DK147452B

DK147452B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotikum benaevnt sulfazecin eller antibiotikum g-6302 samt mikroorganismekultur til anvendelse ved udoeve lse af fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK147452B
Application number: DK582978AA
Authority: DK
Inventors: Akira Imada; Kazuaki Kitano; Mitsuko Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-12-30
Filing date: 1978-12-27
Publication date: 1984-08-13
Also published as: DE2855949A1; PH15534A; CH644593A5; GB2011380A; HU179350B; CA1113873A; ZA786882B; CS208768B2; DE2855949C2; ES476480A1; NL7812493A; AU4230778A; JPS54163501A; US4229436A; DK147452C; SU1003761A3; BE873217A; SE7813384L; SE433229B; AU521534B2

Description

i U7452

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum benævnt sulfazecin eller Antibiotikum G-6302 og med formlen NH- CHo OCK^ I 2 H f 3 Η * 3

HO„C - C - CEL· - CtL· -C-N-C-C-N

2 i 2 2 II i II J—ν'

H 0 B O O XS03H

eller et salt deraf.

Det har vist sig, at mikroorganismer hørende til en hidtil ukendt art af slægten Pseudomonas er i stand til ved dyrkning i et egnet kulturmedium at akkumulere ovennævnte antibiotikum, som er hæmmende over for gram-positive og gram-negative bakterier. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at en organisme af arten Pseudomonas acidophila dyrkes i et kulturmedium, hvorpå det dannede antibiotikum udvindes fra dyrkningsmediet, om ønsket i form af et salt deraf.

Som et eksempel på en stamme af arten Pseudomonas acidophila kan nævnes stamme G-6302 (ATCC-31363, IFO 13774, FERM-P nr.

4344), som isoleredes fra jordprøver opsamlet i Ashigara-Shimo-Gun, Kanagawa Prefecture, Japan.

De bakteriologiske egenskaber af Pseudomonas acidophila stamme G-6302 er som følger: 2 U7A52 (a) Morphologis

Efter 2 dage på en skråstivnet næringsagar ved 28°C er cel= lerne stavformede med en diameter på 0,7-1,0μ og en længde på 0,7-3,5μ. Uden polymorphisme, bevægelig med polære fla= geller eller et polært flagellum. Ikke-spordannende; ingen akkumulering af poly-(3-hydroxy smørsyre som en intracellulær carbonreserve (R.Y. Stanier et al: Journal of General Micro= biology 43, 159 (1966)). Gramnegativ, ikke-syrefast.

(b) Dyrkningsegenskaber på forskellige mediers Dyrket ved 28°C og observeret i 1-14 dage.

(1) Næringsagarplade: cirkulære, hævede kolonier med en diameter på 1-3 mm med intakte rande er dannet efter 3 dage; glat, uigennemsigtig,hvid overflade,intet dif-fusibelt pigment dannet.

(2) Skråstivnet næringsagar: Moderat vækst trevleformet, uigennemsigtigt og flødefarvet.

(3) Næringssuppe: Uklar vækst, i alt væsentligt uden se= dimentation. En hinde viser sig efter 14 dages kul= tivering.

(4) Næringsmiddel gelatinestik: Overfladevækst, uden smeltning.

(5) Lakmusmælk: Ingen ændring (c) Fysiologiske egenskaber: (1) Reduktion af nitrater: Negativ (2) D.enitrifikation: Negativ (3) MR (methylrød) test: Negativ 3 147452 (4) VP (Voges-Proskauer) test: Negativ (5) Produktion af indol: Negativ (6) Produktion af hydrogensulfid: Positiv (svag) (7) Hydrolyse af stivelse: Negativ (8) Udnyttelse af citrat: Positiv (9) Udnyttelse af uorganiske nitrogenkilder I) Kaliumnitrat: Negativ til svag positiv II) Ammoniumsulfat: Positiv (10) Produktion af pigmenter: ingen.

(11) Urease: Positiv (12) Oxidase: Negativ (13) Katalase: Positiv (14) Vækstområde:

I) pH: Vækst ved pH-værdi 4-8, optimalt pH 4,5-6,0 II) Temperatur: vækst ved 2-37°C, optimalt 25-30°C

(15) Oxygenbehov: aerob (16) O-F (oxidativ-fermentativ) test (Hugh-Leifson metode ): oxidativ 1

Produktion af syre og gas fra sukkere: Svag syre= produktion, men ingen gasproduktion bemærkes i pep= ton-vand indeholdende 1 vægt/volumen% D-glucose, D-mannose, D-galactose, maltose, sucrose, trehalose, D-sorbitol, D-mannitol, inositol eller glycerol.

147452 4 (18) Assimilering af carbonkilder:

Resultaterne af kultivering i uorganiske saltmedier (dikaliumhydrogenphosphat 0,7 vægt/volumen%, monoka= liumdihydrogenphosphat 0,3 vægt/volumen%, ammonium* sulfat 0,1 vægt/volumen%, kaliumchlorid 0,1 vægt/ volumen%, magnesiumsulfat, 7 H20 0,01 vægt/volumen%) indeholdende forskellige carbonkilder i 14 dage er angivet i tabel 1.

