FR2550223A1 - Spf-100 et procede de preparation - Google Patents

Abstract

NOUVEAU PRODUIT TUMORICIDE, APPELE SPF-100, OBTENU A PARTIR DE CULTURE DE STREPTOCOQUES. ON LE PREPARE EN AJOUTANT AU MILIEU DE CULTURE, A UN MOMENT APPROPRIE, DE LA PENICILLINE, OU UN DE SES DERIVES, DE MANIERE A CE QUE CETTE SUBSTANCE ACTIVE SOIT LIBEREE, A PARTIR DES ORGANISMES DE STREPTOCOQUES, DANS LE BOUILLON DE CULTURE. ON OBTIENT AINSI UN PRODUIT RELATIVEMENT PUR, A ACTIVITE TUMORICIDE PRONONCEE.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé de culture de streptocoques

au cours duquel sont favorisées l'élimination du corps des bactéries, et l'accumulation dans le milieu de culture, d'une substance active produite par ces bactéries Elle concerne également le produit obtenu, SPF-100, qui possède une activité cancéricide directe

et une activité d'immunoactivation.

On a déjà utilisé, dans des compositions carcinostatiques, du Streptococcus pyogenes vivant, atténué D'au10 tre part, sont déjà connus un procédé qui consiste à broyer les corps de S pyogenes, pour en extraire un constituant actif à l'aide d'eau ou de solution saline, que l'on additionne ensuite d'un solvant organique, afin de recueillir sous forme de précipité le constituant tumoricide (Cf la publication du brevet japonais N 1647/1963); un autre procédé consiste en une bactériolyse'de S pyogenes à l'aide d'une lysokinase telle que lysozyme ou cellulase, ou d'une protéinase, et en un fractionnement de la fraction active sous forme de phase aqueuse {Cf brevet anglais N 1163865). 20 Ainsi qu'il est indiqué plus haut, il est bien connu que les streptocoques eux-mêmes, ou certains de leurs constituants, présentent une activité tumoricide Toutefois, les substances habituellement connues sont principalement des corps bactériens ou des constituants cellulaires, poly25 mères, solubles ou insolubles Afin d'isoler un constituant actif d'une bactérie il s'avère nécessaire de réaliser une bactériolyse ou un broyage mécanique de la bactérie, et de fractionner l'ensemble Ces différents traitements peuvent compliquer la purification du produit, de sorte que l'isole30 ment du constituant actif est très difficile A titre d'exemple d'un constituant actif, réellement isolé et déterminé, on peut citer une protéine de poids moléculaire 150 000

(Cf publication de brevet japonais N 43841/1973).

La présente invention est basée sur la constata35 tion que la purification de différents produits bactériens, provenant de streptocoques, pouvait être considérablement simplifiée, lorsque l'on provoque l'élimination de ces produits hors du corps des bactéries, au cours de la culture, notamment par addition de pénicilline, et que les substan5 ces physiologiquement actives, produites, étaient beaucoup

plus intéressantes.

Le nouveau procédé selon l'invention consiste à

ajouter de la pénicilline, ou un produit dérivé, à un moment approprié, dans le bouillon de culture de streptoco10 ques, et à isoler de ce bouillon le SPF-100 ainsi obtenu.

Ce SPF-100, qui fait également partie de l'invention, est un nouveau produit qui présente un large intervalle de poids moléculaires et peut être classé, en fonction de

ceux-ci, dans SPF-1 et SPF-2.

L'invention est décrite plus en détails avec référence aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1 % de SPF-100, tandis que la figure 2 représente un spectre d'absorption de SPF-100 20 dans l'infrarouge; la figure 3 représente un spectre d'absorption dans l'ultra-violet d'une solution aqueuse à 3,3 % de SPF-1, tandis que la figure 4 représente un spectre d'absorption dans l'infra-rouge de SPF-1; la figure 5 représente un spectre d'absorption dans l'ultra-violet d'une 25 solution aqueuse à 0,2 % de SPF-2, tandis que la figure 6 représente un spectre d'absorption dans l'infra-rouge de

SPF-2.

SPF-100 présente une action cancéricide directe

et une action d'immunoactivation.

Dans le procédé selon l'invention, un produit bactérien est éliminé de l'organisme bactérien et se trouve

présent dans le milieu de culture C'est pourquoi il peut être isolé par un procédé assez simplifié, c'est-à-dire être séparé par filtration des organismes bactériens, le 35 bouillon de culture filtré étant ensuite purifié.

