DE2418349A1

DE2418349A1 - Fortimicin b, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel

Info

Publication number: DE2418349A1
Application number: DE2418349A
Authority: DE
Inventors: Isao Kawamoto; Tokio Machida; Takashi Nara; Ryo Okachi; Seigo Takasawa; Mitsuyoshi Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-04-17
Filing date: 1974-04-16
Publication date: 1974-11-07
Also published as: CH590925A5; NO741300L; DK137864C; ATA310274A; AR201860A1; DE2418349C3; NO139864C; NL157655B; AT329180B; GB1462805A; BE813772A; NO139864B; CA1025384A; IN139126B; SE420214B; DK137864B; NL7405105A; FR2226159A1; JPS49126892A; ZA742107B

Description

" Fortimicin B, Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel ^t!

Priorität: 17. April 1.973, Japan, Nr. 42 696/1973

Die Erfindung betrifft das als Fortimicin B bezeichnete Antibiotikum, ein Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel, die das Fortimicin' B enthalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Antibiotikum mit einem breiten WirkungsSpektrum gegenüber den verschiedensten Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf der Auffindung einer neuen Art eines Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe isoliert vmrde, die aus einem Reisfeld in einer Vorstadt von Hiroshima, Japan, entnommen wurde. Diese neue Art bildet bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium das neue Antibiotikum Fortimicin B, das antibiotische Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien, insbesondere gegenüber Staphylococcen, Escherichia und anderen Bakterien, zeigt. _j

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Gegenstand der Erfindung ist somit Fortimicin B der Summenformel C^cH^pN^Oc, dem Molekulargewicht 3^8, dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Figur 1, dem Ultrarot-Absorptionsspektrum gemäß Figur 2 und dem NMR-Spektrum gemäß Figur 3, und seine Salze mit Säuren.

Figur 4 zeigt das NMR-Spektrum des Aminocyclit-Tsils des Fortimicin B-Moleküls und Figur 5 zeigt das NMR-Spektrum des N-Acetylderivats des Aminocyclit-Teils des Fortimicin B-Moleküls.

Vermutlich hat Fortimicin B die Formel

3 , NHCH,

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Fortimicin B, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der di'e Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin B besitzt, in einem Nährmedium züchtet, das Antibiotikum aus dem Nährmedium isoliert und gegebenenfalls durch JJmsetzen. mit einer anorganischen oder organischen Säure das Salzj

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bildet.

Ein besonders: geeigneter Mikroorganismus gehört zur Art Micromonospora olivoasterospora. Sein typischer Stamm wurde ursprünglich als Stamm MK-70 identifiziert. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville Maryland, V.St.A., unter der Nummer ATCC 21819 hinterlegt. Der MK-70 Stamm hat folgende Eigenschaften:

I. Morphologie

Der MK-70 Stamm ist gram-positiv. Auf üblichem Agar-Nährboden bildet der MK-70 Stamm kein echtes Luftmycel, wie dies bei Streptomyces beobachtet wird. Bei guter Sporenbildung beobachtet man auf der Oberfläche eines Agarnährbodens eine olivgrüne, wachsähnliche, glänzende Schicht von Sporen. Beim Züchten des Stamms in einem flüssigen Nährmedium zeigt die Kulturflüssigkeit während der Anfangsstufen der Züchtung eine hellbraune Farbe, in den Endstufen der Züchtung eine dunkel-olivgrüne Farbe. In der Kulturflüssigkeit kann eine große Zahl von Sporen beobachtet werden. Die mikroskopische Untersuchung der Zellen des MK-70 Stammes, der in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet wurde, hat ergeben, daß das Mycel einen Durchmesser von etwa 0,5 Mikron aufweist, gut entwickelt und nicht septiert ist. Eine einzige Spore wird am Ende jedes Sporophoren (etwa 0,3 bis 1,0 Mikron lang) gebildet, die vom Substratmycel abzweigt. Die Sporen werden über das gesamte, verhältnismäßig lange Substratmycel gebildet. Die reifen Sporen sind kugelförmig und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 Mikron. Unter dem Elektronenmikroskop erscheinen die Sporen wie ein Stern, da aus ihnen

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eine große Zahl von Vorsprüngen herausragen, deren Enden abgerundet sind.

II« Wuchsformen

In Tabelle I sind die Wuchsformen des Mikroorganismus MK-70 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt. Die Angaben über die Farbe werden nach der Einteilung in Color Harmony Manual (Container Corporation of America) gegeben. Der Tyrosin-Agar ist von Gordon & Smith in J. Bact., Bd. 69 (1955), S. 147 beschrieben.

