CH658861A5

CH658861A5 - Antibiotikum acmimycin und verfahren zu seiner herstellung.

Info

Publication number: CH658861A5
Application number: CH4911/83A
Authority: CH
Inventors: Hideo Sakakibara; Masashi Awata; Shuzo Satoi; Naoki Mutoh; Masaki Takada; Mitsuo Hayashi
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1982-09-09
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1986-12-15
Also published as: GB8324134D0; GB2127019B; JPS5945890A; US4517296A; FR2532950B1; DE3332593A1; GB2127019A; FR2532950A1; JPH0133105B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das neue Antibiotikum Acmimycin und dessen Säureadditionssalze, sowie auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, wie in Patentanspruch 1 bzw. 2 definiert.

Das neue antibiotische Acmimycin ist wirksam gegen grampositive und gramnegative Bakterien.

Ein das Antibiotikum Acmimycin erzeugender Mikroorganismus gehört zur Gattung Streptomyces, und ein bevor-5 zugter Stamm ist der Stamm Streptomyces AC4559.

Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes AC4559 sind die folgenden:

(a) Morphologische Eigenschaften:

Die Beobachtungen auf Stärke- anorganisches Salz -10 Agarmedium (ISP-Medium 4) [Int. J. System. Bacteriol., 16, 313-340 (1966)], welches bei 27 °C während 10 bis 14 Tagen gezüchtet wurde, waren wie unten beschrieben. Annähernd dieselben morphologischen Beobachtungen wurden auf Ha-fermehl-Agarmedium (ISP-Medium 3) und Benett-Agarme-15 dium erhalten.

Die Substratmycelien sind gebogen (flexuous) mit verzweigtem Wachstum, Durchmesser 0,4 x 0,5 ji. Keine Trennung von Mycelien und Sporen. Die auf den Substratmycelien gewachsenen Luftmycelien sind gebogen, (spiralig?) und 20 mit einfacher Verzweigung gewachsen, Durchmesser 0,4 x 0,6 (I und bilden viele verkettete Sporen. Die verketteten Sporen sind spiralig mit lockeren (loosely) zwei bis vier Windungen (rounds). Die Sporenoberfläche ist glatt, die Sporen sind in Form von kurzen Stäben oder oval, und die Grösse beträgt 25 0,4 bis 0,6 x 0,6 bis 1,0 |i.

Keine Bildung von flagellaren Sporen und Spronagien.

(b) Wachstum auf verschiedenen Medien:

Die Beobachtungen erfolgten bei 27 °C während 14 Tagen Züchtung auf verschiedenen Medien und sind in Tabelle I zu-30 sammengestellt.

Tabelle I Medium

Wachstum

Saccharose-Nitrat-Agar wenig bis weiss

Glucose-Asparagin-Agar wenig bis schwach

Glycerin-Asparagin-Agar wenig bis schwach

Stärke- anorganisches Salz-Agar

Tyrosin-Agar

Hafermehl-Agar

Nähr-Agar

Emerson-Agar Bennett-Agar gut mässig bis schwach mässig schwach gut gut

Substrat-Mycelien farblos hell-elfenbein (2ca) bis hell-weizenfarbig (2ea)

farblos bis hell-elfenbei (2ca)

bambusfarbig (2fb)

Luft-Mycelien lösliches Pigment wenig oder schwach: kein staubig aqua (18ge~ 18ig)

wenig: hell-aqua (18ec) kein kein gut; staubig-acqua (18ig)

hell-bernsteinfarbig (3ic) klein: weiss (a)

hell-elfenbein (2ca) bis hell-weizenfarbig (2ea)

mais (2hb)

topas (3ne)

mässig; (18ig-staubig-aqua 18ge)

kein kein kein kein kein kein schwach: weisse (a) kein mässig: (18ig-staubigl8ge) kein

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Die Farbangaben erfolgen aufgrund der Klassifizierung (c) Physiologische Eigenschaften:

des «Color Harmony Manual», vierte Ausgabe, 1958 (Con- 1) Wachstumstemperatur: 16 bis 33 °C,

tainer Corp. of America). 2) Verflüssigung von Gelatine: positiv,

3

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3) Stärkehydrolyse: positiv,

4) Koagulierung von Magermilch: negativ, Peptonisierung von Magermilch: positiv,

5) Bildung von melaninartigem Pigment:

negativ auf Tyrosin-Agarmedium und Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agarmedium.

