SE433229B - Antibiotikum g-6302, forfarande for framstellning derav genom odling av pseudomonas acidophila g-6302 och den dervid anvenda mikroorganismen - Google Patents

Description

~7a1z3s4-o 2 (b) Odlingsegenskaper på olika medier.

Odling har genomförts vid 28°C, och odlingsresultatet har iakttagits under 1-14 dygn. (l) Näringsagarplatta: Cirkulära, upphöjda kolonier med en diameter av 1-3 mm och med hela kanter bildas efter 3 dygn. Kolonierna är släta, ogenom- skinliga och vita. Inget diffunderbart pigment bildas. (2) Snedkultur på näringsagarfi Å Måttlig tillväxt, som är trådformad, ogenomskinlig och gräddfärgad. ' (3) Näringsbuljong: Grumlig tillväxt, 1 huvudsak utan sedimentering. En hinna uppträder efter 14 dygns odling. (4) Platta med näringsgelatin: Yttillväxt utan smältning. (5) Lakmusmjölk: Ingen förändring. (c) Fysiologiska egenskaper. (1) Reduktion av nitrater: Negativ, (2) Denitrifiering: Negativ. (Ü) Metylrött-test: Negativt. (4) Voges-Proskauer-test: Negativt. (5) Produktion av indol: Negativ. (6) Produktion av vätesulfid: Positiv (svag). v (7) Hydrolys av stärkelse: Negativ, (8) Utnyttjande av citrat: Positivt. a (9) _UtnyttJande av oorganiska kvävekällor: (I) Kaliumnitrat: Negativt till svagt positivt.

(II) Ammoniumsuifat: Positivt. ' (10) Produktion av pigment: Ingen. (ll) Ureas: Positiv. (12) Oxidas: Negativ. (13) Katalasu: Positiv. (14) Tillväxtområde: (I) pH: tillväxt vid pH 4-8, optimal tillväxt vid pH 4,5-6,0.

(II) temperatur: tillväxt vid 2-3700, optimal till- växt vid 25-3o°c. (15) Syrebehov: Aerob tillväxt. __ 7813384-0 (16) oxidativt-fer-mentacivt test enligt Hugh-Leifsons metod: Oxidativ. (17) Prøduktion av syra och gas från sockerarter: Svag syraproduktíon men ingen gasproduktion erhålles i pepbonvatten irlnehàllandë 1 g per 100 ml av D-glykos, D-mannos, D-galaktos, maltos, sackaros, brehalos, D-sorbitol, D-mannitol, inositol eller glycerol. (18) Assimilering av kolkällor. ' I nedanstående tabell 1 anges resultat av odling undør 11+ dygn i oørganisl-ca saltmedier (0,7 g dikaliumvätefosfat, 0,5 g monokaliumdívätefosfat, 0,1 g ammoniumsulfat, 0,1 g natrium- klorid øch 0,01 s MsS04JH2o per 1oo m1 lösning) innehållande 011m kolkällor' .

Tabell l- Assimilering av kolkällor Kolkälla S lvízäàiâlkoncentration Tillväxt L-arabinos l + D-xylos l + D-glulcos l + D-mannos 1 + D- fruktos l + D-galaktos l + Maltos l + Sackaros l + Laktos 1 - Tre halos 1 + D-s ørbitol 1 + D-mannitol 1 + Inos itol l + Glycer-øl 1 + stärkelse l - a-metyl -D-glukos id l + Melibi os l - Adonitol l + Dulcitol l - Raffinos l + cis -akonitat O, 3 + Citrat 0 , 3 + Isocítrat O , 3 + 7813384-0 » 4 Tabell 1 (forts.) Assimilering av kolkällor Kolkälla Slutlig koncentration Tillväxt :__ g/1oo m1 Glukonat 0,3 + Acetat 0,3 + Fumarat 0,3 + Malat 0,3 + Tartrat 0,3 + p-hydroxibensoat 0,3 + L-alanin 0,3 + ß-alanin 0,3 + L-isoleucin 0,3 + Succinat 0,3 + L-valin ~ 0,3 - 2-Ketoglukonat 0 0,5 + Anm: +: tillväxt; tg svag tillväxt; -2 ingen tillväxt. (19) Andra egenskaper: (I) Utnyttjande_av malonatz Negativt.

(II) Deaminering av fenylalanin: Negativ.

(III) Dekarboxylas-aktivitet: ' (a) Arginin: Negativ. (b) Lysinz Negativ. (c) pOrnitin: Negativ.

(IV) Hydrolys av eskulin: Positiv.

(V) Hydrolys av Tween 80: Positiv.

(VI) Guanin-cytosin-halt av DNA: 59,5 mol-%.