Il existait déjà un procédé au cours duquel on cultivait un streptocoque et atténuait la bactérie obtenue par traitement avec de la pénicilline Cependant, n'a jamais été mentionné un procédé comprenant l'élimination hors des organismes bactériens d'un produit bactérien par

addition de pénicilline au cours de la culture.

Au cours du procédé selon l'invention on peut utiliser toute espèce de streptocoque Conviennent notamment: Streptococcus pyogenes ATCC 21060 10 Streptococcus sp ATCC 21597 Streptococcus pyogenes ATCC 21546 Streptococcus pyogenes ATCC 21547 et

Streptococcus pyogenes ATCC 21548.

On utilise fréquemment des milieux naturels comme 15 milieu d'extrait de viande, milieu d'extrait de levure et milieu d'infusion coeur-cerveau (milieu BHI), bien que l'on puisse utiliser des milieux généraux renfermant des sources de carbone et d'azote, dans la mesure o l'on peut y faire

croître de manière efficace des streptocoques.

Les streptocoques peuvent être cultivés dans des conditions appropriées, c'est-à-dire à un p H de 6 à 8 (de préférence 6,8 à 7,2), et à une température allant de 30 C à 40 C (de préférence entre 35 et 37 C) En général, on utilise une culture anaérobique et statique, bien qu'on

puisse opérer dans d'autres conditions, y compris une culture sous agitation.

Conformément à l'invention, de la pénicilline, ou des substances dérivées sont ajoutées à un moment approprié au cours de la culture, afin d'éliminer de l'organisme de la 30 bactérie différentes substances intéressantes, produites par

elle, et de les accumuler dans le milieu.

On peut opérer avec toute substance dérivée de la pénicilline, connue pour avoir un effet similaire, bien qu'on utilise habituellement de la pénicilline G ou de la cé35 phalosporine C La pénicilline G est utilisée à raison de à 7000 unités/ml de milieu et de préférence 1 000 à 000 unités/ml La céphalosporine C est utilisée à raison de 10 à 4 000 gg, et de préférence 100 à 1 500 gg, par ml

de milieu.

La pénicilline, ou les substances dérivées peuvent être ajoutées 3 à 15 heures, et de préférence 5 à 10 heures, après le début de la phase de croissance logarithmique, lorsque la bactérie est cultivée à 37 C La poursuite de la culture pendant 1 à 20 heures, et de préférence 5 à

15 heures, doit permettre l'accumulation d'une grande quantité de produit bactérien dans le milieu.

Le bouillon de culture ainsi obtenu est centrifugé afin d'enlever la bactérie, et l'on ajoute du sulfate d'ammonium au filtrat Après récupération des fractions corres15 pondant à des degrés de saturation de 50 à 90 %, le précipité obtenu est dissous dans une solution tampon renfermant

un stabilisant.

La solution obtenue, renfermant SPF-100, peut être conservée sous forme congelée ou lyophilisée Cette substance peut être encore purifiée par mise en contact avec

un échangeur d'ions ou des substances de filtration sur gel.

Conviennent des échangeurs d'ions comme résine d'échange d'ions, cellulose d'échange d'ions ou Sephadex d'échange d'ions (un produit de Pharmacia AB), et des substances de 25 filtration sur gel comme Toyopearl HW-50 F ou HW-50 SF (produit de Toyo Soda Kabushiki Kaisha) ou Sephadex (produit de Pharmacia AB) On peut en outre utiliser un gel de phosphate de calcium en tant que tel, bien qu'il soit avantageux de l'utiliser sous forme d'hydroxylapatite Une solution 30 aqueuse de la substance,obtenue de la manière mentionnée plus haut, peut être passée au travers d'une colonne chargée avec ces échangeurs d'ions ou ces substances de filtration sur gel, à une vitesse convenable Ou bien cette solution aqueuse peut être introduite dans un réservoir renfer35 mant ces échangeurs d'ions ou ces substances de filtration sur gel, afin de mettre en contact la substance active avec les matériaux de traitement L'élution peut être réalisée avec une solution tampon de concentration saline et de valeur de p H convenables Eventuellement, on peut combiner 5 deux ou plusieurs échangeurs d'ions, substances de filtration sur gel ou gel de phosphate de calcium Par exemple, une solution de SPF-100 peut être éluée par mise en contact avec DEAE Sephadex, puis l'éluat peut être à soqtour élué

par mise en contact avec Toyopearl HW 50 F ou 50 SF, afin d'ob10 tenir une purification améliorée.

Le SPF-100 selon l'invention, obtenu dans l'exemple 8 comme décrit ciaprès, est une substance analogue à un peptide, qui, lyophilisée, se présente comme une poudre

jaune pâle.

