CH656622A5 - Aminoglycosid-antibiotika saccharocine und deren herstellung. - Google Patents
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Description
656 622
2
PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotisches Saccharocin bzw. 3'-Oxysaccharocin der Formel I:
hoh2c ch3hn
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Amino-glycosid-Antibiotika Saccharocine und deren Herstellung. Die neuen Verbindungen und das Verfahren zu ihrer Herstellung sind in den Patentansprüchen 1 und 2 definiert.
Die antibiotischen Saccharocine entsprechen der Formel I:
in welcher R Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe ist, sowie deren Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung von antibiotischem Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin der Formel I gemäss Patentanspruch 1 oder Salzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Saccharo-polyspora gehört, in einem Medium züchtet, das antibiotisches Saccharocin und 3'-Oxysaccharocin aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls diese Antibiotika in deren Säureadditionssalze umwandelt.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der antibiotisches Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugende Mikroorganismus Saccharo-polyspora sp. AC 3440 FERM-P No. 6238 ist.
in welcher R Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe bedeutet, und im vorliegenden Patent wird ein Antibiotikum, in wel-
20chem R Wasserstoff bedeutet, als Saccharocin bezeichnet, und ein Antibiotikum, in welchem R die Hydroxylgruppe ist, als 3'-Oxysaccharocin bezeichnet, und beide Antibiotika werden allgemein als Saccharocine bezeichnet. Die obigen antibiotischen Saccharocine werden erzeugt durch Züchten eines antibiotisches Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Saccharo-polyspora gehört, z.B. Saccharopolyspora sp. AC 3440 FERM-P No. 6238.
30 Die physico-chemischen Eigenschaften der antibiotischen Saccarocine sind die folgenden:
Schmelzpunkt: optische Drehung:
Elementaranalyse:
berechnet:
gefunden:
Molekulargewicht:
(Felddesorptions-
Massenspektrum)
UV-Spektrum
IR-Spektrum: (KBr-Tablette)
Saccharocin
188-190°C(Zers.) [a]24D+163° (C = 1,0, H2O)
[C2,H«N40i2-2H20] C% H % N % 43,74 7,69 9,72 43,35 7,46 9,74
540
Endabsorption 220-360 nm in H20 Fig. 1, Absorptionsbanden bei 3350,2900, 1585,1460,1380, 1140,1090,990 cm-1
3'-Oxysaccharocin
über 230°C (Zers.)
[a] g +162°
(C = 0,25, H20) [C21H40N4O13-2H2O] C% H % N % 42,56 7,48 9,45 42,07 7,12 9,03
556
Endabsorption 220-360 nm in H20 Fig. 3, Absorptionsbanden bei 3350,2900, 1585,1460,1390, 1345,1040,1000 cm"1
1H-NMR(D20,100 MHz,
innerer Standard Fig. 2
13C-NMR: No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Fig. 4
DSS:
ppm
No.
ppm
101,4
1
102,6
96,5
2
97,0
95,1
3
95,9
87,6
4
88,4
78,1
5
78,4
76,7
6
76,9
73,5
7
74,5
73,4
8
74,1
71,4
9
73,8
71,0
10
72,4
70,2
11
72,0
3
656 622
(Fortsetzung) 'H-NMR(D20,100 MHz, innerer Standard l3C-NMR:
Fig. 2
Fig. 4
DSS:
No.
ppm
No.
ppm
12
67,9
12
71,1
13
67,4
13
70,4
(Dioxan)
14
66,4
14
67,4
(Dioxan)
15
62,3
15
66,6
16
61,3
16
62,3
17
51,1
17
61,8
18
50,2
18
56,7
19
49,8
19
51,3
20
36,3
20
50,1
21
33,0
21
36,8
22
32,7
22
32,2
Farbreaktionen:
Ninhydrin:
Entfärbung von
KMn04:
Elson-Morgan:
Sakaguchi:
Farbe
Natur:
positiv positiv negativ negativ weisses Pulver basisch
20
Dünnschichtchromatographie:
Träger: Silicagel, Merck Art. 5735; Entwickler: Chloroform-Methanol-
Rf = 0,32 Entwickler: Chloroform-Methanol -
Rf = 0,26 Löslichkeit: löslich in Wasser unlöslich in Aceton Benzol, Äthylacetat positiv positiv negativ negativ weisses Pulver basisch
28% wässeriger Ammoniak (2:3:2) Rf = 0,24 14% wässriger Ammoniak (1:2:1) 35 Rf = 0,17 löslich in Wasser unlöslich in Aceton Benzol, Äthylacetat
40
MIC (ng/ml)
Gemäss den obigen physico-chemischen Eigenschaften wurden Saccharocin und 3'-Oxysaccharocin nie in den früher veröffentlichten Daten gefunden und werden daher als neue Antibiotika Saccharocin und 3'-Oxysaccharocin bezeichnet.