Vid jämförelse av de ovan angivna bakteriologiska egenskap- erna av stammen G-6302 med den beskrivning som ges i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Uppl. 7 & 8 finner man, att stammen G-6302 uppenbarligen hör till familjen Psendomonadaceae, eftersom den är en gramnegativ, stavformad bakterie, som är strängt aerob, rörlig med en polär flagell eller polära flageller samt katalas- -positiv. Det faktum att stammen icke har några näringsbehov och har en guanin-cytosin-halt av 59,5 mol-% antyder att stammen hör till släktet Pseudomonas. Såsom exempel på Pseudomonas-bakterier som är relativt besläktade med stammen G-6302 vad beträffar de ovan angivna egenskaperna kan man nämna Pseudomonas syringae och Pseudomonas 7813384-0 o maltophilia, vilka är cytokrom-oxidas negativa. Pseudomonas malto- philia-skiljer sig emellertid uppenbart från stammen G-6302, efter- som Pseudomonas maltophilia kräver metionin och icke ger någon till- växt vid 4°C. Även om Pseudomonas syringae är en art som innefattar ett stort antal underarter, framgår det av nedanstående tabell 2 att en gemensam egenskap hos dylika stammar är oförmàgan att utnyttja vissa kolkällor, vilka kan utnyttjas av stammen G-6302.

Tabell 2 Jämförelse av assimilerbarheten av olika kolkällor.

Pseudomonas Stam Kolkälla syringae G-6302 Trehalos - l + 2-Ketoglukonat g - + ß-Alanin - + L-isoleucin - + Anm: +: assimilering -: ingen assimilering Det optimala pH-värdet för tillväxt av stammen G-6302 är dessutom mycket lågt, nämligen 4,5-6,0, och tillväxt äger rum även vid pH 4,0. Dessa skillnader eliminerar möjligheten att betrakta stammen G-6302 såsom en stam av Pseudomonas syringae. Stammen G-6302 anses därför höra till en ny art av släktet Pseudomonas.

Eftersom det optimala pH-omradet är 4,5-6,0, vilket är lågt för bak- terier av släktet Pseudomonas i allmänhet, har stammen G-6302 be- nämnts Pseudomonas acidophila G-6302.

Prover av stammen G-6302 har deponerats hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Chiba, Japan under deponeringsnumret FERM-P Nr 4344, hos Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan under deponerings- numret IFO 13774 och hos American Type Culture Collection, (ATCC), Maryland, USA under deponeringsnumret ATCC-31363.

De Pseudomonas-bakterier som användes enligt föreliggande uppfinning har vanligen mycket varierande egenskaper och undergàr snabbt mutation när de underkastas konstgjorda mutagena behandlingar, såsom bestrålning med ultraviolett ljus eller röntgenstrålar eller behandling med kemiska mutagener. Alla dylika mutanter med väsent- ligen samma egenskaper som stammen G-6302 är emellertid användbara enligt föreliggande uppfinning, förutsatt att de uppvisar och bibe- håller förmågan att alstra det nya antibiotikumet G-6302. 7s1z3s4~o 6 För odlingen av stammen G-6502 kan man använda sådana kol- källor som glukos, sackaros, maltos, melass, glycerol, oljor och fetter (t.ex. sojabönolja, olivolja, etc.), organiska syror (t,eX, Oïtfflnsyra, bärnstenssyra, glukonsyra, etc.) och andra assimiler- bara kolkällor. Såsom kvävekällor kan man använda organiska och oorganiska kvävehaltiga föreningar och material, t.ex. sojabönmjöl, bomullsfrömjöl, majsstöpvätska, torkad jäst, jästextrakt, köttex_ trakt, pepton, karbamid, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammonium- klorid, ammoniumfosfat, etc. Vidare kan man använda sådana oorganis- ka salter som vanligen erfordras för odling av bakterier, t.ex. nat- riumklorid, kaliumklorid, kalciumkarbonat, magnesiumsulfat, mono- kaliumdivätefosfat, dinatriummonovätefosfat, etc., antingen ensamma eller i lämpliga kombinationer. Det har även visat sig, att utbytet av det önskade antibiotikumet kan ökas genom att man till odlings- mediet sätter en svavelförening som den G-6302-producerande stammen kan utnyttja. Såsom exempel på användbara svavelföreningar kan man nämna oorganiska svavelföreningar, såsom sulfater, (t.ex. natpium- sulfat), tiosulfater (t.ex. natriumtiosulfat) etc., och organiska svavelföreningar, såsom svavelhaltiga aminosyror (t.ex. cystin, cystein, metionin) etc. För detta ändamål föredrages särskilt nat- riumtíosulfat. Koncentrationen av dylika svavelföreningar i odlings- mediet är 0,01-1,0 g per 100 ml, företrädesvis 0,02-0,5 g per 100 ml. Genom tillsättníng av en dylik svavelförening till odlingsmed- iet erhålles en ökad produktion av antibiotikumet G-6502, något som är av avsevärt kommersiellt värde. 7 Vidare kan man till odlingsmediet sätta salter av tungmetall- er, såsom järn(II)sulfat, kopparsulfat, etc., vitaminer såsom vita- min Bl, biotin, etc., och andra tillsatsämnen. Man kan även till- sätta skumdämpare och ytaktiva ämnen, såsom silikonolja, polyalkylen- glykoleter, etc. Andra organiska eller ocrganiska ämnen som främjar tillväxten av mikroorganismen och produktionen av antibiotikumet G-6302 kan naturligtvis också-tillsättas i lämpliga mängder.

