CH640245A5 - Substance antimicrobienne, procede de sa preparation et moyen antimicrobien. - Google Patents
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- CH640245A5 CH640245A5 CH518478A CH518478A CH640245A5 CH 640245 A5 CH640245 A5 CH 640245A5 CH 518478 A CH518478 A CH 518478A CH 518478 A CH518478 A CH 518478A CH 640245 A5 CH640245 A5 CH 640245A5
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Description
La présente invention concerne une substance antimicrobienne, appelée ci-après C-3603. La substance est caractérisée selon l'invention par la revendication 1.
L'invention concerne également un procédé pour préparer la substance. Le procédé est caractérisé selon l'invention par la revendication 2.
L'invention concerne en plus un moyen antimicrobien. Ce moyen est caractérisé selon l'invention par la revendication 3.
Le procédé consiste, de façon générale, à cultiver une espèce particulière du genre Streptococcus, produisant cette substance, et à isoler celle-ci du liquide de culture obtenu.
La nouvelle substance antimicrobienne C-3603 obtenue selon l'invention a une activité élevée contre diverses bactéries à Gram positif, en particulier des bactéries cariogènes de la cavité orale; elle peut donc être employée pour empêcher les maladies infectieuses orales, en particulier les caries dentaires.
Le micro-organisme producteur de la substance antimicrobienne C-3603 est par exemple la souche C-3603 du genre Streptococcus, nouvellement isolée par la titulaire. Les propriétés bactériologiques de cette souche, déterminées comme décrit dans l'ouvrage de Cowan et Steel, «Manual for the Identification of Médical Bacteria», 2e édition, Cambridge University Press (1974), sont les suivantes:
12. Test de Voges-Proskauer: positif.
45 13. Hydrolyse de l'esculine: positive.
14. Lait tournesolé: coagulation, réduction de l'indicateur.
15. Hydrolyse de la gélatine: négative.
16. Hydrolyse de l'arginine: négative.
17. Hydrolyse de l'hippurate: négative.
50 18. Solubilisation par la bile: négative.
19. Test d'oxydation ou de fermentation du glucose: fermentation.
L'examen minutieux des propriétés ci-dessus selon le «Manual for the Identification of Médical Bacteria», 2e édition, Cambridge 55 University Press (1974) de Cowan et Steel, montre de façon évidente que la souche de l'invention appartient à Streptococcus mutans. On a donc appelé cette souche Streptococcus mutans C-3603. La souche a été déposée à l'Institut de recherches sur les fermentations, Ministère des sciences et des technologies industrielles du Japon, sous la réfé-60 rence de dépôt FERM-P N° 4128 et à l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt ATCC N° 31383. Les microorganismes que l'on peut utiliser selon l'invention sont constitués par tout micro-organisme appartenant au genre Streptococcus produisant la substance antimicrobienne C-3603, en plus de la souche 65 précitée et de ses mutants spontanés ou artificiels.
Pour la culture d'un micro-organisme, par exemple de la souche C-3603, utilisable pour la réalisation de l'invention, on peut utiliser divers milieux, connus en soi, une source de carbone, contenant une
3
640 245
source d'azote, des constituants minéraux, des vitamines, des aminoacides, etc. Comme source de carbone, on peut prendre un composé carboné assimilable, tel que par exemple glucose, galactose, maltose, saccharose, lactose, mélasse, etc. Comme source d'azote, on peut utiliser un composé azoté assimilable quelconque, par exemple peptone, extrait de viande, hydrolysat acide de caséine, etc. On peut également employer des sels de l'acide phosphorique et des sels de magnésium, de sodium, de potassium, de calcium, de fer et de manganèse, etc., ainsi que des vitamines, des aminoacides, des antimousses et des agents tensio-actifs. Un milieu liquide est préférable, la culture pouvant être effectuée en conditions aérobies ou anaérobies, mais on préfère une culture statique, aérobie. Le pH initial du milieu est compris entre 5 et 9 et de préférence entre 7 et 8, la température de culture étant de 20 à 42°C et mieux entre 35 et 40°C; la durée de culture est, de façon appropriée, comprise entre 14 et 72 h.
