DE2251916A1

DE2251916A1 - Antibiotikum und verfahren zur herstellung desselben

Info

Publication number: DE2251916A1
Application number: DE19722251916
Authority: DE
Inventors: Shiro Chihara; Yasuo Koyama; Nobuhiro Nakajima; Shiro Nakatsugawa
Original assignee: Kayaku Antibiotic Research Co Ltd
Current assignee: Kayaku Antibiotic Research Co Ltd
Priority date: 1972-10-23
Filing date: 1972-10-23
Publication date: 1974-04-25

Description

Antibiotikum und Verfahren zur Herstellung desselben Die Erfindung betrifft ein Antibiotikum sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum wird Gatavalin genannt.
Es ist bereits bekannt, daß die Kulturbrühe, welche durch Fermentation mit Bazillus polymyxa subsp. colistinus EOYAMA ein Colistin enthält, welches ausgezeichnete antibiotische Eigenschaften gegenüber Gram-negativen Bakterien aufweist.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antibiotikum mit ausgezeichneten Eigenschaften sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Bazillus polymyxa subsp. colistinus KOYAMA ATTC No. 21830 fermentiert und Gatavalin isoliert. Es wurde gefunden, daß bei Fermentation des Bacillus polymyxa subsp. colistinus KOYAMA ein neues Antibiotikum entsteht, welches ein vom Colistin verschiedenes antimikrobielles Spektrum aufweist.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm von Bazillus polymyxa subsp. colistinus EOYAMA hat die folgenden Eigenschaften: Stäbchen: 0,9 -- 1,1 x 4,5 -- 4,6 , Notil, Gram-positiv , Sporen: 1,0 -- 1,2 x 1,2 -- 1,5 , ellipsoid, zentral, Gelatine-Stich: Verflüssigung Glukose-Agar-Schräge: gutes Wachstum, erhaben, glitzernd oder schimmernd, gummiartig, Gasbildung, durchscheinend, lappiger Rand oder Umriß.
Glokuse-Nitrat-Agar: gutes Wachstum, gummiartig.
3rUhe: gleichförmige Trübung, gummiartiges Sediment.
NaCl-BrWhe: kein Wachstum in 5 ffi NaCl.
Milch: Koagulat unter Gasbildung, Kasein wird hydrolysiert.
Kartoffel: üppiges Wachstum, schleimig oder gelartig, gelblich-braun, die Kartoffel wird unter Gasbildung zersetzt.
Indol: keine Erzeugung.
Verwertung von Kohlenstoffquellen: Arabinose + Celobiose - Fruatose + Galactose + Inulin - Lactose + Maltose + Mannose + Rhamnose - Sorbose - Sucrose + Salicin -Xylose + Adonitol - Dulcitol - Erythritol -Inocitol - Mannitol + Sorbitol - Citrat -Acetat - Succinat - Tartrat -.
Stärke: Hydrolyse Erzeugung von Acetylmethylcarbinol.
Umwandlung von Nitraten in Nitrite.
Biotin ist für Wachstum erforderlich.
Antibiotikabildung: Colistin, Gatavalin, Jolipeptin.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kulturbrühe wird nach herkömmlichen Methoden für die Herstellung von Colistin bereitet. Verschiedene Materialien können als Nährstoffquellen für das Kulturmedium verwendet werden. Bevorzug werden als Stickstoffquellen Pepton, Weizenkleine, Weizenmehl, Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt, Proteinhydrolysate, anorganische Nitrate, Ammoniumsalze oder dergl.
Ferner sollten-Eohlenstoffquellen zugegen sein, wie Dextrose, Lactose, Maltose, Stärke, Glycerin, Melasse oder dergl. Diese Kohlenstoffquellén sollten-in vergleichsweise größen Mengen eingesetzt werden. Versc-hiedene anorganische Salze, Hilfsstoffe oder dergleichen sollten- hinzugeset'zt werden, falls erwunscht.- Zur Erzeugung eines Kulturmediums mit den oben erwähnten Nähr'substanzen in großen Maßstab wendet man bevorzugt die Submerskultur an. Die temperatur wird mit etwa 28 °C bis 35 °C gewählt. Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums sollte bei etwa pH 7 liegen. Da das Gatavalin in der Hauptsache in Zellen hergestellt wird, werden nur die Zellen von der Kulturbrühe abgetrennt und weiter verarbeitet. Bei der Aushebung der vorliegenden Erfindung wird die Kulturbrühe oder eine wässrige Suspension der Zellen angesäuert, vorzugsweise auf pH 2 bis 5 unter Zugabe einer Säure, wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder dergl., worauf falls, erforderllich, erhitzt wird. Durch diese Behandlung wird das Gatavalin in den Zellen freigesetzt und gelangt außerhalb der Zellen. Das Gatavalin wird nur freigesetzt, wenn die Zellsuspension oder die Eulturbrühe angesäuert und gerührt wird. Dieser Vorgang kann jedoch durch Erhitzen beschleunigt werden, wie z. B. durch Erhitzen auf eine Temperatur von 50 bis 80 °C während 5 bis 30 min.
Die so erhaltene Lösung, welche das Gatavalin enthält, wird mit einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser nicht mischbar ist, und Gatavalin aufzulösen vermag, extrahiert, wie z. B. mit Butylalkohol, Isoamylalkohol, Chloroform o.dgl.
Das organische Lösungsmittel wird vorzugsweise in Mengen von 1/3 des Volumens der Muttetrlüssigkeit angewandt. Bei dieser Behandlung wird das gesamte Gatavalin in das organische Lösungsmittel überführt und das Colistin verbleibt in der Mutterlauge. Auf diese Weise wird das Gatavalin sauber abgetrennt.
Zur Gewinnung des Gatavalins aus dem Extrakt wird der Extrakt unter vermindertem Druck auf etwa 1/2 des Volumens konzentriert, worauf das Gatavalin durch Zugabe eines das Gatavalin nicht auflösenden Lösunganittels ausgefällt, wie z. B. mit Äther, Äthylacetat, Butylacetat oder Aceton.
Obwohl die Menge des Gatavalin nicht-aurldsenden Lösungsmittels von der Konzentration des Gatavalins im Extrakt und vom verwendeten Lösungsmittel abhängt, kann man in der Regel doch eine Menge entsprechend dem 1-bis 3-fachen der Extraktmenge einsetzen. Ein derart erhaltenes Gatavalin enthält noch einige Verunreinigungen. Es kann jedoch leicht gereinigt werden, z. B. durch Auflösung des Roh-Gatavalins in einer Mischung von Butylalkohol und Methylalkohol und Wasser (1:2:1), Behandlung mit Aktivkohle und Einengen der Lösung, worauf durch Zugabe des das Gatavalin nicht-auflösenden Lösungsmittels zum Rückstand reines Gatavalin abgetrennt wird und ausfällt.
Eirenschaften des Gatavalins 1. Neutrale Substanz 2. Molekulargewicht: etwa 2 000 3. Stabilität: Stabil im sauren Bereich und instabil im alkalischen Bereich.
Stabil bei Erhitzung auf 100 0C während 30 min bei pH 3.
Stabil während mehr als einer Woche in kalter wässriger Lösung.
4. Ultraviolett-Absorption: Endabsorption.
5. Löslichkeiten: Löslich in Dimethylsulfoxid, Essigsäure, Äthylenglycol, Methanol und Äthanol, leicht löslich in Wasser und unlöslich in Äthyläther, Butylacetat, Benzol und Aceton.
6. Farbreaktionen: Ninhydrin-Reaktion (-), Ninhydrin-Reaktion nach saurer Hydrolyse (+), Biuret-Reaktion (+), Dert.-Butyl-hypochlorit (+), Fehling-Reaktion (-), Molisch-Reaktion (-)., 7. Bioautographie auf einer Agar-Platte, geimpft mit St. aurens: n-3utanol: Essigsäure : Wasser = 3:1:1 Rf = 0,9-0,95 8. Aminosäuren-Zusammensetzung: Glutaminsäure 1 (Mol) Asparginsäure 1 Alanin 2 Valin 3 Threonin 3 9. Schmelzpunkt 245~ 248 °C 10. Elemintar-Analyse: C 51,19 %, H 8,19 %, N 14,16 % 11. Infrarot-Absorptions-Spektrum: 3300, 2900, 1740, 1620, 1520, 1220, 1150 cm1 (Fig. 1) 12. Spezifische Drehung: [α]D23 + 22,4 ° (C: 6,5 % in 50 % Methanol) Antimikrobielles Spektrum Minimale Hemm-Kon-Organismus zentration (mcg/ml) Bazillus subtilis 1,25 Bazillus cereus 2,5 Staphylococcus aureus 0,625 Staphylococcus aureus (Mac-R*) 0,625 Sarcina lutea 0,625 Brevibacterium ammoniagenes 1,25 Nicrococcus lysodeikticus 0,312 Mycobacterium 607 0,625 Escherichia coli 100 Pseudomonas aeruginosa 100 Proteus mirabilis 100 Proteins rettgeri 100 Aerobacter aerogenes 100 Achrolobacter liquidum 100 Flavobacterium sulfureum 100 Serratia marcescens 100 Xanthomonas oryzae 100 Candida krusei 10 Candida pseudotropicalis 0,625 Saccharomyces cerevisiae 5 Aspergillus oryzae 5 Aspergillus niger 1,25 Penicillium expansum 1,25 Absidia butterri 2,5 Fusarium sp. 1,25 * (Mac-R) : Gegen Macrolid-Antibiotika resistent.
