DE69010924T2

DE69010924T2 - Antibiotikum L53-18A und dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE69010924T2
Application number: DE69010924T
Authority: DE
Inventors: Misuo Hayashi; Kenya Ishizawa; Atsuki Morishita; Naoki Muto; Tetsu Saito; Satoshi Yaginuma
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1989-01-20
Filing date: 1990-01-05
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2010-01-06
Also published as: ES2057454T3; JPH02190189A; EP0379395A3; US5081023A; CA2008147A1; EP0379395B1; EP0379395A2; JP2787458B2; DE69010924D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues durch Actinomycetes Saccharopolyspora sp. L53-18 erzeugtes Antibiotikum L53-18A und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Antibiotikum L53-18A oder dessen pharmazeutisch verträgliche Salze und ein Verfahren zu dessen Herstellung, gekennzeichnet durch die Züchtung von Actinomycetes-Stamm Saccharopolyspora sp. L53- 18 (FERM BP-2231) oder Mutanten oder Varianten davon, der das neue Antibiotikum (L53-18A) erzeugt, in einer Kulturbrühe, um das Antibiotikum (nachstehend als "L53-18A" bezeichnet) in der Kulturbrühe herzustellen und anzureichern und das Antibiotikum zu sammeln.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum L53-18A weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf.
(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver
(2) Summenformel: C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub2;
(3) Elementaranalyse (%):
C:62,51 ± 1,0, H: 9,38 ± 1,0,
N: 1,89 ± 1,0 (gefunden)
C: 62,25, H: 8,89, N: 1,96 (berechnet)
(4) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): 714 (M+H)&spplus;
(5) Unterscheidung von sauer oder basisch: basisch
(6) Spezifisches Drehvermögen: [α]²²D = -37º±10º (C = 0,8, Chloroform)
(7) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 1, Maximale Absorption in Methanol: λmax = 276 ± 2 nm (E1%1cm = 148 ± 20).
(8) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 2 Hauptwellenzahl (cm&supmin;¹) in Kaliumbromid- Tabletten: etwa 3430, 1735, 1690, 1615 1455, 1370, 1160, 1070 und 1040
(9) Kernmagnetisches Resonanz (¹H-NMR)-Spektrum: Siehe Fig. 3 (300 MHz in deuteriertem Chloroform)
(10) Kernmagnetisches Resonanz (¹³C-NMR)-Spektrum: Signale (δppm) bei 100 MHz in deuteriertem Chloroform sind nachstehend aufgeführt.
204,96(s) 77,93(d) 46,31(d) 21,53(q) 6,00(q) 193,02(s) 77,54(d) 43,05(d) 21,34(t) 175,90(s) 74,76(s) 41,82(t) 21,10(q) 108,58(s) 72,80(s) 40,42(q) 21,01(q) 104,80(d) 70,58(d) 40,42(q) 20,62(q) 96,57(d) 69,69(d) 35,05(t) 17,67(q) 87,14(s) 66,17(d) 31,79(d) 14,06(q) 86,28(d) 64,65(d) 29,13(t) 10,93(q) 78,55(d) 49,29(q) 26,37(q) 10,72(q)
(s: Singulett, d: Doublett, T: Triplett, q: Quartett)
(11) Löslichkeit: Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Benzol und saurem Wasser.
(12) Farbreaktion: Positiv gegenüber Kaliumpermanganatreaktion, Iodreaktion, konzentrierter Schwefelsäurereaktion, Molisch's Reaktion und Dragendorff'sche Reaktion; negativ gegenüber Ninhidrinreaktion, Sakaguchi's Reaktion und Eisen(III)-chloridreaktion.
(13) Dünnschichtchromatographie (TLC): Fleckfilm, Silicagel f (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo Co.)
Lösungsmittel Rf
Chloroform-Methanol-Ammoniakwasser (10:0,5:0,05) 0,36
Benzol-Aceton-Ammoniakwasser (5:5:0,1) 0,29
Ethylacetat-Methanol-Aminoniakwasser (10:0,5:0,1) 0,23
(14) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: phie (HPLC):
Träger: HITACHI GEL #3056 (hergestellt von Hitachi Limited)
Fließbett: Acetonitril-Methanol-1/15M Ammoniumacetat
(50:25:35)
Durchflußrate: 0,8 ml/min
Rt = 6,7 (min)
(15) Antimikrobielle Wirkung (MIC): Die antibakteriellen Bereiche für verschiedene Bakterien sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Testbakterien Minimale Konzentration der Wachstumsinhibierung (ug/ml) Staphylococcus aureus FDA 209P JC-1 Staphylococcus epidermidis ATCC 27626 Streptococcus pyogenes N.Y.5 Streptococcus agalactiae 1020 Sarcina lutea ATCC 9341 Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia coli NIHJ JC-2 Klebsiella pneumoniae NCTC 9632 Pseudomonas aeruginosa IAM 1095
(16) Akute Toxizität: 300 mg/kg (ip) mit überlebenden Mäusen (10 Mäuse pro Gruppe).