(d) Assimilierung von Kohlenstoffquellen:

(+: positiv, — : negativ)

L-Arabinose: —

D-Fructose: —

D-Glucose: +

Saccharose: —

Inosit: —

D-Mannit: —

Raffinose: —

L-Rhamnose: —

X-Xylose: +

(e) Zusammensetzung der Zellwände:

Der LL-Typus von Diaminopimelinsäure wurde nach der Methode von Becker et al. [Appi. Microbiol., 12,421-423 (1964)] nachgewiesen.

Unter Berücksichtigung der oben angeführten taxonimi-schen Eigenschaften wurde der Stamm AC4559 als ein Stamm identifiziert, welcher zur Gattung Streptomyces gehört aufgrund der Bildung von Luftmycelien mit Ketten von zahlreichen Sporen aus echten Substratmycelien, mit LL-Typus Diaminopimelinsäure und einem Fehlen der Bildung von Flagellensporen und Sporangien. Der Stamm AC4559 wird daher als Streptomyces sp. AC4559 bezeichnet, und wurde am 24. Juli 1982 im Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Ytabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305, Japan, unter der Nummer FRi P-6645 hinterlegt.

Die taxonomischen Eigenschaften von Streptomyces ändern sich im allgemeinen leicht, und die durch natürliche oder übliche künstliche Mutationen, z.B. UV-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung oder Behandlung mit Mutagenen, wie N-Me-thyl-N-nitrosoguanidin oder Äthylmethansulfonat, erhaltenen Mutanten können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Eine Ausführungsform des Verfahrens zur Erzeugung des Antibiotikums Acmimycin wird wie folgt beschrieben:

Ein das Antibiotikum Acmimycin erzeugender Stamm, welcher zur Gattung Streptomyces gehört wird in einem geeigneten Medium gezüchtet.

Ein bevorzugtes Medium ist ein übliches Medium für Streptomyces. In einem solchen Medium werden assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und, falls erwünscht, anorganische Salze verwendet. Beispiele für assimilierbare Kohlenstoffquellen sind Glukose, Fructose, Gallaktose, Mannose, Glycerin, Melassen, Stärke, Dextrin oder organische Säuren. Beispiele von assimilierbaren Stickstoffquellen sind organische Stickstoffverbindungen, wie Pharmame-dien, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Soyabohnenpulver, Maiseinweichflüssigkeit, Baumwollsamen-Presskuchen, Kasein, Soyabohnenprotein-Hydrolysat, Aminosäuren, und Harnstoff, oder anorganische Stickstoffverbindungen, wie Nitrate, oder Ammoniumverbindungen, zusammen oder einzeln. Falls erforderlich können anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze oder Phosphate zugesetzt werden. Ferner können Spurenelemente oder Wachstumsstimulantien zugesetzt werden.

Die Züchtung kann im allgemeinen unter Schütteln oder in einer belüfteten bewegten Kultur erfolgen. In einer industriellen Produktion ist eine submerse belüftete Kultur bevorzugt. Der pH des Mediums ist vorzugsweise neutral oder leicht sauer. Die Temperatur während der Züchtung beträgt vorzugsweise 22 bis 32 C. Die Dauer der Züchtung beträgt im allgemeinen 2 bis 5 Tage, wobei die Züchtung unterbrochen werden kann, wenn die maximale Erzeugung des Antibiotikums erreicht ist. Die obige Zusammensetzung, der pH, die Bewegungsgeschwindigkeiten und das Belüftungsvolumen sollten selbstverständlich nach der Natur, der Art und den Bedingungen des verwendeten Mikroorganismus-Stam-mes ausgewählt und reguliert werden.

Ein Schaumverhütungsmittel, wie Silikonöl, Pflanzenöl oder oberflächenaktives Mittel, kann zugesetzt werden, falls erforderlich.

Das angesammelte Antibiotikum ist zur Hauptsache in der Kulturbrühe vorhanden und kann vorzugsweise aus dem Kulturfiltrat isoliert werden, welches durch Filtrieren der Kulturbrühe mit Hilfe von «Celite», «Parlite», «Hyflo-super-cel» (Markennamen von Diatomeenerde) oder durch Zentri-fugieren erhalten wird.

