DE3024047A1

DE3024047A1 - Neues aminoglykosid-antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3024047A1
Application number: DE19803024047
Authority: DE
Inventors: Tadashiro Mishima Shizuoka Fujii; Mitsuo Hayashi; Akira Kadoma; Naoki Muto; Masaru Shizuoka Otani; Shuzo Satoi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-08-18
Filing date: 1980-06-26
Publication date: 1981-04-23
Also published as: JPS6331477B2; FR2463618A1; JPS5629598A; US4349667A; FR2463618B1

Description

Die Erfindung betrifft das neue Aminoglykosid-Antibiotikum aus der Gruppe G-367-2 und seine nichttoxischen Salze sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Das neue Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-2 (nachfolgend als G-367-2 bezeichnet) hat die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 151 - 155⁰C
[a]£⁴: +159,8° (c = 1,0, H₂O)

Elementaranalyse: gefunden: C 50,41, H 7,92, N 15,16

berechnet: C 50,99, H 8,33, N 15,64 Molekulargewicht: 447 (bestimmt durch Massenspektrum) Summenformel: ^c-i9^H37^N5^O7

UV-Absorptionsspektrum: kein charakteristisches Absorptionsmaximum in Wasser bei 220 bis 330 nm, zeigt nur Endabsorption

IR-Absorptionsspektrum (KBr): wie in Fig. 3 dargestellt, Absorptionsbanden bei 3350, 2920, 1650, 1540, 1470, 1350, 1140, 1100, 1050, 1020, 950 cm"¹ NMR-Spektrum (Wasserstoff): wie in Fig. 4 dargestellt

(D₂O, 100 MHz, innerer Standard DSS)

NMR-Spektrum (Kohlenstoff): D₂O, 25 MHz, innerer Standard: Dioxan

Nr.	ppm	,5	Nr.	ppm	,4 (Dioxan)
1	149	,4	11	67	,2
2	101	,7	12	64	,6
3	98	,5	13	51	,1
4	97	,9	14	50	,2
5	87	,1	15	47	,0
6	85	,2	16	43	,7
7	75	,1	17	37	,2
8	73	,0	18	36	,9
9	70	/6	19	23	,5
10	68	ZO	22

Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol,

unlöslich in Aceton/ Benzol, Äthylacetet und Chloroform
Farbreaktion: positiv: Ninhydrin, Entfärbung von Kalium-

permanganat negativ: Elson-Morgan, Biuret

Farbe: weißes Pulver

Beschaffenheit: basisch

Dünnschichtchromatographie (Silikagel):

untere Schicht von Chloroform : Methanol : 28%ig

wässrigem Ammoniak (1 : 1 : 1): Rf = 0,28

10%iges Ammoniumacetat : Methanol (1 : 1) : Rf = 0,10

Die oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften von G-367-2 wie die Elementaranalyse, das Molekulargewicht und die Summenformel sind ähnlich dem bekannten Antibiotikum Sisomicin. Der Rf-Wert von Sisomicin bei ' Dünnschichtchromatographie mit Chloroform : Methanol : 28%ig wässrigem Ammoniak (1:1 : 1) ist aber 0,38, also von dem des G-367-2 verschieden. Andere physikalischchemische Eigenschaften von G-367-2 zeigen an, daß es sich um ein neues Aminoglykosid-Antibiotikum handelt, für das die folgende planare Struktur angenommen wird, wobei es sich vermutlich um ein Stereoisomeres von Sisomicin handelt.

NHCH₃

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" ⁵" 301404?

Das antimikrobielle Wirkungsspektrum (minimale Hemmkonzentration/ MIC) von G-367-2, bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode, zeigt die folgende Tabelle:

_m . . MIC (rr^g/ml)

Testorgan^smus ^py

G-367-2

Staphylococcus aureus ATCC 6538P^; 12,5

. " " MS27 12,5

¹¹ 0119 12,5

Staphylococcus epidermidis

sp-al-1 1 ,6

Streptococcus pyogenes N.Y.5 6,3

Bacillus subtilis ATCC 6633 1,6

Escherichia coli NIHJ-JC2 3,1

W3630 1,6

" W3630 RGN14 1 ,6

Citrobacter freundii GN346 3,1

Klebsiella pneumonia ATCC 10031 1,6

Salmonella enteritidis Gärtner 3,1

Shigella sonnei E33 3,1

Proteus morganii 0239 6,3

Proteus rettgeri ACR 3,1

Enterobacter aerogenes 0655 1,6

Enterobacter cloacae GN336 . 1,6

Serratia marcescens 50

Pseudomonas aerugehosa IAM1095 25

Pseudomonas aerugenosa ML4561 125

" ML4561

>100

6,3 >100 >100 >1 00 >100

	Il	Rms 166	1842
11	ti	ML4561 Rms164-1	maltophilia 1850
ti	Il	ML4561 RP4
Il	ti	1946
Il	putida	2512
Pseudomonas
Pseudomonas

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302404?