La substance antimicrobienne C-3603 est principalement présente dans le filtrat du liquide de culture ainsi obtenu. Pour isoler cette substance du liquide de culture, dont on a éliminé les cellules, on applique les procédés classiques de séparation et de purification, généralement utilisés pour séparer les protéines et les antibiotiques, par exemple le procédé ci-après.
On sépare les cellules du liquide de culture avec un centrifugeur, pour obtenir un liquide surnageant. Du sulfate d'ammonium est ajouté à ce dernier et on laisse reposer à basse température. On recueille par centrifugation le produit précipité et on dissout le précipité recueilli dans une petite quantité de solution de tampon phosphate, puis on sépare le liquide surnageant par centrifugation. La solution surnageante ainsi obtenue est passée à travers une colonne de CM-Sephadex tamponnée avec la solution-tampon, pour y absorber la substance antimicrobienne, puis on élue cette substance avec une solution-tampon alcaline. Un dessalage de la solution obtenue a lieu par filtration sur gel, puis on soumet la solution dessalée à la lyophilisation, mettant ainsi la substance sous la forme d'une poudre blanche.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit, faite en regard des dessins annexés.
La fig. 1 représente le spectre d'absorption ultraviolette de la substance antimicrobienne C-3603.
La fig. 2 est le spectre d'absorption infrarouge de cette substance.
La fig. 3 est un graphique montrant la relation entre la concentration de la substance antimicrobienne et la longueur de la zone d'inhibition dans la méthode par recouvrement.
Voici les propriétés physiques et chimiques de la substance antibiotique C-3603 de l'invention.
1. Analyse élémentaire :
a) C = 50,01%; H = 6,19%; N = 12,84%; S = 0,96%;
O (par différence) = 30,00%
b) C = 49,80%; H = 6,30%; N = 11,41%; S = 1,18%;
O (par différence) = 31,31%.
2. Poids moléculaire: 6000-10000 (par électrophorèse sur un disque de gel de SDS-polyacrylamide).
3. Point de décomposition: 190-195e C.
4. Pouvoir rotatoire spécifique: en raison du poids moléculaire élevé, même avec une solution aqueuse d'acide acétique, on ne peut obtenir une concentration suffisante permettant la mesure.
5. Spectre d'absorption ultraviolette: le spectre, déterminé avec une solution aqueuse, est illustré par la fig. 1 et on observe des maximums d'absorption à 280 nm (E \ v°m : 40) et 289 nm (E j ; 33).
6. Spectre d'absorption infrarouge: ce spectre, déterminé avec une pastille de KBr, illustré par la fig. 2, présente des bandes d'absorption aux nombres d'ondes: 3290, 1650, 1535, 1240, 1105 et 733 cm-1.
7. Solubilité dans des solvants: faiblement soluble dans les solutions aqueuses d'acide (pH 3,0) et pratiquement insoluble dans l'eau; insoluble dans les méthanol, éthanol, acétone, éther, acétate d'éthyle, chloroforme, hexane normal et benzène.
8. Réactions colorées: la substance présente les réactions positives suivantes: ninhydrine, biuret, xanthoprotéine et Adamkiewicz.
9. Point iso-électrique: pHi = 10,0 + 0,2, par séparation électro-phorétique sur disque de gel de Polyacrylamide.
10. Couleur et forme de la substance: poudre blanche.
11. Analyse des aminoacides: un exemple du résultat de l'analyse obtenu avec l'acide p-toluènesulfonique, est illustré au tableau 2; les valeurs numériques sont les pourcentages molaires de chaque ami-noacide par rapport à la concentration molaire totale des aminoacides (y compris NH3). L'analyse a été effectuée selon la technique de T.Y. Liu et Y.H. Chang («J. Biol. Chem.», 246, 2842,1971).
Tableau 2
Aminoacides
% molaire
Aminoacides
% molaire
Asp.
4,5
lieu.
7,0
Thr.
2,2
Leu.
9,5
Ser.
4,1
Tyr.
3,9
Glu.
4,6 "
Phé.
6,1
Pro.
0
Trp.
4,5
Gly.
11,5
Lys.
7,7
Ala.
