DE2855949A1 - Antibiotikum g-6302 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Antibiotikum g-6302 und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit .der
Bezeichnung G-6302, seine Salze und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Mit dem Ziel, neue Antibiotika zu finden, isolierte die Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen aus
Bodenproben und untersuchte die von diesen Mikroorganismen gebildeten Antibiotika. Die Untersuchung ergab, daß
einige dieser Mikroorganismen ein neues Antibiotikum bilden, daß diese Mikroorganismen zur Gattung Pseudomonas
gehören und daß diese Mikroorganismen bei Kultivierung in einem geeigneten Nährmedium ein Antibiotikum
anhäufen, das eine hemmende Wirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien ausübt. Die Anmelderin isolierte
dieses Antibiotikum und stellte auf Grund seiner physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften
fest, daß dieses Antibiotikum neu ist. Es wurde daher als Antibiotikum G-6302 bezeichnet.
Die Bedingungen für die Herstellung von Antibiotikum
G-6302 wurden ebenfalls untersucht. Hierbei wurde festgestellt, daß die Bildung des Antibiotikums G-6302
bedeutend gesteigert werden kann, wenn die in Frage kommenden Mikroorganismen in einem Nährmedium, das mit
einer Schwefelverbindung ergänzt ist, die die Mikroorganismen
zu verwerten vermögen, kultiviert werden. Diesen Feststellungen folgten weitere Untersuchungen, die in
der vorliegenden Erfindung gipfelten.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird das Antibiotikum G-6302 zuweilen kurz als G-6302
bezeichnet.
Die Erfindung umfaßt daher
1) das Antibiotikum G-6302 und seine Salze und
1) das Antibiotikum G-6302 und seine Salze und
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2) die Herstellung des Antibiotikums G-6302 nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
einen Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und das Antibiotikum G-6302 zu bilden vermag,
in einem Nährmedium kultiviert, das Antibiotikum durch den Mikroorganismus im Kulturmedium bilden und
anhäufen läßt und das Antibiotikum isoliert.
Erfindungsgemäß können als Stämme, die das Antibiotikum
G-6302 bilden, alle Bakterienstämme der Gattung Pseudomonas
verwendet werden, vorausgesetzt lediglich, daß die Stämme das Antibiotikum zu bilden vermögen. Als Beispiel
eines solchen Stammes ist Pseudomonas Stamm G-6302 (nachstehend zuweilen als Stamm G-6302 bezeichnet)
zu nennen, der von der Anmelderin von Bodenproben, die in Ashigara-Shimo-Gun, Präfektur Kanagawa, Japan,
entnommen wurden, isoliert wurde.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas
Stamm G-6302 sind nachstehend genannt.
bei 28°C
a) Morphologie
Nach 2 Tagen auf Schrägagar/sind die Zellen stabförmig
mit 0,7 bis 1,0 um Durchmesser und 0,7 bis 3,5 um Länge. Ohne Polymorphismus sind die Bakterien mit einer oder
mehreren polaren Geißeln beweglich. Keine Sporolation; keine Anreicherung von Poly-ß-hydroxybuttersäure als
intrazelluläre Kohlenstoffreserve (R.Y.Stanier und Mitarbeiter, Journal of General Microbiology 43 (1966)
159. Gramnegativ, nicht säurefest.
£) Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien;
Bei 280C kultiviert und 1 bis 14 Tage beobachtet.
D Nähragarplatte: Kreisrunde, erhabene Kolonien von 1 bis 3 mm Durchmesser mit ganzem Rand werden nach
3 Tagen gebildet. Glatt, undurchsichtig, weiß, kein . diffundierbares Pigment gebildet.
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2) Schrägagar: mäßiges Wachstum, fadenförmig, opak und cremefarben. ..
3) Nährbrühe: trübes Wachstum, im wesentlichen ohne Sedimentation. Ein Pellikel erscheint nach 14-tägiger
Kultivierung.
4) Stichkultur in Nährgelatine: Oberflächenwachstum ohne
Verflüssigung.
5) Lackmusmilch:: keine Veränderung c) Physiologische Eigenschaften
1) Reduktion von Nitraten: negativ
2) Denitrifikation: negativ
3) MR-Test (Methylrottest): negativ
4) VP (Voges-Prospkauer)-Test: negativ
5) Bildung von Indol: negativ
6) Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv (schwach)
7) Hydrolyse von Stärke: negativ
8) Verwertung von Citrat: positiv
9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen
I) Kaliumnitrat: negativ bis schwach-positiv II) Ammoniumsulfat: positiv
10) Bildung von Pigmenten: nein
11) Urease: positiv
12) Oxidase: negativ
13) Katalase: positiv
14) Wachstumsbereich
14) Wachstumsbereich
I) pH: Wachstum bei pH 4 bis 8, optimal pH 4,5 bis
6,0
II) Temperatur: Wachstum bei 2 bis 370C, optimal
25 bis 3O°C.
15) Sauerstoffbedarf: aerob
16) O-F-Test (oxydativ-fermentativ) (Hugh-Leifson-Methode):
oxydativ.
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17) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern: schwache Säurebildung, aber keine Gasbildung wird in Pepton-Wasser
festgestellt, das 1% (Gew./Vol.) D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose,
D-Sorbit, D-Mannit, Inosit oder Glycerin enthält.