Das Antibiotikum G-367-2 der vorliegenden Erfindung hat einen starken antibakteriellen Effekt gegen gram-negative Bakterien, und kann in Form seiner nichttoxischen Säureadditionssalze von organischen oder anorganischen Säuren,wie z. B. als Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Carbonat, Acetat, Fumarat, Malat, Citrat, Mandelat, Succinat, Ascorbat, Aspartat oder Glutamat, verwendet werden.

Das Antibiotikum G-367-2 oder seine nichttoxischen Säureadditionssalze kann als injizierbare Zubereitung, z. B. in Form von 2o - 4o mg-Fläschchen oder Ampullen, verwendet werden.

Der G-367-2 produzierende Actinomycetes-Stamm G-367 wurde aus einer Bodenprobe in Fuji-shi, Shizuokaken, Japan isoliert, und mit Dactylosporangium thailandense G-367 bezeichnet. Dieser Stamm wurde im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als FERM-P Nr. 4840 hinterlegt.

Die taxonomischen Eigenschaften (taxonomical properties)

des Stammes sind die folgenden:

I Morphologische Eigenschaften:

Auf Calciummalat-Agar (Bact. Rev. 2^,1 (1957)) wurden bei 3O⁰C, und einer Kultivierung von 3 bis 7 Tagen folgende Beobachtungen gemacht:

Das Substrat-Mycel ist gekrümmt oder webartig, von verzweigtem Wuchs, und ohne Fragmentierung, 0,5 - 0,8 μ im Durchmesser und zeigt keine Bildung von "Luft-Hyphae" (aerial hyphae).

Auf dem Substrat-Mycel wird, eingebettet im Agar, ein kugelförmiger oder ellipsoider Körper mit den Dimensionen 1,5 bis 2,0 χ 2,0 bis 2,5 μ festgestellt.

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Aus dem Substrat-Mycel erheben sich kurze Sporangiophoren, und fingerartige Sporangia zeigt sich einzeln oder gebüschelt an der Oberfläche des Agar-Mediums. Die Größe des Sporangia ist 1,0 - 1,5 χ 4,ο - 6,5 μ. Jedes Sporangium enthält eine vertikale, einzelne Reihe von drei bis vier Sporen. Die kugelförmigen, ellipsoiden oder birnenförmigen Sporen mit einer Größe von 1,0 - 1,5 χ 1,5 - 2,5 μ sind in Wasser beweglich durch polytrichose, polare Fäden.

II Verhalten mit Diaminopimelinsäure (Zusammensetzung von Diaminopimelinsäure):

Durch Mycel-Analyse (mycelial analysis) wurde ein Rm-Wert vom Meso-Typ (meso-type Rm value) und ein niedrigerer Rm-Wert als der des Meso-Typs (langsam wandernde Diaminopimelinsäure) festgestellt.

III Wachstum auf verschiedenen Medien:

Die an verschiedenen Medien bei 30⁰C nach 14 Tagen festgestellten Beobachtungen sind in der folgenden Tabelle veranschaulicht. "Luft-Mycel" (aerial mycelium) wird, außer auf Hafermehl-Agar in einer rudimentären Form, nicht gebildet. Die Bildung von Sporangia ist auf Calciummalat-Agar gut, mittelmäßig auf Boden-Agar (J. gen. Microbiol. ' 5_£, 295 (1968)), und gering oder überhaupt nicht auftretend auf den anderen Medien.

Die Farbbezeichnung basiert auf dem "Color Harmony Manual, 4. Ausgabe 1958" (Container Corporation of America).