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Tabelle I

Nährboden

Wachstum und Koloniegestalt Farbe des Bildung von Substratmycels löslichem Pigment

Czapek's Agar

mäßig; flach staubig olivgrün fi 1g)

keines

Glucose-AsOaragin-Agar

mäßig, flach, wachsartig olivgrün
(1 Pl)

keines

Nähragar

gut; erhaben, gefurcht · olivgrün
(1 l)

keines

Eialbumin-Agar

mäßig; flach, wachsartig hell olivgrün keines gelbbraun (1 Ii)

Stärke-Agar

gut;
flach schwach olivgrün (1 po)

keines

Malzextrakt-_r
Hefeextrakt-Ägar

gut;

erhabeny gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)

dunkel olivgrün (1-1/2 pn)

Hafermehl-Agar

gut;

faltig,

wachsartig bernstein-karamelfarben
(3 1c)
dunkelbraun
(2 pn)

staubig olivgrün (1 Pg)

Dextrose (1%) NZ-Amin (3#)-Agar

mäßig, flach, wachsartig hell weizenfarben
(2 ea)

keines

Bennet's Agar

gut;

erhaben,

gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)

keines

Emerson's Agar

mäßig;-erhaben, gefurcht, wachsartig olivfarben
(1 ni)

keines

Glucose-Hefeextrakt-Agar

gut;

erhaben, gefurcht, wachsartig dunkel oliv- keines grün (1 pn)

Pepton-Eisen-Agar

mäßig; flach, wachsartig dunkel oliv- keines grün (1 nl)

Tyrosin-Agar

mäßig; flach, wachsartig olivgrün
(1 ni)

keines

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III. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes MK-70 sind in Tabelle II zusammengefaßt. In den Versuchen, ausgenommen den Versuchen zur Bestimmung des Temperaturoptimums und der Einwirkung gegenüber Milch und Cellulose, wird der Stamm 2 Wochen bei 27°C gezüchtet. Das Temperaturoptimum wird nach 5-tägiger Züchtung
bestimmt. Die Einwirkung auf Milch und Cellulose wird nach 1monatiger Züchtung bestimmt.

Tabelle II

(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen: Kohlenstoffquelle: D-Arabinose _fc D-Galactose D-Glucose Glycerin D-Lactose D-Fructose L-Inosit D-Mannit b-Raffinose L-Rhamnose Sucrose Stärke D-Xylose

(2) Verflüssigung von Gelatine

(3) Einwirkung auf Milch

(4) Cellulosezersetzung

(5) Stärkehydrolyse

(6) pH-Optimum des Wachstums

(7) Temperaturoptimum des Wachstums

(8) Nitrat-Reduktion

(9) Tyrosinase-Reaktion

(10) Bildung von melanoiden Pigmenten

Verwertung:

schwach Peptonisierung schwach positiv positiv 6,8 bis 7,5 30 bis 38⁰C positiv negativ negativ

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Der MK-70 Stamm ist ein mesophiler Mikroorganismus, der bei der Züchtung auf einem Agar-Nährboden kein echtes Luftmycel bildet, sondern auf dem Substratmycel eine einzige Spore bildet. Die Analyse der Zellwand dieses Stammes hat ergeben, daß sie Mesodiaminopimelinsäure enthält. Dementsprechend gehört der MK-70 Stamm zu einem Stamm der Gattung Micromonospora.

Zuverlässige Grundlagen für die systematische Klassifizierung von Arten der Gattung Micromonospora wurden nicht geschaffen. Deshalb wurde die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung bis jetzt durch einen Gesamtvergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften durchgeführt. Entsprechend dieser Klassifizierungsmethode wurden 3 Stämme berechnet, die zur Gattung Micrcmonospora gehören, nämlich Micromonospora echinospora subsp. echinospora NRRL-2985 (ATCC 15837), Micromonospora echinospora subsp. pallida NRRL-2996 (ATCC 15838) und Micromonospora echinospora subsp. ferruginea NRRL-2995 (ATCC 15836). Diese besitzen runde Vorsprünge auf der Oberfläche der Spore. Diese drei Stämme von M. echinospora bilden Sporen von dunkelbrauner bis schwarzer Farbe, wenn sie auf einem üblichen Agar-Nährboden gezüchtet werden. Sie zeigen jedoch nicht eine, olivgrüne Farbe, wie der MK-70 Stamm. Die drei Stämme von M. echinospora können im Gegensatz zum MK-70 Stamm L-Rhamnose verwerten. Ferner können diese drei bekannten Stämme zwei antibiotisch aktive Verbindungen bilden, von denen eine nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirkt und einen R^-Wert von 0,4 bis 0,5 bei der Papierchromatographie mit Wasser gesättigtem n-Butanol als Entwicklungslösungsmittel hat, sowie das Antibio-Gentamicin, das einen EU-Wert von 0,00 besitzt. Der