12,1
His.
0
Cys.
0
Ammoniac
9,6
Val.
7,0
Arg.
3,3
Mét.
2,4
Total
100,0
12. Analyse des acides gras: on extrait par un mélange de chloroforme et de méthanol l'hydrolysat obtenu avec un acide (HCl 6N, 120° C, 20 h), mais la Chromatographie gaz-liquide ne permet pas de mettre en évidence d'acides gras (C]0-C18).
Les propriétés physiques et chimiques précédentes permettent de considérer que la substance antimicrobienne C-3603 contient un peptide. Des déterminations par dilution sur gélose, effectuées avec plusieurs micro-organismes, permettent d'établir le spectre d'inhibition illustré par les tableaux suivants. Le tableau 3 montre le spectre d'inhibition de la substance antimicrobienne C-3603 vis-à-vis de bactéries productrices d'acide lactique, et le tableau 4 montre le spectre d'inhibition vis-à-vis de bactéries, de levures et de moisissures. Pour ces déterminations, on a utilisé la gélose GAM (Missui Seiyaku, Japon) avec les bactéries productrices d'acide lactique et la gélose nutritive, glucosée, à 1 % pour les bactéries, les levures et les moisissures.
Tableau 3
Souches types
Concentration minimale inhibitrice
(Hg/0
Streptococcus mutans HS-6
6,25
Streptococcus mutans OMZ-61
>100
Streptococcus mutans BHT
12,5
Streptococcus mutans Ingbritt
25
Streptococcus mutans JC-2
50
Streptococcus mutans PS-14
50
Streptococcus mutans' PK-1
100
Streptococcus mutans GS-5
>100
Streptococcus mutans LM-7
25
Streptococcus mutans 6715
100
Streptococcus sanguis ATCC 10557
6,25
Streptococcus sanguis ATCC 10558
6,25
Streptococcus salivarius HHT
12,5
Streptococcus salivarius ATCC 9758
12,5
Streptococcus mitis ATCC 12396
6,25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4
5
I
10
640 245
Tableau 3 (suite)
Tableau 5
Souches types
Concentration minimale inhibitrice (Hg/1)
Streptococcus bovis IFO
6,25
(Institut des fermentations, Osaka,
Japon) 12057
Streptococcus sp. CHT
6,25
Streptococcus pyogenes HD
6,25
(Institut des sciences médicales,
Université de Tokyo, Japon)
703
(Institut des sciences médicales,
Université de Tokyo, Japon)
715
6,25
Lactobacillus brevis AHU
50
(Faculté d'agriculture, Université
d'Hokkaido, Japon)
1509
Leuconostoc mesenteroides IAM
12,5
(Institut de microbiologie appliquée,
Université de Tokyo, Japon)
1151
Mode de traitement
Activité inhibitrice vis-à-vis de: Streptococcus mutans HS-6 (mm)
1. pH 2 substance inhibitrice non chauffée
3,5
2. pH 2 100°C; 10 min
3,5
3. pH 2 121°C; 10 min
3,5
4. pH 7 substance inhibitrice non chauffée
3,9
5. pH 7 100° C; 10 min
3,9
6. pH 11 substance inhibitrice non chauffée
3,7
7. pH 11 100°C; 10 min
3,7
Tableau 4
Souches types
Concentration minimale inhibitrice (Hg/ml)
Bacillus subtilis ATCC 6633
6,25
Staphylococcus aureus IAM 307
6,25
Escherichia coli
>100
Proteus vulgaris IFO 3851
>100
Pseudomonasfluorescens IAM 12022
>100
Serratia marcescens IFO 3046
>100
Candida utilis IAM 4264
>100
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080
>100
Aspergillus niger ATCC 9642
>100
Pénicillium glaucum AHU8287
>100
De plus, la substance antimicrobienne C-3603 présente les propriétés biochimiques suivantes. Pour déterminer son activité, on applique la technique par recouvrement [«An Old Boy's Association of Institute of Medicai Science, University of Tokyo, Saikin-gaku Jiss-huteiyo» (résumé pratique de microbiologie), 5e édition, 1974]. Avec la souche choisie, on ensemence un milieu semi-solide, stérilisé (pH 6,8, à 0,75% de gélose), contenant 1,0% de peptone, 0,5% d'extrait de levure, 1,0% d'acétate de sodium et 1,0% de glucose, et l'on pipette ce milieu dans des tubes à essai stérilisés; après solidification, on le recouvre de 1 ml de la solution aqueuse de substance antimicrobienne et l'on fait incuber à 37° C, pendant 16 h. La longueur de la zone d'inhibition, obtenue après incubation, mesure l'activité inhibitrice. Comme le montre la fig. 3, le logarithme de la concentration de la substance inhibitrice et la longueur de la zone d'inhibition (la souche utilisée est Streptococcus mutans HS-6) sont proportionnels, si bien que la mesure de la longueur de la zone d'inhibition permet de déterminer la concentration de la substance inhibitrice.
