bouillon de fermentation et par conséquent il est avantageux de séparer la culture résultante en cellules microbiennes et en un liquide surnageant par centrifugation ou flltration puis de séparer l'antibiotique désiré d'avec le liquide surnageant. Toutefois, l'antibiotique désiré peut également être obtenu directement à partir du boullon de fermentation.
Des essais pour déterminer l'activité -du produit ainsi obtenu peuvent être effectués vis-h-vis du Comamonas terrigena IPO 13299,en tant qu'organisme d'essai, et en utili-
<EMI ID=41.1>
effectuée par le procédé généralement utilisé pour isoler les .métabolites produits par les micro-organismes. Par exemple <EMI ID=42.1> solubles dans l'eau produites pour la plupart d'une façon extracellulaire, un procédé comprenant l'élimination des
<EMI ID=43.1>
séparation, purification et récolte de la substance active à partir du filtrat est'généralement utilisé pour isoler les
<EMI ID=44.1>
l'avantage de la différence existant dans le comportement et
le degré de solubilité dans divers solvants, la différence dans le comportement ou la vitesse de précipitation, et la différence dans l'affinité d'adsorption, ainsi que la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie sur tamis moléculaire, la concentration sous pression réduite et la lyophilisation, etc.. peuvent être utilisés, seuls ou en combinaisons appropriées, dans un ordre quelconque ou d'une
façon répétée. Des exemples d'adsorbants pouvant être utilisés . sont le charbon actif, les résines adsorbantes, les résines échangeuses d'anions, la cellulose,en poudre, le gel de silice, etc. ou.des véhicules ayant des propriétés de tamis moléculaire. Des exemples de solvants d'élutlon pouvant être utilisés sont les solutions aqueuses de solvants organiques solubles dans l'eau tels que acétone, méthanol, éthanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol et analogues, ou des solutions aqueuses d'acides ou d'alcalis, ou bien un tampon
ou des solutions aqueuses de sels minéraux ou de sels organiques bien que les solvants pouvant être utilisés diffèrent selon le type de véhicule..
<EMI ID=45.1>
le bouillon de fermentation obtenu une fois la culture terminée est filtrée en utilisant un auxiliaire de filtration pour éliminer les cellules microbiennes. Le filtrat résultant est passé à travers une colonne de charbon actif dans des
<EMI ID=46.1> .adsorbé est élué avec un système de solvants hydrophiles. La plus grande partie de l'activité antibactérienne est trouvée . dans l'éluat aqueux. Puisque la substance antibiotique de la présente invention est de nature acide, les résines échananioniques
<EMI ID=47.1>
402 et 410 (Rohm & Haas Co., U.S.A.), "Dowex"-1 (Dow and Chemical Co,,U,S.A.), "Dialon SA"-2lA et C (Mitsubishi Chemical Industries, Japon) peuvent être avantageusement
<EMI ID=48.1>
biotique est encore éluée avec une solution aqueuse de chlorure de sodium ou une solution tampon. L'élimination des sels de l'éluat peut être effectuée en rendant l'éluat faiblement -acide et en soumettant encore cet éluat à la chromatographie sur charbon actif puis à une élution avec
<EMI ID=49.1>
active est concentré sous pression réduite à basse température et du méthanol ou de l'éthanol est ajouté au concentré. Le précipité formé est éliminé par. filtration et la solution hydro-alcoolique résultante est concentré de nouveau sous pression réduite. Au résidu concentré on ajoute de l'acétone ou un produit analogue et le précipité est séparé par filtration. La poudre ainsi obtenue peut être ensuite. purifiée avantageusement par chromatographie sur colonne en utilisant
<EMI ID=50.1>
(Pharmacia Co., Suède) et une résine adsorbante "XAD" (Rohm
et Haas Co. U.S.A.) ou une résine du type à grande porosité "Dialon HP-20" (Mitsubishi Chemical Industries, Japon désignée par la suite quelquefois par le terme "Dialon HP-20"). Pour cela, une solution aqueuse de la poudre obtenue ci-dessus est passée et adsorbée sur du "DEAE Sephadex" 25 (forme Cl-) et âpres lavage à l'eau, la colonne est éluée avec une solution
<EMI ID=51.1>
tuée.en utilisant un mélange d'isobutanol et d'eau, mais les meilleurs résultats peuvent être obtenus en éluant dans des conditions neutres ou faiblement basiques réglées en ajoutant de l'ammoniaque diluée ou produits analogues. La substance
<EMI ID=52.1>
adsorbée est éluée par fractions avec de l'eau. Les fractions actives sont recueillies et concentrées et le concentré est soumis à la chromatographie sur colonne en utilisant le QAE
<EMI ID=53.1> <EMI ID=54.1>
l'éluat par chromatographie sur charbon actif de la même façon que décrite ci-dessus. L' éluat est concentré et le concentré est soumis à la chromatographie sur colonne de "XAD-II" puis en éluant et fractionnant avec de l'eau.
