AT370770B - Verfahren zur herstellung von neuen aminoglykosid-antibiotika - Google Patents

Verfahren zur herstellung von neuen aminoglykosid-antibiotika

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AT370770B
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
    • C12P19/485—Having two saccharide radicals bound through only oxygen to non-adjacent ring carbons of the cyclohexyl radical, e.g. gentamycin, kanamycin, sisomycin, verdamycin, mutamycin, tobramycin, nebramycin, antibiotics 66-40B, 66-40D, XK-62-2, 66-40, G-418, G-52
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Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen Aminoglykosid-Antibiotika G-367-1 und G-367-2, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus vom Stamme Dactylosporangium thailandanse G-367 (FERM-P Nr. 4840) in einem Nährboden kultiviert und die gebildeten Antibiotika daraus isoliert. 



   Das neue Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-1 (nachstehend als G-367-1 bezeichnet) und das neue Aminoglykosid-Antibiotikum G-367-2 (nachfolgend als G-367-2 bezeichnet) haben die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften :
1.   G-367-1 :   
 EMI1.1 
 :Elementaranalyse : gefunden : C 50, 14, H 7, 60, N 14, 42 berechnet : C 50, 51, H 7, 84, N 13, 74 Molekulargewicht : 475 (bestimmt durch Massenspektrum) Summenformel : C   2.

   H 37 Ns 0 B     UV-Absorptionsspektrum :   kein charakteristisches Absorptionsmaximum bei 220 bis 360 nm, zeigt nur Endabsorption IR-Absorptionsspektrum (KBr) : wie in Fig. 1 dargestellt, Absorptionsbanden bei 3350,2920, 1660,1590, 1380,1140, 1100,1050, 1000,950   cm- 1   
 EMI1.2 
 
 EMI1.3 
 
<tb> 
<tb> Nr. <SEP> ppm <SEP> Nr.

   <SEP> ppm
<tb> 1 <SEP> 164, <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 68, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> 2 <SEP> 150, <SEP> 6 <SEP> 12 <SEP> 67, <SEP> 4 <SEP> (Dioxan)
<tb> 3 <SEP> 101, <SEP> 4 <SEP> 13 <SEP> 64, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 4 <SEP> 98, <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> 51, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 5 <SEP> 96, <SEP> 3 <SEP> 15 <SEP> 50, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> 87, <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> 45, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 7 <SEP> 85, <SEP> 3 <SEP> 17 <SEP> 43, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> 8 <SEP> 75, <SEP> 3 <SEP> 18 <SEP> 37, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 9 <SEP> 73, <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 36, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> 10 <SEP> 70, <SEP> 2 <SEP> 20 <SEP> 23, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> 21 <SEP> 22, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 
   Löslichkeit :   löslich in Wasser und Methanol, unlöslich in Aceton, Benzol, Äthylacetat und Chloroform
Farbreaktion : positiv : Ninhydrin, Entfärbung von Kaliumpermanganat negativ :

   Elson-Morgan, Biuret
Farbe : weisses Pulver
Beschaffenheit : basisch
Dünnschichtchromatographie (Silikagel) : untere Schicht von Chloroform : Methanol : 28% ig wässerigem Ammoniak (1 : 1 : 1) : Rf = 0, 36
10% iges Ammoniumacetat : Methanol   (1 : 1) :   Rf = 0, 13
Auf Grund der oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist G-367-1 eine neue Aminoglykosid-Verbindung, für die folgende planare Struktur vermutet wird : 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 2.   G-367-2 :  
Schmelzpunkt : 151 bis   1550C   
 EMI2.2 
 : +159, 8  (o=l, 0.

