CS208768B2

CS208768B2 - Method of making the antibiotics g-6302

Info

Publication number: CS208768B2
Application number: CS788842A
Authority: CS
Inventors: Akira Imada; Kazuaki Kitano; Mitsuko Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-12-30
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1981-09-15
Also published as: FR2413399A1; AU521534B2; DE2855949A1; BE873217A; SU1003761A3; CH644593A5; DK582978A; IT7831423A0; HU179350B; CA1113873A; AU4230778A; SE7813384L; DK147452B; FR2413399B1; DE2855949C2; GB2011380B; DK147452C; GB2011380A; ES476480A1; PH15534A

Description

Vynález se týká způsobu výroby antibiotika G-S302 a jeho solí.

Při hledání nových antibiotik bylo izolováno velké množství mikroorganismů z půdy a byla zkoumána antibiotika produkovaná těmito m^;kroorganismy. Při těchto pokusech se prokázalo, že některé z těchto mikroorganismů jsou schopny produkovat nová antibiotika. Jde o různé kmeny rodu Pseudomonas, které při kultivaci ve vhodném živném prostředí produkují antibiotikum,, které brzdí růst grampozitivních a gramnegativních bakterií. Toto antibiotikum bylo izolováno a vzhledem k jeho fyzikálně chemickým a biologickým vlastnostem bylo možno prokázat, že jde o nové antibiotikum, které pak bylo označeno G-6302.

Byly rovněž studovány podmínky pro výrobu antibiotika G-6302 a bylo prokázáno, že produkci antibiotika G-6302 je možno podstatně zvýšit tak, že se některé ze svrchu uvedených mikroorganismů pěstují v živném prostředí, které je obohaceno sloučeninou síry, kterou tyto mikroorganismy jsou schopny využívat.

V popise vynálezu bude antibiotikum G-6302 v některých případech označováno pouze G-6302,

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby antibiotika G-6302, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Pseudomonas acidophila G-6302, IFO 13774 schopný produkce antibiotika G-6302 v živném prostředí s obsahem využitelného zdroje uhlíku a využitelného zdroje dusíku za aerobních podmínek při pH 4 až 8 a při teplotě 15 až 35 stupňů Celsia do nahromadění antibiotika s následnou izolací antibiotika G-6302 - ze živného prostředí. Produkční kmen byl ' izolován ze vzorků půdy v Ashigara-Shimo-Gun, prefektura Kanagawa v Japonsku.

Kmen Pseudomonas G-6302 má následující bakteriologické vlastnosti.

a) Morfologie

Po 2 dnech na šikmém živném agaru . se při teplotě 28 °C vytvářejí tyčinkovité buňky o průměru 0,7 až 1,0 ^m a o délce ’ 0,7 -až 3,5 μΐη. Tyto buňky nejsou polymorfní, jsou pohyblivé pomocí polárního bičíku nebo - bičíků. Nesporulují, nedochází k nahromadění kyseliny poly-^-hydroxymáselné jako nitrobuněčné rezervy uhlíku (R. Y. Stanier a další: “ JournaJ of Generál Microbiology 43, 159 [13613]). Buňky ' jsou gramnegativní, nebarví se rychle kyselinou.

b) Kultury na různých prostředích

Všechny kultury byly pěstovány pří teplotě 28 °C a; pozorovány po dobu 1 až 14 dnů.

1) Živný agar: Kulaté vystupující kolonie o průměru 1 až 3 mm s celistvým krajem se vytvářejí po 3 dnech pěstování. Jsou hladké, neprůhledné, bílé, rozpustný pigment se netvoří.

2) Šikmý živný agar: Mírný růst, vláknité, neprůhledné a krémově zbarvené kolonie.

3) Živný bujón: Růst ve formě zákalu, v podstatě bez sedimentace. Po 14 dnech pěstování se na povrchu kapalného prostředí ojeví blanka.

4) Živný agar s želatinou ve formě tyčinky: Povrchový růst bez zkapalňování želatiny.

5) Lakmusové mléko: Nedochází к žádné změně.

c) Fyziologické vlastnosti

1) Redukce dusičnanů: negativní.

2) Denitrifikace: negativní.