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Wachstum auf verschiedenen Medien

O OT O

Medium	Wachstum	Farbe des Substrat-Mycels	Lösliches Pigment
Sucrose-nitrat-Agar (Waksmann medium No. 1) *	mäßig bis schwach	aprikosenfarbig (4ia) bis Orange (41c) (dusty orange)	keines
Glucose-asparagin-Agar (Waksmann medium No. 2) *	schwach	melonengelb (3ia) bis aprikosenfarbig (4ia)	keines
Glycerin-asparagin-Agar (ISP medium No. 5)**	gering bis schwach	farblos bis hellmelonengelb (3ea)	keines
Stärke-Anorganischer Agar (ISP medium No. 4) **	mäßig bis gut	orangebraun (4nc) bis orange (41c) (dusty orange)	keines
Tyrosin-Agar (ISP medium No. 7)**	gering bis schwach	aprikosenfarbig (4ga) bis blaß-pastellorange (4ic)	keines
Hafermehl-Agar (ISP medium No. 3)**	mäßig bis gut	rostorange (4pe) bis orangebraun (4pc)	keines
Hefeextrakt-Mslzextrakt-Agar (ISP medium No. 2)**	mäßig bis gut	Ahornfarbig (4Ie) bis Lohfarben (4ne)	Ahomfarbig (4Ie) bis Hellbraun (4ng)
Calciummalat-Agar	schwach	farblos	keines
Nähr-Agar (Waksmann medium No. 14)*	gering	farblos	Il

co O O

CD cn

co

¹Benett-Agar (Waksmann medium No. 30 *	mäßig bis gut	ahornfarbig (4Ie) bis lohfarben (4ne)	ahornfarbig (4Ie) bis hellbraun (4ng)
Emerson-Agar (Waksmann medium No. 28) *	mäßig	pastellorange (4ic) bis ahomfarbig (4Ie)	ahornfarbig (4Ie)
Hickey and Tresner-Agar (Waksmann medium No. 32)*	mäßig bis gut	zimtfarbig (3Ie) bis ahornfarbig (4Ie)	ahomfarbig (4Ie) bis hellgewürzbraun (41g)
Glucose-Hefeextrakt-Agar (Waksmann medium No. 29) *	mäßig	melonengelb (3ga)	keines
Pepton-Hefeextrakt-eisenhal- tiger Agar (IPS medium No.6) **	gering	farblos	keines
Boden-Agar	gering bis schwach	Il	keines
Kartoffelacker (potato stabb) (Waksmann medium No. 40)*	mäßig	Ziegelrot (5ne) bis kupfer farbig (51c)	keines
Kartoffelacker (potato stabb) + Calciumcarbonat	mäßig	Il	keines
Rübenacker (Carrot stabb) *	gering	farblos	keines

* Waksman, S. A.¹ The Actinomycetes Vo 12 1961 P. 327-334 Wiliams & Wilkins Co. ** Inter. ,J. Syst. Bact. _16_, 313 - 340 (1966)
*** Antimicrob. Agents and Chemother. 1963 P. 116 - 124

I .

" ^1o " 302A0A?

1. Verwertung von Kohlenstoffquellen

Kohlenstoffquelle P & G* Lm**

D-Arabinose + +

L-Arabinose + +

D-Fructose + +

D-Galactose + ■ +

D-Glucose + +

Glycerin - -

i-Inosit - -

D-Mannose + +

D-Mannit + +

α-Melibiose + +

ß-Lactose + +

Dulcit

D-Toreharose · + +

D-Cellobiose + - +

Melezitose + +

Raffinose +

L-Rhamnose + +

D-Ribose

L-Sorbose - -

D-Sorbit

Sucrose + +

D-Xylose + +

Adonit " - -

Salicin + - + + - +

Stärke + +

Maltose + +

Dextrin + +

Inulin - -

+: positiv +: schwach positiv -: negativ

* Pridham-Gotlieb anorganisches Medium ** Intern. J. Syst. Bact. , 2Λ_, 240-247 (1971)

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2. Wachstumstemperatür: 20 - 4 0⁰C

3. Peptonisierung und Koagulation von entrahmter Milch: positiv . .

4. Bildung von Melanin-artigem Pigment: negativ auf Tyrosin

und Pepton-Hefeextrakt-eisenhaltigem Agar

5. Stärkehydrolyse: positiv

6. Cellulosezersetzung: negativ

7. Kaseinzersetzung: positiv

8. Tyrosinzersetzung: negativ

9. Gelatinverflüssigung: positiv

10. H₂S-Bildung: schwach positiv

11. Nitratreduktion: positiv

12. Wachstums-pH-Wert: 5,5 - 9,0

Wie oben veranschaulicht, sind die Charakteristika des G-367-Stammes ein auf dem Substrat-Mycel gewachsenes, fingerartiges Sporangia, welches vertikale einzelne Reihen von Sporen enthält, und polytrichose, polare Fäden an den Sporen.