   HElementaranalyse : gefunden : C 50, 41, H 7, 92, N 15, 16 berechnet : C 50, 99, H 8, 33, N 15, 64 Molekulargewicht : 447 (bestimmt durch Massenspektrum) Summenformel :   C H NgO,     UV-Absorptionsspektrum :   kein charakteristisches Absorptionsmaximum in Wasser bei 220 bis 330 nm, zeigt nur Endabsorption IR-Absorptionsspektrum (KBr) : wie in Fig. 3 dargestellt, Absorptionsbanden bei 3350,2920, 1650,1540, 1470,1350, 1140,1100, 1050,1020, 950 cm-' NMR-Spektrum (Wasserstoff) : wie in Fig. 4 dargestellt (D20, 100 MHz, innerer Standard DSS) NMR-Spektrum (Kohlenstoff)   : D2o,   25 MHz, innerer Standard :

   Dioxan 
 EMI2.3 
 
<tb> 
<tb> Nr. <SEP> ppm <SEP> Nr. <SEP> ppm
<tb> 1 <SEP> 149, <SEP> 5 <SEP> 11 <SEP> 67, <SEP> 4 <SEP> (Dioxan)
<tb> 2 <SEP> 101,4 <SEP> 12 <SEP> 64, <SEP> 2
<tb> 3 <SEP> 98, <SEP> 7 <SEP> 13 <SEP> 51,6
<tb> 4 <SEP> 97,5 <SEP> 14 <SEP> 50,1
<tb> 5 <SEP> 87, <SEP> 9 <SEP> 15 <SEP> 47, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> 85,1 <SEP> 16 <SEP> 43,0
<tb> 7 <SEP> 75, <SEP> 2 <SEP> 17 <SEP> 37, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 8 <SEP> 73,1 <SEP> 18 <SEP> 36,2
<tb> 9 <SEP> 70, <SEP> 0 <SEP> 19 <SEP> 23, <SEP> 9 <SEP> 
<tb> 10 <SEP> 68,6 <SEP> 20 <SEP> 22,5
<tb> 
 
Löslichkeit : löslich in Wasser und Methanol, unlöslich in Aceton, Benzol, Äthylacetat und
Chloroform
Farbreaktion : positiv : Ninhydrin, Entfärbung von Kaliumpermanganat negativ : Elson-Morgan, Biuret
Farbe : weisses Pulver
Beschaffenheit : basisch
Dünnschichtchromatographie (Silikagel) : untere Schicht von Chloroform :

   Methanol : 28% ig wässerigem Ammoniak   (1 : 1 : 1) :   Rf = 0, 28   10%iges Ammoniumacetat : Methanol (1 : 1) :   Rf = 0, 10. 



   Die oben angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften von G-367-2 wie die Elementarmalyse, das Molekulargewicht und die Summenformel sind ähnlich dem bekannten Antibiotikum   ! isomicin.   Der Rf-Wert von Sisomicin bei Dünnschichtchromatographie mit Chloroform : Methanol :   ! 8% zig   wässerigem Ammoniak (1 : 1 : 1) ist aber 0, 38, also von dem des G-367-2 verschieden. Andere 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
 EMI3.1 
 US-PS Nr. 4, 011, 390 beschriebenen Mutamicin 6 ist das neue G-367-2 das 2'-Epsisomicin, ein bisher nicht bekanntes Epimeres des Sisomicins. 
 EMI3.2 
 



   Das antimikrobielle Wirkungsspektrum (minimale Hemmkonzentration, MIC) von G-367-1 und   3-367-2,   bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode, zeigt die folgende Tabelle : 
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> MIC <SEP> (mug/ml)
<tb> Testorganismus <SEP> G-367-1 <SEP> G-367-2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> MS27 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 0119 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 5
<tb> Staphylococcus <SEP> epidermidis <SEP> sp-al-l <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> N. <SEP> Y.