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MK-70 Stamm kann dagegen drei antibiotisch aktive Verbindungen bilden, nämlich eine Substanz, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam und einen R_f-¥ert von 0,05 bis 0,1 bei der Papierchromatographie mit dem vorgenannten Entwicklungslösungsmittel hat, eine Verbindung, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam ist und einen R^-Wert von 0,00 hat, sowie die Verbindung Fortimicin B, die sowohl gegenüber gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien wirkt und einen R^-Wert von 0,00 hat. Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß der MK-70 Stamm sich von den drei bekannten Stämmen von M. echinospora unterscheidet.

Der MK-70 Stamm zeigt eine olivgrüne bis dunkel olivgrüne Farbe■ bei der Züchtung auf einem Nährboden, der zur Sporenbildung geeignet ist, und er bildet ein lösliches, olivgrünes Pigment in anderen Nährmedien. Unter den Stämmen der Gattung Micromonospora gibt es einige Stämme, die olivgrüne Sporen bilden können, nämlich Micromonospora chalcea und Micromonospora fusca. Diese Stamme unterscheiden sich jedoch im Aussehen der Sporenoberfläche und der Farbe der löslichen Pigmente.

Andere Arten von Micromonospora, nämlich Micromonospora coerulea zeigen gewöhnlich eine grün-blaue Farbe und bilden blaugrüne lösliche Pigmente. Die Pigmente wirken als Säure-Base-Indikatoren und sind daher verschieden von dem Pigment des MK-70 Stammes. Die Sporen von M. coerulea liegen traubenförmig vor und die Sporerioberflache ist glatt. Somit ist M. coerulea verschieden vom MK-70 Stamm.

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Wie vorstehend beschrieben, gibt es keine Stämme unter den bis Jetzt bekannten Stämmen der Gattung Micromonospora, die dem MK-70 Stamm entsprechen. Deshalb wird der MK-7O Stamm als ein neuer Stamm angesehen, der zur Gattung Micromonospora gehört. Er wurde deshalb mit Micromonospora olivoasterospora bezeichnet. Der Name dieser Art leitet sich von der Bildung olivgrüner kugelförmiger Sporen mit Vorsprüngen ab. Wie vorstehend beschrieben, wurde der MK-70 Stamm bei der American Type Culture Collection als Micromonospora sp. MK-70 hinterlegt. Der MK-70 Stamm wurde ferner beim Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan hinterlegt unter der Nummer FEElMP-Nr. 1560.

Es wurden ferner zwei Variantenstäinme von Micromonospora olivoasterospora isoliert, die ebenfalls Fortimicin B bilden können. Diese Varianten unterscheiden sich vom Typenstamm dadurch, daß sie D-Galactose, D~Fructose und D-Xylose verwerten können. Bei der Züchtung dieser Varianten auf den verschiedensten Nährböden zeigen sie eine helle Weizenfarbe, da sie nicht die Fähigkeit haben,auf dem Mycel Sporen zu bilden. In anderer Hinsicht sind die Varianten dem Typenstamm sehr ähnlich. Diese beiden Varianten wurden ebenfalls bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31009 und ATCC 31010 hinterlegt. Diese Varianten sowie der Typenstamm sind der Öffentlichkeit für Forschungszwecke zugänglich.

Ebenso wie andere Stämme von Actinomyceten können die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Mikroorganismen durch mutagene Mittel, wie UV-Licht, Bestrahlung mit Co⁶⁰, Röntgenstrahlen und den verschiedensten mutagenen chemischen Verbin-

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düngen mutiert werden. Alle Stämme und Mutanten, die die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin B besitzen, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. ' '

Im allgemeinen können im erfindungsgemäßen Verfahren die üblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Für das Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glukose, Stärke, Mannose, Fructose, Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können z.B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren verwendet werden, je nach der Verwertungsfähigkeit des eingesetzten Mikroorganismus. Anorganische und ..organische Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, .Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casaminosäure, und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im Gemisch verwendet werden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate dem Nährmedium zugesetzt werden. Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden, welche das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung von Fortimicin B fördern.