3) Test s methylovou červení: negativní.

4) Proskauerův test: negativní.

5) Tvorba indolu: negativní.

6) Tvorba sirovodíku slabě pozitivní.

7) Hydrolýza škrobu: negativní.

8) Využití citrátů: pozitivní.

9) Využití anorganických zdrojů dusíku.

I) Dusičnan draselný: negativní až slabě pozitivní.

II) Síran amonný: pozitivní.

10) Tvorba pigmentu: pigment se netvofí.

11) Ureáza: pozitivní.

12) Oxidáza: negativní.

13) Kataláza: pozitivní.

14) Růst:

I) pH: Kultura roste při pH 4 až 8, optimální pH je 4,5 až 6,0.

П) Teplota: Kultura roste při teplotě 2 až 37 °C, optimální teplota je 25 až 30 ^PC.

15) Požadavky na kyslík: kultura je aerobní.

16) Oxidativně fermentativní test (Hugh-Leifsonova metoda): oxidativní.

17) Produkce kyseliny a plynu z cukrů: Dochází ke slabé produkci kyseliny, avšak nedochází к produkci plynu při pěstování ve směsi peptonu a vody s obsahem 1 % (hmotnostní °/o) (objemová %) D-glukózy, D-mannózy, D-galaktčzy, maltózy, sacharózy, trehalózy, D-sorbitolu., D-mannitolu, inositolu nebo glycerolu.

18) Využití uhlíkových zdrojů: V následující tabulce jsou uvedeny výsledky pěstování uvedeného kmene po dobu 14 dní. Bylo užito následujících anorganických solí:

°/o (hmotnostní/objemová) hydrogenfosforečnan draselný0,7 dihydrogenfosforečnan draselný0,3 síran amonný0,1 chlorid sodný0,1 síran hořečnatý . 7НгО0,01

Tabulka 1

Využití uhlíkových zdrojů Zdroj uhlíku	Konečná koncentrace % (hmotnostní/objemová)	Růst
L-arabinóza	1	+
D-xylóza	1
D-glukóza	1	+
D-amnnóza	1	+
D-fruktóza	1
D-galaktóza	1	+
maltóza	1	+
sacharcza	1	4-
laktóza	1	—
trehalóza	1	+
D-sorbitol	1	+
D-mannitol	1	+
inositol	1	+
glycerol	1	+
škrob	1	—
tf-methyl-D-glukosid	1	+
melibióza	1	—
adonitol	1	+
dulcitol	1	—
rafinózy	1	+
cis-aconitát	0,3	+
citrát	0,3	+
isocitrát	0,3	+
glukonát	0,3	+
acetát	0,3	+

2i087t68

Zdroj uhlíku	Konečná koncentrace °/o {hmotnostní/objemová)	Růst
fumarát	0,3	“b
malát	0,3	4-
tartrát	0,3	4-
p-hydroxybenzoát	0,3	4-
•L-alanin	0,3	4-
β-alanin	0,3	4-
L-isoleucin	0,3	4-
sukcinát	0,3	4-
* L-valin	0,3	—
2-ketoglukOnát	0,3	4-

Poznámka:

4- = dobrý růst + = slabý růst — = kultura neroste

1.9) Další vlastnosti:

I) Využití malonátu: Negativní.

II) Dearoinace fenylalaninu: Negativní.

III) Aktivita dekarboxylázy:

a) Arginin: Negativní.

b) Lysin: Negativní.

c) Ornitin: Negativní.

IV) Hydrolýza eskulinu: Pozitivní.

V) Hydrolýza Tween 80: Pozitivní.

VI) Obsah guanin-cyto.sinu v DNA: 59,5 mol. %.

Srovnáním svrchu uvedených bakteriologických vlastností kmene G-6302 s popisem v Bergey‘s Manual of Determinative B.acteriology, Ed. 7 a 8, ukazuje, že vzhledem к tomu, že jde o gramnegativní tyčinky, striktně aerobní, pohyblivé s polárním bičíkem nebo bičíky a pozitivní na .kataláz-n, náleží kmen G-6.3Q2 zcela zřejmě .do čeledi Pseudomonadaceae.. To dokládá také skutečnost, že tento kmen nemá žádné zvláštní požadavky na živné prostředí a že jeho obsah guanlncytosinu v desoxyribonukleonové kyselině je 59,5 mol. %, což současně zařazuje tento kmen do rodu Pseudomonas.