Odlingen av stammen G-6302 kan genomföras enligt metoder liknande dem som användes för produktion av antibiotika i allmänhet, varvid man kan använda antingen ett fast odlingsmedium eller ett flytande odlingsmedium. Ett flytande odlingsmedium kan vara station- ärt,_eller det kan omröras eller omskakas eller genombubblas med luft. Det är särskilt lämpligt att använda ett aerobt, omrört flytan- de odlingsmedium. Den föredragna odlingstemperaturen är från 15 till /L- 7813384-0 7 3500, under det att odlingsmediets pH-värde kan vara mellan 4 och 8. Odlingen genomföres under ca 8-168 timmar, företrädesvis under 24-lhä timmar. Eftersom produkten, dvs. antibiotikumet G-6302, huvudsakligen är närvarande i jäsningsbuljongens flytande fas, är det lämpligt att oentrifugera eller filtrera odlingsbuljongen för att avskilja överstàende vätska eller filtrat från cellmassan. Man renar därefter antibiotikum G-6502 i den överstàende vätskan eller filtratet. Direkt rening i odlingsbuljongen är emellertid också möjlig, om så önskas.

Den erhållna produktens styrka kan bestämmas genom prov med Proteus mirabilis IFO BBÄ9 såsom testorganism och användning av G-6502 såsom standard. Härvid användes antingen cylindermetoden eller metoden med pappersskivor, och såsom medium användes trypti- kas~soJa-agar (Baltimore Biologicals, Limited, USA).

Antibiotikumet G-6302 kan utvinnas enligt olika metoder av den typ som vanligen användes för utvinning av mikrobiella metabo- liter. Cellerna kan sålunda avlägsnas genom centrifugering, varef- ter den aktiva produkten separeras från den överstàende vätskan och renas enligt konventionella metoder. Man kan t.ex. använda sig av antibiotikumets löslighet i ett lämpligt lösningsmedel, varvid lös- lighetsskillnader utnyttjas, eller man kan utfälla antibiotikumet ur en lösning, varvid skillnader i utfällningshastighet utnyttjas.

Man kan vidare utnyttja antibiotikumets karaktäristiska adsorptions- affinitet till olika adsorptionsmedel. Man kan även genomföra jon- bytarkromatografi på jonbytare, genomföra koncentrering under för- minskat tryck eller genomföra frystorkning, kristallisation, omkris- tallisation, torkning, etc. Dessa olika metoder kan användas anting- en var för sig eller i lämpliga kombinationer, och metoderna kan eventuellt upprepas en eller flera gånger.

En typisk procedur beskrives nedan. Efter avslutad odling filtreras odlingsbuljongen, och det resulterande filtratet ledes genom en kolonn av aktivt kol, varpå det adsorberade antibiotikumet G-6502 elueras med ett hydrofilt organiskt lösningsmedel. Såsom exem- pel på hydrofila organiska lösningsmedel kan man nämna lägre ketoner, (t.ex. aceton, metyletylketon, metylisobutylketon, etc), lägre alko- holer (t.ex. metanol, etanol, isopropanol, propanol, butanol, etc).

Dessa lösningsmedel kan användas antingen ensamma eller i blandning med vatten. Pa grund av antibiotikumets G-6502 sura natur kan man med fördel använda anjonbytare i Cl-form (Amberlite IRA-400 & 402, 7813384~O 8 Amberlite Co., USA; Dowex-1, Dow and Chemical Co., USA;-Dåaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Industries, Japan). Den adsorberade aktiva produkten elueras med t.èx. en vattenlösning av natriumklo- rid. För avsaltning av eluatet genomföres på nytt kolonnkromatografi på aktivt kol. Det härvid erhållna eluatet koncentreras, varefter exempelvis aceton tillsättes. Den härvid bildade fällningen avskilj- es genom filtrering, tvättas med aceton och dietyleter och torkas under förminskat tryck, varvid ett ljusbrunt pulver erhålles. För rening av antibiotikumet G-6302 i pulverform kan man med fördel an- vända sig av kolonnkromatografi på DEAE-Sephadex (Pharmacia, Sverige).

En kolonn av DEAE-Sephadex A-25 tvättas sålunda med 0,01 M fosfat- buffert (pH 6,6), och en vattenlösning av det erhållna pulvret ledes genom kolonnen för adsorption av antibiotikumet. Kolonnen tvättas med samma buffertlösning som ovan, och eluering genomföres med samma buffert innehållande 0,5 g natriumklorid per 100 ml lösning. De akti- va fraktionerna förenas och pH-värdet inställes på 3,0. Lösningen ledes därefter på nytt genom en kolonn av aktivt kol. Kolonnen tvätt- as med vatten och med vattenhaltig metanol (20 volymprocent). Man eluerar därefter med vattenhaltig aceton, och de aktiva fraktionerna förenas och koncentreras under förminskat tryck. Aceton sättes till koncentratet, varvid G-6302 erhålles. Antibiotikumet G-6302 bildar metallsalter och ammoniumsalt. Såsom exempel på metallsalter kan man nämna natriumsalt, kaliumsalt, litiumsalt, etc.

Nedan anges de fysikalisk-kemiska egenskaperna för det i exempel 1 framställda antibiotikumec G-6502. _ 1. Smältpunktz 12o°c (sincring), 15o?c (sönderaelning). 2. Utseende: vitt pulver. 3. Elementaranalys i % efter torkning under förminskat tryck över fosforpentoxid vid 4000 under 6 timmar: 0 54,85 55,45 (51a99 _+_ 0,5) H 5,111 5,24 (5,58 i 0,5) N 15,22 15,75 (15,60 i 0,5) S 7,65 i 7,75 (7,70 i 0,5) 0 (58,15 i 0,5) 4. Molekylvikt: Titrimetri: 400 ï_2O Empirisk formel baserad på ovanstående data: c12H20N4so9.H2o _ Beräkn.: c 34,78; H 5,35; N 13,52; S 7,74. . . ll. 12. 7813384-0 9 UV-absorption: endast ändabsorption (ingen karaktäristisk absorption över 210 nm).