Ein gebildetes Sporangium, welches polytrichose Fäden enthält, ist für den Genus Actinoplanaceae charakteristisch, und unter diesen sind fingerartige Sporangia und vertikale, einzelne Reihen von Sporen für den Genus Dactylosporangium charakteristisch.

Da der Stamm G-367 weiterhin ein orange-braunes bis braunes Substrat-Mycel und ein braunes lösliches Pigment aufweist, wurde der Stamm zu Dactylosporangium thailandense (Arch. Micr-obiol. J5_8, 4 2-52, 1967} zugeordnet. Der Stamm wird deshalb als Dactylosporangium thailandense G-367 bezeichnet.

Die Herstellung des neuen Antibiotikums G-367-2 kann durch aerobe Kultivierung eines G-367-2

produzierenden Stammes vom Genus Dactylosporangium in einem herkömmlichen Medium bewirkt werden. Es kann ein festes, oder flüssiges Medium verwendet werden, wobei für'eine Herstellung

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in großem Maßstab ein flüssiges Medium bevorzugt ist.

Herkömmliche Nährmedien für Mikroorganismen können verwendet werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen wie z.B. Glukose, Sucrose, Maltose, Stärke, Dextrin und Melasse können verwendet werden. Assimilierbare Stickstoffquellen wie z.B. die bei der Stärkeerzeugung anfallende "Kornaufschlußlauge" (corn steep liquor), Sojabohnenpulver, Baumwollsamenpulver, Weizenkleber, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kaseinhydrolysat, Ammoniumsalze und Nitrate können verwendet werden. Wenn notwendig, können auch Phosphate und Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, Kobalt, Eisen oder Mangan verwendet werden.

Die Temperatur der Kultivierung hängt vom Wachstum der Mikroorganismen und von der Produktion von Antibiotika ab und beträgt vorzugsweise 25 bis 35⁰C. Die Zeit der Kultivierung hängt ab von den Bedingungen und beträgt gewöhnlich 100 bis 200 h, wobei die Kultivierung bei der maximalen Wirksamkeit der Antibiotika im Medium beendet wird.

Die Antibiotika werden aus dem Filtrat der Kulturen gewonnen.

Die Isolierung von G-367-2 kann durch herkömmliche

Isolierungsmethoden für wasserlösliche, basische Aminozucker-Antibiotika erfolgen.

G-367-2 kann auf einer Agarplatte mit Hilfe von Bacillus subtilis als Testorganismus untersucht werden.

Die Ausführungsform der Isolierung und Reinigungsmethode von G-367-2 wird wie folgt beschrieben.

Das Kulturfiltrat wird erhalten, indem man das Kulturmedium

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auf einen sauren pH-Wert einstellt, neutralisiert und dann filtriert. Das Kulturfiltrat wird auf eine Kationenaustauschersäule, wie z.B. Amberlite IRC-50 (vom Aitunoniura-Typ)gebracht, um aktive Substanzen zu adsorbieren, die aktiven Substanzen werden durch zwei normale wässrige Ammoniaklösung eluiert, konzentriert, und dann der pH-Wert des Eluats eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Kationenaustauschersäule wie z.B. CM-Sephadex C-25 (vom Ammoniumtyp) aufgebracht, mit wässrigem Ammoniak (Konzentrationsgradient 0 bis 0,35 N) eluiert, um die aktiven Fraktionen zu erhalten, welche konzentriert und gefriergetrocknet werden. Man erhält G-367-2

als gereinigtes weißes Pulver in Form der freien Base. Das so erhaltene G-367-2 zeigt einen einzelnen Fleck

im Dünnschichtchromatogramm.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiel 1:

Ein Medium (pH-Wert 7,0, 100 ml), welches 1 % Dextrin, 1 % Glukose, 0,5 %' Kaseinhydrolysat, 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % Calciumcarbonat enthält, wurde in einem 500 ml-Erlenrneyer-Kolben bei 12O⁰C 20 min lang sterilisiert.