Im erfindungsgeraäßen Verfahren wird vorzugsweise ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submersverfahren und . unter Rühren durchgeführt. Vorzugsweise wird die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 40⁰C und bei annähernd neutralem pH-Wert durchgeführt. Nach etwa 4 bis 15-tägiger Züchtung hat ,

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sich in der Kulturbrühe eine ausreichende Menge des Antibiotikums gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin B in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Filtrat isoliert und gereinigt. Die Isolierung und Reinigung von Fortimicin B aus dem Filtrat wird nach üblichen Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrobiellen Stoff Wechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten durchgeführt. Da Fortimicin B eine Base darstellt und in Wasser löslich, Jedoch in üblichen organischen Lösungsmitteln schlecht löslich ist, kann das Antibiotikum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter wasserlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden. Die Reinigung von Fortimycin B kann insbesondere durch eine ge- . eignete Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenharzaustausehern, Säulenchromatographie an Cellulose., Adsorption und Desorption an Sephadex LH-20 und Chromatographie an Kieselgel gereinigt werden.

Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft und hierauf auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH"-Form ! gegeben. Die adsorbierten Substanzen werden mit Wasser eluiert und die eluierten aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin B und andere aktive Komponenten enthält.

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Zur Isolierung des Fortimicin B aus dem Rohprodukt'z.B. an Kieselgel chromatographiert. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Isopropanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2:1: 1) verwendet. Das pulverförmige Rohprodukt wird im Entwicklungslösungsmittel gelöst und auf die Kieselgelkolonne gegeben. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt.. Die erste aktive Fraktion enthält Fortimicin B. Andere aktive Komponenten, . wie die vorläufig mit XK-70-1 bezeichnete Substanz sind in den nachfolgenden eluierten Fraktionen enthalten. Die Fortimicin B enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft.- Nach dem Gefriertrocknen des Konzentrats wird ein weißes Pulver erhalten, das die Base des Antibiotikums enthält.

Die Fortimicin B enthaltenden aktiven Fraktionen werden durch aufsteigende Papierchromatographie mit Filterpapier Whatman Nr. 1 bestimmt. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 15 Stunden unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2 : 1 : 1) durchgeführt. Der R^-Wert von Fortimicin B auf dem Papierchromatogramm beträgt etwa 0,65.

Fortimicin B ist eine weiß gefärbte basisch reagierende Sub- · stanz mit einem Molekulargewicht von 348 und einem Schmelzpunkt, von 101 bis 103⁰C. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 51,72 %; H- 9,20 %; N=16,16 %; 0= 22,92 %. Die Ver

bindung hat die Summenformel

5*

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ORlGfNAL INSPECTED

In Figur 1 ist das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von Fortimicin B wiedergegeben. Das Spektrum zeigt keine charakteristischen Maxima im Spektralbereich von 220 bis 360 mu und lediglich eine Endabsorption.

Die freie Base des Fortimicin B hat folgenden optischen Drehwert /ά/β⁴ = + 22,2 (C = 1,01, H₂O).

In Figur 2 ist das Ultrarot-Absorptionsspektrum des Antibiotikums als Kaliumbromid-Preßling wiedergegeben. Fortimicin B zeigt Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (cm"* ): 523, 561, 650, 702, 755, 815, 879, 917, 993, 1034, 1066,

1250,
•1093, 1150,/1336, 1370, 1470, 1578, 210Ö, 2930 und 3355.

Das NMR-Spektrum von Fortimicin B ist in Figur 3 wiedergegeben. Die Absorption bei 5,6 2 ppm, bezogen auf ein anomeres Proton, deutet auf die Gegenwart eines Monoglycosids im Antibiotikum. Das Spektrum zeigt ferner ein Hethyl-Dublett bei 1,59 ppm, einen Methylenpeak bei 2,0 bis 2,5 ppm und eine Absorption bei 3,3 ppm benachbart zu einem anomeren Proton.

Bei der Hydrolyse von Fortimicin B mit 6 η Salzsäure und an- . schließender Dünnschichtchromatographie wird ein Fleck in der ■ gleichen Stellung beobachtet, wo Purpurosamin B einen Fleck bei der Dünnschichtchromatographie des Hydro lysats eines anderen Antibiotikums, nämlich Gentamicin C₂,bildet. Aus diesen Befunden und dem Massenspektrum, das nachstehend diskutiert wird, ist der Monoglycosidteil des Fortimicin B vermutlich das Purpurosamin B der Formel

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Figur 4 zeigt das NMR-Spektrum eines Aminocyclit-Teils, der durch Hydrolyse von Fortimicin B erhalten wird. Das Spektrum hat Singulett-Peaks bei 3,17 ppm und 3,95 ppm, welche die Gegenwart einer N-Methylgruppe und einer O-Methylgruppe anzeigen.