Die minimale hemmende Konzentration (MIC) von Saccharocin und 3'-Oxysaccharocin nach der Agar-Verdün-nungsmethode bestimmt, ist aus der folgenden Tabelle I ersichtlich.
Tabelle I MIC (|xg/ml)
Saccha
3'-Oxy-saccha-
Testorganismus rocin rocin
Salmonella enteritidis gaertner
6,3
12,5
Shigella sonnei E33
6,3
25
Proteus morganii 0239
6,3
12,5
Proteus rettgeri ACR
3,1
12,5
Enterobacter aerogenes 055
6,3
12,5
Enterobacter cloacae GN336
6,3
12,6
Serratia marcescens
6,3
12,5
Pseudomonas aeruginosa
25
50
Pseudomonas aeruginosa ML4561
25
50
Pseudomonas aeruginosa ML4561
Rm3166
12,5
25
Pseudomonas aeruginosa ML4561
Rm3164-1
25
50
Pseudomonas aeruginosa ML4561
RP4
12,5
50
Pseudomonas aeruginosa 1946 > 100
>50
Pseudomonas aeruginosa 2512
50
50
Pseudomonas putida 1842
25
50
Pseudomonas martifiriae 1850 > 100
>50
45
50
Saccha
3'-Oxy-saccha-
Testorganismus rocin rocin
Staphylococcus aureus ATCC
6538P
12,5
25
Staphylococcus aureus MS27
12,5
25
Staphylococcus aureus 0119
6,3
12,5
Staphylococcus epidermidis
ap-al-1
6,3
12,5
Streptococcus pyogenes N.Y. 5
25
50
Bacillus subtilis ATCC 6633
0,8
3,1
Escherichia coli NIHJ-JC2
6,3
12,5
Escherichia coli W3630
1,6
3,1
Escherichia coli W33630RGN14
3,1
12,5
Citrobacter freundie GN346
6,3
12,5
Klebsiella pneumoniae ATCC
10 031
3,1
12,5
55
60
65
Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, weisen die Saccharocine antibakterielle Wirksamkeit gegen gram-negative Bakterien auf.
Die Saccharocine können auch in Form ihrer nicht-toxi-schen physiologisch annehmbaren Säureadditionssalze eingesetzt werden, z.B. Salze anorganischer oder organischer Säuren, wie Hydrochloride, Jodide, Sulfate, Phosphate, Carbonate, Acetate, Fumarate, Malate, Citrate, Mandelate, Succi-nate, Ascorbate, Aspartate oder Glutamate. Die Saccharocine oder deren nicht-toxischen Salze können zu injizierbaren Präparaten mit 20 bis 100 mg/Fläschchen oder 20 bis 100 mg/ Ampullen, sowie zu Ampullen mit 20 bis 100 mg/Ampulle verarbeitet werden. Die Saccharocine oder deren Salze können ferner für Geflügel, Kleintiere oder Fische verwendet werden oder als Futterzusatz. Obwohl die Saccharocine leicht in Wasser gelöst werden können, können sie in Form von Säureadditionssalzen hergestellt werden zur Behandlung von Tieren oder als Wachstumsstimulatoren für dieselben. Ein «Prodrug» der Saccharocine kann ebenfalls hergestellt werden für die Arzneimittelformulierung.