Die Isolierung des vorliegenden Antibiotikums kann durch Anwendung des Aminoglycosid-Antibiotikum-Isolier-verfahrens aus dem Kulturfiltrat erfolgen. Beispielsweise kann Chromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes oder eines anderen Absorbenten eingesetzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Kulturfiltrat auf ein pH von 7 eingestellt und der Chromatographie unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes, wie «Amberlite IRC-50» oder CG-50 (Marke) insbesondere des Ammonium-Typs davon, Ionenaustauscherzellulose, wie CM-Zellulose, oder eines «Sepha-dex»-Ionenaustauschers, wie «CM-Sephadex» (Markenname) unterworfen. Das adsorbierte Antibiotikum wird mit einem schwach-basischen Eluierungsmittel, wie verdünnter wässeriger Ammoniumhydroxidlösung, gegebenenfalls unter Veränderung der Konzentration davon, eluiert.

Die erhaltenen eluierten Fraktionen, welche die identische Zusammensetzung enthalten, werden vereint, konzentriert und lyophilisiert, um das Antibiotikum Acmimycin zu erhalten.

Eine weitere Reinigung kann durch Wiederholung der obigen chromatographischen Verfahren erfolgen.

Da das Antibiotikum Acmimycin ein basisches Antibiotikum ist, kann es in Form seiner Säureadditionssalze erhalten werden. Beispiele derartiger Salze sind pharmakologisch annehmbare, nicht-toxische Salze, wie z.B. anorganische Salze, wie das Hydrochlorid, Sulfat oder Phosphat, oder organische Salze, wie das Acetat, Propionat, Malat, Succinat, Tartrat, Citrat, L-Glutamat oder L-Aspartat.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die biologischen Eigenschaften sind die folgenden:

I. Physikalisch-chemische Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse: (C^Hi^NiC^ • V2H2O):

gefunden: C 48,36%, H 7,32%, N7,86%

berechnet: C 48,26%, H 7,77%, N7,51%

(2) Molekulargewicht: 346 (aus Ionenspitze des Massenspektrums).

(3) Schmelzpunkt: 123 °C (Zersetzung).

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(4) Spezifische Drehung: [a] ^ = + 44,2° (c = 1, H20).

(5) UV-Spektrum: in H20, eine spezifische maximale Absorptionsspitze bei 220 bis 360 nm, Endabsorption.

(6) IR-Spektrum (KBr): Fig. 1,3400,2900,1675,1455, 1350,1235,1060 cm-1.

(7) NMR-Spektrum (I3C, in DiO, 24 MHz, innerer Standard: Dioxan): 150,5,103,3,95,3, 89,4,71,6, 70,2,66,8, 66,2, 62,0,60,7,59,4, 56,1,31,5,21,7 ppm.

(8) NMR-Spektrum ('H, in D20,100 MHz, innerer Standard: DSS): Fig. 2.

(9) Löslichkeit: löslich in Wasser, schwach-löslich in nie5

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25

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deren Alkoholen, wie Methanol, unlöslich in Aceton, Benzol und Äthylacetat.

(10) Farbreaktion: positiv: Ninhydrinreaktion und Entfärbung von Kaliumpermanganatreaktion, negativ: Elson-Morgan-Reaktion und Sakaguchi-Reaktion.

(11) Natur: basisch.

(12) Farbe: blass-gelb.

(13) Silikagel-Dünnschichtchromatographie (Merck, Art. 5735):

Rf = 0,73 [Chloroform-Methanol-14% wässeriges Ammoniumhydroxid (1:2:1)]

Rf = 0,77 [Chloroform-Methanol- 28% wässeriges Ammoniumhydroxid (2:3:2)].

Unter den bekannten Antibiotika gleicht Acmimycin dem Actinospectacin (Spectinomycin) [Antibiot. & Chemoth., 11, 118-122 (1961), japanische Auslegeschrift No. 39-2993, ungeprüfte japanische Offenlegungsschrift No. 48-18489]. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist Acimycin ein neues Antibiotikum. Seine Strukturformel wird wie folgt vorgeschlagen:

H3CHN.