Kurze Erläuterung der Zeichnungen

Figuren 1, 2 und 3 sind ein UV-Absorptionsspektrum, ein IR- Spektrum bzw. ein kernmagnetisches Resonanzspektrum )¹H- NMR-Spektrum) des neuen Antibiotikums L53-18A.

Beschreibung der Erfindung

Als Antibiotika mit einer Summenformel C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub2; sind A- 6888X (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung 55- 154994) und Dedesosaminyl-5-O-mycaminosyl-10, 11-Dihydromycinamycin IV (J. Antibiot., 35, 1407-1408, 1982) bekannt. Jedoch weist das erste eine maximale Absorption bei 239 nm und das letztere maximale Absorptionen bei 211 nm und 275 nm auf und diese sind deutlich unterschiedlich zu dem vorliegenden Antibiotikum L53-18A. Als Antibiotika mit einem Molekulargewicht von 713 sind zusätzlich zu den vorstehenden Antibiotika 16, 17-Dihydro-17-hydroxyrifamycin S (J. Antibiot., 35, 594-601, 1982) und Anthrimycin C (J. Antibiot., 35, 378-380, 1982) bekannt, aber die Summenformeln dieser Antibiotika sind C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub7;NO&sub1;&sub3; bzw. C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub1;N&sub9;O&sub1;&sub1; und diese sind deutlich unterschiedlich zu dem vorliegenden Antibiotikuin L53-18A.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum L53-18A ist ein Macrolid- Antibiotikum und weist die vorstehend aufgeführten Eigenschaften auf und gleicht Erythromycin, jedoch weist Erythromycin die Summenformel C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub7;NO&sub1;&sub3; auf und zeigt nur eine schwache UV-Absorption bei 288 nm und kann von dem erfindungsgemäßen Antibiotikum vollständig unterschieden werden (Index of Antibiotics form Actinomycetes, Bd. 1, S. 273, University of Tokyo Press, 1967, herausgegeben von H. Umezawa). Deshalb ist das erfindungsgemäße Antibiotikum L53-18A ein neues Antibiotikum.
Aufgrund der vorstehend aufgeführten physikalisch-chemischen Eigenschaften kann die folgende Formel als wahrscheinliche Strukturformel des vorliegenden Antibiotikums L53-18A aufgeführt werden.
Ein für die Herstellung des vorliegenden L53-18A zu verwendender geeigneter Actinomycetes L53-18-Stamm ist ein aus Ackerboden von Setouchi-cho, Oshima-gun, Kagoshima-ken (Amamiohshima) isolierter Stamm und wurde zur Gattung Saccharopolyspora gehörend als Ergebnis eines Stammnachweises identifiziert. Seine morphologischen Eigenschaften, das Wachstum von entsprechenden Kulturmedien und die physiologischen Eigenschaften sind nachstehend dargestellt.