Tabel 1

Assimilering af carbonkilder

Carbonkilde Slutkoncentration Vækst _ (vægt/volumen%) _ L-arabinose 1 + D-xylose 1 + D-glucose 1 + D-mannase 1 + D-fructose 1 + D-galactose 1 +

Maltose 1 +

Sucrose 1 +

Lactose 1 147452 5

Carbonkilde Slutkoncentration Vækst _ (vægt/volumen%) __

Trehalose 1 + D-sorbitol 1 + D-mannitol 1 +

Inositol 1 +

Glycerol 1 +

Stivelse 1 α-methyl-D-glucosid 1 +

Melibiose 1

Adonitol 1 +

Dulcitol 1

Raffinose 1 +

Cis-aconitat 0,3 +

Citrat 0,3 +

Isocitrat 0,3 +

Gluconat 0,3 +

Acetat 0,3 +

Fumarat 0,3 +

Malat 0,3 +

Tartrat 0,3 + p-hydroxybenzoat 0,3 + L-alanin 0,3 + (3-alanin 0,3 + L-isoleucin 0,3 +

Succinat 0,3 + L-valin 0,3 - 2-ketogluconat 0,3 +

Noter: + : Vækst * : Ringe vækst Ingen vækst (19) Andre egenskaber: I) Udnyttelse af malonat: Negativ II) Deairtinering af phenylalanin: Negativ III) Decarboxylaseaktivitet 6 147452 a) Arginin: Negativ b) Lysins Negativ c) Ornithin: Negativ IV) Hydrolyse af esculin: Positiv V) Hydrolyse af Tween 80: Positiv VI) GC (guanin-cytosin) indhold af DNA:59,5 mol%.

Sammenligning af de ovennævnte bakteriologiske egenskaber af Stamme G-6302 med beskrivelsen i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ed, 7 & 8 viser, at når hen= ses til , at det er en gram-negativ stavformet bakterie, som er helt aerob,bevægelig med et polært flagellum eller flageller og catalase-positiv, hører Stamme G-6302 øjen= synligttil familien Pseudomonadaceae. Den kendsgerning, at den ikke har særlige næringskrav, og har et GC-indhold på 59,5 mol%f antyder, at stammen hører til slægten Pseudomonas.

Som Pseudomonasbakterier, der er forholdsvis beslægtede med Stamme G-6302 med hensyn til de ovennævnte egenskaber, kan nævnes Pseudomonas syringae og Pseudomonas maltophilia, som er cytochrome oxidasenegative. p. maltophilia er imidlertid tydeligt forskellig fra Stamme G-6302 derved, at P. maltophilia er methioninkrævende og ikke giver nogen vækst ved 4°C. Medens Pseudomonas syringae er en inhomogen art, som omfatter et stort antal varianter er det klart fra tabel 2, at den manglende evne til at udnytte visse carbonkilder som et fælles træk for sådanne stammer ikke findes hos Stamme G-6302.

Tabel 2

Sammenligning af assimilerbarhed af forskellige carbonkil= der.

7 147452

Pseudomonas Stamme

Carbonkilde syringae G-6302

Trehalose - + 2-ketogluconat - + β-alanin - + L-isoleucin - + + : assimileret ikke assimileret yderligere er den optimale pH-værdi for vækst af Stamme G-6302 meget lav, nemlig 4,5-6,2, idet vækst optræder endog ved pH 4,0. Disse forskelle fjerner muligheden for at betragte Stamme G-6302 som en stamme af Pseudomonas syringae. G-6302 betragtes derfor som hørende til en ny art af slægten Pseudomonas. Og når henses til det for= hold,at dens lave optimale vækst-pH er 4,5-6,0, hvilket er lavt for bakterier af slægten Pseudomonas generelt, blev Stamme G-6302 benævnt Pseudomonas acidophila G-6302.

Prøver af denne Stamme G-6302 er blevet deponeret henholds= vis ved Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Chiba, Japan un= der deponeringsnummeret FERM-P nr. 4344, i Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan under IFO accessionsnum= meret 13774 og i the American Type Culture Collection, (ATCC), Maryland, U.S.A. under accessionsnummeret ATCC-31363.

Opfindelsen angår ligeledes en mikroorganismekultur til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilken kultur er ejendommelig ved, at det er en biologisk ren kultur af mikroorganismen Pseudomonas acidophila G-6302 (IFO 13774).

Pseudomonasbakterierne muterer let, når de udsættes for kunstige mutageniske behandlinger såsom bestråling med ultraviolet lys eller røntgenstråler eller behandling med kemiske mutagener. Alle sådanne mutanter og varianter, som har væsentlig samme egenskaber som Stamme G-6302, og som derfor kan henregnes til arten Pseudomonas acidophila, er imidlertid anvendelige i forbindelse med den foreliggende opfindelse, hvis de blot besidder og bevarer evnen til at opbygge G- // 8 147452 6302 antibiotiket.

Til dyrkningen af Stamme G-6302 kan der anvendes sådanne carbonkilder som glucose, sucrose, maltose, rest melasse, glycerol, olier og fedtstoffer (f.eks. sojabønneolie, olivenolie etc.), organiske syrer (f.eks. citronsyre, rav= syre, gluconsyre etc.) og andre assimilerbare carbonkilder.