. IR-spektrum (KBr): se fig. 1.

Nedan anges vágtalen 1 cm' för de dominerande topparna: 544o(s), 292o(m), 285o(m), 26oo(w), 177o(s), 165o(s), 153o(s), 1458(m), 159o(w), 134o(w), 128o(sn), 124o(s), 121o(sh), 118o(m), 1118(w), 1o43(s), 792(w), 632(s). (s, m och w betecknar kraftig, medelkraftig respektive svag absorption; sh betecknar platå). specifik vridning: göjš3 +91+°¿1o° (c=o,35, Hzo).

NMR-spektrum i dimetylsulfoxid (100 MHz): J},3l ppm (S, en kemisk förskjutning som kan tillskrivas o-ckâ).

Löslighet 1 lösningsmedel: Antibiotikumet är olösligt 1 petroleumeter, hexan, dietyl- eter, bensen, etylacetat och kloroform; svárlösligt 1 etanol, pyridin och aceton; lösligt 1 metanol och dimetyl- sulfoxidg och lättlösligt i vatten.

Färgreaktioner: Positiv; ninhydrin och kaliumpermanganat; Negativ: järn(III)klorid-kaliumferrioyanid, Sakaguchi och Molisch reaktioner; Tveksamt positiv: Ehrlichs reaktion.

Stabilitet: Antibiotikumet är stabilt 1 vattenlösning inom pH-omradet 5-7 vid 60°C under 10 minuter men är instabilt vid pH-värden över 8,5.

Basioitet, neutralitet eller aciditet: Antibiotikumet är surt.

Nedan anges de fysikalisk-kemiska egenskaperna för det 1 exempel 5 framställda natriumsaltet av G-6302¿ 1. 2D 3.

Smältpunktz ingen bestämd smältpunkt (brunfärgning vid 17o°c).

Utseende: vitt pulver.

Elementaranalys i % efter torkning under förminskat tryck över fosforpentoxid vid 40°C under 6 timmar: C 53:08 35:32 H 5,07 4197 H 12,73 13,27 S 7,53 7:43 Na 5:19 5:51 7813381e “Û 4. Molekylvikt: 458 t 5 under antagande-av att varje mole- kyl innehåller en molekyl natrium.

Empirisk formel baserad på ovanstående data: cleslgmasognaæïgo _ Beräkn.: C 33,03; H.4,85; N 12,84; S 7,355 ja 5,27.

. UV-spektrum: endast ändabsorption. l 6. IR-spektrum (KBr): se fig. 2. Vàgtalen i cm'1 för de dominerande topparna anges nedan: - 5450(S), 5250(Sh)» 3000(m), l770(S), l640(S), l530(S), 145o(w), 11+o5(w), 1343(w), 12800511), 1245(s), 118o(w), 1118(w), 1o5o(s), 82o(w), 785m), 632(s). (s, m och w betecknar kraftig, medelkraftig respektive svag absorption; sh betecknar platå). 7. specifik vridning: ßj? +85°¿1o° (e=o,37, H20). 8. Löslighet i lösningsmedel: Olösligt i petroleumeter, hexan, dietyleter, bensen, etylacetat, kloroform och aoeton; svårlösligt 1 meta- nol, etanol och pyridin; lösligt i dimetylsulfoxid; lättlösligt 1 vatten. 9. Färgreaktioner: Positiv: ninhydrin och kaliumpermanganat; Negativ: järn(III)klorid~kaliumferricyanid, Sakaguchi och Molisch reaktioner; Tveksamt positiv: Ehrlichs reaktion.

. Stabilitet: stabilt i vattenlösning inom pH-området 3-7 vid 60°C under 10 minuter; instabïlt över pH 8,5.

För omvandling av den fria syraformen av antibiotikumet G-6302 till ett salt, t.ex. natriumsaltet, sättes en ekvimolär mängd natriumhydroxid till en vattenlösning av den fria syran, varefter systemet frystorkas. ' i Ett salt av G-6302 kan omvandlas till den fria syraformen genom att man t.ex. sätter 1 N klorvätesyra till en vattenlösning av t.ex. natriumsaltet av G-6302, så att lösningens pH-värde sänkes till 3,0. Därefter avsaltas lösningen med hjälp av aktivt kol.

De biologiska egenskaperna av antibiotikumet G-6502 anges nedan. Det antimikrobiella spektrumet av G-6502 och dess natriumsalt mot olika mikroorganismer anges 1 nedanstående tabell 3 (metoden med utspädning på agarplattor). 7813384-0 11 Av resultaten i tabell 5 framgår, att antibiotikumet G-6302 huvudsakligen är aktivt mot gramnegativa bakterier, men antibioti- kumet är även aktivt mot några grampositiva bakterier.

Den akuta giftigheten av natriumsaltet av antibiotikumet G-6302 är låg. Inga försöksdjur dör vid intravenös administrering av detta salt till möss 1 en dos av 500 Ing/kg.