I. Morphologische Eigenschaften:

Der Stamm wurde auf Stärke-Agar-Medium mit anorganischen Salzen [Inter. J. System, Bacteriol. 16: 313-340 (1966)] bei 30ºC 10-14 Tage gezüchtet, und die Ergebnisse der Beobachtung sind dargestellt. Fast die gleichen morphologischen Eigenschaften wurden auf Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin- Agar, Hafermehl-Agar oder Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium beobachtet. Das Substrat-Myzel ist in Form einer gebogenen oder geraden Linie und wächst unter Bildung von Verzweigungen und bildet eine Untergliederung in den Teilen der Hyphen oder in dem späteren Züchtungsstadium und weist einen Durchmesser von 0,4-0,6 um auf. Sporen werden nicht gebildet.
Von dem Substrat-Myzel erzeugte Lufthyphen sind in Form einer gebogenen Linie oder geraden Linie und bilden einfache Verzweigungen und weisen einen Durchmesser von 0,5-0,7 um auf. Die Spitze davon ist eine schleifenförmige, hakenförmige und spiralförmige lose Doppelwindung oder ist in Form einer gebogenen Linie oder einer geraden Linie. Die Lufthyphen bilden aus vielen perlenartigen Verknüpfungen bestehende Arthrosporen (normalerweise zehn oder mehr), und es werden oft Hohlräume zwischen den Sporen beobachtet.
Die Sporen sind oval oder weisen eine kurze zylindrische Form von (0,5-0,7) x (0,7-1,3) um auf und die Beobachtung durch das Transmissionselektronenmikroskop zeigt, daß die Sporen durch eine Hülle mit vielen langen stachligen Auswüchsen auf der Oberfläche bedeckt sind.
Das Substrat-Myzel oder die Lufthyphen bilden keine Sporangium-, Sclerotium- oder Flagellumsporen.

II. Färbung:

Gram-positiv und nicht-säurebeständig.

III. Zellkomponenten:

(1) Diaminopimellinsäure und Zucker

Diaminopimellinsäure des Mesotyps wird durch Analyse gemäß der Methode von Staneck et al. [Appl. Microbiol. 28: 226- 231 (1974)] nachgewiesen und die vom LL-Typ wird nicht nachgewiesen. Die Zuckeranalyse zeigt Arabinose und Galactose, aber keine Xylose. Somit gehört das Zuckermuster zum Typ A (Inter. J. System. Bacteriol. 20: 435-443 (1970)].

(2) Phospholipid:

Nach der Methode von Minnikin et al. [Inter. J. System Bacteriol. 27: 104-117 (1977)] wird Phosphatidylcholin nachgewiesen. Somit gehört der Phospholipid-Typ [Biochem. System. Ecol 5: 249-260 (1977)] zum P III-Typ.

(3) Mycolsäure:

Gemäß der Fettanalyse nach der Methode von Modarska et al. (J. Gen. Microbiol. 71: 77-86 (1972)] wird kein LCN-A nachgewiesen. Die Analyse nach der Methode von Minnikin et al. [J. Gen. Microbiol. 88: 200-204 (1975)] ergibt weder Nocardomycolsäure noch Mycolsäure.

(4) Menachinon:

Gemäß der Analyse nach der Methode von Collins et al. (J. Appl. Bacteriol. 48: 277-282 (1980)] wird hauptsächlich aus MK-9(H&sub4;) und MK-10(H&sub4;) zusammengesetztes Menachinon (MK) nachgewiesen.