Figur 5 zeigt das *NMR-Spektrüm des N-Acetylderivats des Aminocyclit- Teils. Der einzige Peak bei 2,48 ppm zeigt die Gegenwart einer N-Acetylgruppe, d.h. die Gegenwart von Stickstoff im Aminocyclit-Teil.

Im Massenspektrum wurden Peaks bei folgenden m/e-Werten aufgezeichnet:

349.2442, 331.2099, 286.1762, 235.1297, 207.1338, 143.1184, 126.0916, 100.0768, 97.0890, 88.0752, 87.0669, 86.0596, 82.0642, 72.0440, 70.0646, 56.0497, 44.0499.

Auf Grund der vorstehend angegebenen Werte des Massenspektrogramms sind die Werte ein Indiz für den M -Zustand. Das

positive heißt, die im Molekül induzierte/Ladung ist das Ergebnis der Anlagerung eines Wasserstoffkerns und nicht der übliche Verlust eines Elektrons.

Deshalb ist jeder Wert um einen Faktor von 1 höher als der rieh tige Wert. Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß der Wert des

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Molekülions M⁺ = m/e 349 und der von M - H₂O = m/e 331 ist. Außerdem zeigt der Wert m/e 143 die Gegenwart von Purpurosamin B an.

Das N-Acetylderivat des Aminocyclit-Teils, der bei der Hydrolyse von Fortimicin B erhalten wird, hat ein Molekularion von M⁺¹ von m/e 249, M⁺¹ - H₂O von m/e 231, M⁺¹ - 2H₂O von ra/e 213 und M⁺ - CH-,ΟΗ von m/e 217. Somit muß es die Suramenforinel C₁₀H₂₀N₂Oc haben.

Aus dem NMR-Spektrum und den Werten des Massenspektrums des Aminocyclit-Teils »-ergibt sich, daß das Fortimicin B-Molekül eine O-Methylgruppe, eine N-Methylgruppe und zwei Hydroxylgruppen enthält. Diese Analyse wird durch den Befund gestützt, daß bei der Oxidation von Fortimicin B mit Perjodsäure 2 Mol Perjodsäure pro Mol Fortimicin verbraucht werden. Bei der Acetylierung des Antibiotikums mit Essigsaureanhydrid und anschließender Behandlung mit Perjodsäure wird keine Perjodsäure verbraucht. Aufgrund der vorstehenden Befunde hat Fortimicin B vermutlich folgende Strukturformel:

L ' · J

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■ NHCH₃

Die Gegenwart der "aufgeführten Substituenten ist zwar sicher, .ihre Stellung im Molekül wurde jedoch noch nicht bestimmt.

Die freie Base des Fortimicin B ist in Wasser gut löslich, in Methanol löslich, in Äthanol mäßig löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Petroläther und η-Hexan unlöslich.

Fortimicin B ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Kaliumpermanganat-Reaktion, sowie eine negative Sakaguchi-, Elson-Morgan- und Biuret-Reaktion.

Die R~-Werte von Fortimicin B bei der Papierchromatographie und DünnschichtChromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln sind in den Tabellen III, IV und V zu-

wurdeji

sammengefaßt. Diese Werte / mit den R_f-Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher Weise entwickelt wurden.

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Tabelle III
R^-Werte von Fortimicin B im aufsteigenden Papier-

chromatogramm bei 28⁰C

Entwicklungslösungsmittel ' R_f-¥ert Entwicklungs-

20gewichtsprozentige Ammonium- ο «^ χ

Chloridlösung ^u'^ö:? ^

wassergesättigtes N-Butanol' O 00 - 15

n-Butanol-Essigsäure-Wasser η na -m

.(3:1:1) ' ' ^{u>uy Ί5}

wassergesättigtes Äthylacetat ' ·0 00 4

2 Gewichtsprozent p-Toluolsul- 0 07 15

fonsäure und 2 Volumprozent * ' -*

wassergesättigtes n-Butanol mit

2 Gewicht

fonsäure

Piperidin

Tabelle IV

R_f-Werte von Fortimicin B und Gentamicin C Komplex bei der DUnnschichtchromatographie an Kieselgel; entwickelt bei Raumtemperatur während 5 Stunden

Entwickler	*)'	Antibiotikum	R_f-¥ert
I		Fortimicin B	0,80
I		Gentamicin C Komplex	0,71
II		Fortimicin B	0,62
. II		Gentamicin C Komplex	0,06 bis 0,16

*) Entwickler I: Die obere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1 : 1)

Entwickler II: lOprozentige Ammoniumacetatlösung und Methanol (Volumverhältnis 1:1).