Som nitrogenkilder kan anvendes organiske dg uorganiske nitrogenholdige forbindelser og stoffer såsom f.eks. soja= bønnemel, bomuldsfrømel, majsstøbevæske, tørret gær, gær= ekstrakt, kødekstrakt, pepton, urinstof, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumchlorid, ammoniumphosphat etc. De uorganiske salte, som normalt er nødvendige til dyrkningen af bakterier såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, calcium= carbonat, magnesiumsulfat, monokaliumdihydrogenphosphat, dinatriummonohydrogenphosphat etc. kan desuden anvendes en= ten alene eller i en passende kombination. Det har vist sig, at udbyttet af det ønskede antibiotikum kan forøges ved at supplere et sådant medium med en svovlforbindelse, som G-6302 danneren er i stand til at udnytte, nemlig uor= ganiske svovlforbindelser såsom sulfater (f.eks. natrium= sulfat) , thiosulfater (f.eks. natriumthiosulfat) etc. eller organiske svovlforbindelser såsom svovlholdige aminosyrer (f.eks. cystin, cystein, methionin) etc. Til dette formål foretrækkes natriumthiosulfat specielt. Koncentrationen af sådanne svovlforbindelser i kulturmediet er 0,01-1,0 vægt/volumen%, og fortrinsvis 0,02-0,5 vægt/volumen%. Til= sætning af en sådan svovlforbindelse til mediet resulterer i en forøget produktion af G-6302, og er således af betyde= lig kommerciel værdi.

Salte af tunge metaller såsom ferrosulfat, kobbersulfat etc., vitaminer såsom vitamin B^, biotin etc. og andre ad= ditiver kan desuden inkorporeres, som det er nødvendigt. Antiskummemidler og overfladeaktive midler såsom silicon= olie, polyalkylenglycolether, etc. kan også tilsættes. An= dre organiske eller uorganiske stoffer, som kan hjælpe med 147452 9 til vadesten af mikroorganismerne og fremme dannelsen af G-6302, kan naturligvis også tilsættes i passende mængder.

Dyrkningen af Stamme G-6302 kan gennemføres ved hjælp af fremgangsmåder som ligner de, der anvendtes til fremstil= ingen af antibiotika generelt, idet der anvendes en fast kultur eller en flydende kulturmetode. I tilfældet med fly® dende kultur kan den være stationær, under omrøring, under omrystning eller aerob, selv om aerob omrøringskultur er særlig ønskelig. Det foretrukne dyrkningstemperaturområde er ca. 15-35°C, medens kulturmediets pH-værdi kan variere fra ca. 4-8. Dyrkningen gennemføres i ca. 8-168 timer, for® trinsvis i 24-144 timer. Da produktet Antibiotikum G-6302 for det meste findes i den flydende fase af fermentations= suppen, er det fordelagtigt at centrifugere eller filtrere suppen for at skille den overliggende væske eller filtratet fra en cellulær masse og rense G-6302 i den overliggende væske eller filtratet. Men direkte rensning fra fermenta® tionssuppen er altså mulig om ønsket.

Bestemmelse af styrken af det således opnåede produkt kan gennemføres mod Froteus mirabilis IFO 3849 som testorga= nisme og under anvendelse af G-6302 som standarden ved cy= lindermetoden eller papirskivemetoden under anvendelse af TSA (trypticase sojaagar (Baltimore Biologicals, Limited, U.S.A.).

Antibiotikum G-6302 kan udvindes ved hjælp af de forskel= lige fremgangsmåder, som almindeligt anvendes til udvindin= gen af mikrobielle metaboliter. Cellerne fjernes således f.eks. ved centrifugering, og det aktive produkt skilles fra den overliggende væske og renses ved hjælp af sædvanli= ge metoder. Således kan f.eks. fremgangsmåden, som gør brug af opløseligheden eller opløselighedsforskellen med hensyn til et egnet opløsningsmiddel, fremgangsmåden som udnytter udfældningen eller forskellen i udfældningshastig® heden af det antibiotiske stof fra en opløsning, fremgangs® ίο 147462 måden, som udnytter dets karakteristiske absorbtive affi= nitet for forskellige asdsorbenter, ionbytterkromatografi på ionbyttere, koncentration under reduceret tryk, fryse= tørring, krystallisation, omkrystallisation, tørring etc. anvendes enten enkeltvis eller i en egnet kombination og rækkefølge eller/og i repetition.

En typisk fremgangsmåde kan beskrives nedenfor. Efter endt dyrkning filtreres således fermentationssuppen, det resul= terende filtrat ledes gennem en søjle af aktiveret carbon, og det adsorberede G-6302 elueres med et hydrofilt orga= nisk opløsningsmiddel. Som eksempler på det hydrofile or= ganiske opløsningsmiddel kan nævnes lavere ketoner (f. eks. acetone, methylethylketon, methylisobutylketon, etc.), lavere alkoholer (f.eks. methanol, ethanol, isopropanol, propanol, butanol, etc.). Disse opløsningsmidler kan an= vendes alene eller som en blanding i kombination med vand.