18) Assimilierung von Kohlenstoffquellen:
Die Ergebnisse der Kultivierung in anorganische Salze enthaltenden Medien (Gew./Vol.: o,7 % Dikaliumhydrogenphosphat,
0,3% Monokaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumsulfat, 0,1% Natriumchlorid,
0,01% Magnesiumsulfat.7 H„0), die verschiedene
Kohlenstoffquellen enthalten, für 14 Tage sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Verwertung von Kohlenstoffquellen
Kohlenstoffquelle Endkonzentration
% (Gew./Vol.) Wachstum
1 +
D-XyI öse 1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
Maltose 1 +
1 +
1 +
1 +
I-Mannit 1 +
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| Kohlenstoffquelle | Endkonzentration | /Vol.) | Wachstum |
| % (Gew. | 1 | ||
| Glycerin | 1 | + | |
| Stärke | 1 | - | |
| α-Methyl-I-glucosiH | 1 | + | |
| Melibiose | 1 | — | |
| Adonit | 1 | + | |
| DuI c it. | 1 | — | |
| Faffinose | 0.5 | 4- | |
| cis-Aconitn! | 0.5 | + | |
| Citrat | 0.5 | + | |
| Isocitrat | 0.5 | ||
| Gluconat | 0.5 | + | |
| Acetat. | 0.5 | 4- | |
| I'umar-'i' | 0.5 | + | |
| 0.5 | + | ||
| Tart-iffi{ | 0.5 | + | |
| p-Hydroxybenzoat | 0.5 | + | |
| L-Alanin | 0.5 | + | |
| β-Alanin | 0.5 | + | |
| Ji-Isoleucin | 0.5 | 4- | |
| Succinafc1 | 0.5 | 4- | |
| L-Valin· | 0.5 | - | |
| i?-Eetop\Luconat | 4- | ||
| + = Wachstum | |||
| + = spärliches Wachstum | |||
| - = kein Wachstum | |||
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19) Andere Eigenschaften
I) Verwertung von Malonat: negativ
II) Desaminierung von Phenylalanin: negativ III) Decarboxylase-Aktivität
a) Arginin: negativ
b) Lysin: negativ
c) Ornithin: negativ
IV) Hydrolyse von Esculin: positiv
V) Hydrolyse von "Tween 80": positiv VI) GC-Gehalt (Guanin-Cytosin) von DNA: 59,5 Mo1.-%
Ein Vergleich der vorstehend genannten bakteriologischen Eigenschaften des Stamms G-63C2 mit der Beschreibung
in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Auflage 7 und 8, ergibt, daß der Stamm G-6302 angesichts
der Tatsache, daß er ein gramnegatives stabförmiges Bakterium, streng aerob, mit einer oder mehreren
polaren Geißeln beweglich und Katalase-positiv ist, offensichtlich zur Familie Pseudomonadaceae gehört. Die
Tatsache, daß er keinen Nährstoffbedarf und einen GC-Gehalt von 59,5 Mol.-% hat, läßt erkennen, daß der
Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört. Da Pseudomonas-Bakterien hinsichtlich der vorstehend genannten Eigenschaften
mit dem Stamm G-6302 verwandt sind, sind Pseudomonas syringae und Pseudomonas maltophilia zu
nennen, die negativ für Cytochromoxydase sind. P.maltophilia
ist jedoch vom Stamm G-6302 offensichtlich insofern verschieden, als P.maltophilia Methionin benötigt
und bei 4°C kein Wachstum zeigt. Während Pseudomonas syringae eine Spezies ist, die eine große Anzahl von
Nomenspezies enthält, ergibt sich eindeutig aus Tabelle 2, daß das gemeinsame Merkmal dieser Stämme,
d.h. die Unfähigkeit, gewisse Kohlenstoffquellen zu verwerten, beim Stamm G-6302 nicht zu finden ist.
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Vergleich der Verwertbarkeit verschiedener Kohlenstoffquellen
Kohlenstoffquelle Pseudomonas Stamm G-6302
syringae
Trehalose - +
2-Ketogluconat - +
ß-Alanin - +
L-Isoleucin - +
+ = verwertet
- = nicht verwertet
Ferner ist der optimale pH-Wert für das Wachstum des Stamms G-6302 sehr niedrig, nämlich 4,5 bis 6,0, wobei
selbst bei pH 4,0 Wachstum stattfindet. Diese Unterschiede schalten die Möglichkeit aus, den Stamm G-6302
als einen Stamm von Pseudomonas syringae anzusehen. G-6302 ist daher als neue Spezies der Gattung Pseudomonas
zu betrachten. Angesichts der Tatsache, daß sein niedriger optimaler pH-Wert für das Wachstum 4,5 bis
6,0 beträgt, der für Bakterien der Gattung Pseudomonas im allgemeinen niedrig ist, wurde der Stamm G-6302 als
Pseudomonas acidophila G-6302 bezeichnet.
Proben dieses Stamms G-6302 wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of
Technology (FERM), Chiba, Japan, unter der Zugangsnummer FERM p- .4344, beim Institute for Fermentation,
Osaka (IFO), Japan, unter der Zugangsnummer IFO 13774 und bei der American Type Culture Collection (ATCC),
Maryland, USA, unter der Zugangsnummer ATCC-31363 hinterlegt.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Pseudomonas-Bakterien
sind im allgemeinen sehr leicht variabel in den Eigenschaften und unterliegen Mutationen,
wenn sie künstlich mutagenen Behandlungen, beispielsw.
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Bestrahlung mit UV-Licht oder Röntgenstrahlen oder einer Behandlung mit chemischen Mutagenen unterworfen werden.