Ces fractions sont trouvées comprendre des fractions montrant un pic unique sur un chromatogramme en phase liquide comme décrit plus loin. Les fractions actives sontrassemblées et concentrées à siccité sous. pression réduite à basse température, et de l'acétone ou un produit semblable est ajouté au
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
cifiquement, le bouillon de fermentation obtenu une fois
la culture terminée est filtrée en utilisant l'auxiliaire de filtration pour élimine.' les cellules microbiennes . Le filtrat résultant est passé à travers une colonne de charbon actif dans des conditions neutres ou faiblement acides et
<EMI ID=57.1>
hydrophiles. Puisque la substance antibiotique de la présente Invention est de nature acide, des résines échangeuses
<EMI ID=58.1>
vent être utilisées avantageusement pour la purification ultérieure. La substance active est encore éluée avec la solution aqueuse de chlorure de sodium ou une solution tampon. L'élimination des sels de l'éluat peut être effectuée en rendant l'éluat neutre ou faiblement acide et en le soumettant de nouveau a une chromatographie sur charbon actif, puis éluant avec un mélange hydro-alcoolique, etc. L'éluat contenant la substance active est concentré sous .pression réduite et à basse température et on ajoute du méthanol ou de l'éthanol au concentré. Le précipité formé est éliminé. par filtration et la solution hydro-alcoolique résultante est de nouveau concentrée sous pression réduite, Pour une purification poussée du concentré résultant, la <EMI ID=59.1> d'une élution avec de l'eau pour éliminer le tampon.
Les fractions actives .éluées sont concentrées sous pression réduite à basse température et le concentré est lyophilisé pour obtenir le C-19393H2 sous forme d'une poudre blanche.
Les composés de la présente Invention peuvent former respectivement des sels de métaux alcalins ou des sels d'ammonium. Comme exemple de sels métalliques de chaque
<EMI ID=60.1>
lithium, etc.
Les propriétés chimiques et physiques du sel disodlque du C-19393S2 obtenu dans l'exemple 1 décrit plus loin sont les suivantes
(1) aspect : poudre blanche
<EMI ID=61.1>
(c=0,5 dans l'eau)
<EMI ID=62.1>
Les échantillons sont séchés sur du pentoxyde de
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
(la teneur en oxygène est le reste calculé en soustrayant les teneurs des autres éléments)
(4) Poids moléculaire : (calculé comme contenant 2 atomes de
<EMI ID=65.1>
(6) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:
Le spectre mesuré dans l'eau est Indiqué sur la figure 1 et la valeur maximum est la suivante :
<EMI ID=66.1>
(7) Spectre d'absorption infrarouge <EMI ID=67.1> une pastille de bromure de potassium est montré sur la figure, et les pics principaux (nombre d'ondes) sont les suivants:
<EMI ID=68.1>
(8) Chromatographie en couche mince ("Cellulose f" (Tokyo
Kasei Co., Ltd. Japon);
<EMI ID=69.1>
(9) Chromatographie en phase liquide sous
<EMI ID=70.1>
(10) solubilité :
Insoluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone; faiblement soluble dans l'éthanol, butanol, la
<EMI ID=71.1>
l'acide acétique; très soluble dans l'eau.
(11) Réactions colorés
Positives : réaction de Ehrlich et au permanganate
de potassium
Négatives : réactions à la Ninhydrine, Greig-Leaback,
Dragendorff, au chlorure ferrique et de . Sakaguchi.