Ein Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugender Mikroorganismus, ein Actinomycetes-Stamm AC 3440, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche im Feld von Ato-ch, Ato-gun, Yamaguchi-ken, Japan gesammelt wurde, und dieser Stamm wurde identifiziert als ein Stamm, welcher
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zur Gattung Saccharopolyspora gehört. Dieser Stamm wurde als Saccharopolyspora sp. AC 3440 bezeichnet und im Fermentation Research Institute, Agency of Industriel Science and Technology, MITI, 1-3 Higashi 1-chôme, Yatabe-machi, Tsubuta-gun, Japan, unter der Nummer FERM-P No. 6238 am 4. Dezember 1981 hinterlegt.
Die taxonomischen Eigenschaften sind die folgenden:
1. Morphologische Eigenschaften:
Auf Stärke-anorganischem-Agar-Medium [ISP-Medium 4, Int. J. System. Bacteriol., 16,313 bis 340 (1966)] bei 37°C während 10 bis 14 Tagen kultiviert, ergab der Mikroorganismus folgende Eigenschaften:
Die Substrat-Mycelien waren wellenförmig oder gerade, verzweigtes Wachstum, Spaltung auf der Seite der Mycelien oder bei späteren Züchtungen, und Durchmesser 0,4 bis 0,6 (i.
Keine Sporenbildung.
Luft-Mycelien, gewachsen aus Substrat-Mycelien, sind wellenförmig oder gerade, einzelne Verzweigungen, Durchmesser 0,5 bis 0,7 n, Schleifen oder schwache zwei- bis dreimal gewundene Spiralen oder wellenförmig oder gerade an der Spitze (cusp).
Perlenartige Ketten (mehr als 10 Sporen) von Sporen, verzweigt aus Luft-Mycelien werden gebildet, und oft sind Teile zwischen den Sporen durch leere Mycelien getrennt.
Die Sporen sind elliptisch oder kurzzylindrisch, 0,5 bis 0,7 x 0,7 bis 1,3 p. und bedeckt durch einen Sporenüberzug mit viel büscheliger gerader oder wellenförmiger langer haariger Substanz.
5 Keine Bildung von Sporangien, Sclerotia- oder Flagella-Sporen auf den Substrat-Mycelien oder Luft-Mycelien.
2. Gram-Färbung: positiv Säureechtfärbung: negativ.
3. Mycelien-Zusammensetzung:
10 (a) Diaminopimelinsäure (DAP) vom Meso-Typus, analysiert nach der Methode von B. Becker et al. [Appi. Micro-biol., 12,421 bis 423 (1964)] wurde festgestellt.
Arabinose und Galactose, analysiert nach der Methode gemäss Lechevalier [J. Lab. Clin. Med., 71,934 bis 944 (1986)] wurden ebenfalls festgestellt.
(b) Lipidanalyse gemäss H. Mordarska et al. [J. Gen. Mi-crob., 71,77 bis 86 (1972)]: Es wurde kein Lipid LCN-A gefunden; und nach der Methode gemäss D.E. Minnikin et al.
20 [J. Gen. Microbiol., 88,200 bis 204 (1975)]: es wurde keine Nocardomycolsäure und keine Mycolsäure gefunden.
4. Züchtungsmerkmale:
Die Beobachtung auf verschiedenen Kulturmedien, welche bei 37°C während 14 Tagen bebrütet wurden, sind in Ta-
25 belle II zusammengestellt. Die Farbangabe erfolgte gemäss dem Color Harmony Manual, 4. Auflage, 1958 (Container Corp. America).
Tabelle!!