Alle diese Mutanten und Varianten sind jedoch für die Zwecke der Erfindung nur geeignet, wenn sie die Fähig—
keit zur Bildung von G-6302, des gewünschten Antibiotikums gemäß der Erfindung, aufweisen und bewahren.
Für die Kultivierung des Stamms G-6302 können Kohlenstoffquellen
wie Glucose, Saccharose, Maltose, ausgebrauchte Melasse, Glycerin, Öle und Fette (z.B. Sojabohnenöl
und Olivenöl),organische Säuren (z.B.Citronensäuren,
Bernsteinsäure und Gluconsäure) und andere verwertbare Kohlenstoffquellen verwendet werden. Als
Stickstoffquellen eignen sich organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen und Materialien,
beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser,
Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat. Ferner können die für die Kultivierung von Bakterien normalerweise erforderlichen
anorganischen Salze, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Monokaliumdihydrogenphosphat
und Dinatriummonohydrogenphosphat, allein oder in geeigneter Kombination verwendet
werden. Es wurde gefunden, daß die Ausbeute an gewünschtem
Antibiotikum gesteigert werden kann, wenn das N-ährmedium
durch eine Schwefelverbindung, die der G-6302 bildende Stamm zu verwerten vermag, nämlich anorganische
Schwefelverbindungen, z.B. Sulfate (Natriumsulfat), Thiosulfate (z.B. Natriumthiosulfat) oder organische
Schwefelverbindungen, beispielsweise schwefelhaltige
Aminosäuren (z.B. Cystin, Cystein und Methionin), ergänzt wird. Für diesen Zweck wird Natriumthiosulfat
besonders bevorzugt. Die Konzentration dieser Schwefelverbindungen im Nährmedium beträgt 0,01 bis 1,0%
(Gew./Vol.), vorzugsweise 0,02 bis 0,5 %, Der Zusatz
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einer solchen Schwefelverbindung zum Nährmedium hat erhöhte Bildung von G-6302 zur Folge, so daß er
kommerziell von erheblichem Wert ist.
Ferner können Salze von Schwermetallen, z.B. Eisen(II)-sulfat
und Kupfersulfat, Vitamine, z.B. Vitamin B^ und
Biotin, und andere Zusatzstoffe nach Bedarf zugesetzt werden. Schaumverhütungsmittel und oberflächenaktive
Mittel, z.B. Siliconöl und Polyalkylenglykolather, können ebenfalls zugesetzt werden. Natürlich können auch
andere organische oder anorganische Stoffe, die das Wachstum des Mikroorganismus fördern und die Bildung
von G—6302 steigern, in geeigneten Mengen zugegeben
werden.
Die Kultivierung des Stamms G-6302 kann nach ähnlichen Verfahren, wie sie für die Erzeugung von Antibiotika
im allgemeinen angewandt werden, unter Verwendung eines festen Kulturmediums oder in einem flüssigen Kulturmedium
erfolgen. Die Flüssigkultur kann stationär, unter Rühren, Schütteln oder aerob durchgeführt werden,
wobei die aerobe Kultur unter Rühren besonders zweckmäßig ist. Die bevorzugte Kultivierungstemperatur liegt
im Bereich von etwa 15 bis 35°C, während der pH-Wert des Nährmediums zwischen etwa 4 und 8 liegen kann. Die
Kultivierung wird etwa 8 bis 168 Stunden, vorzugsweise 24 bis 144 Stunden durchgeführt. Da das gebildete Antibiotikum
G-6302 zum größten Teil in der flüssigen Phase des Kulturmediums vorliegt, ist es zweckmäßig, das
Kulturmedium zu zentrifugieren oder filtrieren, um den flüssigen Überstand oder, das Filtrat von der Zellmasse
zu entfernen, und das Antibiotikum G-6302 im flüssigen Überstand oder im Filtrat zu reinigen. Gegebenenfalls
kann auch eine direkte Reinigung aus dem Kulturmedium vorgenommen werden.
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Die Testung der Aktivität des in dieser Weise hergestellten Produkts kann gegen Proteus mirabilis IFO 3849
als Testmikroorganismus unter Verwendung von G-6302 als
Standard nach der Zylindermethode oder der Papierblättcheniuethode
unter Verwendung von TSA (Trypticase-Soja-Agar
(Baltimore Biologicals, Ltd., U.S.A.) erfolgen.
Das Antibiotikum G-G302 kann mit Hilfe der verschiedenen
Verfahren, die üblicherweise für die Isolierung von Metaboliten-Mikroorganismen angewandt werden, isoliert
werden. Beispielsweise werden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, worauf das aktive Produkt nach üblichen
Methoden vom flüssigen Überstand abgetrennt und gereinigt wird. Beispielsweise können das Verfahren, bei
dem die Löslichkeit oder der Löslichkeitsunterschied in einem geeigneten Lösungsmittel ausgenutzt wird, das Verfahren,
bei dem die Fällung oder der Unterschied in der Fällungsgeschwindigkeit des Antibiotikums aus einer
Lösung ausgenutzt wird, das Verfahren, bei dem seine charakteristische Adsorptionsaffinität zu verschiedenen
Adsorptionsmitteln ausgenutzt wird, die Ionenaustauschchromatographie
an Ionenaustauschern, Konzentrierung unter vermindertem Druck, Gefriertrocknung, Kristallisation,
Umkristallisation, Trocknung usw. entweder allein oder in geeigneter Kombination und Reihenfolge und/oder
in Wiederholung angewandt werden.