IV. Eigenschaften bei der Züchtung:

Die Züchtung wird in verschiedenen Kulturmedien bei 30ºC 20 Tage ausgeführt und die Beobachtungsergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Farbangaben sind in Übereinstimmung mit "Color Harmony Manual", vierte Ausgabe, 1958 (Container Corporation of America). Tabelle 2 Eigenschaften bei der Züchtung auf verschiedenen Kulturmedien L53-18-Stamm Kulturmedien Wachstum Substrat-Myzel Lufthyphen Lösliches Pigment Saccharose-Nitrat-Agar Glucose-Asparagin-Agar Glycerin-Asparagin-Agar Anorganische-Salze-Stärke-Agar Tyrosin-Agar Hafermehl-Agar Hefeextract-Malzextrakt-Agar Nähragar Glycerinnitrat-Agar Bennett's-Agar Emerson's-Agar Hickey- und Tresners-Agar gut schlecht gut bis mittelmäßig mittelmäßig kupferbraun (5 pi) farblos oder weiß (2ca) zimtfarbig (3 le) eichenbraun (4 pi) schwach gelbbraun (4 gc) schwach weizenfarbig (2ea) gut; pulvrig, schwach rehbraun (4ge) bis hellbraun (4ec) keine gut oder mittelmäßig; pulvrig, schwach rehbraun (4ge) bis hellbraun (4ec) gut oder mittelmäßig; schwach rehbraun (4ge) bis hellbraun (4ec) gut, pulvrig, schwach rehbraun (4ge) bis hellbraun (4ec) schwach; weiß(a) bis perlmutt (3ba) dunkles gelbbraun (4 pg) dunkles, schwaches gelbbraun (4pg) farblos (4gc)