I. Thermostabilité:
Même si on effectue un traitement de chauffage à 100°C pendant 10 min à pH 2, 7 ou 11, l'activité inhibitrice ne diminue pas. De plus, si l'on chauffe dans un autoclave à 121C pendant 10 min à pH 2, l'activité inhibitrice ne diminue pas. Les résultats sont illustrés par le tableau 5.
Nota: On neutralise la substance inhibitrice après le chauffage à pH 2 et à pH 11. La concentration de la substance inhibitrice, lors 20 du traitement par la chaleur est de 80 (ig/ml.
2. Stabilité vis-à-vis du pH:
La substance inhibitrice est stable dans la gamme des pH de 1 à 12. La stabilité de l'activité inhibitrice en solution aqueuse à divers 25 pH est illustrée par le tableau 6.
Tableau 6
30
35
40
45
so Nota: On ajuste le pH de la substance inhibitrice à chaque valeur (concentration 140 (ig/ml), on laisse reposer à 37CC pendant 17 h et on neutralise, puis on dilue à 80 ng/ml.
3. Effet du traitement enzymatique:
55 On ajoute, dans les conditions indiquées au tableau 7, de la papaïne, de la pronase, de la pronase E, de la trypsine, de l'a-chymotrypsine, de la lipase, de la phospholipase C et de l'a-amylase: une certaine baisse de l'activité inhibitrice de la substance de l'invention est observée dans le cas du traitement par l'a-chymotrypsine et par la trypsine à des concentrations très élevées en enzyme (enzyme 5000 |ig/ml, substrat 150 ng/ml).
(Tableau en tête de la page suivante)
65 Comme publications relatives à des substances semblables à la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention, on peut citer: J.R. Tagg et coll. («J. Exp. Med.», 138, 1168, 1973); D. Paul et H.D. Slade («Infect. Immun.», 12, 1375, 1975), T. Yamamoto et
PH
Activité inhibitrice vis-à-vis de: Streptococcus mutans HS-6 (mm)
1
4,1
2
4,1
3
4,0
4
4,0
5
3,9
6
4,0
7
3,9
8
3,9
9
4,0
10
3,8
11
3,8
12
4,0
5
Tableau 7
640 245
Nota: L'activité résiduelle est exprimée en pour-cent du rapport à l'activité de la substance inhibitrice sans addition d'enzyme, à partir des concentrations obtenues au moyen du graphique de la fig. 3.
Conditions du traitement enzymatique
Activité inhibitrice vis-à-vis de Streptococcus mutans HS-6
Enzyme pH
Température (°C)
Concentration de l'enzyme (Hg/ml)
Concentration
Substance inhibitrice sans addition d'enzyme
Substance inhibitrice avec addition d'enzyme
Temps (min)
de la substance inhibitrice (Hg/ml)
Longueur de la zone d'inhibition (mm)
Activité résiduelle (%)
Longueur de la zone d'inhibition (mm)
Activité résiduelle (%)
Papaïne W-40
7,0
37
70
10000
160
5,0
100
5,0
100
(Amano Pharmaceut. Ltd)
7,0
37
70
500
100
4,4
100
4,4
100
8,1
25
1380
150
145
4,8
100
4,8
100
Pronase (Calbiochem)
8,1
25
1380
50
145
4,8
100
4,8
100
8,1
25
1380
10
145
4,8
100
4,8
100
8,0
45
70
500
100
4,4
100
4,4
100
Pronase E
8,1
25
1380
150
145
4,8
100
4,8
100
(Kaken Chemical Co., Ltd)
8,1
25
1380
50
145
4,8
100
4,8
100
8,1
25
1380
10
145
4,8
100
4,8
100
7,0
37
60
5000
150
4,9
100
4,3
66
Trypsine 2 = I
7,0
37
60
100
150
4,9
100
4,9
100
(Sigma Chemical Co.)