Ein typisches Verfahren wird nachstehend beschrieben. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium filtriert,
das erhaltene Filtrat durch eine Aktivkohlesäule geleitet und das adsorbierte G-6302 mit einem hydrophilen
organischen Lösungsmittel eluiert. Als hydrophile organische Lösungsmittel eignen sich beispielsweise
niedere Ketone (z.B. Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutylketon) und niedere Alkohole (z.B. Methanol,
Äthanol, Isopropanol, Propanol und Butanol). Diese Lösungsmittel können allein oder als Gemisch
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in Kombination mit Wasser verwendet werden. Auf Grund der sauren Natur von G-6302 können Anionenaustauschharze,
z.B. Harze der Cl-Form (Amberlite IRA-400 und
402, Hersteller Amberlite Co., USA; Dowex-1, Hersteller Dow and Chemical Co., USA; Diaion SA-21A, Hersteller
Mitsubishi Chemical Industries, Japan) vorteilhaft verwendet werden. Das adsorbierte aktive Produkt wird
beispielsweise mit einer wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Um das Eluat zu entsalzen, wird die Säulen-Chromatographie
erneut mit Aktivkohle durchgeführt. Das erhaltene Eluat wird dann eingeengt und beispielsweise
mit Aceton versetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Aceton und Diäthyläther gewaschen und
unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein hellbraunes
Pulver gewonnen wird. Zur Reinigung des Antibiotikums G-6302 im Pulver kann die Säulenchromatographie
an DEAE-Sephadex (Pharmacia, Schweden) vorteilhaft angewandt werden. Beispielsweise wird eine Säule des Produkts
DEAE-Sephadex A-25 mit 0,01-molarem Phosphatpuffer
(pH 6,6) gewaschen und eine wässrige Lösung des Pulvers durch die Säule geleitet, an der das Antibiotikum adsorbiert
wird. Die Säule wird mit der vorstehend genannten Pufferlösung gewaschen, worauf mit dem Puffer,
der 0,5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid enthält, eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen,
auf pH 3,0 eingestellt und erneut durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wird mit Wasser und anschliessend
mit 20%igem wässrigem Methanol gewaschen. Die Elution wird dann mit wässrigem Aceton durchgeführt. Die
aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck getrocknet. Dem Konzentrat wird
Aceton zugesetzt, wobei G-6302 erhalten wird. G-6302 bildet Metallsalze und das Ammoniumsalz. Als Beispiele
von Metallsalzen sind das Natriumsalz, Kaliumsalz und Lithiumsalz zu nennen.
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Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des gemäß
Beispiel 1 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend genannt.
1) Schmelzpunkt 120°C (Sinterung), 1300C (Zers.)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 400C für 6 Stunden)
G 34.85 55Λ5 (54.99 ± 0.5)
H 5.41 5,24 (5.58 ± 0.5)
N 1?.?2 15.73 (13.60 + 0.5)
S 7.65 7.75 (7.70 ± 0.5)
0 (3.8.13 ± 0.5)
4) Molekulargewicht durch Titrometrie: 400 +_ 20
Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Kennzahlen)
C12H20N4SO9-H2O
Berechnet: C 34,78; H 5,35; N 13,52; S 7,74
5) UV-Absorptionsspektrum: nur Endabsorptionen (über 210 nm keine charakteristischen Absorptionen)
6) Infrarotabsorptionsspektrum (siehe Fig.l), Hauptpeaks
(KBR) -teuf1)
?440(b), ?920(m), 2850(m), 2600(w), 177O(s), 165oTsT,~
153O(s), 1458(m), 159O(w), 1340(w), 1280(sh), 1240(s)
1210(sh), 1180(m), 1118(w), 1045(s), 792(w), 632(s)
(s= stark; m = mittel; w = schwach; sh = Schulter)
7) Spezifische Drehung: /äj^3 + 94° +_ 10° (c = 0,35, H
8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd,
100 MHz) δ 3,31 ppm(s, chemische verschie-
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bung, die O-CH_ zuzuschreiben ist).
9) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Unlöslich in PetrolMther, Hexan, Diäthyläther,
Benzol, Äthylacetat und Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton; löslich in Methanol und
Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser.
10) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktion; negativ: EisendlD-chlorid-Kaliumferricyanid-,
Sakaguchi— und Molisch—Reaktionen; unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion.
11) Stabilität: In wässriger Lösung im Bereich von
pH 3 bis 7 bei 60°C 10 Minuten stabil; über pH 8,5 instabil.
12) Basisch, neutral oder sauer; sauer.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes
des gemäß Beispiel 3 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend genannt.
1) Schmelzpunkt: kein scharfer Schmelzpunkt (Bräunung
bei 170°C)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 40°C für 6 Stunden)
| C | 33,08 | 33,32 |
| H | 5,07 | 4,97 |
| N | 12,73 | 13,27 |
| S | 7,33 | 7,43 |
| Na | 5,19 | 5,31 |
4) Molekulargewicht: 438 _+ 5 unter der Annahme, daß
jedes Molekül 1 .Mol Najsnthält.
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Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Daten)
Berechnet C 33,03; H 4,85; N 12,84; S 7,35; Na 5,27
5) UV-Absorptionsspektrum: Nur Endabsorptionen.
6) Infrarotabsorptionsspektrum (Fig.2), Hauptpeaks
(KBr) (cm"1): 3430 (stark), 3250 (Schulter), 3000
(mittel), 1770 (stark), 1640 (stark), 1530 (stark), 1450 (schwach), 1405 (schwach), 1343 (schwach),
1280 (Schulter), 1245 (stark), 1180 (schwach), 1118 (schwach), 1050 (stark), 820 (schwach), 785 (schwach),
632 (stark).