NHCH

OCH,

II. Biologische Eigenschaften:

(1) Antibakterielles Spektrum:

Die minimale hemmende Konzentration (MIC) (ng/ml) des Antibiotikums Acmimycin nach der Agar-Verdünnungs-methode ist in Tabelle II zusammengestellt:

Salm, enteritidis Gaertner Shigella sonnei E 33 Proteus morganii 0239 Proteus rettgeri ACR s Enterobac. aerogenes 0655 Emterobac. cloacae GN 336 Serratia maroescens Pseudo. aeruginosa I AM 1095

25 25 >100 100 >100 50 25 >100

Tabelle II

Testorganismus

Staph. aureus ATCC 6538P

Staph. aureus MS 27

Staph. aureus 0119

Staph. epidermidis sp-al-1

Strept. pyogenes N.Y.5

Bacillus subtilis ATCC 6633

E. coli NIHJ-JC2

E. coli W 3630

E. coli W 3630 RGN 14

Cit. freundii GN 346

Kleb, pneumoniae ATCC 10031

MIC 100 100 >100 50 3,1 25 50 25 >100 >100 12,5

io In den beiliegenden Zeichnungen stellt:

Fig. 1 das IR-Spektrum des Antibiotikums Acmimycin, und

Fig. 2 das NMR-Spektrum ('H) des Antibiotikums Acmimycin dar.

ls Das folgende Beispiel illustriert die vorliegende Erfindung.

Beispiel

Ein Medium (pH 7,100 ml x 10 Kolben), welches 1% 20 Glukose, 1% Dextran, 0,5% Kaseinhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt und 0,1 % Calciumcarbonat in einem 500 ml -Erlenmeyer-Kolben enthielt, wurde bei 120 °C während 20 Minuten sterilisiert. Eine Oese voll Streptomyces sp. AC4559 FERM P-6645 wurde in jeden Kolben geimpft und diese Kol-25 ben bei 30 °C während 72 Stunden kultiviert, um eine Impfkultur zu erhalten.

Ein flüssiges Medium (pH 7,0,20 Liter), welches 5% Dextrin, 0,5% Glukose, 3% Soyabohnenpulver, 0,5% Calciumcarbonat und 1,3 ppm Kobaltchlorid enthielt, wurde in einem 30 30 Liter-Fermentiergefäss der Dampfsterilisierung unterworfen.

Impfkultur (1 Liter) wurde dazugegeben und das Gemisch unter Rühren bei 30 °C während 96 Stunden mit 200 Touren pro Minute und einer Belüftung von 15 Liter/Minute kulti-35 viert, um die Kulturbrühe (19 Liter) zu erhalten.

Das Kulturfiltrat wurde auf eine Säule aus «Amberlite IRC-50» (Rohm & Haas Co., Marke) vom Ammoniumtypus (1 Liter) gegeben, mit Wasser gewaschen und mit 2N wässerigem Ammoniumhydroxid (3 Liter) eluiert. Das ganze Eluat *o wurde im Vakuum auf 10 ml konzentriert, auf pH 7,0 eingestellt und auf eine Säule aus «CM-Sephadex» (200 ml, Pharmacia Fine Chemicals, Ammonium-Typus) gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und durch Eluierung mit linearen Gradienten von 0 bis 0,1N wässerigem Ammonium-« hydroxid (2 Liter) eluiert. Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktio-nen fraktioniert und mit Silicagel-Dünnschichtchromatogra-phie (Merck, Art. 5735) unter Verwendung von Chloroform-Methanol- 14% wässerigem Ammoniumhydroxid (1:2:1) geprüft, um das Antibiotikum Acmimycin durch Ninhydrinfar-50 bung festzustellen. Die Fraktionen No. 35 bis 45, welche Acmimycin enthielten, wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, um das Antibiotikum Acmimycin (100 mg) zu ergeben.

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotikum Acmimycin der Formel:

HjCHN

NHCH

OCH,

und dessen Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Acmimycin und dessen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Acmimycin erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört, züchtet, bis das Antibiotikum gebildet ist und das Antibiotikum Acmimycin aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz umwandelt.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Acmimycin erzeugende Mikroorganismus Streptomyces sp. AC4559 FRI P-6645 ist.