Antibiotikumet G-6302 har även visat sig ha en skyddande verkan på möss infekterade med Escherichia coli eller Klebsiella pneumoniae i en subkutan dos av 10 mg/kg eller en oral dos av 100 mß/ks- Tabell 2 Antimikrobiellt spektrum av G-6302 och dess natriumsalt Minsta hämmande koncentration - ps/ml Testorganism G-6302 G-6302-Na Escherichia coli NIHJ 25 25 Escherichia coli T-7 25 25 Salmonella typhosa Boxhill 58 12,5 12,5 Shigella flexneri Ew-10 2 25 Klebsiella pneumoniae Ur 12,5 12,5 Proteus vulgaris IFO 3988 100 100 Proteus morganii IFO 5168 100 _ 100 Proteus mirabilis IFO 3849 25 25 Serratia marcescens IFO 12648 100 100 Pseudomonas aeruginosa U-51 ,>l00 >lOO stapnyioßøccus aux-aus FDA 2o9P 1>1oo >1oo Streptococcus pyogenes E-14 >lOO >1OO Bacillus subtilis PCI 219 100 100 Corynebacterium dphtheriae Toronto 12,5 12,5 Candide aibicans :Fo 0583 >1oo* >1oo* Saocbaromyces cerevisiae IFO 0209 >100* >lOO* Aspergilius niger Iro 4066 >1oo* >1oo* Penieiilium cnrysogenum IFo 4626 >1oo* >1oo* Anm.: Medium = Tryptikas-soja-buljong-agar *Medium = Näringsagar innenaiiande 1 76 glukos.

Av ovanstående antimikrobiella spektrum framgår, att antibio- tikumet G-6502 enligt uppfinningen hämmar såväl gramnegativa som gram~ positiva bakterier. Antibiotikumet kan därför användas vid behandling 7813384-0 12 av infektioner framkallade av de ovan angivna bakterierna hos dägg- djur (t.ex. möss, råttor, hundar och människor) och domesticerade fågelarter (t.ex. hönsfåglar och ankor). När antibiotikumet G-6302 användes för att bota infektioner av Escherichia coli, löses anti- biotikumet t.ex. i fysiologisk saltlösning och administreras parente- ralt, t.ex. subkutant eller intramuskulärt, i en dygnsdos av 5-30 mg/kg. För oral idministrering blandas antibiotikumet G-6302 t.ex. med laktos, varefter blandningen hälles 1 kapslar. Administrering sker i en dygnsdos av 20-200 mg G-6302 per kg kroppsvikt.

Antibiotikumet G-6502 kan även användas såsom germicid eller desinfektionsmedel. Antibiotikumet G-6302 kan t.ex. lösas i des- .tillerat vatten till bildning av en lösning innehållande O,l-l,O g G-6302 per 100 ml lösning. Alternativt kan antibiotikumet G-6302 blandas med en salvbas, såsom vaselin eller lanolin, till bildning av en salva innehållande 5-20 mg G-6302 per g. Den framställda lös- ningen eller salvan kan anbringas på tassarna, benen, ögonen, öron- en eller andra delar av de ovan angivna djuren såsom desinfektions- medel.

G-6302 är en mycket lovande förening, eftersom den kan an- vändas såsom mellanprodukt för syntes av nya medicinska substanser.

En jämförelse mellan antibiotikumet G-6302 och kända anti- biotika har avslöjat följande. Såsom exempel på antibiotika, vilka är lösliga i vatten, är sura och innehåller svavel, kan man nämna penicilliner och cefalosporiner. Eftersom antibiotikumet G-6302 icke uppvisar någon absorption i det ultravio1=tta området av spek- trum, skiljer det sig emellertid från eefalosporiner. Vidare skilj- er sig antibiotikumet G-6302 från naturligen förekommande penicillin- er och cefalosporiner, eftersom NMR-spektrumet ger en kemisk för- skjutning som kan tillskrivas 0-metylprotoner och eftersom glutamin- syra erhålles vid sur hydrolys.

Det finns â andra sidan många kända antibiotika som alstras av bakterier av släktet Pseudomonas, men inget av dessa är ett vattenlösligt antibiotikum, som är surt och innehåller svavel. Anti- biotikumet G-6502 skiljer sig dessutom från kända antibiotika pro- duoerade av andra mikroorganismer än Pseudomonas-stammar genom att det har unika fysikaliskskemiska och biologiska egenskaper. Anti- biotikumet G-6302 måste därför anses vara en ny förening.

Uppfinningen illustreras genom följande exempel. 7813384-0* 13 Exemggl l. Celler av Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM- -P Nr. 4544; IFO 15774; ATCC~3l363) odlade på en snedkultur av när- ingsagar användes för att ympa två 2 liters Sakaguchi-kolvar vardera innehållande 500 ml av ett medium bestående av 1 g gluk0S, 0,5 E polypepton (tillverkat av Daigo Nutritive Chemicals Co, Japan) 0,5 g köttextrakt och 0,5 g natriumklorid per 100 ml lösning; mediets pH-värde var 7,0. Varje kolv inkuberades vid 28°C under 48 timmar på en skakapparat med fram- och återgàende rörelse. Den resulterande kulturen användes såsom ympkultur.