7) Spezifische Drehung: /oj^ + 85° _+ 10° (c = 0,37,
8) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton; schwerlöslich
in Methanol, Äthanol und Pyridin; löslich in Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser.
9) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktionen; negativ: Eisen(III)-chlorid-Kaliumferricyanid-,
Sakaguchi- und Molisch-Reaktionen; unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion.
10) Stabilität: In wässriger Lösung im Bereich von pH 3 bis 7 bei 600C für 10 Minuten stabil; über pH 8,5
instabil.
Die Umwandlung von G-6302 in Form der freien Säure in ein Salz, beispielsweise das Natriumsalz, kann durch
Zusatz eines molaren Äquivalents Natriumhydroxyd zu einer wässrigen Lösung der freien Säure und anschliessende
Gefriertrocknung des Systems erfolgen.
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Das Salz von G-6302 kann in die freie Säure beispielsweise durch Zusatz von ln-Salzsäure zu einer wäßrigen
Lösung beispielsweise des Natriumsalzes von G-6302 zur Einstellung auf pH 3,0 und Entsalzen der Lösung mit
Hilfe von Aktivkohle umgewandelt werden.
Die biologischen Merkmale von G-6302 sind, nachstehend
genannt. Das antibiotische Spektrum von G-6302 und seinem Natriumsalz gegen verschiedene Mikroorganismen
ist in Tabelle 3 angegeben (Agarplatten-Verdünnungsmethode). Die Ergebnisse zeigen, daß das Antibiotikum
G-6302 hauptsächlich gegen gramnegative Bakterien, jedoch auch gegen einige grampositive Bakterien wirksam
ist.
Die akute Toxizität des Natriumsalzes von Antibiotikum G-6302 ist gering. Wenn das Salz in einer Dosis von
500 mg/kg Mäusen intravenös verabreicht wurde, starb kein Tier.
Ferner wurde gefunden, daß G-6302 bei einer· subkutanen
Dosis von 10 mg/kg oder bei einer oralen Dosis von 100 mg/kg eine Schutzwirkung auf Mäuse ausübt, die
mit Escherichia coli oder Klebsieila pneumohiae infiziert worden sind.
Antimikrobielles Spektrum von G—6302 und seinem
Natriumsalz
Testmikroorganismus Mindesthemmkonzentration,
Escherichia coli NIHJ 30 Escherichia coli T-7 . Salmonella typhosa Boxhill 58
Shxgelln flexneri EW-IO
Klebsiella pneumoniae DT
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| G-6302 | .5 | G-6302 | .Na |
| 25 | 25 | ||
| 25 | .5 | 25 | |
| 12 | 12. | 5 | |
| 25 | 25 | ||
| 12 | 12. | 5 | |
| 100 | 100 |
| 100 | 100 |
| 25 | 25 |
| 100 | 100 |
| 100 | > 100 |
| 100 | > 100 |
| 100 | > 100 |
| 100 | 100 |
| 12.5 | 12.5 |
| 100* | > 100* |
| 100* | > 100* |
| 100* | > 100* |
| 100* | > 100* |
- 19 -
Proteus vulgaris IFO 3988
Proteus morpanii IFO 3168
Proteus rairabilis IFO 3849
Proteus morpanii IFO 3168
Proteus rairabilis IFO 3849
Serratia marcescens IFO 12648
Pseudoinonas aerugrinosa U~31
Pseudoinonas aerugrinosa U~31
Staphylococcus aureus FL1A 2O9P '.
Streptococcus pyogenes E-14- . . Bacillus subtilis PCI 219
Corynebacteriura diphtheriae Toronto Candida albicans IFO O583
Corynebacteriura diphtheriae Toronto Candida albicans IFO O583
faccharomyces cerevisiae IFO 0209 '.
Asperpällus niger IFO 4066
Penicillium chrysogenum IFO 4626
Penicillium chrysogenum IFO 4626
Medium = Trypticase-Sojabrühe-Agar 'Medium: Nähragar mit 1% Glucosegehalt
Wie _das vorstehende antibiotische Spektrum zeigt, übt
das Antibiotikum G-6302 gemäß der Erfindung eine hemmende Wirkung auf gramnegative und grampositive
Bakterien aus. Es kann daher zur Behandlung von Infektiorien mit den genannten Bakterien bei Säugetieren
(z.B. Maus, Ratte, Hund und Mensch) und Geflügel (z.B. Huhn und Ente) verwendet werden. Für die Verwendung
als.Mittel gegen Infektionen mit Escherichia coli wird G-6302 beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung
gelöst und parenteral, beispielsweise subkutan oder intramuskulär, in einer Tagesdosis von 5 bis
30 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Für die orale Verwendung wird das Antibiotikum G-6302 beispielsweise
mit Lactose gemischt, in Kapseln gefüllt und in einer Dosis von 20 bis 200 mg (als G-63O2)/kg Körpergewicht
täglich verabreicht.
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G-6302 kann auch als keimtötendes Mittel oder Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise wird
G-6302 zur Herstellung einer Lösung, die 0,1 bis- 1,0% (Gew./Vol.)G-6302 enthält, in destilliertem Wasser gelöst
oder mit einer Salbengrundlage, z.B. Vaseline oder Lanolin, zur Herstellung einer Salbe.formuliert,
die 5 bis 20 mg G-6302/g enthält. Die Lösung bzw. Salbe wird auf Pfoten, Beine, Augen, Ohren oder andere
Teile der vorstehend genannten Tiere als Desinfektionsmittel aufgebracht.