V. Physiologische Eigenschaften:

(1) Bereich der Züchtungstemperatur: 24-25ºC, am geeignetsten 28-35ºC.
(2) Gelatineverflüssigung: positiv
(3) Stärkehydrolyse: positiv
(4) Peptonisierung von Magermilch: positiv
Coagulation von Magermilch: unklar
(5) Herstellung von Melaninpigment:
Auf Tyrosin-Agar-Mediuin: negativ
Auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium: negativ
(6) Sauerstoffbedarf: aerobisch
(7) Herstellung von Schwefelwasserstoff: positiv
(8) Resistenz gegen Lysozyin: empfindlich [Inter. J. System. Bacteriol. 27, 176-178 (1977)]
(9) Resistenz gegen Natriumchlorid: Wachstum bei 0-10%, aber kein Wachstum bei 11% oder mehr. (ISP-Medium 2 wurde als Grundmedium verwendet).
(10) Resistenz gegen Antibiotika: wie in Tabelle 3 dargestellt. (nach J. Antibiot. 32: 180-186 (1976)] Tabelle 3 Antibiotika MIC (ug/ml) Kanamycin Gentamicin Paromomycin Streptomycin Neomycin Spectinomycin Rifampicin Leucomycin A5
(11) Auflösungsvermögen von verschiedenen Stoffen: Tabelle 4 Stoffe Auflösungsvermögen Tyrosin Casein Xanthin Hypoxanthin Cellulose Adenin Aesculin Keratin Elastin Harnstoff
[Nach Gray et al. Ecology of soil bacteria, S. 293-321, Liverpool University Press, 1967, J. Gen. Microbiol. 69: 33- 38 (1971) und J. Gen. Microbiol. 88: 75-85 (1975)]
(12) Verwertung von Kohlenstoffquellen;
(a) Zucker (ISP-Medium 9 wurde als Grundmedium verwendet) Tabelle 5 Zucker Verwertung L-Arabinose D-Fructose D-Galactose D-Glucose Gylcerin Inosit D-Mannit D-Mannose Melezitose Melibiose β-Lactose Maltose Raffinose L-Rhamnose D-Ribose Trehalose Saccharose L-Sorbose D-Sorbit Dulcit D-Xylose Salicin Cellobiose Stärke Adonit Erythrit α-Methyl-D-glycosid Cellulose
(b) Organische Säuren [gemäß J. Bacteriol. 73: 15-27 (1957)] Tabelle 6 Organische Säuren Verwertung Natriumacetat Natriumbenzoat Natriumbutyrat Natriumcitrat Natriumfumarat Natriummalat Natriumpropionat Natriumsuccinat Natriumtartrat Adipinsäure Natriumpyruvat Sebacinsäure
Wie vorstehend gezeigt, weist der Stamm L53-18 folgende Eigenschaften auf.
(1) Hinsichlich der Morphologie werden Lufthyphen erzeugt, die viele Sporenketten aus Substrat-Myzel mit Teilbarkeit bilden und keine Flagellum- oder Sporangiumsporen bilden.
(2) Hinsichtlich der Zellkomponenten ist die Diaminopimellinsäure vom Meso-Typ, das Zuckermuster* vom A-Typ, Phospholipid** vom PIII-Typ, Nocardomycolsäure oder Mycolsäure ist nicht enthalten und Menachinon (MK) ist hauptsächlich aus MK-9(H&sub4;) und MK-10(H&sub4;) zusammengesetzt.
* Klassifizierung nach Lechevalie et al [Inter. J. System, Bacteriol., 20: 435-443 (1970)].
** Klassifizierung nach Lechevalie et al [Biochem. System. Ecol., 5: 249-260 (1977)].
Somit gehört der Stamm L53-L18 zu der Gattung Saccharopolyspora Lacey und Goodfellow und wird als Saccharopolyspora sp. L53-18 [bezogen auf J. Gen. Microbiol. 88: 75-85 (1975)] bezeichnet. Dieser Stamm ist als FERM BP-2231 bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum L53-18A wird in der folgenden Weise nach einem Verfahren zur Herstellung von Antibiotika erhalten. Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus, die die Fähigkeit zur Erzeugung des Antibiotikums L53- 18A in einem sammelbaren Menge aufweisen, werden in einem für die Züchtung von Mikroorganismen verwendete Komponenten enthaltenden Kulturmedium aerob gezüchtet. Die Züchtung wird gewöhnlicherweise in einem flüssigen Medium durchgeführt. Ein belüftetes submerses Züchtungsverfahren ist industriell vorteilhaft. Das vorstehende Antibiotikum wird in der Kulturbrühe erzeugt und angereichert und das Antibiotikum wird aus der Kulturbrühe gesammelt.
Als Nährstoffe für das Kulturmedium können solche im großen Umfang verwendet werden, die gewöhnlicherweise für die Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Beispielsweise werden Glucose, Dextrin, Saccharose, Stärke, Fructose, Maltose, Endmelasse, fette Öle und organische Säuren als Kohlenstoffquellen verwendet und Sojabohnenpulver, Baumwollsamenpulver, Kornquellflüssigkeit, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff werden als Stickstoffquellen verwendet. Ferner, wenn benötigt, können Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Eisen(II)-sulfat, Kupfer(II)-sulfat, Zinksulfat und Cobaltchlorid, und Schwermetallsalze, Vitamine, Antischäumungsmittel und Aminosäuren zugegeben werden.
Die Züchtungsbedingungen können gegebenenfalls, solange der Stamm wachsen und das Antibiotikum erzeugen kann, variiert werden. Beispielsweise beträgt die Züchtungstemperatur 24- 25ºC, bevorzugt 28-35ºC, der pH-Wert beträgt 5,0-9,5, insbesondere etwa 7,0, und die Züchtungsdauer beträgt 2-8 Tage, normalerweise 4-7 Tage.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum L53-18A ist basisch und in organischen Lösungsmitteln löslich und ist hauptsächlich im Filtrat vorhanden, und somit umfaßt eine Ausführungsform der Isolierung und Gewinnung des Antibiotikums L53-18A aus der Kultur zuerst das Unterwerfen der Kulturbrühe einer Filtration und einer zentrifugalen Trennung, um den Myzelkuchen zu entfernen, die Extraktion des resultierenden Filtrats mit einem nicht-wasserlöslichen Lösungsmittel bei einem pH-Wert im alkalischen Milieu und die Konzentrierung des Extrakts zum Erhalt eines Roh-Antibiotikums. Die für die Extraktion verwendeten nicht-wasserlöslichen Lösungsmittel beinhalten beispielsweise Ethylacetat, Butylacetat, Butanol und Chloroform. Ferner kann der zu extrahierende Stoff an synthetische Adsorptionsmittel adsorbiert werden, beispielsweise Harze, wie DIAION HP-20, anschließend mit Wasser enthaltendem Alkohol oder dergleichen eluiert werden und zum Erhalt des Roh-Antibiotikums konzentriert werden. Für die weitere Reinigung ist eine Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel, aktiviertem Aluminiumoxid, etc. geeignet. Als Lösungsmittel für die Elution werden Chloroform, Ethylacetat, Benzol, Methanol, Aceton, Ammoniakwasser und dergleichen einzeln oder in Kombination verwendet.