En jäsningsbehållare av rostfritt stål med volymen 200 liter fylldes med 120 liter av ett medium innehållande 3 g glycerol, 0,1 g glukos, 0,5 g polypepton, 0,5 g köttextrakt och 0,5 g NaCl per 100 ml lösning. Efter inställning av pH-värdet på 7,0 med 30 %-ig vattenlösning av natriumhydroxid steriliserades med vattenånga vid l20°C under 20 minuter. Den steriliserade behållaren ympades däref- ter med den ovan framställda ympkulturen, och man inkuberade vid en temperatur av 2800 under luftning med 120 liter luft per minut och under omrörning med 180 varv per minut under 78 timmar. Ibn resul- terande buljongen centrifugerades i en Sharples centrifugalseparator för avlägsnande av cellerna, varvid man erhöll 110 liter överstàen- de vätska. Denna vätskas pH-värde inställdes på 4,2, varefter väts- kan leddes genom en kolonn innehållande 15 liter aktivt kol (kroma- tografisk kvalitet Shirasagi från Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan). Den aktiva substansen adsorberades på det aktiva kolet.

Kolonnen tvättades med 45 liter vatten, varefter man eluerade med 45 liter vattenhaltig aceton (50 volymprocent). Eluatet uppsamlades i fraktioner med volymen 10 liter. Fraktionerna analyserades med hjälp av Proteus mirabilis IFO 3849. Fraktionerna 2 och 3 förenades, liter vatten tillsattes, och den erhållna blandningen leddes genom en kolonn fylld med 10 liter Dowex-l 1 Cl-form (Dow and Chemical Industries, USA). Kolonnen tvättades med 25 liter vatten, varefter man eluerade med 50 liter av en 5 X-ig vattenlösning av natriumklo- rid. De aktiva fraktionerna förenades, pH-värdet inställdes på Ä,0, och den resulterande blandningen leddes genom en kolonn av 8 liter aktivt kol. Kolonnen tvättades med 24 liter vatten, varefter man eluerade med vattenhaltig metanol (20 volymprocent). De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades till en volym av 50 ml under förminskat tryck. Man tillsatte därefter 200 ml aceton, och den resulterande fällningen avlägsnades genom filtrering, tvättades vs133aß-n 14 med 50 ml aceton och med l00 ml dietyleter och torkade: därpå under förminskat tryck. Man erhöll härvid 12 g oren produkt. g av den ovan erhållna orena produkten löstes i 500 ml 0,01 M fosfatbuffert (pH 6,6), och den resulterande lösningen leddes genom en kolonn av 200 ml DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Sverige).

Kolonnen hade i förväg buffrats med samma buffertlösning som ovan.

Kolonnen tvättades med 400 ml av samma buffertlösning, varefter man eluerade med samma buffert innehållande 0,5 g natriumklorid per 100 ml. De aktiva fraktionerna förenades, och pH-värdet inställdes på 5,2 med 1 N HCl. Den resulterande blandningen leddes genom en kolonn innehållande 60 ml aktivt kol. Kolonnen tvättades med 200 ml vatten och med 100 ml vattenhaltig metanol (20 volymprocent), var-- efter man eluerade med vattenhaltig aceton (50 volymprocent). De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades under förminskat tryck. Återstoden löstes i 5 ml metanol. Efter tillsättning av 100 ml aoeton fick den resulterande lösningen stå kallt. Den härvid bildade fällningen avskiljdes genom filtrering, tvättades med dietyl- eter och torkades under förminskat tryck över fosforpentoxid vid 40°C under 6 timmar. Härvid erhölls 3,8 g pulver. Den erhållna produktens IR-spektrum visas i fig. l. f Elementaranalys: C 34,83; H 5,41; N 13,22; S 7,65 vikt-%.

Exemgel 2. En jäsningsbehållare av rostfritt stål med volym- en 50 liter fylldes med 35 liter av ett medium innehållande 3 g glycerol, 0,1 g glukos, 0,5 g polypepton, 0,5 g köttextrakt och 0,5 g natriumklorid per 100 ml. Efter inställning av mediets pH-värde på 7,0 med en 30 %-ig vattenlösning av natriumhydroxid sterilisera- des mediet med vattenånga vid l20°C under 20 minuter. Den sterilise- rade behållaren ympades med samma mikroorganism-stam som i exempel l och inkuberaaes under 48 timmar vid 28°c under iuftning med 55 111m- luft per minut och under omrörning med en hastighet av 180 varv per minut. På detta sätt framställdes en andra ympkultur.