G-6302 ist insofern eine sehr aussichtsreiche Verbindung, als sie als Zwischenprodukt für die Synthese
neuer Medikamente wertvoll ist.
Ein Vergleich von Antibiotikum G-6302 mit den bekannten Antibiotika hatte die folgenden Ergebnisse: Als
Antibiotika, die wasserlöslich und sauer sind und Schwefel enthalten, sind Penicillin und die Cephalosporine zu nennen. G-6302 unterscheidet sich jedoch
von den Cephalosporinen darin, daß es im UV-Bereich des Spektrums nicht absorbiert. Die Tatsache, daß das
kernmagnetische Resonanzspektrum eine chemische Verschiebung zeigt, die O-Methylprotonen zuzuschreiben
ist, und die Tatsache, daß G-6302 bei saurer Hydrolyse Glutaminsäure bildet, stellen Beweise dar, daß
G-6302 von allen natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen verschieden ist.
Es gibt zwar zahlreiche bekannte Antibiotika, die von Bakterien der Gattung Pseudomonas gebildet werden,
aber keines dieser Antibiotika ist in Wasser löslich und sauer und enthält Schwefel. Ferner unterscheidet
sich G-6302 von allen bekannten Antibiotika, die von anderen Mikroorganismen als Pseudomonas-Stämmen gebildet
werden, durch seine einmaligen physikalischchemischen und biologischen Eigenschaften. -G-63O2 ist
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daher als neue Verbindung anzusehen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die
Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm
zu Kubikzentimeter, und die Prozentsätze basieren auf "Gew./Vol.", falls nicht anders angegeben.
Die Zellen von Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P
Nr.4344; IFO 13774; ATCC-31363), die auf Schrägagar gezüchtet worden waren, wurden zum Beimpfen von zwei
Sakaguchi-Kolben verwendet, die ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatten und je 500 Raumteile eines
Mediums aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton (Hersteller Daigo Nutritive Chemicals Co., Japan), 0,5% Fleischextrakt
und 0,5% Natriumchlorid enthielten (pH 7,0). Jeder Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden
Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28°C bebrütet. Die hierbei erhaltene Kultur wurde als Impfkultur verwendet.
In einen als Fertnenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 200000 Raumteilen
wurden 120000 Raumteile eines Mediums gegeben, das 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5%
Fleischextrakt und 0,5% NaCl enthielt und nach Einstellung auf pH 7,0 mit 30%igem wässrigem Natriumhydroxyd
20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert worden war. Der sterilisierte Tank wurde dann
mit der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und bei einer Temperatur von 28°C unter Belüftung mit
einer Rate von 120.000 Raumteilen/Minute und einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM 78 Stunden
bebrütet. Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Sharples-Zentrifugalabscheider zur Entfernung der
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Zellen zentrifugiert, wobei 110000 Raumteile eines flüssigen Überstandes zurückblieben. Die Flüssigkeit
wurde auf pH 4,2 eingestellt und durch eine Säule aus 15000 Raumteilen Aktivkohle (chromatographische Qualitat,
Shirasagi, hergestellt von der Anmelderin) geleitet, wobei die aktive Substanz an der Aktivkohle
adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 45000 Raumteilen Wasser gespült und dann mit 45000 Raumteilen 50%igem
wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10.000 Raumteilen aufgefangen. Die Fraktionen
wurden gegen Proteus mirabilis IFO 3849 getestet. Die Fraktionen Nr.2 und 3 wurden zusammengegossen
und mit 20000 Raumteilen Wasser versetzt. Das Gemisch wurde durcn eine Kolonne geleitet, die mit
10000 Raumteilen des Harzes "Dowex-1" (Cl-Form, Hersteller
Dow and Chemical Industries, USA) gefüllt war. Die Säule wurde mit 25000 Raumteilen Wasser gespült
und dann mit 50000 Raumteilen einer 5%igen wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen
wurden zusammengegossen, auf pH 4,0 eingestellt und erneut durch eine Aktivkohlesäule (8000 Raumteile)
geleitet. Die Säule wurde mit 24000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 20%igem wässrigem Methanol eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 50 Raumteile eingeengt.
Dann wurden 200 Raumteile Aceton zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert, mit 50 Raumteilen
Aceton und 100 Raumteilen Diäthyläther gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet.
Hierbei wurden 12 Teile rohes Produkt erhalten.
In 500 Raumteilen M/100-Phosphatpuffer (pH 6,6) wurden
10 Teile des vorstehend genannten rohen Produkts gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von 200 Raumteilen
DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Schweden) geleitet, das vorher mit der vorstehend genannten Puffer-
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lösung gepuffert worden war. Die Säule wurde mit 400 Raumteilen der gleichen Pufferlösung gewaschen
und dann mit dem gleichen Puffer, dem 0,5% Natriumchlorid zugesetzt worden waren, eluiert. Die aktiven
Fraktionen wurden zusammengegossen, mit In-HCl auf pH 3,2 eingestellt und durch eine Säule von 60 Raumteilen
Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 200 Raumteilen Wasser und 100 Raumteilen 20%igem wässrigem
Methanol gewaschen und anschließend mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden
zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und in 5 Raumteilen Methanol gelöst. Nach Zugabe
von 100 Raumteilen Aceton wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung
wurde abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und 6 Stunden unter vermindertem Druck bei 400C über Phosphorpentoxyd
getrocknet. Hierbei wurden 3,8 Teile eines Pulvers erhalten. Das Infrarot-Absorptionsspektrum
dieses Produkts ist in Fig.l dargestellt.