7,0
37
60
50
150
4,9
100
4,9
100
7,0
37
60
10
150
4,9
100
4,9
100
7,8
28
400
200
150
4,9
100
2,4
17
a-chymotrypsine
7,8
28
400
150
150
4,9
100
2,9
24
S = II
7,8
28
400
100
150
4,9
100
3,1
28
(Sigma Chemical Co.)
.7,8
28
400
50
150
4,9
100
3,9
49
7,8
28
400
10
150
4,9
100
3,9
49
Lipase M-AP-10
7,0
37
60
5000
150
4,9
100
4,9
100
(Amano Pharmac. Co. Ltd)
7,0
37
70
500
100
4,4
100
4,4
100
Phospholipase C
7,0
37
70
500
100
4,4
100
4,4
100
(Sigma Chemical Co.)
7,0
37
60
375
150
4,9
100
4,9
100
a-Amylase (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd)
7,0 7,0 7,0 7,0
37 25 25 25
70 1380 1380 1380
500 150 50 10
100 145 145 145
4,4 4,8 4,8 4,8
100 100 100 100
4,4 4,8 4,8 4,8
100 100 100 100
coll. («Archs oral Biol.», 20, 389, 1975) et Katsuyuki Futakami (brevet japonais publié N° 44296/77). Cependant, la substance décrite par J.R. Tagg et coll. est totalement inactivée en milieu ss alcalin de pH supérieur à 11, contrairement à la substance antimicrobienne C-3603 qui ne présente pas de diminution de l'activité inhibitrice. De plus, cette substance est totalement inactivée lorsqu'on lui ajoute de la pronase ou de la trypsine, tandis que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention ne présente pas de baisse de 60 l'activité inhibitrice sous l'effet de la pronase et jouit d'une remarquable tolérance à la trypsine, comme le montre le tableau 7.
De plus, la substance décrite par J.R. Tagg et coll. n'a aucune activité inhibitrice vis-à-vis de Staphylococcus aureus, contrairement à la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention. 65
La substance décrite par D. Paul et coll. a un poids moléculaire supérieur à 20000, tandis que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention a un poids moléculaire de 6000 à 10000. Egalement,
la substance décrite par D. Paul et coll. est totalement inactivée à pH 11, alors que, à ce pH, la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention reste active.
Egalement, lorsqu'on ajoute de la pronase, de la phospholi-pase C et de la trypsine, la substance décrite par D. Paul et coll. est totalement inactivée, tandis que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention ne l'est pas avec les deux premières de ces enzymes et présente une remarquable tolérance à la trypsine, comme le montre le tableau 7.
De plus, le spectre d'inhibition de la substance décrite par D. Paul et coll. montre l'absence de toute activité vis-à-vis de Streptococcus mutans BHT et JC-2 et de Basilius subtilis, contrairement à la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention.
La substance décrite par T. Yamamoto et coll. est totalement inactivée par l'addition de pronase E et elle n'a pas d'activité d'inhi
640 245
6
bition de Streptococcus mitis ATCC 12396 et Streptococcus CHT, tandis que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention n'est pas inactivêe par la pronase E, comme le montre le tableau 7, et inhibe ces deux souches.