Da L53-18A eine antibakterielle Wirkung aufweist, kann ein entsprechender Test durch Messung der antibakteriellen Wirkung in einem biologischen Test mit geeigneten Testbakterien, wie für gängige Antibiotika verwendete Sarcina lutea, und durch Ausführung einer quantitativen Bestimmung durchgeführt werden.
Wenn nötig, kann das erfindungsgemäße Antibiotikum in Form von pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Salzen, beispielsweise Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure und Schwefelsäure, und mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure, verwendet werden.
Die nachfolgenden, nicht-einschränkenden Beispiele erläutern weiter die vorliegende Erfindung. "%" bedeutet in diesen Beispielen bezogen auf das Gewicht, außer anders aufgeführt.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, das 1,0% Glucose, 1,0% Dextrin, 0,5% Caseinhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt und 0,1% Calciumcarbonat enthält, wurde als Züchtungsmedium verwendet. Ein Kulturmedium, das 2,5% Dextrin, 1,2% Ebios, 2,0% Kornquellflüssigkeit, 0,1% Natriumbromid und 0,001% Cobaltchlorid enthält, wurde als Herstellungsmedium verwendet. Beide Medien wurden vor der Sterilisierung auf einen pH von 6,5 eingestellt.
Saccharopoluspora sp. L53-18-Stamm (FERM BP 2231), der ausreichend in schrägstehendem Hafermehl-Agar wachsen gelassen wurde, wurde in zwei 500 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die 100 ml des vorstehenden Züchtungsmediums, das sterilisiert worden ist, enthielten, und diese Kolben wurden bei 28ºC 3 Tage geschüttelt. Diese wurden als die ersten Zuchtungskulturen bezeichnet. Anschließend wurden 200 ml der ersten Züchtungkultur in einen 30 Liter-Glas-Fermenter inokuliert, der 20 Liter sterilisiertes Züchtungsmedium enthielt. Die Züchtung wurde bei 28ºC 2 Tage unter Belüftung (20 l/min) und Schütteln (200 UpM) durchgeführt.
Die resultierende Kulturbrühe wurde als zweite Züchtungskultur bezeichnet.
Danach wurde die zweite Züchtungskultur in einen 250 Liter- Züchtungsbehälter inokuliert, der 200 Liter des sterilisierten Herstellungsmediums enthielt. Die Fermentation wurde bei 28ºC 4 Tage unter Belüftung (160 l/min) und Schütteln (150 UpM) durchgeführt.
Nach Beendigung der Züchtung wurde eine Filtration unter Verwendung von Diatomeenerde zum Erhalt von 200 Liter Kulturfiltrat durchgeführt. Die Produktionsmenge von L53-18A betrug in diesem Fall etwa 10 ug/ml nach den unter Verwendung von Sarcina lutea ATCC 9341 als Testbakterium durchgeführten biologischen Test.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 erhaltene Filtrat (220 Liter) wurde mit Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt und wurde einer Extraktion mit 120 Litern Ethylacetat zum Erhalt von 100 Liter das gewünschte Produkt enthaltender Ethylacetatlösung unterworfen. Anschließend wurden 70 Liter Wasser zu dem Extrakt zugegeben und die Extraktion wurde durch Einstellung des pH auf 4,5 mit Salzsäure zur Überführung und Lösung des Extrakts in einer wäßrigen Schicht ausgeführt. Diese wäßrige Schicht wurde mit Ammoniakwasser auf pH 8,0 eingestellt und anschließend mit 30 Liter Chloroform zur Überführung und Lösung des gewünschten Produkts in die Chloroformschicht extrahiert. Die Chloroformschicht wurde unter vermindertem Druck zum Erhalt von etwa 50 g einer gelbbraunen Rohmasse extrahiert.
Die resultierende Masse wurde in einer kleinen Menge Ethylacetat gelöst und die Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (1,5 Liter), die zuvor mit Ethylacetat gefüllt wurde, aufgebracht, mit 3 Litern Ethylacetat gewaschen und danach mit einem Gemisch aus Ethylacetat-Methanol-Ammoniakwasser (10:0,5:0,1) eluiert und jeweils in 400 ml fraktioniert. Die Fraktionen Nrn. 24-35 wurden gesammelt, unter vermindertem Druck konzentriert, anschließend auf eine Kieselgelsäule (250 ml), die mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol-Ammoniakwasser (10:0,2:0,02) gefüllt wurde, aufgebracht und mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol-Ammoniakwasser (10:0,3:0,03) eluiert. Das gewünschte Produkt wurde durch die mit Sarcina lutea ATCC 9341 gemessene antibakterielle Wirkung und durch Kieselgeldünnschichtchromatographie mit einer Chloroform-Methanol-Ammoniakwasser (10:0,5:0,05)-Entwicklerlösung bestätigt, und nur L53-18A enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck bis zur Trockene zum Erhalt von 620 mg weißem Pulver von L53-18A konzentriert.