Toxizität: (intraperitoneale Verabreichung) Maus: LD50 : 22,5 mg/K Ratte:LD50 : >50 mg/k Im folgenden sei die Herstellung und Reinigung des-Gatavalins an Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Herstellung des Gatavalins Beispiel 1 2 1 einer 24-Stunden-Kultur von Bazillus polymyxa subsp.
colistinus KOYAMA, gezüchtet bei 30 °C in einer Reziprok-Schüttelvorrichtung,wurde dazu verwendet,einen 500-1-Fermenter mit 200 l'Medium zu impfen. Die Inkubation wurde während 24 h bei 30 °C unter angemessener Belüftung fortgesetzt. Das Medium enthielt 10 g Stärke, 5 g (NH4)2SO4, 0,5 g MgS04 7H20, 0,5 g EH2P04, 3 g CaCO3, 0,5 g NaCl, 150 mcg MnS04 und 10 mcg Biotin pro Liter, PH 7,0.
Isolierung des Gatavalins Beispiel 2 200 1 der so erhaltenen KulturbrUhe wurden zentrifugiert und in Zellen und überstehende FlEssigkeit getrennt. Nur die Zellen wurden isoliert. Die Zellen wurden in 20 l Wasser suspendiert und die Suspension wurde auf pH 3 mit Salzsäure eingestellt. Die Suspension wurde während 10 bis 15 min auf 70 °C erhitzt und durch Zentrifugierung in Zellen und überstehende Fldssigkeit geschieden. Die Flüssigkeit enthielt das Gatavalin. Zu der Uberstehenden Flüssigkeit wurden 10 1 n-Butanol unter Rühren gegeben, um das Gatavalin zu extrahieren. Die n-Butanol-Schicht wurde auf 5 1 unter vermindertem Druck reduziert und 10.1 Äther wurden zu dem Rückstand gegeben, wobei ein Niederschlag entstand. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet, wobei rohes Gatavalin ( Ausbeute 80 t) erhalten wurde. 20 g des rohen Gatavalins wurden in 1 1 einer Mischung von Butanol, Methanol und Wasser (1:2:1) aufgelöst und die unlöslichen Stoffe wurden entfernt. Das Filtrat wurde durch eine Aluminiumoxydsäule, welche mit 40 g aktiviertem Aluminiumoxyd gepackt war, geschickt. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 100 ml bei 50 bis 60 °C eingeengt und 300 ml Äther wurden zum RUckstand gegeben. Danach fiel ein weißes Pulver aus. Man erhielt auf diese Weise 3 g reines Gatavalin.
Beispiel 3 300 1 KulturbrUhe wurden auf pH 3,0 mit 4N-Salzsäure angesäuert und während 10 min auf 80 °C erhitzt und danach filtriert. Nach dem Abkühlen auf 20 0 wurde das Filtrat ferner auf pH 1,0 mit 4N-Salzsäure angesäuert, worauf 100 1 n-Butanol unter RUhren während 1 h hinzugegeben wurden, um das Gatavalin zu extrahieren. Die Butanol-Schicht wurde auf 10 1 unter vermindertem Druck eingeengt und das Gatavalin wurde mit dem 3-fachen Volumen Äthyläther ausgefällt. Das ausgefällte und getrocknete Pulver (rohes Gatavalin) 100 g) wurde in 5 1 50% Methanol aufgelöst und der pH-Wert wurde auf 4,0 mit N-Salzsäure eingestellt. Danach wurde die Löeung durch eine Aluminiumoxydsäule (30 x 500 mm) gepackt mit 200 g aktiviertem Aluminiumoxyd geschickt. Der Durchlauf wurde unter vermindertem Druck auf 3 1 eingeengt und das Gatavalin wurde mit 3 1 n-Butanol extrahiert. Die Butanol-Schicht, welche Gatavalin enthielt, wurde konzentriert und unter vermindertem Druck auf die Hälfte des Volumens eingeengt. Das Gatavalin wurde durch Zugabe von Äthyläther ausgefällt, wobei 20 g eines weißen Pulvers von Qatavalin' erhalten wurden. Zur weiteren Reinigung wurde das weiße Pulver in 50 % Methanol aufgelöst und durch eine Sephadex-LH-20-Säule geschickt. Die durchlaufende Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und mit Äthyläther ausgefällt. Man erhielt 15,5 g reines Gatavalin.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E