Bakterie tohoto rodu jsou velmi podobné kmenu G-6302 a to zejména Pseudomonas syringae a Pseudomonas maltophilia, které jsou negativní na cytochromoxidázu. P. maltophilia se však od kmene G-6302 zřejmě liší, protože ke svému růstu vyžaduje methionin -a neroste při teplotě 4 °C. Pseudomoiias syringae má řadu poddruhů, z následující tabulky 2 je však zcela zřejmé, že neschopnost tohoto kmenu využívat různé zdroe uhlíku tento kmen odlišuje od kmene G-6302.

Tabulka 2

Zdroj uhlíku

Srovnání využitelnosti různých zdrojů uhlíku

Pseudomonas syringae G-6302 trehalóza 2-ketoglukonát β-alanin L-isolaucin

4,

444Poznámka:

4- = využívá se — = nevyužívá se

Mimoto je optimální hodnota pH pro růst kmene G-6302 velmi nízká, to jest 4,5 až 6,0, přičemž к růstu dochází i při pH 4,0. Tyto rozdíly vylučují možnost pokládat kmen G-6302 za kmen Pseudomonas syringae. Je nutno předpokládat, že kmen G-6302 náleží do nového druhu rodu Pseudomonas. Vzhledem к tomu, že kmen roste při pH 4,5 až 6,0, které je obecně velmi nízké pro celý rod

Pseudomonas, byl kmen G-6302 pojmenován Pseudomonas acidophila G-6302.

Vzorky kmene G-6302 byly uloženy ve sbírkách Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Chiba, Japonsko pod číslem FERM-P č. 4344, Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japonsko pod číslem IFO 13774 a v Američan Type Culture Collection, (ATCC), Maryland, USA pod číslem ATCC-31363.

Bakterie Pseudomonas, užívané při provádění způsobu podle vynálezu, jsou obvykle vysoce variabilní ve svých vlastnostech a vytvářejí snadno mutace v případě, že jsou podrobeny umělému působení, které obvykle vyvolává vznik mutací, například ozáření ultrafialovým světlem nebo paprsky X nebo působení chemických látek. Všechny takto vzniklé mutanty a varianty je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu, pokud si uchovávají schopnost produkovat antibiotikum G-6302.

Při pěstování kmene G-6302 je možno využít běžných zdrojů uhlíku, jako jsou glukóza, sacharóza, maltóza, výpalky z melasy, glycerol, oleje a tuky, například sójový olej, olivový olej a podobně, organické kyseliny, jako jsou kyselina citrónová, jantarová, glukonová a podobně, a další využitelné zdroje uhlíku. Ze zdrojů dusíků je možno užít organické a anorganické sloučeniny, které obsahují dusík a materiály s obsahem těchto sloučenin, například sójovou mouku, mouku z bavlníkových semen, kukuřičný výluh, sušené kvasnice, extrakt z kvasnic, extrakt z masa, pepto.n, močovinu, síran amonný, dusičnan amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný a podobně.

Mimoto je možno užít anorganické soli, které jsou běžně užívány při pěstování bakterií, například chlorid sodný, chlorid draselný, uhličitan vápenatý, síran horečnatý, dihydrogenfosforečnan draselný, dihydrogenfosforečnan sodný a podobně, a to jednotlivě, nebo ve vhodné směsi. Bylo zjištěno, že výtěžek žádaného antibiotika je možno zvýšit tak, že se živné prostředí doplní sloučeninou síry, kterou produkční kmen antibiotika G-6302 může využívat. Jde například o anorganické sloučeniny síry, například síranu, jako síran sodný, thiosírany, jako thiosíran sodný, nebo o organické sloučeniny síry, například aminokyseliny obsahující síru, jako cystin, cystein, methionin a podobně. Zvláště výhodnou solí je thiosíran sodný. Koncentrace těchto sloučenin síry v živném prostředí se pohybuje v rozmezí 0,01 až 1,0, s výhodou 0,02 až 0,5 °/o (hmotnostní/objemová %). Přidání těchto sloučenin síry k živnému prostředí zvyšuje produkci antibiotika G-6302 natolik, že je možno toto antibiotikum vyrábět průmyslově.