Beispiel 3

0,05M wäßrige Zitronensäurelösung wurde zu 50 mg des in Beispiel 2 erhaltenen weißen Pulvers zugegeben, um das Pulver zu lösen, und die Lösung wurde auf pH 7,0 eingestellt und zum Erhalt eines weißen Pulvers des Citrats des erfindungsgemäßen Antibiotikums L53-18A lyophilisiert. Das in Beispiel 2 erhaltene weiße Pulver wurde in wäßriger Salzsäure mit pH 4,0 gelöst und die Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und zum Erhalt eines weißen Pulvers des Hydrochlorids des erfindungsgemäßen Antibiotikums L53-18A lyophilisiert.
Das neue Antibiotikum L53-18A oder dessen pharmazeutisch verträgliches Salz zeigt gegen Gram-positive Bakterien eine antibakterielle Wirkung, und somit kann dieses formulierte Antibiotikum oder Salz als Antibiotikum für die Behandlung von bakteriellen Infektionen durch orale oder parenterale Verabreichung bei Menschen, Haustieren und Geflügel wie gängige Antibiotika verwendet werden.

Claims

1. Antibiotikum L 53-18A, erhältlich von Saccharopolyspora sp. (FERM 2231) oder einer Mutante oder Variante, oder eines seiner pharmazeutisch verträglichen Salze mit den folgenden Eigenschaften:

Elementaranalysen (%):

C = 62,51 ± 1,0, H = 9,38 ± 1,0, N = 1,69 ± 1,0

Molekulargewicht: 714(M+H)&spplus; (FAB-MS Methode)

Summenformel: C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub3;NO&sub1;&sub2;

UV-Absorptionsspektrum: Maximale Absorption bei 276 ± 2 nm in methanolischer Lösung

IR-Absorptionsspektrum: Absorptionsspektrum nach der Kaliumbromid-Tablettenmethode bei 3430, 1735, 1690, 1615, 1455, 1370, 1160, 1070 und 1040 cm&supmin;¹

Löslichkeit in Lösungsmitteln: Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Benzol und saurem Wasser

Farbreaktion: Positiv gegenüber Kaliumpermanganat- Reaktion, Iodlösung, Reaktion mit konzentrierter Schwefelsäure, Molisch's-Reaktion und Dragendorff-Reaktion und negativ gegenüber Ninhydrin- Reaktion, Sakaguchi's-Reaktion und Eisen-III-Chlorid-Reaktion

Basisch, sauer oder neutral: Basisch

Farbe: Weiß

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums L 53-18A nach Anspruch 1, bei dem man einen das Antibiotikum L 53-18A produzierenden Mikroorganismus, der zur Gattung Saccharopolyspora gehört, kultiviert und danach das Antibiotikum L 53-18A von der Kultur sammelt.

3 Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der das Antibiotikum L 53- 18A produzierende Mikroorganismus der Gattung Saccharopolyspora Saccharopolyspora sp. L 53-18 (FERM BP-2231) oder eine Mutante oder eine Variante des Mikroorganismus ist, die das Antibiotikum L 53-18A in einer sammelbaren Menge bilden kann.