På grund af den sure karakter af G-6302 kan anionbytter= harpikser såsom Cl-form harpikser (Amberlite IRA-400 & 402 fremstillet af Amberlite Co., U.S.A.; Dowex-1, Dow Chemical Company, U.S.A.; Diaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Industries, Japan) anvendes med fordel. Det adsorbe= rede aktive produkt elueres f.eks. med en vandig oplØs= ’ning af natriumchlorid. Til afsaltning af eluatet gennem= føres søjlekromatografi igen med aktiveret carbon. Det opnåede eluat koncentreres derpå, acetone, f.eks.,tilsæt= tes, og det resulterende bundfald filtreres fra, vaskes med acetone, diethylether og tørres under reduceret tryk til udvinding af lysebrune pulvere. Til rensning af G-6302 i pulverne kan der med fordel anvendes søjlekromato= grafi på DEAE-Sephadex (Pharmacia, Sverige). En søjle af DEAE-Sephadex A-25 vaskes således med M/100 phophatpuf= fer (pH 6,6), og en vandig opløsning af de ovennævnte pul= vere ledes gennem søjlen, og det antibiotiske stof adsorbe= res derpå. Søjlen vaskes med den samme puffeopløsning som ovenfor, og eluering gennemføres med pufferen indeholdende 0,5 vægt/volumenS natriumchlorid. De aktive fraktioner for= 11 1Λ7Λ52 enes, indstilles til pH 3,0 og ledes igen gennem en søjle af aktiveret carbon. Søjlen vaskes successivt med vand og 20 volumen/volumen% vandig methanol. Eluering gennemføres derpå med vandig acetone, og de aktive fraktioner forenes og koncentreres under reduceret tryk. Acetonen sættes til koncentratet, hvorved der opnås G-6302. G-6302 danner me= talsalte og ammoniumsalt. Som metalsaltene kan nævnes, natriumsaltet, kaliumsaltet, lithiumsaltet etc.

De fysisk-kemiske egenskaber af det i det efterfølgende eksempel 1 opnåede G-6302 er som følger: 1. Smeltepunkt: 120°C(sintring), 130°C (dekomponering).

2. Udseende: Hvidt pulver 3. Elementæranalyse (efter tørring under reduceret tryk over phosphorpentoxid ved 40°C i 6 timer)(%): C 34,83 35,45 (34,99 ± 0,5) H 5,41 5,24 (5,58 ± 0,5) N 13,22 13,73 (13,60 ± 0,5) S 7,65 7,75 (7,70 ± 0,5) 0 (38,13 ± 0,5) 4. Mole kyl vægt:

Titrometri: 400 + 20

Empirisk formel (baseret på de ovennævnte data) C12H20N4S09)H2°

Beregnet C, 34,78; H 5,35; N 13,52; S 7,74 5. Ultraviolet absorptionsspektrum:

Kun endeabsorptioner (ingen karakteristiske absorp= tioner over 210 nm) 6. Infrarødt absorptionsspektrum (fig.l), dominerende spidser (KBr) (cm-1): 3440(s), 2920(m), 2850(m), 2600(w), 1770(s), 1650(s), 1530(s), 1458(m), 1390(w), 1340(w), 1280(sh), 1240(s), 1210(sh), 1180(m), 1118 (w) , 1043(s), 792 (w), 632(s) (s, m og w betyder henholdsvis kraftige, mellem- 12 147452 stærke og svage absorptioner; sh betyder skulder) 7. Specifik drejning: [a]^+ 94° - 10° (c=0,35, ^0) 8. Kernemagnetisk resonansspektrum (i dimethylsulf= oxid, 100 MHz) 6 3,31 ppm(3, et kemisk skift, der kan tilskrives 0-CH3) 9. Opløselighed i opløsningsmidler:

Uopløselig i petroleumsether, hexan, diethylether, benzen, ethylacetat og chloroform, tungtopløselig i ethanol, pyridin og acetone, opløselig i metha= nol og dimethylsulfoxid, let opløselig i vand.

10. Farvereaktioner:

Positiv: ninhydrin- og kaliumpermanganatreaktioner; negativ: ferrichlorid- kaliumferricyanid, Sakaguchi og Molischreaktioner; tvivlsom positiv: Ehrlich-reaktion 11. Stabilitet:

Stabil i vandig opløsning i intervallet pH 3-pH 7 ved 60°C i 10 minutter: ustabil over pH 8,5.

12. Basicitet, neutralitet eller aciditet: sur.

De fysisk-kemiske egenskaber af det i det efterfølgende ek= sempel 3 opnåede natriumsalt af G-6302 er som følger: 1. Smeltepunkt: Intet veldefineret smeltepunkt (bli= ver brunt ved 170°C ) .

2. Udseende: Hvidt pulver.

3. Elementæranalyse (efter tørring under reduceret tryk og over phosphorpentoxidved 40°C i 6 timer)(%): C 33,08 33,32 H 5,07 4,97 N 12,73 13,27 S 7,33 7,43

Na 5,19 5,31 4. Molekylvægt: 438 + 5, det antages, at 1 mol Na er indeholdt i hvert molekyle.

Empirisk formel (baseret på ovennævnte data) C12Hl9N4S09Na'H2° 147452 13

Beregnet C, 33,03, H, 4,85, N, 12,84, S, 7,35, Na, 5,27 5. Ultraviolet absorptionsspektrum! Kun endeabsorp= tioner.

6. Infrarødt absorptionsspektrum (fig. 2), domineren* de spidser (KBr) (cm : 3430(s), 3250(sh), 3000(m), 1770(s), 1640(s), 1530(s) 1450(w), 1405(w), 1343(w), 1280(sh), 1245(s), 1180(w) (s, m og w betyder henholdsvis kraftig, mellemstærk og svag absorption; Sh betyder skulder).

7. Specifik drejning! [o]^+85° * I0°(c=0,37, HjO) 8. Opløselighed i opløsningsmidler:

Uopløselig i petroleumsether, hexan, diethylether, benzen, ethylacetat, chloroform og acetone, tungt opløselig i methanol, ethanol og pyridin, opløse* ligt i dimethylsulfoxid, let opløselig i vand.