   <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ATCC <SEP> 663 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NIHJ-JC2 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NIHJ-W3630 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NIHJ-W3630 <SEP> RGN14 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Citrobacter <SEP> freundii <SEP> GN346 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Klebsiella <SEP> pneumonia <SEP> ATCC <SEP> 10031 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> Gärtner <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> E33 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Proteus <SEP> morganii <SEP> 0239 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Proteus <SEP> rettgeri <SEP> ACR <SEP> 3,

   <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Enterobacter <SEP> aerogenes <SEP> 0655 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> GN336 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> IAM1095 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> ML4561 <SEP> 25 <SEP> 125
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> ML4561
<tb> Rms <SEP> 166 <SEP> > 100 <SEP> > 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> ML4561
<tb> Rms164-1 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 Fortsetzung 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> MIC <SEP> (mJ1g/ml)
<tb> Testorganismus <SEP> G-367-1 <SEP> G-367-2
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> ML4561
<tb> RP4 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 6,

   <SEP> 3 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> 1946 <SEP> > 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aerugenosa <SEP> 2512 <SEP> > 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> putida <SEP> 1842 <SEP> > 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 
<tb> Pseudomonas <SEP> maltophilia <SEP> 1850 <SEP> > 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 
<tb> 
 
Die gemäss der Erfindung hergestellten Antibiotika G-367-1 und G-367-2 haben einen starken antibakteriellen Effekt gegen Gram-negative Bakterien, und können in Form ihrer nicht-toxischen Säureadditionssalze von organischen oder anorganischen Säuren, wie z. B. als Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Carbonat, Acetat, Fumarat, Malat, Citrat, Mandelat, Succinat, Ascorbat, Aspartat oder Glutamat, verwendet werden. 



   Die Antibiotika G-367-1 und G-367-2 oder ihre nicht-toxischen Säureadditionssalze können als injizierbare Zubereitungen,   z. B.   in Form von 20 bis 40 mg-Fläschchen oder Ampullen, verwendet werden. 



   Der G-367-1 und G-367-2 produzierende Streptomyces-Stamm G-367 wurde aus einer Bodenprobe in Fuji-shi, Shizuokaken, Japan, isoliert, und mit Dactylosporangium thailandense G-367 bezeichnet. 



  Dieser Stamm wurde im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als FERM-P Nr. 4840 hinterlegt. 



  Die taxonomischen Eigenschaften (taxonomical properties) des Stammes sind die folgenden :
I. Morphologische Eigenschaften :
Auf Calciummalat-Agar (Bact. Rev.   ! !.' 1 [1957])   wurden bei   30oC,   und einer Kultivierung von 3 bis 7 Tagen folgende Beobachtungen gemacht :
Das Substrat-Mycel ist gekrümmt oder webartig, von verzweigtem Wuchs und ohne Fragmentierung,   0, 5   bis   il   im Durchmesser und zeigt keine Bildung von"Luft-Hyphae" (aerial hyphae). 



   Auf dem Substrat-Mycel wird, eingebettet im Agar, ein kugelförmiger oder ellipsoider Körper mit den Dimensionen 1, 5 bis   2,   0x 2, 0 bis 2, 5 p festgestellt. 



   Aus dem Substrat-Mycel erheben sich kurze Sporangiophoren, und fingerartige Sporangia zeigen sich einzeln oder gebüschelt an der Oberfläche des Agar-Mediums. Die Grösse des Sporangiums ist 1, 0 bis 1, 5 x 4, 6 bis 6,5 p. Jedes Sporangium enthält eine vertikale, einzelne Reihe von drei bis vier Sporen. Die kugelförmigen, ellipsoiden oder birnenförmigen Sporen mit einer Grösse von 1, 0 bis   1,   5   xl, 5   bis 2, 5 p sind in Wasser beweglich durch polytrichose, polare Fäden. 



   II. Verhalten mit Diaminopimelinsäure (Zusammensetzung von Diaminopimelinsäure) :
Durch Mycel-Analyse (mycelial analysis) wurde ein Rm-Wert vom Meso-Typ (meso-type Rm value) und ein niedrigerer Rm-Wert als der des Meso-Typs (langsam wandernde Diaminopimelinsäure) Eestgestellt. 