Gatavalin mit den folgenden charakteristischen Bigenschaften: Molekulargewicht : etwa 2 000 Schmelzpunkt: 245 °C ~ 248 °C Elementar-Analyse: C 51,19 %, H 8,19 %, N 14,16 % Aminosäuren-Zusammensetzung: Glutaminsäure (1 Mol), Asparginskure (1 Mol), Alanin (2 Mol), Valin (3 Mol), Threomin (3 Mol) Infrarot-Absorptions-Spektrum: 3300, 2900, 1740, 1620 1520, 1220, 1150 cm-1 Spezifische Drehung: [α]@@ + 22,4 °(C: 6,5 % in 50 % D ol) Bioautographie: Rf = 09 ~ 0,95 (n-butanol: Essigsäure : Wasser 1 3 : 1 : 1) Ultraviolett-Spektrum: Endabsorption Parbreaktionen: Positiv auf Biur.t und Tert.-Butylhypochlorit, negativ auf Ninhydrin, Fehling und Molisch.
2. Verfahren zur Herstellung des Gatavalin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bazillus polymyka subsp.

colistinus KOYAMA, ATTC No. 21830 kultiviert und das Gatavalin aus der KuLturbrühe isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gatavalin aus der Kulturbrühe isoliert, inden man dieselbe auf pH 2 bis 5 ansäuert, danach erhitzt und das Gatavalin mit einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser nicht mischbar ist, und das Gatavalin aufzulösen vermag, extrahiert, worauf das Gatavalin durch Zugabe eines Gatavalin nicht-auflösenden Lösungsmittels ausgefällt wird.
4. VeSbhren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gatavalin isoliert wird, indem man die Zellen von der EulturbrUhe abtrennt und in Wasser suspendiert, danach die Suspension auf pH 2 bis 5 einstellt und erhitzt, worauf das Gatavalin mit einem organischen Lösungsmittel, welches mit Wasser nicht mischbar ist und das Gatavalin aufzulösen vermagt, extrahiert und schließlich durch Zugabe eines das Gatavalin nicht-lösenden Lösungsmittels ausfällt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Butylalkohol, Isoamylalkohol oder Chloroform verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Gatavalin nicht-auflösendes Lösungsmittel Äther, Äthylacetat, Butylacetat und Aceton eingesetzt wird.

L e e r s e i t e