La demande de brevet japonais publiée N° 44296/77 indique que, selon les propriétés physiques et chimiques observées, la substance inhibitrice est neutre, contrairement à la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention qui est basique, de point iso-électrique de 10,0+0,2. En outre, la substance de cette publication est inactivêe pratiquement totalement par addition de lipase, ce qui suggère qu'elle contient un lipide comme site actif de l'inhibition, alors que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention ne présente pas de diminution de l'activité inhibitrice sous l'effet de la lipase, selon le tableau 7, et ne contient pas d'acides gras (C10-C18), comme le montre l'analyse. La comparaison entre l'activité inhibitrice de la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention et celle qu'indique la publication japonaise montre qu'il existe certaines différences vis-à-vis des souches d'essai, Streptococcus mutans GS-5, 6715, PK-1, PS-14etOMZ-61.
La comparaison ci-dessus de l'art antérieur montre que la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention diffère bien des substances analogues indiquées. La substance C-3603 de l'invention constitue donc une nouvelle substance antimicrobienne.
Pour étudier in vitro l'effet de prévention des caries dentaires que permet la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention, on a ef-5 fectué des essais de culture pour rechercher la production d'un Polysaccharide adhésif. Pour cela, on ensemence avec des bactéries cario-gènes ou une plaque dentaire fraîche, recueillie dans la cavité orale d'un sujet humain, 10 ml d'un milieu liquide (pH 6,8) renfermant 2,0% de peptone, 0,2% de NaCl, 0,3% de K2HP04, 0,2% de io KH2P04, 0,1% de K2C03, 0,012% de MgS04, 7H20, 0,001 5% de MnS04,4-6 H20,10% de saccharose et diverses quantités de la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention; on fait tremper dans ce milieu un fil métallique inoxydable, de diamètre de 0,8 mm, fixé à un bouchon de coton. Après culture en anaérobiose à 37° C 15 pendant 1 d, on transfère ce fil métallique inoxydable dans un milieu frais, ensemencé par des bactéries cariogènes ou par une plaque dentaire, et on répète la culture. On répète ces opérations pendant 10 d, puis on détermine la quantité de Polysaccharide insoluble adhérant au fil. En même temps, on examine les conditions de culture des 20 micro-organismes par observation du trouble du liquide de culture à l'œil nu et mesure du pH. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 8.
Tableau 8
Souche de Streptococcus ou plaque dentaire
Concentration de la substance antimicrobienne (Hg/ml)
Conditions de culture
Poids de Polysaccharide
Observation à l'œil nu pH du liquide après culture adhérant au fil inoxydable
(mg)
0
+
4,5
6,68
Streptococcus salivarius HHT
2,5 25
+
4,6 6,6
4,90 0,04
50
6,6
0,03
0
•
4,2
6,44
Plaque dentaire
2,5 25
+-+
4.2
4.3
7,15 0,94
50
+
4,3
0,06
Nota: Observation à l'œil nu; + culture abondante;
— pas de culture apparente.
On exprime la quantité de Polysaccharide après conversion en glucose selon la méthode phénol/ acide sulfurique.
Dans le cas de Streptococcus salivarius HHT, la croissance est remarquablement inhibée pour une concentration de la substance inhibitrice supérieure à 25 jig/ml et la quantité de Polysaccharide adhérant au fil inoxydable est remarquablement réduite par rapport au témoin (ayant une concentration en substance inhibitrice de 0 ng/ ml). Dans le cas de la plaque dentaire d'un sujet, on n'observe pas d'inhibition de la culture, même à une concentration de la substance inhibitrice supérieure à 25 Hg/ml, mais la quantité de Polysaccharide adhésif est nettement réduite par rapport au témoin. Donc, la substance antimicrobienne C-3603 évite la production d'un Polysaccharide que l'on estime responsable des caries dentaires et il semble donc que l'on puisse utiliser cette substance de façon efficace pour la prévention des caries dentaires. Pour la prévention et le traitement médical des caries dentaires, on peut utiliser la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention comme composant actif d'une pâte dentifrice, d'un médicament appliqué à la cavité orale, d'un gargarisme, d'une pommade, d'une gomme à mâcher, d'une pilule à sucer ou, de façon générale, d'un aliment, etc. De plus, la substance antimicrobienne C-3603 de l'invention présente un spectre d'inhibition spécifique permettant de lui prévoir d'autres utilisations diverses.