Les propriétés physiques et chimiques du sel
<EMI ID=72.1>
plus loin sont les suivantes :
(1) aspect : poudre blanche
(2) analyse élémentaire {$) ^déterminée sur l'échantillon <EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
(3) Poids moléculaire (calculé comme contenant 1 atome de
<EMI ID=75.1>
(4) Formule moléculaire
<EMI ID=76.1>
(5) Pouvoir rotatoire spécifique :
<EMI ID=77.1>
(6) Spectre d'absorption en ultraviolet
Le spectre mesuré dans l'eau est montré sur la figure 3 et les valeurs maximum sont les suivantes :
<EMI ID=78.1>
(7) Spectre d'absorption en infrarouge
Le spectre mesuré du produit dispersé dans une pastille de bromure de potassium est montra sur la figure 4 et les pics principaux (nombre d'onde) sont les suivants :
<EMI ID=79.1>
<EMI ID=80.1>
(9) Chromatographie en couche mince /en utilisant la "Cellulose f" (Tokyo Kasei Co. Ltd., Japon) )
<EMI ID=81.1>
(10) Chromatographie en phase liquide sous haute pression
(Waters Associates Ine. U.S.A.) <EMI ID=82.1>
(11) Réactions colorées
Positives : Réactions d'Ehrlich, au permanganate
de potassium.
Négatives : Réactions à. la ninhydrine, Greig-
Leaback, Dràgendorff', au chlorure ferrique et de Sakaguchi
(12) Solubilité :
Insoluble dans le chloroforme et l'acétate d'éthyle:
faiblement soluble dans l'acétone, l'éthanol et le butanol; soluble dans le méthanol et l'eau. D'après les propriétés décrites ci-dessus, les
<EMI ID=83.1>
ment.des antibiotiques du type (i-lactame et en se basant sur chacune des analyses élémentaires et des poids moléculaires estimés, les formules moléculaires estimées sont
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
max
et 287 + 4 nm sur le spectre d'absorption en ultraviolet,
on estime que les antibiotiques de la présente invention ont le même groupe chromophore que dans le MM-4550 parmi les antibiotiques connus du type p-lactame.
Le tableau 3 montre les résultats comparatifs du
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
vis, des bactéries Gram-positives et Gram-négatives.
<EMI ID=91.1>
Note) Milieu : Bouillon d'agar
<EMI ID=92.1>
forte activité Inhibitrice de la béta-lactamase et, par
<EMI ID=93.1>
diverses bactéries résistant aux dérivés de la pénicilline
<EMI ID=94.1>
dérivés de la pénicilline et/ou aux dérivés de la céphaloaporlne. Cette augmentation de l'activité antimicrobienne <EMI ID=95.1>
dans le tableau 5.
Tableau 5 Effet de renforcement de l'activité antimtcro-
<EMI ID=96.1>
C-19393S2
<EMI ID=97.1>
<EMI ID=98.1>
à produire la béta-lactamase.
Milieu : infusion de coour-agar
(Elken Chemical Co. Japon).
Comme on peut le voir d'après le spectre anti-
<EMI ID=99.1>
Invention montre une activité antimicrobienne vis-à-vis 'des bactéries Grain-positives et Gram-négatives. Par consé-
<EMI ID=100.1>
d'infections bactériennes chez les mammifères (par exemple souris, rat, chien, êtres humains), les différentes espèces de volatiles (par exemple. poules, canards).
<EMI ID=101.1>
dissout cet antibiotique dans la solution saline physiologique pour préparer une solution injectable qui peut être administrée par voie parentérale, par exemple par vole souscutanée ou Intramusculaire, à la dose de 2 à 200 mg/kg/jour,
<EMI ID=102.1> <EMI ID=103.1>
Invention peut être utilisé comme désinfectant. Par exemple,
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
de 0,1 à 1% (poids/volume) ou une pommade contenant 2 à
<EMI ID=106.1>
vaseline blanche ou de lanoline comme base, peut être utilisée comme bactéricide ou désinfectant des mains, des membres, des yeux, des oreilles, etc. des animaux ci-dessus.
Comme on peut le voir d'après les.résultats du
<EMI ID=107.1>
Inhibitrice de la béta-lactamase et par conséquent augmente remarquablement la sensibilité des bactéries résistant à la
<EMI ID=108.1>
béta-lactamase. Par conséquent le C-19393S2 peut être utilisé pour le traitement des infections chez les mammifères
(par exemple souris, rat, chien, êtres humains) et les espèces volatiles (par exemple poules;.canards etc.) en particulier dans les Infections bactériennes dues aux bactéries résistant aux antibiotiques béta-lactame, en
<EMI ID=109.1>
porine.