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Tabelle V

Rp-Werte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papiercnromatographie unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2 : 1 ; 1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden

Antibiotikum R^

Streptomycin A 0,02

Streptomycin B 0,00

Bluensomycin ' 0,01

Ribostamycin 0,00

Lividomycin A 0,00

Lividomycin B 0,03

Lividomycin D 0,02

Spectinomycin 0,45

Kasugamycin 0,01

Butirosine A 0,00

Butirosine B 0,01

Hygromycin B 0,02

Destomycin A · 0,03

Gentamicin A 0,00

Gentamicin B 0,00

Gentamicin C_1a 0,18

Gentamicin C₁ 0,59

Gentamicin C₂ 0,38

Sisomicin 0,18

Neomycin A 0,00

Neomycin B 0,03

Neomycin C 0,00

Antibiotic Nr. 460 0,01

Kanamycin A 0,02

Kanamycin B 0,01

Kanamycin C . 0,02

Paromomycin 0,00

Nebramycin Komplex 0,01

Tobramycin 0,02

Apramycin 0,02

XK-62-2 0,49

Fortimicin B 0,65 L

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In Tabelle VI ist die minimale Hemmkonzentration von Fortimicin

* ■

B gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen zusammengefaßt.

Tabelle.VI

Mikroorgani smus minimale Hemmkon-

ζ entration, γ/ρ,ιΐ

Streptococcus faecalis ATCC 10541 >416,5

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 6,6

Staphylococcus aureus KY 8942

(resistent gegenüber Kanamycin, Paromomycin und Streptomycin) 104,2

Staphylococcus aureus KY 8950 52,1

(resistent gegenüber Streptomycin, Tetra- . ■

cyclin, Penicillin und Sulfonamiden)

Staphylococcus aureus KY 8953 26,1

(resistent gegenüber Streptomycin. Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin, Neomycin, Kanamycin B und Erythromycin)

Staphylococcus aureus KY 8956 0,83

(resistent gegenüber Streptomycin, Paromomycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

Staphylococcus aureus KY 8957 1,65

(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin B, Tetracyclin und Paromomycin)

Bacillus subtilis Nr. 10707; KY 4273 104,2

Bacillus cereus ATCC 9634 104,2

Bacillus cereus var.mycoides ATCC 9463 10^,2 , Klebsieila pneumoniae ATCC 10031 26 1

Escherichia coli ATCC 26 13 1

Escherichia coli KY 8302 208,3

(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin und L. opectmomycin;

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Tabelle IV - Fortsetzung

Mikroorganismus minimale Hemmkon

zentration, v/ml

Escherichia coli KY 8310 52,1

(resistent gegenüber Chloramphenicol,
Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin,
Kanamycin B, Paromomycin,· Tetracyclin
und Spectinomycin)

Escherichia coli KY 8314 · 26,1

(resistent gegenüber Streptomycin)

Escherichia coli KY 8315 26,1

(resistent gegenüber Streptomycin,
Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)

Escherichia coli KY 8327 13,1

(resistent gegenüber Kanamycin ,
Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin)

Escherichia coli KY 8331 1,65

(resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin,
Neomycin, Paromomycin und Lividomycin)

Escherichia coli KY 8332

(resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin) 3,3

Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1 208,3

Proteus vulgaris ATCC 6897 26,1

Shigella sonnei ATCC 9290 52,1

Salmonella tvphosa ATCC 9992 13,1

Aus Tabelle VI ist ersichtlich, daß Fortimicin B eine antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie auch gegenüber Staphylococcus aureus und Escherichia coli besitst«, die gegenüber den verschiedensten bekannten Antibiotika resistent sind. Aufgrund des breiten antibakteriellen ftirkungespektrums und der charakteristischen-Struktur eignet sich Fortimicin 3 als Desinfektionsmittel., Ferner ist Fortimicin B sine trertvolle Aus-

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gangsverbindung zur Herstellung der verschiedensten Derivate.