En jäsningsbehållare av rostfritt stål med volymen 2000 liter fylldes med 1200 liter av ett medium innehållande 3 g glycerol, 0,1 g glukos, 0,5 g polypepton, 0,5 g köttextrakt, 0,5 g natriumklorid, och 0,1 g natriumtiosulfat per 100 ml lösning. Efter inställning av pH-värdet på 7,0 med en 50 %-ig natriumhydroxidlösning steriliserades mediet med vattenånga vid l20°C under 20 minuter. Den steriliserade behållaren ympades med den ovan framställda andra ympkulturen. vaiš334~o Den ympade behållaren inkuberades under 90 timmar vid 2800 under luftning med en hastighet av 1200 liter luft per minut och under omrörning med en hastighet av 180 varv per minut. Härvid er- hölls 1150 liter odlingsbuljong. Till denna buljong sattes 40 liter Hyflo-Super-Cel (Johnes-Manville, USA), varefter man filtrerade i en filterpress. Filtratets pH-värde inställdes på 4,2 med 4 N sva- velsyra, varefter filtratet leddes genom en kolonn innehållande 120 liter aktivt kol. Kolonnen tvättades med 300 liter vatten, varefter man eluerade med vattenhaltig aceton (50 volymprocent). De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades under förminskat tryck för avlägsnande av aoetonen. Det härvid erhållna vattenhaltiga kon- centratet utspäddes med vatten till en volym av 200 liter, varefter den utspädda blandningen leddes genom en kolonn innehållande 50 li- ter Diaion SA-°lA i Cl-form (Mitsubishi Chemical Industries, Japan).

Kolonnen tvättades med 150 liter vatten, varefter man eluerade med en l %_íg vattenlösning av natriumklorid. De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades under förminskat tryck till en volym av 100 ml. Därefter tillsattes 2 liter metanol, och den utfällda nat- riumkloriden avfiltrerades. Filtratet koncentrerades ytterligare vid förminskat tryck till en volym av 200 ml, varefter 2 liter ace- ton tillsattes och den bildade fällningen avfiltrerades och torkades.

Man erhöll härvid 757 g oren produkt. 500 g av denna orena produkt löstes i 5 liter vatten. Efter inställning av pH-värdet på 4,0 leddes lösningen genom en kolonn innehållande 5 liter aktivt kol. Den akti- va bestàndsdelen eluerades genom gradienteluering från 10 liter vatt- en till 10 liter vattenhaltig metanol, (70 volymprocent). Eluatet uppsamlades i fraktioner med volymen l liter. De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades under förminskar tryck för avlägsnande av metanolen. Koncentratet utspäddes till 6 liter med 0,01 M fosfat- buffert (pH 6,0). Den härvid erhållna lösningen adsorberades på en kolonn av 3 liter DEAE-Sephadex A-25, vilken kolonn hade preparerats på samma sätt som beskrives i exempel l. Efter tvätning av kolonnen med 6 liter av samma buffert eluerade man med samma buffert inne- hållande 0,5 g natriumklorid per 100 ml. Eluatet uppsamlades i frak- tioner med volymen 500 ml. De aktiva fraktionerna förenades, och pH-värdet inställdes på 3 med 1 N Hcl. Den resulterande blandningen leddes genom en kolonn innehållande 500 ml aktivt kol. Kolonnen tvättades med 2 liter vatten och med 2 liter vattenhaltig metanol, (20 volymprocent) varefter man eluerade med vattenhaltig aceton 7813384-0 16 (50 volymprocent). Eluatet uppsamlades i fraktioner med volymen 200 mló De aktiva fraktionerna förenades och koncentrerades under förminskat tryck, och återstoden löstes genom tillsättning_av 300 ml metanol. Efter tillsättning av 5 liter aceton och 4 liter dietyleter fick den resulterande lösningen stå i kyla. Det härvid utfällda anti- biotikumet G-6502 avskiljdes genom filtrering, tvättades med dietyl- eter och torkades under förminskat tryck över fosforpentoxid. Man erhöll härvid 72 g produkt. ' Eiementaranalys: c 55,45; H 5,24,- N 13,75,- s 7,75 vikt-f.

Exemgel 2. I 90 ml vatten löstes 4 g av den i exemplen 1 och 2 erhållna fria formen av antibiotikumet G-6502. Under kylning tillsattes därefter ca 9 ml l N vattenlösning av hydroxid. Därefter tillsattes en ytterligare mängd l N natriumhydroxidlösning, varvid .lösningens pH-värde mättes till dess att pH-värdet blev 6,5. Lösning- en frystorkades, varvid man erhöll 4,2 g G-6502-mononatriumsalt såsom ett vitt pulver. Efter torkning av produkten under förminskat tryck vid 40°C under 6 timmar uppvisade produkten det 1 fig. 2 visade IR- -spektrumet. ' Elementaranalys: C 53,08; H 5,07; N 12,75; S 7,35; Na 5,19 vikt-%. y Exemgel 4. Celler av Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P Nr 4544; IFO 13774; ATCC-31365) odlade på en snedkultur av närings- agar användes för att ympa en 200 ml konisk kolv innehållande 40 ml av ett medium innehållande l g glukos, 0,5 g polypepton, 0,5 g kött- extrakt och 0,5 g natriumklorid per 100 ml; mediets pH-värde var 7,0. Den ympade flaskan inkuberades vid 2800 under 48 timmar på en roterande skakapparat. Härvid erhölls en ympkultur.