<EMI ID=110.1>
d'autres agents du type béta-lactame pour le traitement des Infections, par exemple par l'E.coll résistant aux antibio-
<EMI ID=111.1>
d'ampicilline sont dissoutes dans la saline physiologique pour préparer une solution injectable qui peut être administrée par voie parentérale, par exemple par vole sous-cutanée
<EMI ID=112.1>
administré par vole orale à la dose de 1 à ?00 mg/kg/jour, de préférence 5 à 100 mg/kg/jour sous .forme 'de capsules <EMI ID=113.1>
céphalexine.
Quand le C-19393S2 est utilisé comme désinfectant, une préparation liquide par exemple une solution aqueuse
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
par gramme de vaseline blanche ou de lanoline, comme base, peuvent être utilisées comme bactéricides ou désinfectants pour les mains, les membres, les yeux, les oreilles, etc.. des animaux ci-dessus.
L'antibiotique C-19393S2 est également prévu pour être utilisé comme produit intermédiaire pour la synthèse de nouveaux,types de produits. pharmaceutiques. L'antibiotique de la présente invention est stable en solution aqueuse dans la région de pH neutre.
Les propriétés physiologiques du C-19393H2 sont les suivantes.
<EMI ID=116.1>
C-19393H2 vis-à-vis des divers micro-organismes est montré dans le tableau 6; et d'après ces résultats on volt que
<EMI ID=117.1>
ne vis-à-vis des bactéries Gram-positives et Gram-négatives.
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
Note) Milieu: Bouillon d'agar Comme le montre le tableau 6 ci-dessus, l'antibio-
<EMI ID=120.1>
et Gram-négatives et, par conséquent, peut être utilisé pour le traitement des Infections bactériennes chez les mammifères par exemple : souris, rat, chien, êtres humains et analogues et chez les espèces de volailles, par exemple poule, canard et analogues.
<EMI ID=121.1>
est dissous dans la solution de saline physiologique pour préparer une solution injectable qui peut être administrée par vole parentérale, par exemple par voie sous-cutanée ou
<EMI ID=122.1> rence 0,5 à 20 mg/kg/jour. Egalement, pour l'administration orale, l'antibiotique C-19393H2 est mélangé avec du lactose et encapsulé pour fabriquer une prépara lion en capsules qui peut être administrée à la dose de 1 à 100 mg/kg/jour, de préférence 5 à 50 mg/kg/jour.
En outre, le C-19393H2 obtenu selon la présente Invention peut être utilisé comme désinfectant. Par exemple,
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
(poids/volume ) ou une pommade contenant 0, 2 à 20 mg, de
<EMI ID=125.1>
blanche ou de lanoline comme base, peuvent être utilisées comme bactéricides ou désinfectants pour les mains, les membres, les yeux, les oreilles, etc. des animaux ci-dessus.
L'antibiotique C-19393H2 est également prévu pour être utilisé comme produit intermédiaire pour la ,synthèse de nouveaux types de produits pharmaceutiques. L'antibiotique de la présente invention est stable en solution aqueuse dans la région de pH neutre.
Comme décrit ci-dessus le MM-4550 peut être pris en exemple comme antibiotique relativement similaire aux antibiotiques de la présente invention C-19393S2 et
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
<EMI ID=128.1>
770-772, 1977) qui est la même substance que le MM-4550 est très Instable (Umezawa et Col., The journal of Anti-
<EMI ID=129.1>
La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après dans lesquels, sauf indication contraire, tous les pourcentages sont exprimés en poids/volume.