9. Farvereaktioner:

Positiv: ninhydrin og kaliumpermanganatreaktioner; negativ: ferrichlorid-kaliumferricianyid, Sakaguchi-og Molischreaktioner, tvivlsom positiv: Ehrlichre* aktion.

10. Stabilitet:

Stabil i vandig opløsning i området pH 3 - pH 7 ved 60°C, ved opvarmning i 10 minutter; ustabil over pH 8,5.

Til omdannelse af den fri syreform af G-6302 til et salt kan natriumsaltet for eksempel opnås ved at sætte 1 molær* ækvivalent natriumhydroxid til en vandig opløsning af den fri syre og derpå frysetørre systemet.

Til omdannelse af et salt af G-6302 til den fri syreform kan sidstnævnte opnås for eksempel ved at sætte IN saltsyre til en vandig opløsning af for eksempel natriumsaltet af G-6302 for at bringe opløsningens pH værdi på 3,0 og afsal* te opløsningen ved hjælp af aktiveret carbon.

14 147452

De biologiske egenskaber af G-6302 er som følger. Dé anti= mikrobielle spektra af G-6302 og dets natriumsalt overfor forskellige mikroorganismer er vist i tabel 3 (agarplade= fortyndingsmetode).

Det fremgår af denne tabel, at Antibiotikum G-6302 hoved= sagelig er aktiv mod gramnegative bakterier, men også er aktiv mod nogle grampositive bakterier.

Den akutte toksicitet af natriumsaltet af Antibiotikum G-6302 er lav, idet der ikke er blevet konstateret døds= fald ved administration af 500 mg/kg af saltet til mus ad intravenøs vej.

G-6302 viste sig også at have en beskyttende virkning på mus, der er inficeret med Escherichia coli eller Klebsiella pneumoniae ved subkutan dosering af 10 mg/kg eller ved oral dosering af 100 mg/kg.

Tabel 3

Antimikrobielle spektra af G-6302 og dets natriumsalt

Testorganisme Minimal haanningskoncentration (mcg/ml) G-6302 G-6302,Na

Escherichia coli NIHJ 25 25

Escherichia coli T-7 25 25

Salmonella typhosa Boxhill 58 12,5 12,5

Shigella flexneri EW-10 25 25

Klebsiella pneumoniae DT 12,5 12,5

Proteus vulgaris IFO 3988 100 100

Proteus morganii IFO 3168 100 100

Proteus mirabilis IFO 3849 25 25

Serratia marcescens IFO

12648 100 100 147452 15

Tabel 3 fortsat

Antimikroblelle spektra af G-6302 og dets natriumsalt

Testorganisme Minimal hæmningskoncentration (mcg/ml) G-6302 G-6302,Na

Pseudomonas aeruginosa U-31 > 100 > 100

Staphylococcus aureus FDA 209P > 100 > 100

Streptococcus pyrogenes 10 E-14 > 100 > 100

Bacillus subtilis PCI 219 100 100

Corynebacterium diphtheriae

Toronto 12,5 12,5

Candida albicans IFO 0583 > 100X > 100* 15 Saccharomyces cerevisiae

IFO 0209 > 100* > 100X

Aspergillus niger IFO 4066 > 100X > 100X

Penicillium chrysogenum

IFO 4626 > 100X > 100X

20 Noter: Medium = Trypticase-sojasuppeagar x Medium = Næringsagar indeholdende 1% glucose

Som det fremgår af ovennævnte antimikrobielle spektrum, er G-6302 hæmmende overfor gramnegative og grampositive bakterier. Det kan derfor anvendes til behandlingen af infektioner med de ovennævnte bakterier i pattedyr (f.eks. mus,rotter,hunde og mennesker) og fuglearter, som opdrættes (f.eks. høns og ænder). For at anvende G-6302 som et lægemiddel mod 30 Eschericia coliinfektioner opløses det for eksempel i fy= siologisk saltvand og administreres parenteralt, for ek= sempel subkutant eller intramuskulært i den lave dosiskon= centration på 5-30 mg/kg legemsvægt daglig. Til oralt 147452 16 brug blandes Antibiotikum G-6302 for eksempel med lactose, indkapsles og administreres i doser på 20-200 mg (som G-6302)/kg legemsvægt daglig.

G-6302 kan også anvendes som et germicid eller desinfek* tionsmiddel. G-6302 opløses for eksempel i destilleret vand til fremstilling af en opløsning indeholdende 0,1- 1,0 vægt/volumen% G-6302 eller tilberedes med en salve* basis såsom vaseline eller lanolin til fremstilling af en salve indeholdende 5-20 mg G-6302 pr. gram, og nævnte op= løsning eller salve anvendes på poter, ben, øjne, ører el= ler andre dele af de ovennævnte dyr som et desinfektions* middel.

Sammenligning af Antibiotikum G-6302 med de kendte antibi* otika har vist følgende. Som antibiotika, der er opløseli* ge i vand er sure og indeholder svovl, kan for det første nævnes peniciliner og cephalosporiner. Ved at G-6302 ikke absorberer i spektrets ultraviolette område er det imid* lertid forskelligt fra cephalosporiner. Den kendsgerning, at det kernemagnetiske resonansspektrum giver et kemisk skift, der kan tilskrives 0-methylprotoner, og den kends* gerning, at det giver anledning til glutaminsyre ved sur hydrolyse, er det bevismateriale, som godtgør, at G-6302 er forskelligt fra enhver af de naturligt forekommende pe= niciliner og cephalosporiner.