Elementaranalyse: C 34,83; H 5,41; N 13,22; S 7,65 (Gew.-%).
In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 50000 Raum—
teilen wurden 35000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton,
0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid bestand. Nach Einstellung des Mediums auf pH 7,0 mit 30%igem
wässrigem Natriumhydroxyd wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 1200C sterilisiert. Der sterilisierte Tank
wurde mit dem gleichen Mikroorganismus-Stamm, der bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendet
wurde, beimpft und zur Herstellung einer sekundären Impfkultur 48 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit
einer Rate von 35.000 Raumteilen/Minute und einer
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_ 24 -
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Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet.
In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000
Raumteilen wurden 1 200 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% PoIypepton,
0,5% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,1% Natriumthiosulfat bestand. Nach Einstellung auf
pH 7,0 mit 30%iger Natriumhydroxydlösung wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert. Der
sterilisierte Tank wurde mit der vorstehend genannten sekundären Impfkultur beimpft.
Das beimpfte Medium im Tank wurde 90 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 1 200 000 Raumteilen/Minute
bei einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet, wobei 1 150 000 Raumteile Kulturmedium
erhalten wurden. Diesem Kulturmedium wurden 40 000 Teile des Filterhilfsmittels "Hyflo-Super-Cel"
(Johnes-Manville, USA) zugesetzt, worauf es mit einer Filterpresse filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit
4n-Schwefelsäure auf pH 4,2 eingestellt und durch eine Säule über 120 000 Raumteile ."' Aktivkohle geleitet. Die
Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven
Fraktionen wurden zusammengegossen und zur Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Das
hierbei erhaltene wässrige Konzentrat wurde mit Wasser auf 200 000 Raumteile verdünnt und durch eine Säule
von 50 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Diaion SA-21A" (Cl-Form, Hersteller Mitsubishi Chemical
Industries, Japan) geleitet. Die Säule wurde dann mit 150 000 Raumteilen Wasser gespült und mit l%igem
wässrigem Natriumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem
Druck auf 100 Raumteile eingeengt. Dann wurden 2000 Raumteile Methanol zugesetzt. Das ausgefällte
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Natriumchlorid wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck weiter auf 200 Raumteile
eingeengt, worauf 2000 Raumteile Aceton zugesetzt wurden. Die Fällung wurde abfiltriert und getrocknet.
Hierbei wurden 757 Teile rohes Produkt erhalten.
Dieses rohe Produkt (500 Teile) wurde in 5000 Raumteilen Wasser gelöst, auf pH 4,0 eingestellt und an einer
Aktivkohlesäule (5000'Raumteile) adsorbiert. Das aktive
Ingrediens wurde nach der Gradienten-Elutionsmethode, bei der das Laufmittel von 10 000 Raumteilen
Wasser bis zu 10 000 Raumteilen 70%igem wässrigem Methanol verändert wurde, eluiert. Das Eluat wurde in
Fraktionen von je 1000 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, zur Entfernung
des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt und mit M/100-Phosphatpuffer (pH 6,0) auf
6000 Raumteile aufgefüllt. Diese Probelösung wurde an einer Säule von 3000 Raumteilen des Adsorptionsmittels
"DEAE-Sephadex A-25", das auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise vorbehandelt worden war, adsorbiert. Die Säule wurde mit 6000 Raumteilen des gleichen
Puffers gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, der mit 0,5% Natriumchlorid ergänzt war, eluiert. Das
Eluat wurde in Fraktionen von je 500 Raumteilen aufgefangen.
Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit In-HCl auf pH 3 eingestellt und durch eine
Säule von 500 Raumteilen Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 2000 Raumteilen Wasser bis 2000 Raumteilen
20%igem wässrigem Methanol gewaschen, worauf mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert wurde. Das Eluat
wurde in Fraktionen von je 200 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, unter
vermindertem Druck eingeengt und durch Zusatz von 300 Raumteilen Methanol gelöst. Nach Zugabe von
3000 Raumteilen Aceton und 4000 Raumteilen Diäthyl-
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äther wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Das hierbei ausgefällte G-6302 wurde abfiltriert, mit
Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 72 Teile.
Elementaranalyse: C 35,45; H 5,24; N 13,73; S 7,75
In 90 Raumteilen Wasser wurden 4,0 Teile der gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellten freien Form von G-6302
gelöst. Unter Kühlen wurden etwa 9,0 Raumteile wässriges ln-Natriumhydroxyd zugesetzt. Anschließend wurde
eine weitere Menge ln-Natriumhydroxyd zugesetzt, wobei der pH-Wert der L"öung überwacht wurde, bis er 6,5
erreichte. Die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 4,2 Teile G-6302-Mononatriumsalz als weißes Pulver
erhalten wurden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Produkts nach dem Trocknen unter vermindertem
Druck für 6 Stunden bei 40°C ist in Fig.2 dargestellt.
Elementaranalyse: C 33,08; H 5,07; N 12,73; S 7,33; Na 5,19 (Gew.-%).
Mit den Zellen von auf Schrägagar gezüchtetem Pseudomonas
acidophila G-6302 (FERM-P Nr.4344; IFO 13774; ATCC-31363) wurde ein Kolben geimpft, der ein Fassungsvermögen
von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Mediums aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton,
0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0). Der geimpfte Kolben wurde zur Herstellung
einer Impfkultur auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28°C bebrütet.