Exemple 1
On fait croître une culture de Streptomyces sp. souche C-19393 (IFO 13886, ATCC 31486) sur 200 ml de milieu T chargé dans un flacon Erlenmeyer de un litre pour obtenir des spores. Les spores résultants sont ensuite mis en suspension dans de l'eau stérillisée à une concentration de 1,2 x 108 cellules vivantes/ml La suspension de spore est diluée avec de l'eau stérilisée jusqu'à un volume
égal à dix fols le volume initial, et 1 ml de la suspension diluée est utilisée pour Inoculer 40 ml d'un milieu pour
<EMI ID=130.1>
germes inoculé est ensuite cultivé sur une secoueuse rotative à 28[deg.]C pendant deux jours. La culture résultante est utilisée pour inoculer 500 ml d'un milieu de culture ensemencé chargé dans un flacon de secoueuse de Sakaguchi et le bouillon ensemencé inoculé est cultivé sur une
<EMI ID=131.1>
La culture de germes ainsi obtenue est transférée dans un récipient de fermentation de 50 litres en acier �oxydable contenant 30 litres d'un milieu ensemencé renfermant 15 ml d "'Actocol" (Takeda Chemical Industries, Ltd.,Japon) et
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
bouillon de culture est transféré dans un récipient de
<EMI ID=134.1>
principal et. cultivé à 30[deg.]C pendant 5 jours, avec une aération de 840 1/minute et une agitation de 180 tours/ minute. Le milieu ensemencé utilisé ci-dessus est composé
<EMI ID=135.1>
brute de soja, 10 g de liqueur de macération du mats,
<EMI ID=136.1>
3 g de chlorure de sodium et 5 g de carbonate de calcium précipité par litre de bouillon qui a été réglé à un pH de 7 avant d'être stérilisé, et le milieu de culture principal utilisé ci-dessus est composé de 30 g de glucose,
30 g d'amidon soluble, 15 g de farine de soja dégraissée,
15 g de farine de graines de'coton, 0,25 g de phosphate monopotassique, 0,6 g de phosphate dipotassique, 0,002 g
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
milieux utilisés ci-dessus sont stérilisés à la vapeur à
120[deg.]C pendant ?0 minutes.
Le bouillon de fermentation ainsi obtenu est filtré
<EMI ID=139.1>
obtenir 1230 1 d'un filtrat qui est ensuite réglé à pH 6,3 et passé à travers une colonne remplie avec 100 litres de charbon
<EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
d'eau, respectivement. L'éluat contenant le C-19393H2 est
<EMI ID=142.1>
<EMI ID=143.1>
éluée avec 3? litres d'une solution aqueuse de chlorure de
<EMI ID=144.1>
colonne remplie avec 4 litres de charbon actif. Après lavage
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<EMI ID=146.1>
lange Isobutanol; ammoniaque N/20 (8:92) et l'éluat est concentré à un volume de 150 ml sous pression réduite.1350 ml de méthanol sont ajoutés au concentré et le précipité ainsi formé est éliminé par filtration. Le filtrat est concentré
<EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
est lavée successivement avec des solutions aqueuses de
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substance antibiotique désirée est éluée avec 1500 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium O,4M. L'éluat est réglé à pH 5.et passé à travers une colonne remplie avec
500 ml de charbon actif. Après lavage avec 1,5 1 d'eau, la
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ammoniaque N/20 (8:92) et l'éluat est concentré à siccité;
on ajoute alors de l'acétone au résidu pour obtenir 2,4 g d'une poudre jaune pâle. Après dissolution de la poudre obtenue dans une petite quantité d'eau, la solution est passée à tra-
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Les fractions qui montrent l'activité antibiotique sont
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travers une colonne remplie avec 200 ml de "QAE-Sephadex
<EMI ID=154.1> <EMI ID=155.1>
remplie avec 600 ml de charbon actif. Après avoir lavé la colonne avec 1,8 1 d'eau, la colonne est éluée avec 3 litres
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concentré à siccité et de l'acétone est ajoutée au résidu pour obtenir 1,07 g d'une poudre. Une portion de 620 mg de la poudre ainsi obtenue est dissoute dans une petite quantité d'eau et la solution est passée à travers une colonne remplie avec
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est ensuite éluée par fractions avec de l'eau et chacune des fractions qui montre une activité antibiotique est soumise.à l'analyse par chromatographie en phase liquide comme décrit ci-dessus. Les fractions qui montrent un seul pic sont rassem-. blées et concentrées à siccité et de l'acétone est ajouté au
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C-19393S2 sous forme d'une poudre blanche.