På den anden side er der mange kendte antibiotika opbyg* get ved hjælp af bakterier af slægten Pseudomonas, men in* gen af dem er et vandopløseligt antibiotikum, der er surt og indeholder svovl. G-6302 afviger desuden fra alle de kendte antibiotika dannet ved hjælp af andre mikroorga* nismer end Pseudomonasstammer på baggrung af dets eneståen* 147452 17 de fysisk-kemiske og biologiske egenskaber. G-6302 betrag= tes derfor som en hidtil ukendt forbindelse.

De følgende eksempler belyser den foreliggende opfindelse nærmere.

I eksemplerne er alle dele vægtdele, medmindre andet er anført, og sammenhængen mellem dele og volumendele svarer til sammenhængen mellem gram og millimeter, og 7% er baseret på vægt/volumen, medmindre andet er anført.

Eksempel 1

Cellerne af Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P Nr.4344; IFO 13774; ATCC-31363) dyrket på en skråtstivnet nærings= 3 agar blev anvendt til at inokulere to 2 x 10 volumendele Sakaguchikolber hver indeholdende 500 volumendele af et medium sammensat af 1% glucose, 0,5% polypepton (fremstil= let af Daigo Nutritive Chemicals Co., Japan), 0,5% kØdeks= trakt, 0,5% natriumchlorid (pH 7,09),og hver kolbe blev inkuberet på et frem- og tilbagegående rysteapparat ved 28° C i 48 timer. Den resulterende kultur blev anvendt som udgangskultur.

3

En 200 x 10 volumendele rustfri ståltank gæringsapparat 3 blev fyldt med 120 x 10 volumendele af et medium sammensat af 3% glycerol, 0,1% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% kød= ekstrakt og 0,5% NaCl og, efter indstilling til pH 7,0 med 30% vandig natriumhydroxid, steriliseret med damp ved 120°C i 20 minutter. Den steriliserede tank blev derpå inokuleret med den ovennævnte kultur og inkuberet ved en tem= peratur på 28°C med udluftning med en hastighed på 120 x 3 10 volumendele pr. minut og med 180 omdrejninger pr. minut i 78 timer. Den resulterende suppe blev centrifugeret med en Sharples centrifugalseparator til fjernelse af cellerne, hvilket efterlod 110 x 103 volumendele overliggende væske.

147452 18 Væskens pH-værdi blev indstillet på 4,2, og væsken blev 3 sendt gennem en søjle af 15 x 10 volumendele aktiveret carbon (kromatografisk kvalitet Shirasagi, fremstillet af

Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) for at få det ak= tive stof adsorberet derpå. Søjlen blev skyllet med 45 x 3 10 volumendele vand, og derpå blev eluering gennemført 3 med 45 x 10 volumendele 50 volumen/volumen% vandig aceto= 3 ' ne, idet eluatet blev opsamlet i 10 x 10 volumendele fraktioner. Fraktionerne blev undersøgt overfor Proteus mirabilis IFO 3849. Fraktionerne nr. 2 og nr. 3 blev for= 3 enet, 20 x 10 volumendele vand blev tilsat, og blandin= 3 gen blev ledt gennem en søjle pakket med 10 x 10 volumen« dele Dowex-1 (Cl-form) (Dow and Chemical Industries, U.S.

3 A.). Søjlen blev skyllet med 25 x 10 volumendele vand, 3 og der blev gennemført eluering med 50 x 10 volumendele af en 5% vandig natriumchloridopløsning. De aktive frak= tioner blev forenet, indstillet til pH 4,0 og ledt gennem 3 en søjle af aktiveret carbon (8 x 10 volumendele). Søj= 3 len blev vasketmed 24 x 10 volumendele vand, og eluering blev gennemført med 20 volumen/volumen% vandig methanol.

De aktive fraktioner blev forenet og koncentreret til 50 volumendele under reduceret tryk. 200 volumendele acetone blev derpå tilsat, og det resulterende bundfald blev fil= treret fra, vasket med 50 volumendele acetone og 100 vo= lumendele diethylether efterfulgt af tørring under redu= ceret tryk. Ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået 12 dele råprodukt.

I 500 volumendele M/100 phosphatpuffer (pH 6,6) blev der opløst 10 dele af det ovennævnte råprodukt, og opløsnin« gen blev ledt gennem en søjle af 200 volumendele DEAE-Sephadex A-25(Pharmacia, Sverige) forud pufret med den samme pufferopløsning som nævnt. Søjlen blev vasket med 400 volumendele af den samme pufferopløsning, og derpå blev eluering gennemført med den samme puffer, hvortil der var blevet sat 0,5% natriumchlorid. De aktive frak= tioner blev forenet, indstillet til pH 3,2 med 1N-HC1 147452 19 og ledt gennem en søjle af 60 yolumendele aktiveret car= bon. Søjlen blev vasket med 200 volumendele vand og 100 volumendele 20 volumen/volumen% vandig methanol efterfulgt af eluering med 50 volumen/volumen% vandig acetone. De ak= tive fraktioner blev forenet, koncentreret under reduceret tryk og opløst i 5 volumendele methanol. Efter tilsætning af 100 volumendele acetone fik opløsningen lov til at hen= stå i kulden. Det resulterende bundfald blev filtreret fra, vasket med diethylether og tørret under reduceret tryk og over phosphorpentoxid ved 40°C i 6 timer. Ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået 3,8 dele pul= ver. Det infrarøde absorptionsspektrum af dette produkt er vist i fig. 1.