Par exemple, cette substance présente une activité inhibitrice puis-so sante vis-à-vis de Streptococcus pyogenes; on peut donc l'utiliser pour la prévention et le traitement médical du rhumatisme articulaire aigu et de la scarlatine qui sont des maladies infectieuses, provoquées par Streptococcus pyogenes.
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants.
55
Exemple 1:
On ensemence, avec Streptococcus mutans C-3603 FERM-P N° 4128 et ATCC N° 31383, 100 ml d'un milieu liquide (pH 7,7) contenant 1,0% de glucose, 2,0% de peptone, 0,5% de NaCl, 0,3% 60 de K2HP04,0,2% de KH2P04,0,01% de MgS04, 7 H20 et 0,002% de MnS04, 4-6 H2Ó et on effectue une culture statique en aérobiose à 37° C pendant 1 d. On ensemence avec ce milieu de culture 101 du même milieu et on effectue une culture statique à 37° C pendant 20 h en aérobiose. On centrifuge à 20000 g le liquide 65 de culture obtenu pour séparer un liquide surnageant. On ajoute à ce liquide surnageant 3,8 kg de sulfate d'ammonium et on laisse reposer à environ 5°C pendant une nuit. On recueille le précipité par centrifugation à 20 000 g.
7
640 245
Le précipité obtenu est dissous dans une petite quantité de solution de tampon phosphate (10~2 M; pH 7,0), puis la solution obtenue est centrifugée à 12000 g pendant 10 min pour séparer le précipité. On fait passer la solution surnageante obtenue à travers une colonne (5,0 x 30 cm) garnie de CM-Sephadex C-25, préalablement tamponnée avec la même solution-tampon, pour adsorber la substance inhibitrice; on lave à fond la colonne avec la même solution-tampon.
On lave ensuite avec une solution de tampon phosphate (5 x 10~2 M; pH 7,0) dont on ajusté le pH à 9,5 par addition d'hydroxyde de sodium, puis on fait passer une solution-tampon à pH 10,8 que l'on a ajustée, de façon semblable, par addition d'hydroxyde de sodium pour éluer la substance inhibitrice. On fait passer la solution éluêe à travers une colonne de Sephadex G-25 (5,5 x 80 cm) pour la désioniser, puis on lyophilise la solution de la substance inhibitrice obtenue, et l'on recueille environ 80 mg de la substance inhibitrice purifiée, blanche. La substance antimicrobienne, ainsi purifiée, présente une bande unique par électrophorèse sur disque de gel de Polyacrylamide à 15% à pH 2,3.
Exemple 2:
A 101 du liquide surnageant, obtenu comme dans l'exemple 1, on ajoute 40 1 d'eau désionisée. On fait passer le liquide surnageant, dilué, ainsi obtenu, à travers une colonne (5,0 x 30 cm) de CM-5 Sephadex que l'on a préalablement tamponnée avec une solution de tampon phosphate (10-2 M; pH 7,0), pour adsorber la substance inhibitrice, et on fait passer la même solution-tampon à travers la colonne pour la laver à fond.
10 On lave ensuite par passage d'une solution de tampon phosphate (5 x 10~2 M; pH 7,0), dont le pH a été ajusté à 8,0 par addition d'hydroxyde de sodium, puis on fait passer une solution de tampon phosphate (10-2 M; pH 7,0) contenant 3% de NaCl, pour éluer la substance inhibitrice. On fait passer l'éluat à travers une colonne de ls Sephadex G-25 (5,5 x 80 cm) de façon à le désioniser et on lyophilise la solution de substance inhibitrice ainsi obtenue, ce qui donne environ 140 mg de la substance antimicrobienne, purifiée et blanche.
Cette dernière forme une bande unique en électrophorèse sur disque de gel de Polyacrylamide à 15% à pH 2,3.