Les propriétés physico-chimiques de la composition tumoricide SPF-100 sont les suivantes: 1 Analyse élémentaire:

C: 46,42 à 43,69 %

H: 5,94 à 4,85 % et

N: 11,42 à 9,50 %

2 Poids moléculaire: Approximativement 500 à 25 000, déterminé par

filtration sur gel.

3 Point de décomposition: Le produit br nit à 160 C, il noircit à 2000 C, et

se décompose.

4 Pouvoir rotatoire spécifique:

/>j 20 = + 45,0 o (c= 1,0).

D Spectre d'absorption dans l'ultra-violet: La figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1 %, qui est caractérisé par des absorptions à 257,

265, 280, 287 et 325 nm.

6 Spectre d'absorption dans l'infra-rouge: La figure 2 représente un spectre d'absorption

dans l'infra-rouge.

7 Solubilité dans les solvants: Le produit est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol, et diffi5 cilement ou non soluble dans des solvants y compris n-butanol, isobutanol, npropanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl isobutyl cétone, et

éther éthylique.

8 Acidité: La valeur du p H d'une solution aqueuse à 1 % est

de 6,5.

9 Forme:

Poudre jaune pâle.

Réactions colorées: Réaction à la ninhydrine: positive Réaction du biuret: positive Réaction de Molisch: négative Réaction de Dische: négative Réaction à l'anthrone: négative, et

Réaction au sulfate de cystéine: négative.

11 Stabilité: Il peut être stabilisé par addition de L-cystéine, dithiothreitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, et C -cyclodextrine, (NH 4)2 SO 4, sel

ordinaire ou similaire.

Les exemples non limitatifs suivants sont une

illustration d'une forme de réalisation préférée de la présente invention.

Dans ces exemples, l'unité d'activité de SPF-100 30 est déterminée par le procédé d'Udaka (Journal of Antibiotics, Vol 35, N 10, pp 1319 à 1325, octobre 1982) L'activité est dosée biologiquement avec un mutant perméable aux macromolécules d'un bacille MP-2 du colon (FERM-P 5432) Z Cf.

Agric Biol Chem, Vol 43, p 371 ( 1979)l, avec indication 35 de l'activité antibactérienne contre MP-2.

C'est-à-dire qu'un milieu (milieu M 3) comprenant 1,75 % de "Bact Antibiotic medium 3 " (un produit de Difco) et 1,3 % d'agar, est stérilisé par chauffage à 120 C pendant 15 minutes Puis des portions de 20 ml de ce milieu sont versées dans des bottes de Pétri, et on laisse refroidir pour préparer les milieux de plaque. D'autre part, on stérilise par chauffage à 120 C pendant minutes un milieu qui comprend 0,5 % de peptone, 0,5 % d'extrait de viande, 0,3 % de Na Cl et 0,8 % d'agar Puis on 10 le met dans un thermostat à 42 C Lorsque la température de ce milieu atteint 42 C, on y ajoute MP-2 préalablement cultivé à 37 C pendant 17 heures, à raison de 104 cellules/ml 2 ml de ce milieu sont recueillis à l'aide d'une pipette et déposés à la surface du milieu M 3 qui a été an15 térieurement préparé Puis le milieu additionné est immédiatement étalé de manière homogène et solidifié Une solution d'essai renfermant le SPF-100 est diluée de manière convenable Une rondelle de papier (diamètre 8 mm; un produit de Toyo Roshi Co,Ltd) est imprégnée avec la solution 20 ainsi obtenue Cette rondelle de papier est ultérieurement

placée sur la plaque préparée plus haut, et la culture est menée pendant 17 heures à 37 C afin de déterminer le diamètre de la zone d'inhibition résultant de SPF-100 Puis l'on définit comme correspondant à une unité ( 1 u) la concentra25 tion de SPF-100 pour laquelle le diamètre de la zone d'inhibition est de 10 mm.

EXEMPLE 1

On utilise 9 litres de milieu A ayant la composition suivante: Extrait de viande 1 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides Casamino 0,25 % Na Cl 0,1 % p H = 6,9 ml d'un milieu BHI sont ensemencés avec Streptococcus pyogenes ATCC 21060, et l'on soumet à une culture statique pendant 8 heures à 37 C pour obtenir un fluide de culture de germe Puis on ensemence 1 litre de milieu A avec 100 ml du fluide de culture de germe ainsi obtenu, et l'on soumet à une préculture dans des conditions identiques à celles que l'on a observées pour le fluide de culture de germe Puis on ensemence 8 litres de milieu A avec le fluide de culture ainsi obtenu, et l'on cultive en anaérobie, 10 sous agitation dans une fiole à fermentation ( 10 litres)

à raison de 300 tours/minute, pendant 11 heures 30, à 37 C.