Elementæranalyse : C, 34,83; H, 5,41; N, 13,22; S, 7,65 (vægt/vægt%)

Eksempel 2

Et 50 x 10^ volumendele rustfri ståltankgæringsapparat 3 blev fyldt med 35 x 10 volumendele af et medium sammen= sat af 3% glycerol, 0,1% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% kødekstrakt og 0,5% natriumchlorid, og efter indstilling af mediets pH-værdi på 7,5 med 30% vandig natriumhydroxid blev der steriliseret med damp ved 120°C i 20 minutter.

Den steriliserede tank blev inokuleret med den samme stamme af mikroorganisme, som blev anvendt i eksempel 1, og inkuberet ved 28°C med udluftning med en hastighed på 3 35 x 10 volumendele/minut og ved omrøring med 180 omdrej= ninger pr. minut i 48 timer til fremstilling af en anden udgangskultur.

3

Et 2000 x 10 volumendelerustfri ståltankforgæringsappa= 3 rat blev fyldt med 1200 x 10 volumendele af et medium sammensat af 3% glycerol, 0,1% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% kødekstrakt, 0,5% natriumchlorid og 0,1% natrium= thiosulfat, og efter indstilling af pH-værdien til 7,0 20 167452 med en 30% opløsning af natriumhydroxid blev der sterili= seret med damp ved 120°C i 20 minutter. Den steriliserede tank blev inokuleret med den ovennævnte 2. udgangskultur.

Det inokulerede tankmedium blev inkuberet ved 28°C med ud=

O

luftning ved en hastighed på 1200 x 10 volumendele/minut og ved en omrøring med 180 omdrejninger pr. minut i 90 ti= 3 mer, hvorved der blev opnået 1150 x 10 volumendele suppe.

Til denne suppe blev der sat 40x10 dele Hyflo-Supr-Cel (Johnes-Manville, U.S.A.) og filtreret med en filterpresse. Filtratets pH-værdi blev indstillet på 4,2 med 4N svovl= 3 syre og ledt søjlevis over 120 x 10 volumendele aktiveret 3 carbon. Søjlen blev vasket med 300 x 10 volumendele vand, og eluering blev gennemført med 50 volumen/volumen% van= dig acetone. De aktive fraktioner blev forenet og koncen= treret under reduceret tryk til fjernelse af acetonen. Det således opnåede vandige koncentrat blev fortyndet med vand 3 til 200 x 10 volumendele og sendt gennem en søjle af 50 3 x 10 volumendele Diaion SA-21A (Cl-form)(fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries, Japan). Søjlen blev skyl= 3 let med 150 x 10 volumendele vand, og eluering blev gen= nemført med 1% vandig natriumchlorid. De aktive fraktio= ner blev forenet og koncentreret under reduceret tryk til 3 100 volumendele, hvorefter der blev tilsat 2 x 10 volu= mendele methanol, og det udfældede natriumchlorid blev filtreret fra. Filtratet blev koncentreret yderligere un= der reduceret tryk til 200 volumendele, hvorefter der 3 blev tilsat 2 x 10 volumendele acetone, og bundfaldet blev filtreret fra og tørret. Ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået 757 dele råprodukt. Dette 3 råprodukt (500 dele) blev opløst i 5 x 10 volumendele vand, indstillet til pH-værdi 4,0 og adsorberet på en 3 søjle af aktiveret carbon (5 x 10 volumendele). Den ak= tive bestanddel blev elueret ved hjælp af gradientelue= 3 ringsmetoden under anvendelse af 10 x 10 volumendele 3 vand gennem 10 x 10 volumendele 70 volumen/volumen% 3 vandig methanol, og eluatet blev afkølet i 1 x 10 volu= 147452 21 menfraktioner. De aktive fraktioner blev forenet, koncen= treret under reduceret tryk til fjernelse af methanolet og 3 suppleret til 6 x 10 volumendele med M/100 phosphatpuffer (pH 6,0). Denne prøveopløsning blev adsorberet på en søjle 3 af 3 x 10 volumendele DEAE-Sephadex A-25, som var blevet fremstillet som beskrevet i eksempel 1, og efter vaskning 3 af søjlen med 6 x 10 volumendele af de samme puffer blev eluering gennemført med den samme puffer suppleret med 0,5% natriumchlorid, idet eluatet blev opsamlet i 500 volumende= le fraktioner. De aktive fraktioner blev forenet, indstil= let til pH 3 med IN saltsyre og ledt gennem en søjle af 3 0,5 x 10 volumendele aktiveret carbon. Søjlen blev vasket 3 3 med 2 x 10 volumendele vand gennem 2 x 10 volumendele 20 volumen/volumen% vandig methanol, og derpå blev eluering gennemført med 50 volumen/volumen% vandig acetone, idet eluatet blev opsamlet i 200 volumendele fraktioner. De ak= tive fraktioner blev forenet, koncentreret under reduceret tryk og opløst ved tilsætning af 300 volumendele methanol.