Exemple 2
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12 1) et la colonne est lavée avec 6 litres d'eau éluée avec
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L'éluat est passé à travers une colonne remplie avec 25 ml de charbon actif. Après lavage avec 75 litres d'eau, l'anti-
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sous pression réduite. 15 litres de méthanol sont ajoutés au concentré et le précipité ainsi formé est éliminé par filtration. Le filtrat est concentré à un volume de 2 litres et passé à travers une colonne remplie, avec 5 litres "Diaion
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fractionnée avec 5 litres d'eau et 10 litres d'un mélange méthanol:eau (1:9). Les fractions actives sont rassemblées et concentrées, et le concentré est passé à travers une colonne remplie avec 3 litres de "DEAE-Sephadex A-25"
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aqueuse de chlorure de sodium 0,02M et l'antibiotique désiré est élue et fractionné avec 12 litres de solution aqueuse de chlorure de sodium 0,05M. Les fractions actives sont passées à travers une. colonne remplie avec 2 litres de "Dialon HP-20"
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aqueuse
tien/de chlorure de' sodium., et, après levage avec 10 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 5%, le principe actif est élue et fractionné avec 10 litres d'un mélange méthanol:solution aqueuse de chlorure de sodium à 5% (5:95) et 10 litres d'un mélange méthanol:solution aqueuse de
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passées à travers une colonne remplie avec 500 ml de charbon actif et, après lavage avec 1,5 1 d'eau, sont éluées avec
<EMI ID=167.1>
et le concentré est passé à travers une colonne remplie
<EMI ID=168.1>
élué et fractionné avec de l'eau. Les fractions ayant une activité antibiotique sont rassemblées et concentrées et le concentré est passé à travers une colonne remplie avec
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avec 400 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium
<EMI ID=170.1>
à travers une colonne remplie avec 200 ml de charbon actif et, après lavage avec 0,6 litre d'eau, sont éluées avec 1
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du propanol est ajouté au concentré pour préparer une solu-
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
la colonne est éluée avec de l'eau. Les fractions actives sont concentrées et le concentré est soumis à la chromato-
<EMI ID=174.1>
sant "RP-18" (E.Merck & Co. Allemagne le l'Ouest) comme véhicule et élue avec un mélange tampon au phosphate 0,02M:
<EMI ID=175.1> <EMI ID=176.1>
(maille 149 um à 74 um) etéluées par fractions avec de l'eau. Chacune des fractions qui révèle l'activité antimicrobienne est soumise à l'analyse en chromatographie en phase liquide comme décrit ci-dessus. Les fractions qui montrent un seul.
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<EMI ID=178.1>
Exemple 3
1150 litres d'un filtrat de bouillon de culture préparé par un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple
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avec 100 litres de charbon actif. Après lavage avec 300 litres d'eau,.la colonne est éluée avec 350 litres d'un mélange
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<EMI ID=181.1> .est éluée avec 100 litres d'une solution aqueuse de chlorure <EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
été traitée avec 40 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 5%, et la colonne est lavée avec 20 litres d'une solution aqueuse de chlorure de sodium à 5%. Ensuite les C-19393S2 et C-I9393H2 sont élues de la colonne avec 40 litres d'eau et 60 litres d'un mélange méthanol : solution aqueuse de chlorure de sodium à 5% (5:95) respectivement. L'éluat
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une colonne remplie avec 2 litres de charbon actif. Après lavage avec 6 litres d'eau, la colonne est éluée avec 10 litres d'un mélange isobutanol 8%-ammoniaque N/20 et l'éluat est concentré. Le concentré est passé à travers une colonne remplie
<EMI ID=185.1>
avec 1 litre d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,2M, la colonne est éluée avec 1 litre d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,4M. Ensuite, l'éluat est dessalé par chromatographie sur charbon actif et est soumis à la chromatographie sur colonne avec "Amberlite XAD-II" et on continue de travailler de façon identique à celle de l'exemple 1
pour obtenir 100 mg du sel disodique de l'antibiotique C-19393S2 sous forme d'une poudre blanche.
Exemple 4
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2 litres de charbon actif. Après lavage avec 6 litres d'eau, la colonne est éluée avec 10 litres d'une mélange lsobutanol:
ammoniaque N/20 (8:92) et l'éluat est concentré. Le concentré est passé à travers une colonne remplie avec 200 ml de
<EMI ID=187.1>
d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,02M, la colonne est éluée avec 1 litre d'une solution aqueuse de chlorure de sodium 0,04M. Une fois que l'éluat a été dessalé par chromatographie sur charbon actif, il est soumis à la chroma'-
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<EMI ID=189.1>
de l'eau. Les fractions qui montrent un seul pic par chromatographie en phase liquide sont rassemblées et concentrées et le concentré est lyophilisé pour obtenir 48 mg du sel sodique
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REVENDICATIONS '
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formule
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dans laquelle 8 représente un groupe -SO�H ou de l'hydrogène, et les sels de ces antibiotiques.
2. Procédé pour la préparation des antibiotiques C-19393S2 et/ou C-19393H2 caractérisé parle fait qu'il comprend la culture d'un micro-organisme appartenant au
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nant des sources de carbone assimilables et des sources d'azote digestibles jusqu'à ce que les antibiotiques C-19393S2
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milieu, et la récupération de ces antibiotiques.