Dactylosporangium thailandense G-367 wurde aus einem geneigten Agar-Medium (agar slant medium) mit Hilfe einer öse eingeimpft und die Kultur bei 30⁰C 120 h lang geschüttelt (shake cultured). Diese Samenkultur wurde einem sterilisierten Medium der gleichen Zusammensetzung (20 1) in einen 30 1-Fermentergefäß eingeimpft und 72 h lang bei 30⁰C kultiviert (Rührgeschwindigkeit 300 UpM, Luftbegasung 20 l/min). Dieses kultivierte Medium (10 1) wurde in einem 250 1 Tank einem sterilisierten Medium eingeimpft, das 5 % Dextrin, 0,5 % Glukose, 3 % entfettetes Sojabohnen pulver, 0,7 % Calcium,-

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carbonat und 1,3 ppm Kobaltchlorid enthält (pH-Wert 7,2,~ 200 1) und bei 30⁰C 120 h lang kultiviert (Umdrehungsgeschwindigkeit 250 UpM, Luftbegasung 100 l/min). Man erhält 190 1 des kultivierten Mediums.

Beispiel 2:

Das nach Beispiel 1 erhaltene kultivierte Medium wurde durch Zugabe von 12 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, 30 min lang gerührt, dann durch Zugabe von konzentriertem wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, und nach Zugabe des Filterhilfsmittels "Perlite" (4 kg, Handelsname) filtriert. Das Filtrat wird auf eine Amberlite IRC-50-Säule (Rohm & Haas Co., Ammoniumtyp, 10 1) aufgebracht und nach dem Waschen mit Wasser mit 2 N wässriger Ammoniaklösung (20 1) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml konzentriert.

Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6 U Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Säule von CM-Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemical Corporation, Ammoniumtyp, 500 ml, 4 cm Durchmesser) aufgebracht. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die aktive Substanz durch Gradientenelution mit wässrigem Ammoniak (5 1, Konzentrationsgradient 0 bis 0,35 N)eluiert. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie geprüft (untere Phase eines Gemisches aus Chloroform : Methanol : 28%ig wässrigem Ammoniak im Verhältnis 1:1 : 1), und die aktive Substanz durch Ninhydrin-Farbreaktion festgestellt.

G-367-2 wurde in den Fraktionen Nr. 19o - 2o5 gefunden. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und nach dem Gefriertrocknen das weiße Pulver erhalten. Das Pulver wurde bei 4o°C 48 h lang unter reduziertem Druck ge-

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trocknet und das gereinigte G-367-2 als weißes Pulver erhalten (freJeBase, 680 mg).

In den nachstehenden Zeichnungen bedeuten:

Fig. 1: IR-Spektrum von G-367-2 und Fig. 2: NMR-Spektrum (Wasserstoff) von G-367-2.

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-H,

Leerseite

Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing". H.¥e!ckmann:, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska 8000 MÜNCHEN 86, DEN 26, *)ϋΠΙ POSTFACH 860 820 MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22 HCH KP-5561 TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA 632-1, Mifuku, Ohito-cho Tagata-gun, Shizuoka-ken Japan Neues Aminoglykosid-Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung-1 Patentansprüche

1. Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-2 und seine nichttoxischen Säureadditionssalze.

2. Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-2 nach Anspruch 1,
charakterisiert durch die folgenden Parameter:
Schmelzpunkt; 151 - 155°C,

^7j⁴: +159,8° (c = 1,o, H₂O)

Elementaranalyse: gefunden: C 5o,41, H 7,92, N 15,16

berechnet: C 5o,99, H 8,33, N 15,64
Molekulargewicht: 447 (bestimmt durch Massenspektrometrxe)

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Summenformel: C .H.J₅O₇ . *^y!i'^y ■'

UV-Absorptionsspektrum: kein charakteristisches Absorptionsmaximum bei 22o - 36o nm, zeigt nur Endabsorption

IR-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 3 dargestellt NMR-Spektrum: wie in Fig. 4 dargestellt Löslichkeit: löslich in Wasser, Methanol

unlöslich in Aceton, Benzol, Äthylacetat und Chloroform
Farbreaktion: positiv: Ninhydrin, Entfärbung einer Kalium-

permanganat-Lösung negativ: Elson-Morgan, Biuret Farbe: weiß
Beschaffenheit: basisch.

3. Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-2 nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus vom Stamme Dactylosporangium thailandense G-367 (FERM-P Nr. 484o) in einem Nährboden kultiviert und die gebildeten Antibiotika daraus isoliert.

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