3

Efter tilsætning af 3 x 10 volumendele acetone og 4 x 3 10 volumendele diethylether fik opløsningen lov til at henstå i kulden, og det udfældede G-6302 blev filtreret fra, vasket med diethylether og tørret under reduceret tryk og over phosphorpentoxid. Udbytte 72 dele.

Elementær-analyse: C, 35,45; H, 5,24; N, 13,73; S, 7,75 (vægt/vægt%).

Eksempel 3 I 90 volumendele vand blev der opløst 4,0 dele af den fri form af G-6302, der blev opnået i eksemplerne 1 og 2, og under afkøling blev der tilsat ca. 9,0 volumendele IN van= dig natriumhydroxid. Dette blev efterfulgt af tilsætningen af en yderligere mængde IN -natriumhydroxid, idet opløsnin= gens pH-værdi blev fulgt, indtil pH-værdien 6,5 var etab= leret. Opløsningen blev frysetørret, hvorved der blev op= 147452 22 nået 4,2 dele G-6302 mononatriumsalt som et hvidt pulver.

Det infrarøde spektrum af dette produkt efter tørring un= der reduceret tryk og ved 40°C i 6 timer er vist i fig.2.

Elementær-analyse: C, 33,08; H, 5,07; N, 12,73; S, 7,33,

Na, 519 (vægt/vægt%).

Eksempel 4

Cellerne af Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P nr. 4344, IFO 13774, ATCC-31363) dyrket på en skråstivnet næringsagar blev anvendt til at inokulere en 200 volumendele konisk kolbe indeholdende 40 volumendele sammensat af 1% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% gærekstrakt og 0,5% natriumchlorid (pH 7,0), og den inokulerede kolbe blev inkuberet på et roterende rysteapparat ved 28°C i 48 timer for at fremstil= le en udgangskultur.

200 volumendele koniske kolber blev derpå hver fyldt med 40 volumendele af et medium sammensat af 3% glycerol, 1% glucose, 0,5% polypepton (Daigo Nutritive Chemicals), 0,5% kødekstrakt og 0,5% natriumchlorid (pH 7,0), og 0,02-0,5% af forskellige svovlforbindelser blev sat til kolberne.

Hver kolbe blev derpå inikuleret med 1 volumendel af den ovennævnte udgangskultur og inkuberet på et roterende ry= steapparat ved 28°C i 96 timer. Som det fremgår af den følgende tabel, blev produktionen af G-6302 forøget væsent= ligt ved tilsætningen af svovlforbindelser.

Koncentration Produktion

Svovlforbindelse_(%)_yg/mi_

Ikke tilsat - 15

Methlonin_°·°*

Cr3teln_;_ofl 65

Cystin Å'tP

Natriumsulfat °'°2

Natriumthiosulfat ?'?2 _____ 0,1 80 147452 23

Eksempel 5 I 7,5 volumendele koldt vand blev der opløst 1 del af den frie form af G-6302, der blev opnået i eksemplerne 1 eller 2, og til blandingen blev der sat 17,5 volumendele kold methanol.

Den således opnåede blanding blev holdt i kulden i 24 ti= mer for at få en udkrystallisation af pulverformet G-6302 i form af farveløse krystaller. Krystallerne blev isoleret, vasket med en ringe mængde 80 volumen/volumen% kold vandig methanol, kold methanol og ether i nævnte rækkefølge og tørret over phosphorpentoxid under reduceret tryk ved 60° C i 6 timer, hvorved der blev opnået 0,930 dele krystaller af G-6302. De fysisk-kemiske egenskaber af de således op= nåede krystaller er som følger: 1. Smeltepunkt: 168-170°C.

2. Elementær-analyse: (vægt/vægt%)

Fundet C 35,51 35,56 H 5,61 5,61 N 12,93 12,98 S 7,45 7,59

Beregnet som C12H20N4S09" CH30H* C 35,69 H 5,76 N 12,81 5 7,33 3. Specifik drejning: [a]p3+82°-5°(c=l,0 i H^O) 4. Infrarødt absorptionsspektrum (fig.3), dominerende spidser (KBr) (cm : 3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625 5. Kernemagnetisk resonansspektrum: i dimethylsulfoxid, (100 MHz) 6 3,31 ppm (s, 3H) (et kemisk skift kan tilskrives 0-CH3 af G-6302)

Claims

147452 δ 3,20 ppm (s, 3H) (et kemisk skift kan tilskrives 0-CHg fra methanol, som er indeholdt i krystallerne. Andre fysisk-kemiske egenskaber, dvs. ultraviolet absorp= tionsspektrum, opløselighed i opløsningsmidler, farvereak= tioner, stabilitet og basicitet, neutralitet eller aciditet er de samme som for det i eksempel 1 opnåede produkt. Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum benævnt sulfazecin eller Antibiotikum G-6302 og med formlen NH0 CH, 0CEU | 2 Hf3 Hf3 HO-C - C - CH- - CH-, - C- N- C- C- N^ -1 2 1 2 2 ii i« I H OHO J-N. 0. xso3h eller et salt deraf, kendetegnet ved, at en organisme af arten Pseudomonas acidophila dyrkes i et kulturmedium, hvorpå det dannede antibiotikum udvindes fra dyrkningsmediet, om ønsket i form af et salt deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Pseudomonas acidophila G-6302 IF0 13774.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der til kulturmediet sættes en svovlforbindelse.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at svovlforbindelsen er natriumthiosulfat, natriumsulfat, cystin, cystein eller methionin.