On ajoute alors 1000 u/ml-de pénicilline G, et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé pour enlever les bac15 téries.

Le bouillon de culture filtré renferme 256 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 2

9 litres de milieu B de composition suivante soni#tilisés: Extrait de viande 1 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Na Cl 0,1 % p H = 7 On ensemence 8 litres de milieu B avec 1 litre d'un fluide 25 de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21060 a été précultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie, sous agitation, dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/

minute, pendant 11 heures à 37 C Puis on y ajoute 800 u/ml 30 de pénicilline G, et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé pour enlever les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 351 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 3

On utilise 9 litres de milieu C de composition suivante:

9 2550223

Extrait de viande 1 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides casamino 0,25 % p H 6,2 On ensemence 8 litres de milieu C avec 1 litre d'un fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21060 a été préalablement cultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie, sous agi10 tation, dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/minute pendant 14 heures à 37 C Puis on y

ajoute 1000 u/ml de pénicilline G et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé pour éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 298 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 4

Sont utilisés 9 litres de milieu D ayant la composition suivante: Extrait de viande 0,5 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides casamino 0,25 % Na Cl 0,5 % p H = 6,5 On ensemence 8 litres de ce milieu D avec 1 litre d'un fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21060 a été préalablement cultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, et on cultive en anaérobie, sous agitation, dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison 30 de 300 tours/minute pendant 15 heures et demi à 37 C Puis on y ajoute 1200 u/ml de pénicilline G, et l'on poursuit la

culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé pour en éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 285 u/ml de SPF-100. 35

EXEMPLE 5

On utilise 9 litres de milieu E ayant la composition suivante: Extrait de levure 3 % p H = 6,5 8 litres de ce milieu E sont ensemencés avec 1 litre d'un fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21060 a été préalablement cultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie, sous agitation, dans une fiole de fermentation ( 10 litres)

à raison de 300 tours/minute pendant 15 heures à 37 C.

Puis on y ajoute 1000 u/ml de pénicilline G et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé pour enlever les bacté15 ries.

Le bouillon de culture filtré renferme 182 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 6

9 litres de milieu F ayant la composition suivante sont utilisés: Maltose 0,3 % Extrait de viande 2 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % p H = 7 On ensemence 8 litres de ce milieu F avec 1 litre d'un fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21060 a été préalablement cultivé de la manière décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie avec agitation dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison 30 de 300 tours/minute pendant 10 heures et demi, à 37 C Puis on y ajoute 1000 u/ml de pénicilline G et l'on poursuit la culture-pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de

culture obtenu est centrifugé en vue d'éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 250 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 7

On utilise 9 litres de milieu G ayant la composition suivante: Extrait de viande 1 % Polypeptone 1 % Na Cl 0,5 % p H = 7 8 litres de ce milieu G sont ensemencés avec i litre de fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyoge10 nes ATCC 21060 a été préalablement cultivé de manière identique à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et on cultive en anaérobie avec agitation, dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/minute, pendant heures, à 37 C Puis on y ajoute 1000 u/ml de pénicilli15 ne G et la culture est poursuivie pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé

pour en extraire les bactéries Le bouillon de culture filtré renferme 200 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 8

Sont utilisés 9 litres de milieu H ayant la composition suivante: Extrait de viande 1 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides casamino 0, 25 % Na Cl 0,1 % p H = 7 On ensemence 8 litres de ce milieu H avec 1 litre de fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus sp ATCC 30 21597 a été préalablement cultivé de manière semblable à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie avec agitation dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/minute, pendant 11 heures à 37 C Puis on y ajoute 1000 u/ml de pénicilline G et l'on 35 poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé afin d'en éliminer les bactéries

Le bouillon de culture filtré renferme 250 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 9

9 litres de milieu I de composition suivante, sont utilisées: Extrait de viande 0,5 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides casamino 0, 25 % Na Cl 0,1 % p H = 6,5 8 litres de ce milieu I sont ensemencés avec I 1 litre d'un fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyoge15 nes ATCC 21546 a été préalablement cultivé de manière identique à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie avec agitation dans une fiole de fermentation ( 10 litres), à raison de 300 tours/minute, pendant 11 heures à 37 C Puis on y introduit 1000 u/ml de pénicil20 line G et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires On centrifuge le bouillon de culture obtenu afin

d'en éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 340 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 10