Fortimicin B ist ein. neues Antibiotikum. Als wasserlösliche basische Antibiotika, die durch Mikroorganismen der Gattung Micromonospora erzeugt werden, und die ein breites antibakterielles WirkungsSpektrum besitzen, sind beispielsweise folgende Verbindungen bekannt:

Gentamicin (M.J. Weinstein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1963, 1 und D. J. Cooper et al., J. Infect. Dis., Bd. 119, (1969), S. 342),

Antibiotikum Nr. 460 (japanische Patentveröffentlichung Nr. 16 153/71),

.Sisomicin (M.J. Weinstein et al., J. Antibiotics, Bd. 23 (1970),. S. 551, 555 und 559).

Aus Tabelle IV und V ist ersichtlich, daß die R^-Werte von Fortimicin B bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und der Papierchromatographie sich deutlich unterscheiden von den Komponenten des Gentamicin A, B, C ^ , C« und Cj, Antibiotikum Nr. 460, Sisomicin und XK-62-2. Selbst beim Vergleich mit den wasserlöslichen basischen Aminoglykosid-Antibiotika, die ähnliche Eigenschaften haben wie Fortimicin B oder dessen Bestandteile, wie Neomycin A (Neamine), Paromomycin und Gentamicin, wobei die letztgenannten Antibiotika das Desoxystreptamin als Bestandteil erhalten, während Fortimicin B kein Desoxystreptamin enthält, unterscheiden sich diese Antibiotika deutlich. Ferner unterscheidet sich die chemische Struktur von Fortimicin B von den anderen bekannten Antibiotika.

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Da Fortimicin basische Gruppen enthält, kann es in Form von Salzen mit Säuren vorliegen. Die Salze leiten sich von anorganischen Säuren, v/ie Salzsäure, Bromwasserstoff säure, Jodwasserstoff säure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure und Phosphorsäure, oder organischen Säuren, v/ie Maleinsäure, Essigsäure, Citronen säure, Oxylsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure oder Ascorbinsäure, ab.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Micromonospora olivoasterospora (ATCC 21819; FERM-P Nr. 1560) wird als Einsaatstamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet, das 2 Prozent Glukose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml" des Vorkulturmediums in einem 50 ml fassenden großen Reagensglas beimpft. Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur in 30 ml eines zweiten Vorkulturmediums in einem 250 ml Erlenmeyerkolben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Vorkultunaediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung wird 2 Tage unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt»- Sodann werden 30 Hl des zweiten Vorkulturmediums in 300 Ml eines dritten Vorkulturmediums is einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft _s der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des drittes! Forkulturmediums ist die gleiche wie die des erstes Yorkulturmediums. Die Zücfc-

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tung im dritten Vorkulturmedium wird 2 Tage unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liter der dritten Vorkulturbrühe - entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben - in 15 Liter eines vierten Vorkulturmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/min; Belüftung 15 Liter/min) bei 30⁰C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Mediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl überimpft. Dieses Nährmediuoi enthält 4 Prozent Stärke, 2 Prozent Sojabohnenmehl, 1 Prozent

. Maisquellwasser, 0,05 Prozent K₂HPO^, 0,05 Prozent MgS0^.7H₂0, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO₃. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei 30⁰C durchgeführt. Die erhaltene Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Sodann werden etwa 7 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird mit 6 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Austauscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Aktive Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasser werden die adsorbierten aktiven Verbindungen sait 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert.

^ Die Aktivität" des Eluats wird durch ein Antibiogramm nach der J

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Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, und das Gemisch wird unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml eines Anionenharzaustauschers in der OH"-Form gegeben. Sodann wird das Austauscherbett mit etwa 2 Liter Wasser gewaschen, um Verunreinigungen abzutrennen. Die aktiven Verbindungen v/erden mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit etwa 50 ml pulverisierte Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden an der Aktivkohle "adsorbiert. Die Kolonne wird mit Wasser ausgewaschen^und das abfließende Wasser und das Waschwasser wird verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,2 η Schwefelsäure eluiert. Die Aktivität des Eluats wird nach der Testplättchenmethode am Bacillus subtilis bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen werden auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der OH"-Form gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen gesammelt und auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird lyophilisiert. Es wird ein pulveriges Rohprodukt erhalten, das Fortimicin B enthält. Die Ausbeute beträgt etwa 32 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aktivität von 680 Einheiten/ mg (die Aktivität von 1 mg reiner Verbindung entspricht .· 1000 Einheiten).