Medium
Wachstum
Farbe des Substratmycelius Luftmyceline lösliche Pigmente
Saccharose-Nitrat-Agar
bernstein (3pe) -
nicht gut oder bernstein (3pe) -
(Waksman-MediumNo. I)1
gut senfgold (2pe)
Spuren, weiss (a)
senfgold (2pe)
Glucose-Aspargin-Agar
hell-elfenbein (2ca) -
wenig:
(Waksman-Medium No. 2)
mässig farblos weiss (a)
keine
Glycerin-Aspargin-Agar mässig hell-weizen (2ea) -
nicht gut oder bernstein (3pe)
(ISP-Medium 5)2
gut mais (2hb)
mässig: weiss (a)
wenig
Stärke-anorganisches-
nicht gut oder
Salz-Agar gut bernstein (3pe) -
mässig:
keine
(ISP-Medum 4)
senfgold (2pe)
weiss (a)
Tyrosin-Agar
bernstein (3pe) -
mässig:
(ISP-Medium 7)
gut senfgold (2pe)
weiss (a)
keine
Hafermehl-Agar
hell-elfenbein (2ca) -
(ISP-Medium 3)
gut farblos keine keine
Hefeextrakt-Malzextrakt-
hell-elfenbein (2ca) -
wenig oder keine:
Agar
(Waksman-Medium No. 4)
mässig farblos weiss (a)
keine
Glycerin-Nitrat-Agar
mässig:
gold (21c)
(Waksman-MediumNo. 1)
gut mais (2hb)
weiss (a)
wenig
Benett-Agar
senfgold (3pe) -
wenig:
(Waksman-MediumNo. 30)
gut hell-gold (2pe)
weiss (a)
keine
Emason-Agar
bernstein (3pe) -
bernstein (3pe)
(Waksman-Medium No. 28)
gut senf (2pe)
wenig: weiss oder senfgold (2pe)
Hickey-Tresner-Agar
senfgold wenig
(Waksman-Medium No. 32)
gut
(2pe)
weiss (a)
keine
1) Waksman, S.A., «The Actinomycetes», Band 2,1961, Seiten 327 bis 334
2) Inter. J. System. Bacteriol., 16,313 bis 340 (1966).
5. Physiologische Eigenschaften:
Die Beobachung erfolgte auf einer vierzehntägigen bei 37°C bebrüteten Kultur, sofern nicht spezifisch etwas anderes vermerkt ist.
(a) Wachstumstemperatur: 22 bis 53 °C (optimale Wachstumstemperatur: 30 bis 45 °C) [ISP-Medium 2].
(b) Gelatineverflüssigung: positiv.
(c) Stärkehydrolyse: positiv.
(d) Magermilch-Peptonisierung: positiv, Koagulation: negativ.
(e) Bildung eines melaninartigen Pigmentes: negativ 60 [ISP-Medium 7 und 6].
(f) Natur: aerob.
(g) H->S-Bildung: positiv [bleiacetathaltiges Papier, ISP-Medium 6],
es (h) Nitratreduktion: negativ [J. Bacteriol., 73,15 bis 27 (1957)].
(i) Beständigkeit gegen Lysozym: nichtbeständig [J. Gen. Microbiol., 45,355 bis 364 (1961)].
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(j) Beständigkeit gegen Natriumehlorid: Wachstum: 0 bis 10%; kein Wachstum: über 11%.
(k) Beständigkeit gegen Antibiotika: [J. Antibiot., 32,180 bis 186 (1979)].
Antibiotika
Kanamycin
Gentamycin
Paromomycin
Streptomycin
Neomycin
Tobramycin
Rifampicin
Leucomycin-A5
MIC (mcg/ml) >100 >100 50 25 100 >100 > 12,5 >100
(P) Zersetzung von verschiedenen Substanzen:
Tyrosin + Adenin +
Casein + Aesculin +
Xanthin + Kelatin —
Hypoxanthin + Xylan —
Cellulose + Elastin +
[+: positiv; / — : negativ]
[T.R.G. Gray et al. ed. «Ecology of Soil Bacteria, Seiten 293 bis 321, Liverpool Univ. Press, Liverpool, 1967», J. Gen. Microbiol., 69,33 bis 80 (1971) und J. Gen. Microbiol., 88,75 bis 85 (1975)].