On utilise 9 litres de milieu J ayant la composition suivante: Extrait de viande 2 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % Acides casamino 0,25 % Na Cl 0,5 % p H = 6,5 8 litres de ce milieu J sont ensemencés avec 1 litre d'un

fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyoge35 nes ATCC 21547 a été préalablement cultivé de manière sem-

blable à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et l'on cultive en anaérobie avec agitation dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/minute pendant 8 heures à 37 C Puis on y ajoute 1500 u/ml de pénicilline G et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé afin

d'en éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 320 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 11

9 litres de milieu K, de composition suivante, sont utiliss:s Maltose 0,3 % Polypeptone 1 % Extrait de levure 0,25 % p H = 6,8 On ensemence 8 litres de ce milieu K avec 1 litre de fluide de culture de germe, dans lequel Streptococcus pyogenes ATCC 21548 a été préalablement cultivé de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et on cultive en 20 anaérobie avec agitation dans une fiole de fermentation ( 10 litres) à raison de 300 tours/minutes, pendant 5 heures à 37 C Puis on y ajoute 1000 u/ml de pénicilline G et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le

bouillon de culture obtenu est centrifugé pour en enlever 25 les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 270 u/ml de SPF-100.

EXEMPLE 12

litres de bouillon de culture filtré, obtenu dans l'exemple 4, renferme 143 x 104 u de SPF-100. A ce bouillon filtré on ajoute du sulfate d'ammonium et l'on récupère un précipité à partir d'une fraction correspondant à un degré de saturation de 50 à 90 % Ce précipité renferme 118 x 104 u de SPF-100 On dissout la totalité de ce précipité dans 300 ml d'une solution tampon phosphate,

et la solution ainsi obtenue est introduite dans une colon-

ne de DEAE-cellulose ( 5 x 70 cm) o SPF-100 est absorbé.

Puis on élue graduellement avec une solution 0,3 M de Na Cl, afin de fractionner la fraction active L'activité ainsi obtenue est de 102,2 x 104 u Puis cette fraction active est introduite dans une colonne de DEAESephadex A-25 ( 2,6 x cm), afin d'absorber la partie active On élue ensuite avec une solution de tampon phosphate, dans laquelle la concentration de sel Ordinaire augmente de façon linéaire, afin de recueillir la fraction active L'activité ainsi obtenue

est de 79,3 x 104 u.

En outre, cet éluat est concentré et introduit dans une colonne ( 2,6 x 100 cm) d'une substance Toyopearl HW-50 F de filtration sur gel, pour y être absorbé On élue ultérieurement avec une solution tampon phosphate à 1/100 M (KH 2 PO 4-Na 2 HPO 4) 15 afin de récupérer une fraction active qui correspond à SPF100 L'activité ainsi obtenue est de 71,1 x 104 u.

L'éluat ainsi obtenu nst lyophilisé et donne 1780 mg de SPF100 sous forme d'une poudre jaune pale.

Le SPF-100,obtenu dans l'exemple 12,est soumis à

des essais-in vitro, in vitro/in vivo, et in vivo, afin d'examiner son activité tumoricide éventuelle.

Exemple d'essai 1 (essai in vitro)

L'activité tumoricide de l'agent essayé in vitro, est déterminée en fonction de la détermination du degré de croissance 25 cellulaire.

Des lymphogranulomatoses P-388 et L-1210, obtenus par repiquage de tumeurs implantées de manière isologue de DBA/ 2 lignées de souris, sont utilisés comme cellules cancéreuses Ces lymphogranulomatoses sont mises respectivement en 30 suspension dans un milieu RPMI 1640 renfermant 5 x 10 5 M de mercapto-2 éthanol et 50 mg/litre de kanamycine, auquel on a ajouté 10 % de FCS On injecte ensuite 1 ml de ce milieu dans une plaque de Falcon 3047, à une concentration en cellules cancéreuses de 5 x 104 cellules/creux Ultérieurement, 35 on injecte une quantité déterminée de l'agent à essayer, dissous ou mis en suspension dans 1 ml de ce milieu, dans le milieu mentionné plus haut, et l'on cultive en présence de 5 % de CO 2 à 37 C 48 heures après l'injection del'agent à essayer, on effectue une coloration vitale avec de la nigrosine, et le degré de croissance cellulaire est déterminé par l'équation suivante: Nombre de cellules dans Degré de croissance chaque groupe d'essai

cellulaire (%) Nombre de cellules dans x 1.

le groupe témoin

Le tableau 1 présente les résultats.