   III. Wachstum auf verschiedenen Medien :
Die an verschiedenen Medien bei   300C   nach 14 Tagen festgestellten Beobachtungen sind in ler folgenden Tabelle veranschaulicht."Luft-Mycel" (aerial mycelium) wird, ausser auf Hafernehl-Agar in einer rudimentären Form, nicht gebildet. Die Bildung von Sporangia ist auf Calciumnalat-Agar gut, mittelmässig auf Boden-Agar (J. gen. Microbiol. 50,295 [1968]), und gering oder iberhaupt nicht auftretend auf den andern Medien. 



   Die Farbbezeichnung basiert auf dem "Color Harmony Manual, 4. Ausgabe 195811 (Container corporation of America). 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 Wachstum auf verschiedenen Medien 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> des <SEP> Substrat-Mycels <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Sucrose-nitrat-Agar <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> aprikosenfarbig <SEP> (4ia) <SEP> bis <SEP> orange <SEP> keines
<tb> (Waksnannnedium <SEP> No.

   <SEP> l) <SEP> * <SEP> (4ic) <SEP> (dasty <SEP> orange)
<tb> Glucose-asparagin-Agar <SEP> schHach <SEP> melonengelb <SEP> (3ia) <SEP> bis <SEP> keines
<tb> (Waksmann <SEP> medium <SEP> No.2)* <SEP> aprikosenfarbig <SEP> (4ia)
<tb> Glycerin-asparagin-Agar <SEP> gering <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> farblos <SEP> bis <SEP> hellmelonengelb <SEP> (3ea) <SEP> keines
<tb> (ISP <SEP> medium <SEP> No.5)**
<tb> Stärke-Anorganischer <SEP> Agar <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> orangebraun <SEP> (4nc) <SEP> bis <SEP> oran- <SEP> keines <SEP> 
<tb> (ISP <SEP> medium <SEP> No.

   <SEP> 4) <SEP> ** <SEP> ge <SEP> (41c) <SEP> (dusty <SEP> orange)
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> gering <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> aprikosenfarbig <SEP> (4ga) <SEP> bis <SEP> keines
<tb> (ISP <SEP> medium <SEP> No.7)** <SEP> blass-pastellorange <SEP> (4ic)
<tb> Hafermehl-Agar <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> rostorange <SEP> (4pe) <SEP> bis <SEP> orange- <SEP> keines <SEP> 
<tb> (ISP <SEP> mediun <SEP> No.3)** <SEP> braun <SEP> (4pc)
<tb> Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> ahornfarbig <SEP> (41e) <SEP> bis <SEP> loh- <SEP> ahornfarbig <SEP> (41e)
<tb> (ISP <SEP> medium <SEP> No. <SEP> 2) <SEP> ** <SEP> farben <SEP> (4ne) <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (4ng)
<tb> Calciummalat-Agar <SEP> schwach <SEP> farblos <SEP> keines
<tb> Nahr-Agar <SEP> gering <SEP> farblos <SEP> keines
<tb> (klaksmann <SEP> ann <SEP> medium <SEP> No.

   <SEP> 14) <SEP> * <SEP> 
<tb> Benett-Agar <SEP> mässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> ahornfarbig <SEP> (41e) <SEP> bis <SEP> loh- <SEP> ahornfarbig <SEP> (41e)
<tb> (Waksmann <SEP> medium <SEP> No.30)* <SEP> farben <SEP> (4ne) <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (4ng)
<tb> Emarson-Agar <SEP> mässig <SEP> pastellorange <SEP> (4ic) <SEP> bis <SEP> ahorn-ahornfarbig <SEP> (41e)
<tb> (Waksmann <SEP> medium <SEP> No.28)* <SEP> farbig <SEP> (41e)
<tb> Hickey <SEP> and <SEP> Tresner-Agar <SEP> nässig <SEP> bis <SEP> gut <SEP> zimtfarbig <SEP> (31e) <SEP> bis <SEP> ahorn- <SEP> ahornfarbig <SEP> (41e) <SEP> bis
<tb> (Waksmannnedium <SEP> No.