(m) Verwendung von Kohlenstoffquellen: (aa) Zucker:
L-Arabinose ± D-Ribose
D-Fructose + Trehalose
S-Galactose + Saccharose
D-Glucose + L-Sorbose
Glycerin + D-Dorbit i-Inosit + Dulcit
D-Mannose + Xylose
D-Mannit + Saliein
Melezitose — Cellobiose
Melibiose — Stärke
ß-Lactose + Adnit
Maltose + Aerythrit
25
+
+
+
±
+
+
+
+
+
+
+
Paraffinose + a-D-Methylglycosid +
L-Rhamnose +
[ISP-Medium 9, + : positiv; ± : zweifelhaft; — : negativ] (bb) organische Säuren:
Natriumacetat + Natriumpropionat + Natriumbenzoat + Natriumpyruvat + Natriumbutylat + Natriumsuccinat + Natriumeitrat + Natriumtartrat + Natriumfumarat + Natriumadipat + Natriummalat + Natriumsebaeat + [entsprechend J. Bacteriol., 73,15 bis 27 (1957)].
Wie oben ersichtlich, sind die Kennzeichen des Stammes AC3440: (1) bei der morphologischen Beobachtung, Luft-Mycelien gewachsen aus gespaltenen Substrat-Mycelien, zusammen mit der Bildung von losen runden Spiralen oder geraden oder welligen Sporenketten und Sporen, bedeckt mit einem langen büscheligen Sporenüberzug; (2) in der Zellwandanalyse, Feststellung von Meso-Diaminopimelinsäure, Ara-binose und Galactose, keine Feststellung von Lipiden LCN-A, Nocardomycolsäure und Mycolsäure; (3) in den Stämmen, gram-positiv und säurefeste Färbung negativ, und (4) aerobe Natur. •
Unter Bezugnahme auf die obigen taxonomischen Eigenschaften war der Stamm AC3440 fast identisch mit den Charakteristika der Gattung Saccharopolyspora Lacey Goodfel-low [J. Gen. Microbiol., 88,75 bis 85 (1975)]. Dieser Stamm wird entsprechend als Saccharopolyspora sp. AC3440 bezeichnet.
Der Stamm, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist beispielsweise Saccharopolyspora sp. f AC3440 FERM-P No. 6238. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieses Stammes eingeschränkt, da andere Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugende Stämme, welche zur selben Gattung gehören, sowie natürliche oder künstliche Mutanten davon gleichfalls verwendet 10 werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die oben genannten, Saccharocine erzeugenden Mikroorganismen, welche zur Gattung Saccharopolyspora gehören, aerob in einem üblichen Medium gezüchtet. 15 Die Züchtung der Mikroorganismen kann in einer flüssigen oder festen Kultur erfolgen. Eine submerse belüftete Kultur (submerged aeragion cultur) wird für die industrielle Erzeugung bevorzugt.
Ein übliches Kulturmedium für Mikroorganismen kann 20 mit Vorteil verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Dextrin, Stärke oder Molassen. Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen sind zum Beispiel Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenpulver, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Ammonium- oder Nitratsalze, usw. Verschiedene Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat können gegebenenfalls zugefügt werden.
Die Kulturtemperatur kann innerhalb der Grenzen für das Wachstum der Mikroorganismen und der Erzeugung der Saccharocine gewählt werden und liegt vorzugsweise bei 25 bis 35 °C. Die Kulturdauer kann je nach den Züchtungsbedingungen gewählt werden und beträgt üblicherweise 72 bis 140 Stunden. Die Züchtung sollte unterbrochen werden,
wenn die Saccharocin-Erzeugung praktisch beendet ist.
Die Saccharocine befinden sich in der Kulturflüssigkeit.
Die Isolierung der Antibiotika aus der Kulturbrühe kann je nach Art der basischen Aminoglycosid-Saccharocine 40 durchgeführt werden.
Die erzeugten Saccharocine können nach der üblichen Agar-Plattenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testorganismus bestimmt werden.