TABLEAU 1

Degré de croissance cellulaire (%) Dose de SPF-100 Lymphogranulomatose (x 102 u) P 388 L 1210

4,7 92,0 98,6

9,3 83,9 94,6

18,6 78,2 68,0

37,2 57,2 49,2

Exemple d'essai 2 (Essai in vitro/in vivo) L'activité tumoricide de l'agent à essayer in vitro/in vivo, est déterminée par l'utilisation de souris femelles

ddy, âgées de 4 ou 5 semaines.

Des cellules cancéreuses d'ascites d'Ehrlich, qui sont uti25 lisées en tant que cellules cancéreuses, sont mises en suspension dans une solution tampon KRP, puis sont mélangées avec une quantité déterminée de l'agent à essayer, et mises à incuber pendant 60 ou 80 minutes à 37 C On inocule par voie intrapéritonéale à des souris, des portions de 0,2 ml ( 0,2 ml/souris) du milieu renfermant 4 x 106 ou 8 x 10 cellules cancéreuses, et l'on observe le nombre de souris

vivantes Les tableaux 2 et 3 présentent les résultats.

TABLEAU 2

Activité tumoricide de SPF-100 (Nombre de souris vivantes) (souris femelles ddy âgées de 5 semaines) Dose (u) Nombre de jours

0 10 15 20 25

Témoin ( 0) 8/8 8/8 7/8 1/8 0/8 0,625 x 102 8/8 8/8 8/8 6/8 3/8 x 102 8/8 8/8 8/8 6/8 2/8

Dans les tableaux 2 à 5, les données numériques représentent le nombre de souris vivantes/ le nombre de souris utilisées.

TABLEAU 3

Activité tumoricide de SPF-100 (Nombre de souris vivantes) (souris femelles ddy Agées de 4 semaines) Nombre de jours Dose (u)

0 10 15 20 25

Témoin ( 0) 8/8 8/8 2/8 0/8 0/8 20 x 102 8/8 8/8 8/8 8/8 6/8 Exemple d'essai 3 (essai in vivo) L'activité tumoricide de l'agent à essayer in vivo est déterminée par l'utilisation de souris males CRJ-CD-1 (ICR)

âgées de 7 semaines Des cellules cancéreuses d'ascites de 25 Sarcoma-180, qui sont utilisées en tant que cellules cancéreuses, sont mises en suspension dans une solution de Hank.

Puis on inocule aux souris des portions de 0,1 ml de suspension renfermant 2 x 106 cellules cancéreuses, par voie intrapéritonéale. Une quantité déterminée de l'agent à essayer est administrée par voie intrapéritonéale aux souris, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, avant l'inoculation des cellules cancéreuses, ou bien une fois par jour pendant 5 jours consécutifs,respectivement avant et après l'inocula35 tion des cellules cancéreuses, afin d'observer le nombre de

souris vivantes Les résultats sont reportés dans les tableaux 4 et 5.

TABLEAU 4

Activité tumoricide de SPF-100 (Nombre de souris vivantes) (administré avant l'inoculation) Nombre de jours Dose (u) Témoin 10 1 x 10 ' x 1 Dose (t

10 15 20

( 0) 8/8 8/8 8/8 2/8

8/8 8/8 8/8 5/8

o 02 8/8 8/8 8/8 4/8

TABLEAU 5

Administration avant et après l'inoculation 1) Nombre de jours

0/8 4/8 2/8

10 10 15 20 25

Témoin ( 0) 8/8 8/8 8/8 3/8 1/8 1 x 102 8/8 8/8 8/8 7/8 4/8 x 102 8/8 8/8 7/8 5/8 2/8

EXEMPLE 13

1000 mg du SPF-100 obtenu d'une manière semblable à celle qui est décrite dans l'exemple 8,-sous forme de poudre jaune pâle, sont dissous dans 30 ml d'une solution tampon phosphate, et l'on verse une colonne dé Sephadex A-25 ( 2,6 x cm), afin d'absorber SPF-100 Puis, afin d'obtenir une fraction active, on élue avec une solution tampon phosphate

à concentration linéairement croissante de sel ordinaire.

La totalité de la fraction active obtenue est ultérieurement concentrée à 5 ml, que l'on verse dans une colonne d'un gel de filtration de substance TOYO pearl HW-50 F ( 2 x 100 cm) et on élue avec une solution tampon phosphate pour obtenir une fraction active renfermant une substance de poids

moléculaire de l'ordre de 500 à 7 000 Cette fraction active est lyophilisée, ce qui donne 350 mg d'une poudre blanche,qui correspond à SPF-1. Les propriétés physicochimiques de SPF-1 sont les suivantes: 1 Analyse

élémentaire: C: 41,26 % H: 4,91 % et N: 6,52 %

36,64 % 4,19 % 5,40 %

2 Poids moléculaire: Approximativement 500 à 7 000, d'après la détermination par

filtration sur gel.