Dann wurden in Kolben mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen je 40 Raumteile eines Mediums,
das 3% Glycerin, 1% Glucose, 0,5% Polypepton (Daigo
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Nutritive Chemicals), 0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0), gegeben, worauf
0,02 bis 0,5% verschiedener Schwefelverbindungen.dem Kolben zugesetzt wurden. Jeder Kolben wurde dann mit
1 Raumteil der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und 96 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
bei 28°C bebrütet. Wie die folgende Tabelle zeigt, wurde die Bildung von G-6302 durch den Zusatz der
Schwefelverbindungen erheblich gesteigert.
Schwefelverbindung Konzen- Bildung von
tration G-6302,
Ohne Zusatz - 15
Methionin 15
Cystein Cystin 20 Natriumsulfat
Natriumthiosulfat
| 0,02 0,5 |
Beispiel 5 | 20 43 |
| 0,02 0,1 |
55 65 |
|
| 0,02 0,5 |
30 65 |
|
| 0,02 0,1 |
70 48 |
|
| 0,02 0,1 |
.55 80 |
|
In 7,5 Raumteilen kaltem Wasser wurde 1 Teil der gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestellten freien Form von
G-6302 gelöst. Der Lösung wurden 17,5 Raumteile kaltes Methanol zugesetzt.
Das erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden in der Kälte stehen gelassen, wobei pulverförmiges G-6302 zu farblosen
Kristallen kristallisierte. Die Kristalle wurden isoliert, mit einer geringen Menge kaltem wässrigem
80%igem Methanol, kaltem Methanol und Äther in dieser
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Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck Stunden bei 60°C über Phosphorpentoxyd getrocknet,
wobei 0,930 Teile kristallines G-6302 erhalten wurden, Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erhaltenen
Kristalle sind nachstehend genannt.
1) Schmelzpunkt 168 bis 1700C
2) Elementaranalyse (Gew.-%) Gefunden
C 35.51 35.56
H 5.61 5.61
W 12.93 12.98
S 7Λ5 7.59
Berechnet für C12H20F4SO9 · CH5, OH
C 35.69
H 5.76
N 12.81
S 7.33
3) Spezifische Drehung: £ÖJ^3 + 82° +_ 5° (c = 1,0,
in H2O)
4) IR-Absorptionsspektrum (Fig.3), Hauptpeaks (KBr)
(cm ) :
3440, 3355, 3OOO, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245,
12?0, IO38,
5) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd,
100 MHz) S 3,31 ppm (s, 3H) (auf 0-CH3 von G-6302 zurückzuführende
chemische Verschiebung).
δ 3,20 ppm (s, 3H) (chemische Verschiebung, die auf
das O-CH_ des in den Kristallen enthaltenen
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Methanols zurückzuführen ist).
Die übrigen physikalisch-chemischen Eigenschaften, d.h. UV-Absorptionsspektrum, Löslichkeit in Lösungsmitteln,
Farbreaktionen, Stabilität, Basizität, Neutralität oder Aciditä- sind die gleichen wie bei
dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Produkt.
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- ZO-
Leerseite
Claims (9)
1) Antibiotikum G-6302 und seine Salze, gekennzeichnet
•—■>' durch die folgenden Eigenschaften:
1} Schmelzpunkt 1200C (Sinterung), 130°C (Zers.)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (%)
(nach 6-stündiger Trocknung über Phosphorpentoxyd unter
vermindertem Druck bei 40°C).
4) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
keine charakteristischen Absorptionen über 210 niri
5) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr, Hauptabsorptionen
(Wellenzahlen in cm"1)): 1770, 1650, 1530, 1240, 1043
6) Spezifische Drehung: /ö/?3 + 94° +_ 10° (c = 0,35,
7) Löslichkeit: unlöslich in Petroläther, Hexan,
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ORIGINAL INSPECTED
Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat und Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton;,
löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in V/asser;
8) basisch, neutral oder sauer: sauer
9) Molekulargewicht 400 +_ 20 (durch Titrometrie)
1O) Farbreaktionen: Ninhydrxn- und Kaliumpermanganatreaktionen
positiv; EisenClII)-chlorid-Kaliumferricyanat—Reaktion,
Sakaguchi— und Molisch-Reaktion negativ; L'hrlich-Reaktion: unsicher positiv.
2) Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum G-6302, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus,
der zur Gattung Pseudomonas gehört und Antibiotikum G—6302 zu bilden vermag, in einem Währmedium kultiviert,
das Antibiotikum G-6302 im Kulturmedium sich bilden und anhäufen läßt und das Antibiotikum isoliert.
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas acidophila
verwendet.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas acidophila
G-6302 (ATCC-31363, IFO 13774, FERM-P 4344) verwendet.
5) Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium durch eine Schwefelverbindung
ergänzt, die von dem Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Antibiotikum G-6302
zu bilden vermag, verwertet wird.
6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schwefelverbindung Natriumthiosulfat,
Natriumsulfat, Cystin, Cystein oder Methionin verwendet.
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7) Bine im wesentlichen reine Kultur des zur Gattung Pseudomonas gehörenden Mikroorganismus mit den
Charakteristiken, die mit denen des Mikroorganismus ATCC-31363 identifizierbar sind, wobei diese Kultur
in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und digestjerbare Stickstoffquellen enthält,
eine gewinnbare Menge des Antibiotikums G-6302 zu bilden vermag.
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| DE2855949C2 DE2855949C2 (de) | 1987-06-04 |
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|---|---|---|---|
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