Das erhaltene Rohproduktpulver v/ird gleichmäßig auf den Kopf einer mit 1 Liter Kieselgel dicht gefüllten Kolonne aus Glas ,

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gegeben. Die Kieselgelkolonne wird folgendermaßen hergestellt: Zunächst wird das Kieselgel in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Isopropanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 2:1 : 1) suspendiert. Die Suspension wird in die Kolonne in gleichmäßiger Schicht eingefüllt und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen. Hierauf wird das Rohproduktpulver in den Kopf der Kolonne eingefüllt. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, das langsam in den Kolonnenkopf eingespeist wird. Danach wird das · Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Std. fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Test-. plättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen, und die Fortimicin B enthaltenden Fraktionen werden gesammelt. Fortimicin B ist die aktive Komponente, die zu Beginn aus der Kolonne eluiert wird. Beim weiteren Eluieren werden andere Nebenprodukte, einschließlich des Antibiotikums XK-70-1, die im Rohproduktpulver enthalten sind, eluiert. Die Fortimicin B enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wird sodann in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Es werden 1,5 g Fortimicin B als freie Base erhalten. Die Aktivität des Präparats beträgt 965 Einheiten/mg.

Beispiel 2

Der in Beispiel 1 verwendete Stamm wird als Einsaatstamm verwendet. Es wird ferner ein Einsaatmedium für die vier Stufen der Vorkultur verwendet, das 1 Prozent Glucose, 1 Prozent lösliche Stärke, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton

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und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Die vier Vorkulturen werden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines fünften Vorkulturmediums der gleichen Zusammensetzung in einem 300 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Die Züchtung in diesem Fermenter wird 2 Tage unter Be3.üftung und Rühren bei 30°C durchgeführt. Hierauf werden 150 Liter der fünften Vorkulturbrühe in 1200 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Tankfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 4 Prozent lösliche Stärke, 3 Prozent gepulverte Trockenhefe (Ebios), 0,05 Prozent K₂HPO₅, 0,05 Prozent MgSO^.7H₂O, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO₃. Die Fermentation wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren bei 37⁰C durchgeführt. Die Produktion an aktiven Verbindungen erreicht 96 Stunden nach Beginn der Züchtung ein Maximum. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B in gleicher Weise isoliert und gereinigt. Ausbeute 34 g eines Präparats mit einer Aktivität von 950 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora Mm 744, KY1OO67 (ATCC 31009; FERM-P 2193) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,3 Prozent Hefeextrakt und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Vor der Sterilisation wurde das Nährmediura auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die erste bis vierte Vorkultur wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Nährmediums in einem 300 Liter

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fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 2 Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Sojabohnerimehl, 2 Prozent Glucose,» 1 Prozent Maisquellwasser, 1 Prozent Hefeextrakt, 0,05 Prozent K₂HPO^, 0,05 Prozent MgS0₄.7H₂0, 0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO₅. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 ü/min; Belüftungsgeschwindigkeit 80 Liter/min) bei 30⁰C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B isoliert und gereinigt. Ausbeute 1,3 g eines Präparats mit einer Aktivität von 962 Einheiten/mg.

Beispiel 4 ·

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MKr80, KY 11055 (ATCC 31010; FERM-P 2192) verwendet. Als Einsaatmediura für die erste bis fünfte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 1 Prozent Glucose, 1 Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die erste bis fünfte Vorkultur wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Sodann werden 150 Liter der fünften Vorkulturbrühe in 1200 Liter eines Nährmediuias in einem 2000 Liter fassenden Tankfermenter überimpft. Dieses Nährmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie die des Beispiels 1. Die Züchtung wird 4 Tage unter .Belüftung und Rühren bei 30°C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die

Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B abgetrennt und gereinigt. Ausbeute 38 g eines Präparats mit einer Aktivität von 972 Einheiten/mg. ■ j

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Claims

Patentansp rüche

1. Fortimicin B der Summenformel ^i5^30^4°5» ^^era Molekulargewicht 348, dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß
Figur 1, dem Ultrarot-Absorptionsspektrum gemäß Figur 2 und dem NMR-Spektrum gemäß Figur 3, und seine Salze mit Säuren.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindimg gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin B besitzt, in einem Nährmedium züchtet und aus dem Nährmedium die Verbindung isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Art von Micromonospora
olivoasterospora verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micromonospora olivoasterospora
ATCC 21819t Microraonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 3101O verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 4O⁰C und einem pH-Wert um den Neutralpunkt durchführt.

6. Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819, 31009 oder 31010 zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis

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7. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder HiIfsstoffen. ' '

8. Verwendung von Fortimicin B als Desinfektionsmittel.

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