   <SEP> 32) <SEP> * <SEP> farbig <SEP> (41e) <SEP> hellgewUrzbraun <SEP> (41g) <SEP> 
<tb> Elucose-Hefeextrakt-Agar <SEP> mässig <SEP> nelonengelb <SEP> (3ga) <SEP> keines
<tb> (Waksman <SEP> medium <SEP> No.29)*
<tb> Pepton-Hefeextrakt-eisenhal-gering <SEP> farblos <SEP> keines
<tb> tiger <SEP> Agar <SEP> (IPS <SEP> medium <SEP> Nr.5)**
<tb> Boden-Agar <SEP> gering <SEP> bis <SEP> schwach <SEP> farblos <SEP> keines
<tb> Kartoffelacker <SEP> (potato <SEP> stabb) <SEP> mässig <SEP> ziegelrot <SEP> (5ne) <SEP> bis <SEP> kupfer-keines
<tb> (Wakenann <SEP> medium <SEP> No.40)* <SEP> farbig <SEP> (51c)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 Fortsetzung 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> Farbe <SEP> des <SEP> Substrat-Mycels <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Kartoffelacker <SEP> (potato <SEP> stabb) <SEP> mässig <SEP> ziegelrot <SEP> (5ne)

   <SEP> bis <SEP> kupfer- <SEP> keines <SEP> 
<tb> + <SEP> Calciumcarbonat <SEP> farbig <SEP> (5lc)
<tb> Rübenacker <SEP> (Carrot <SEP> stabb) <SEP> gering <SEP> farblos <SEP> keines
<tb> 
 
 EMI6.2 
 
S. A.' The Actinomycetes Vo 12 1961 P. 327-334 Wiliams & Wilkins Co.1. Verwertung von Kohlenstoffquellen 
 EMI6.3 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> P <SEP> & G* <SEP> Lm**
<tb> D-Arabinose <SEP> +
<tb> L-Arabinose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Fructose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Galactose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Glucose <SEP> + <SEP> +
<tb> Glycerin
<tb> i-InositD-Mannose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Mannit <SEP> + <SEP> +
<tb> a-Melibiose <SEP> + <SEP> +
<tb> ss-Lactose <SEP> + <SEP> 
<tb> Dulcit
<tb> D-Toreharose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Cellobiose <SEP> + <SEP> +
<tb> Meleditose <SEP> + <SEP> +
<tb> Raffinose <SEP> +
<tb> L-Rhamnose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Ribose
<tb> L-Sorbose
<tb> D-Sorbit
<tb> 

  Sucrose <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Xylose <SEP> + <SEP> +
<tb> Adonit
<tb> Salicin <SEP> ¯-+ <SEP> ¯-+
<tb> Stärke <SEP> + <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> P <SEP> & <SEP> G* <SEP> Lm**
<tb> Dextrin <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> - <SEP> -
<tb> 
 
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   Die Ausführungsform der Isolierung und Reinigungsmethode von G-367-1 und G-367-2 wird wie folgt beschrieben. 



   Das Kulturfiltrat wird erhalten, indem man das Kulturmedium auf einen sauren PH-Wert einstellt, neutralisiert und dann filtriert. Das Kulturfiltrat wird auf eine Kationenaustauschersäule, wie z. B. Amberlite IRC-50 der Firma Rohm & Haas (vom Ammonium-Typ) gebracht, um aktive Substanzen zu adsorbieren, die aktiven Substanzen werden durch zwei normale wässerige Ammoniaklösungen eluiert, konzentriert, und dann der PH-Wert des Eluats eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Kationenaustauschersäule, wie z. B. CM-Sephadex   C-25   (vom Ammoniumtyp) aufgebracht, mit wässerigem Ammoniak (Konzentrationsgradient 0 bis 0, 35 N) eluiert, um die aktiven Fraktionen zu erhalten, welche konzentriert und gefriergetrocknet werden. Man erhält G-367-1 und G-367-2 als gereinigtes weisses Pulver in Form der freien Base.