3 Point de décomposition:

Le produit brunit à-170 C, et il noircit à 200 C et se dé10 compose.

4 Pouvoir rotatoire spécifique:

/20 = + 63,3 à 64,3 (c = 1,04).

Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: La figure 3 représente un spectre d'absorption dans l'ultra15 violet d'une solution aqueuse à 3,3 %, qui est caractérisée

par des absorptions à 257, 265, 280 et 287 nm.

6 Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

La figure 4 représente un spectre d'absorption dans l'infrarouge.

7 Solubilité dans les solvants: La substance est soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants y compris méthanol, éthanol, n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl isobutyl cétone et éther éthylique. 25 8 Acidité:

La valeur du p H d'une solution aqueuse à 0,85 % est de 6,5.

9 Forme:

Poudre blanche.

Réactions colorées: Réaction à la ninhydrine: positive Réaction du biuret: positive Réaction de Molisch: négative Réaction de Dische: négative Réaction à l'anthrone: négative

Réaction au sulfate de cystéine: négative.

11 Stabilité: Cette substance peut être stabilisée par addition de Lcystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline,

(NH 4)2 SO 4, sel ordinaire ou similaire.

EXEMPLE 14

On obtient, d'une manière identique à celle qui est décrite dans l'exemple 13, une fraction active renfermant une

substance de poids moléculaire de l'ordre de 7 000 à 25 000.

Par lyophilisation de cette fraction active on obtient 380 10 mg d'une poudre jaune pale qui correspond à SPF-2.

Les propriétés physicochimiques de SPF-2 sont les suivantes: 1 Analyse élémentaire:

C: 53,64 % H: 5,98 % N: 11,63 %

s

48,57 % 5,02 % 10,50 %

2 Poids moléculaire: Approximativement de 7 000 à 25 000, d'après la détermination par filtration sur gel. 20 3 Point de décomposition:

Le produit brûnit à 160 C, il noircit à 200 C et se décompose.

4 Pouvoir rotatoire spécifique: Z 20 = + 30,7 (c = 1,00) 5 Spectre d'absorption dans l'ultraviolet: La figure 5 représente un spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aueuse à 0,2 %, qui est caractérisé

par des absorptions à 257, 265, 280, 287 et 325 nm.

6 Spectre d'absorption dans l'infrarouge: 30 La figure 6 représente un tel spectre.

7 Solubilité dans les solvants: Le produit est soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol, et difficilement, ou pas du tout, soluble dans des solvants y compris n-butanol, isobu35 tanol, n-propanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl

isobutyl cétone et éther éthylique.

8 Acidité:

La valeur du p H d'une solution aqueuse à 1 % est de 6,5.

9 Présentation: Poudre jaune pâle. Réactions colorées: Réaction à la ninhydrine: positive Réaction au biuret: positive Réaction de Molisch: négative 10 Réaction de Dische: négative Réaction à l'anthrone: négative

Réaction au sulfate de cystéine: négative.

11 Stabilité: Le produit peut être stabilisé par addition de L-cystéine, 15 dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, Ca et

O-cyclodextrine, (NH 4)2504, sel ordinaire ou similaires.

EXEMPLE 15

litres de bouillon de culture filtré, obtenu dans l'exemple 8, sont purifiés d'une manière identique à celle qui est décrite dans l'exemple 12, pour donner 1460 mg de SPF100 sous forme de poudre jaune pale 1000 mg de cette poudre sont traités de la manière indiquée dans l'exemple 13, afin d'obtenir 330 mg de SPF-1, et de la manière indiquée dans l'exemple 14, afin d'obtenir 370 mg de SPF-2. 25 EXEMPLE 16 On purifie, comme indiqué dans l'exemple 12, 5 litres de bouillon de culture filtré obtenu dans l'exemple 9, et l'on

obtient 1650 mg de SPF-100 en poudre jaune pale.

1000 mg de cette poudre sont traités comme dans l'exemple 30 13 pour donner 315 mg de SPF-1, et comme dans l'exemple 14 pour donner 390 mg de SPF-2.