Zur Isolierung der Saccharocine aus der Kulturbrühe 45 kann wie folgt vorgegangen werden:
Die Saccharocin und/oder 3'-Oxysaccharocin erzeugenden Mikroorganismen werden gezüchtet und die erhaltene Kulturbrühe filtriert. Die Kulturbrühe wird sodann wegen so der Aminoglycosidnatur der Saccharocine auf ein saures pH eingestellt, neutralisiert und filtriert, um ein Kulturfiltrat zu erhalten. Die aktiven Bestandteile werden an Ionenaustauscherharz, z.B «Amberlite IRC-50» (NHJ-Typus) (Markenbezeichnung) adsorbiert, indem das Kulturfiltrat beispiels-55 weise über eine Säule aus diesem Material geleitet wird. Die aktiven Bestandteile werden mit IN wässerigem Ammoniak eluiert und das Eluat konzentriert. Nach Einstellung des pH wird das Konzentrat über eine Säule aus «CM-Sephadex C-25» (NHJ-Typus) geleitet, um die aktiven Bestandteile 6o daran zu adsorbieren, und die Säule sodann mit 0,03N wässerigem Ammoniak eluiert, wodurch zuerst 3'-Oxysaccharocin und später Saccharocin eluiert werden. Die Eluate werden konzentriert und lyophilisiert, um Saccharocin bzw. 3'-Oxy-saccharocin als gereinigte weisse freie Base zu erhalten. Die 65 derart erhaltenen Produkte ergeben einzelne Flecken auf der Dünnschichtchromatographie.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung.
35
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Beispiel 1
Ein wässeriges Medium (100 ml), pH 7,0), welches 1 % Dextrin, 1% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 0,5% Hefeextrakt und 0,1% Calciumcarbonate (alle Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben wurde bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert. Die Saccharopolyspora sp. AC3440 FERM-P No. 6238 wurde in diese Lösung eingeimpft und das Gemisch einer Schüttelkultur bei 30°C während 72 Stunden unterworfen, um eine Impfkultur zu bilden.
Das Hauptkulturmedium (100 ml, pH 7,0), welches 0,2% Glucose, 4% Glycerin, 5% Pepton, 0,2% Stärke, 0,5% entfettetes Sojabohnenpulver, 0,5% Trockenhefe, 0,5% NaCl und 0,2% Calciumcarbonat enthielt, wurde in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben sterilisiert. 100 derartige Kolben mit Hauptkulturmedium wurden mit 3% der oben erhaltenen Impfkultur beimpft und bei 30 °C während 96 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Die erhaltenen Kulturmassen wurden vereint und ergaben 10 Liter Kulturbrühe.
Beispiel 2
Die in Beispiel 1 erhaltene Kulturbrühe wurde auf pH 2,0 eingestellt durch Zusatz von 12N H2S04, während 10 Minuten gerührt, durch Zusatz von konzentriertem wässrigem Ammoniak auf pH 7,0 eingestellt und zentrifugiert, wobei 9 Liter überstehende Flüssigkeit erhalten wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde über eine Säule aus «Amberlite IRC-50»
(NHJ-Typus, 1 Liter, Rohm & Haas Co.) geleitet, die Säule sodann mit Wasser gewaschen und mit IN wässerigem Ammoniak (2 Liter) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde durch Zusatz 5 von 6N-H2S04 auf pH 7,0 eingestellt, über eine Säule (Durchmesser 3 cm) aus «CM-Sephadex C-25» (NHJTypus, 300 ml, Pharmacia Fine Chem. Co.)geleitet und die Säule mit 0,03N wässerigem Ammoniak eluiert.
10 Die Eluate wurden in 20 ml-Fraktionen fraktioniert. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie, entwickelt mit Chloroform-Methanol-konzentriertem wässrigem Ammoniak (2:3:2) und Ninhydrinfärbung untersucht. Die Fraktionen No. 98 bis 109 enthielten 3'-Oxysaccharocin und 15 die Fraktionen No. 124 bis 143 enthielten Saccharocin. Jede Fraktion wurde gesammelt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, um ein weisses Pulver zu erhalten. Das Pulver wurde im Vakuum über Phosphorpentoxid bei 40°C während 48 Stunden getrocknet, wobei gereinigte, kristalline, freie Sac-20charocin-Base (110 mg) und 3'-Oxysaccharocine-Base (30 mg) als weisses Pulver erhalten wurden.
In den beiliegenden Zeichnungen stellt:
Fig. 1 das IR-Spektrum von Saccharocin,
Fig. 2 das NMR-Spektrum von Saccharocin,
Fig. 3 das IR-Spektrum von 3'-Oxysaccharocin,
Fig. 4 das 'H-NMR-Spektrum von 3'-Oxysaccharocin dar.
C
2 Blatt Zeichnungen
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