R
1 feuille dessins
Claims (18)
- 640 2452REVENDICATIONS1. Substance antimicrobienne, caractérisée en ce qu'elle présente les propriétés physiques et chimiques suivantes:1) poids moléculaire: 6000-10000, déterminé par électrophorèse sur disque de gel de SDS-polyacrylamide;2) point de décomposition: 190-195°C;3) spectre d'absorption ultraviolette: déterminé en solution aqueuse, il est illustré par la fig. 1 et présente des maximums d'absorption à 280 nm (E }°^ : 40) et 289 nm (E \ v°m : 33);4) spectre d'absorption infrarouge: mesuré avec une pastille de KBr, il est illustré par la fig. 2 et présente des bandes d'absorption aux nombres d'ondes 3290,1650, 1535, 1240,1105 et 733 cm-1;5) solubilité dans les solvants: faible dans les solutions aqueuses acides (pH 3,0) et pratiquement nulle dans l'eau; nulle dans les méthanol, éthanol, acétone, éther, acétate d'éthyle, chloroforme, hexane normal et benzène;6) réactions colorées: positives dans les réactions colorées de ninhydrine, de biuret, de xanthoprotéine et d'Adamkiewicz;7) point iso-électrique: pHi = 10,0+0,2 (déterminé par séparation iso-électrique sur disque de gel de Polyacrylamide);8) couleur et forme: poudre blanche;9} analyse des aminoacides: après hydrolyse par l'acide p-toluènesulfonique, présence des aminoacides suivants: acide asparti-que, thréonine, serine, acide glutamique, glycine, alanine, valine, méthionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine, trypto-phane, lysine, ammoniac et arginine, sans que l'on observe de proline, de cystéine ni d'histidine.
- 2. Procédé pour préparer la substance antimicrobienne suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une espèce du genre Streptococcus produisant cette substance dans un milieu, et à isoler la substance antimicrobienne dans le liquide de culture obtenu.
- 3. Moyen antimicrobien, en particulier contre la carie dentaire et/ou le rhumatisme et/ou la scarlatine et /ou une autre affection due au streptocoque pyogène, caractérisé en ce qu'il contient comme agent actif la substance antimicrobienne selon la revendication 1.
- 4. Moyen antimicrobien selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est en forme de dentifrice et/ou de gomme à mâcher et/ou de pilule à sucer.
- I. Propriétés morphologiquesC'est un Coccus à Gram positif mesurant 0,8 à 1,2 |im, qui forme des chaînes de deux à dix et quelques éléments. On n'observe pas de formation de spores, de mobilité, d'acidorésistance ni de polymor-5 phie.
- II. Propriétés culturales établies sur divers milieux
- I. Gélose Mitis salivarius, 37°C; culture anaérobie pendant 2 d; croissance modérée, colonies rondes, entières et convexes.10 2. Gélose trypticase-soja; 37°C, culture anaérobie pendant 2 d; croissance abondante, colonies rondes, entières, plates, sans production de pigment.
- 3. Gélose à l'infusion de cervelle et de cœur; 37°C, culture anaérobie pendant 2 d; croissance abondante, colonies rondes, entières,15 plates, sans production de pigment.
- 4. Gélose GAM (Nissui Seiyaku, Japon) à 37°C; culture anaérobie pendant 2 d; croissance abondante, colonies rondes, entières, convexes, sans production de pigment.
- 5. Bouillon trypticase-soja à 5% de saccharose à 37°C; culture 20 anaérobie pendant 2 d; on effectue la culture avec une inclinaison de45°, et une grande quantité d'une substance insoluble, que l'on suppose être un Polysaccharide, adhère au fond et à la partie inférieure, sous la surface inclinée du tube à essai.25 III. Propriétés physiologiques1. Hémolyse: néant.
- 2. Catalase: négative.
- 3. Oxydase: négative.
- 4. Culture à 45°C: négative.30 5. Thermorésistance (60°C pendant 30 min): négative.
- 6. Culture à pH 9,6: négative.
- 7. Nécessité du C02 : positive.
- 8. Culture sur un milieu à 4% de NaCl: négative.
- 9. Culture sur un milieu à 40% de bile: positive.35 10. Culture sur un milieu à 1/4000 de telluri te: négative.
- II. Formation d'acides à partir des hydrates de carbone :D-glucose . L-arabinose. Glycérol . . Lactose . .+Tableau 1 Maltose . . Mannitol. . Rafiïnose. . Salicine . .+ + + +D-Sorbitol Saccharose Tréhalose.+ + +
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