EXEMPLE 17

On utilise 3 litres de milieu L de composition suivante:

BHI 3,7 %

p H = 7,4

21 2550223

On ensemence 100 ml d'un milieu BHI avec Streptococcus pyogenes ATCC 21060, et l'on soumet à une-culture statique pendant 8 heures à 37 C afin d'obtenir un fluide de culture de germe 300 ml de ce fluide de germe sont ensemencés dans 5 3 litres de milieu L, et l'on cultive en anaérobie, avec agitation, dans une fiole de 3 litres, à 37 C, pendant 11

heures et demie Puis on ajoute 500 gg/ml de céphalosporine C, et l'on poursuit la culture pendant 5 heures supplémentaires Le bouillon de culture obtenu est centrifugé 10 afin d'en éliminer les bactéries.

Le bouillon de culture filtré renferme 120 u/ml de SPF-100.

On purifie 3 litres de bouillon de culture filtré, de la manière décrite dans l'exemple 12, afin d'obtenir 530 mg de

poudre jaune pâle de SPF-100.

500 mg de cette poudre sont traités comme dans l'exemple 13 pour obtenir 110 mg de SPF-1, et comme dans l'exemple 14

pour obtenir 160 mg de SPF-2.

Claims (9)

Revendications

1 Substance tumoricide, appelée SPF-100, caractérisée par les propriétés physicochimiques suivantes: ( 1) Analyse élémentaire C: 46,42 à 43,69 %

H: 5,94 à 4,85 %

N: 11,42 à 9,50 %

( 2) Poids moléculaire Environ 500 à 25 000, d'après la détermination par filtration sur gel. 10 ( 3) Point de décomposition

La substance br nit à 160 C et noircit à 200 C et se décompose.

( 4) Pouvoir rotatoire spécifique 720 = + 45 (c = 1) D ( 5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet

La figure 1 représente un spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1 %, qui est caractérisé par des ab sorptions à 257, 265, 280, 287 et 325 nm. 20 ( 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge.

La figure 2 représente un spectre d'absorption dans l'infrarouge.

( 7) Solubilité dans les solvants, La substance est soluble dans l'eau, partiel25 lement soluble dans le méthanol et l'éthanol, et difficilement, ou pas soluble du tout dans des solvants, y compris n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexane, chloroforme, acétone, méthyl isobutyl cétone et éther éthylique. 30 ( 8) Acidité

La valeur du p H d'une solution aqueuse à 1 % est de 6,5.

( 9) Présentation.

Poudre jaune pâle.

( 10) Réactions colorées.

Réaction à la ninhydrine: positive Réaction du biuret: positive Réaction de Molisch: négative Réaction de Dische: négative

Réaction à l'anthrone: négative Réaction au sulfate de cystéine: négative ( 11) Stabilité.

La substance peut être stabilisée par ad10 dition de L-cystéine, dithiothreitol (DTT),

glycérol, albumine, globuline, oi et cyclodextrine, (NH 4)2 SO 4, sel ordinaire ou similaire.

2 Substance selon la revendication 1, caractérisée en 15 ce qu'elle peut être classée entre SPF-1 et SPF-2.

3 Procédé de production de SPF-100, selon la revendication 1 ou 2, à partir d'une culture de Streptocoques, caractérisé en ce que l'on provoque la libération de la substance dans le bouillon de culture par addition de pénicil20 line, ou de produits dérivés, à un moment approprié au

cours de la culture.

4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme streptocoque, Streptococcus pyogenes ATCC 21060, Streptococcus sp ATCC 21597; Streptococcus pyo25 genes ATCC 21546, Streptococcus pyogenes ATCC 21547 ou

Streptococcus pyogenes ATCC 21548.

Procédé selon une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'on utilise pour la culture des milieux naturels comme milieu d'extrait de viande, d'extrait de levure, 30 ou d'infusion coeur-cerveau (milieu BHI).

6 Procédé selon une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'on opère à un p H de 6 à 8, de préférence 6,8 à 7,2, et à une température allant de 30 à 40 C, de

préférence entre 35 et 37 C.

7 Procédé selon une des revendications 3 à 6, carac-

térisé en ce qu'on opère en culture anaérobique et statique.

8 Procédé selon une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce qu'on ajoute de la pénicilline G à raison de

100 à 7 000 u/ml de milieu, de préférence à raison de 1000

à 5000 u/ml.

9 Procédé selon une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce qu'on ajoute de la céphalosporine C à raison

de 10 à 4000 gg, et de préférence 100 à 1500 gg par ml de 10 milieu.

Procédé selon une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que la pénicilline, ou son dérivé, est ajoutée,

lors d'une culture à 37 C, 3 à 15 heures, et de préférence à 10 heures, après le début de la phase de croissance lo15 garithmique, et en ce que, après cette addition, on poursuit la culture pendant 1 à 20 heures, de préférence pendant 5 à 15 heures.