Koníska kolvar med volymen 200 ml fylldes med vardera 40 ml av ett medium innehållande 3 g glycerol, l g glukos, 0,5 g polypep- ton (Daigo Nutritive Chemicals), 0,5 g köttextrakt och 0,5 g natrium- klorid per 100 ml. Mediets pH-värde var 7,0. Till kolvarna sattes 0,02-0,5 g per 100 ml av olika svavelföreningar. Varje kolv inkube- rades därefter med l ml av den ovan framställda ympkulturen, och man inkuberade på en roterande skakapparat vid 28°C under 96 timmar. Av resultaten i nedanstående tabell framgår, att produktionen av G-650 ökades kraftigt genom tillsättningen av svavelföreningar. 4 78133811-0 17 Koncentration Produktion Svavelförening g/100 ml pg/ml; Ingen -- 15 Metionin 0,02 20 0,5 45 Cystein 0,02 55 0,1 65 Cystin 0,02 30 0,5 65 Natriumsulfat 0,02 70 0,1 48 Natriumtiosulfat 0,02 55 0,1 80 Exemgel 5. I 7,5 ml kallt vatten löstes l g av den 1 exem- pel l eller exempel 2 erhållna fria formen av G-6302. Man tillsatte därefter 17,5 ml kall metanol.

Den sålunda erhållna blandningen fick stå kallt under 24 timmar, varvid pulvret av G-6302 kristalliserade till färglösa kristaller. Kristallerna uppsamlades, tvättades med en liten mängd kall vattenhaltig metanol (80 volymprocent), med kall metanol och med eter, och torkades därefter över fosforpentoxid under förmins- kat tryck vid 60°C under 6 timmar. Härvid erhölls 0,930 g kristall- er av G-6302. De fysikalisk-kemiska egenskaperna av de sålunda er- hållna kristallerna anges nedan: 1. smä1tpunkt= 168-17o°c. 2. Elementaranalys i vikt-S: Funnet: C 55,51 55,55 H 5,61 5,61 N 12,93 12,98 S 7,45 7,59 Beräknat för Cl2H2ON¿SO C 55,69 H 5,76 N 12,81 S 7,55 3. Specifik vridning: ¿@/š3+82°¿5° (c=1,ø, 1 H20). 9.cH3oH.1/2H2o=

Claims (5)

7813384-0 âV

1. 4. 18 IR-spektrum (KBr): se fig. 5. Nedan anges vågtalen i cm"l för de dominerande topparna: }4Ä0, 3355, ÉOOO, 1780, 1660, 1650, l5§8, 1265, 1245, 1220, 10§8, 625. NMR-spektrum i dimetylsulfoxid (100 MHz): ¿'3,31 ppm (s, 3H) (en kemisk förskjutning som kan üll- skrivas o-CH; 1 G-ójoz). J 5,20 ppm (s, BH) (en kemisk förskjutning som kan till- skrivas O-CH3 i metanol, som ingår i kristallerna). Andra fysikaliskekemiska egenskaper, dvs. UV-absorption, löslighet i olika lösningsmedel, färgreaktioner, stabilitet samt basicitet, neutralitet eller aoiditet, är desamma som för den i exempel l erhållna produkten. Strukturformeln för det nya antibiotikumet G-6302 har i efterhand bestämts till: NH2 H CH c o v :311 g 3 Ho c-c-cH -cH -c-N- -c-N - 2 ¿ 2 26 H H /_...N o/ \soH 5 'Patentkrav Antibiotikum G-6302 och salter därav, k ä n n e t e c k n a t att det har följande egenskaper: (1) (2) (3) (4) (5) _16) Smältpunkt: 12000 (sintring), 130°C (sönderdelning) Utseende: vitt pulver 7 Elementaranalys i % efter torkning över fosforpentoxid under förminskat tryck vid 40°C under 6 timmar: C 34,99 0,5 H 5,58 0,5 N 13,30 0,5 O 38,13 0,5 S 7,70 0,5 UV-absorption: ingen karakteristisk absorption över 1210 nm IR-spektrum (KBr): |+ |+ |+ |+'|+ dominerande absorption vid följande vågtal: 1770, 1650, 1530, 1240, 1043 cm_1 Specifik vridning: [QÅÉ3 + 940 i 1o° (Cs0,35, Hg?)H '781338lv0 19 (7) Löslighet: olösligt i petroleumeter, hexan, dietyleter, bensen, etylacetat och kloroform; svårlös- ligt i etanol, pyridin och aceton; lösligt i metanol och dimetylsulfoxid; och lättlös~ ligt i vatten (8) Basicitet, neutralitet eller aciditet: Antibiotikumet är surt (9) Mo1eky1vikt= 400 ï zo (bestämt genom titrimetri) . (10) Färgreaktioner: Positiv: ninhydrin- och kaliumpermanganat-reaktioner; Negativ: järn(III)klorid-kaliumferricyanid, Sakaguchi och Molisch reaktioner; Tveksam positiv: Ehrlichs reaktion.

2. Förfarande för framställning av antibiotikumet G-6302 enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att Pseudomonas acidophila G-6302 (IFO 13774) odlas i ett odlingsmedium till dess att anti- biotikum G-6302 har alstrats och ackumulerats i odlingsbuljongen, varefter antibiotkumet utvinnes.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att man till odlingsmediet sätter en svavelförening, vilken assimile- ras av mikroorganismen Pseudomonas acidophila G-6302 (IFO 13774).

4. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att svavelföreningen är natriumtiosulfat, natriumsulfat, cystin, cyste- in eller metionin.

5. En i huvudsak ren kultur av en mikroorganism hörande till släktet Pseudomonas och med egenskaper identifierbara med egenska- perna av IFO 13774, k ä n n e t e c k n a d av att den i ett odlingsmedium innehållande assimilerbara kolkällor och smältbara kvävekällor kan producera en utvinningsbar mängd av antibiotikumet G-6302.