   Das so erhaltene   G-367-1   und G-367-2 zeigt einen einzelnen Fleck im Dünnschichtchromatogramm. 
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 hydrolysat,   0, 5%   Hefeextrakt und 0, 1% Calciumcarbonat enthält, wurde in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben bei   120 C   20 min lang sterilisiert. 



   Dactylosporangium thailandense G-367 wurde aus einem geneigten Agar-Medium (agar slant medium) mit Hilfe einer Ölse eingeimpft und die Kultur wurde bei   30 C   120 h lang geschüttelt (shake cultured). Diese Samenkultur wurde einem sterilisierten Medium der gleichen Zusammensetzung (20 1) in einem 30   1-Fermentergefäss   eingeimpft und 72 h lang bei   300C   kultiviert (Rührgeschwindigkeit 300 Umdr/min, Luftbegasung 20   l/min).   Dieses kultivierte Medium (10 1) wurde in 
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100   l/min).   Man erhielt 190 1 des kultivierten Mediums. 



   Beispiel 2 : Das nach Beispiel 1 erhaltene kultivierte Medium wurde durch Zugabe von
12 n Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 2 eingestellt, 30 min lang gerührt, dann durch Zugabe von konzentriertem wässerigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7, 0 eingestellt, und nach Zugabe des   Filterhilfsmittels"Perlite"   (4 kg, Handelsname) filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Amberlite IRC-50-Säule (Rohm & Haas Co., Ammoniumtyp, 10 1) aufgebracht und nach dem Waschen mit Wasser mit 2 n wässeriger Ammoniaklösung (20 1) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. 



   Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6 n Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 7, 0 eingestellt und auf eine Säule von CM-Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemical Corporation, Ammoniumtyp, 500 ml, 4 cm Durchmesser aufgebracht. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die aktive Substanz durch Gradientenelution mit wässerigem Ammoniak (5 1, Konzentrationsgradient 0 bis 0, 35 N) eluiert. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie geprüft (untere Phase eines Gemisches aus Chloroform : Methanol : 28% ig wässerigem Ammoniak im Verhältnis 1 : 1 : 1), und die aktive Substanz durch Ninhydrin-Farbreaktion festgestellt. G-367-1 wurde in den Fraktionen 175 bis 185 gefunden. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und nach Gefriertrocknung wurde ein weisses Pulver erhalten.

   Das Pulver wurde bei   40 C   48 h lang über Phosphorpentoxyd bei reduziertem Druck getrocknet und ergab das gereinigte G-367-1 als weisses Pulver (freie Base, 750 mg). 



   G-367-2 wurde in den Fraktionen Nr. 190 bis 205 gefunden. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und nach dem Gefriertrocknen wurde das weisse Pulver erhalten. 



  Das Pulver wurde bei   400C   48 h lang unter reduziertem Druck getrocknet und das gereinigte G-367-2 wurde als weisses Pulver erhalten (freie Base, 680 mg). 



   In den nachstehenden Zeichnungen bedeuten :
Fig.   l :   IR-Spektrum von G-367-1
Fig. 2 : NMR-Spektrum (Wasserstoff) von G-367-1
Fig. 3 : IR-Spektrum von G-367-2 und
Fig. 4 : NMR-Spektrum (Wasserstoff) von G-367-2.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung der neuen Aminoglykosid-Antibiotika G-367-1 und G-367-2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus vom Stamme Dactylosporangium thailandanse G-367 (FERM-P Nr. 4840) in einem Nährboden kultiviert und die gebildeten Antibiotika daraus isoliert.
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