Mimoto je možno doplnit živné prostředí solemi těžkých kovů, jako jsou síran železnatý, síran měďnatý, nebo vitamíny, například vitamínem Bi, biotinem a podobně. Je možno přidat také protipěnivé a povrchově aktivní látky, jako silikonový olej, polyalkylglykolether a podobně. V případě, že se produkce antibiotika zvýší přidáním jiných anorganických nebo organických látek, je možno tyto látky do živného prostředí pro pěstování kmene G-6302 rovněž ve vhodném množství přivádět.

Pěstování kmene G-6302 se obvykle provádí běžným způsobem, a to při použití pevné kultury nebo submerzní kultury. V případě kapalné kultury může jít o kulturu stacionární, pěstovanou za stálého míchání, protřepávání nebo jako aerobní kultura, nejvýhodnější je aerobní kultura, která se stále míchá. Výhodná teplota je 15 až 35 °C, pH živného prostředí se může pohybovat v rozmezí 4 až 8. Kultivace se provádí po. dobu 8 až 168 hodin, svýhodou 24 až144 hodin. Protože vzniklé antibiotikum G-6302 je převážně přítomno v kapalné fázi fermentačního prostředí, je výhodné odstředit nebo odfiltrovat pevný podíl a tím získat kapalnou fázi živného prostředí, z této kapalné fáze je pak možno získat antibiotikum G-6302 dalším čištěním. Je však možné i přímé čištění z neodděleného fermentačního prostředí v případě potřeby.

Účinnost získaného antibiotika je možno prokazovat zejména proti Próteus mirabilis IFO 3849, přičemž se užije antibiotikum G-6302 a provádí se stanovení ve válcích nebo stanovení pomocí papírových kotoučů; přičemž se užije TSA (agar s tryptikázou a sójou Baltimore Biologicals, Limited, USA).

Antibiotikum G-6302 je možno izolovat různými postupy, které se běžně užívají k izolaci mikrobiálních metabolitů. Buňky je možno odstranit odstředěním a ze supernatantu je možno získat účinnou látku čištěním běžným způsobem. Je například možno užít postupu, který využívá rozdílů v rozpustnosti různých podílů v různých rozpouštědlech s následným vysrážením jednotlivých součástí supernatantu přidáváním různých rozpouštědel.

Je také možno užít postupů, které využívají charakteristickou adsorpční afinitu antibiotika k různým adsorpčním činidlům, chromatografií na iontoměničích, koncentrace za sníženého tlaku, lyofilizace, krystalizace, překrystalování, sušení a podobně, a to bud jednotlivě, nebo ve vhodných kombinacích a/nebo s opakováním jednotlivých postupů.

Typický postup bude dále popsán. Po skončeném pěstování se fermentační prostředí zfiltruje, filtrát se nechá projít sloupcem aktivovaného uhlí a adsorbované antibiotikum G-6302* se vymývá hydrofilním organickým rozpouštědlem. Příkladem hydrofilních organických rozpouštědel mohou být nižší ketony, například aceton, methylethylketon, methylisobutylketon a podobně, nižší alkoholy, například methanol, ethanol, isopropanol, propanol, butanol a podobně.

Tato rozpouštědla je možno užít jednotlivě, ve směsi nebo ve směsi s vodou. Protože antibiotikum G-6302 je kyselé povahy, užívá se aniontoměničů, například pryskyřic v Cl” formě (Amberlíte IRA-400 a 402, AmbeTlite Co. USA; Dowex-1, Dow and Chemical Co., USA; Diaion SA-21A, Mitsubishi Chemical Industries, Japonsko). Adsorbovaná účinná látka se vymývá například vodným roztokem chloridu sodného. Eluát se zbaví solí obvyk208768 le . chromatografii na sloupci naplněném aktivovaným uhlím. Získaný eluát se zahustí, přidá se například aceton. Výsledná sraženina se oddělí filtrací, promyje se acetonem a diethyletherem a suší se za sníženého tlaku, čímž se získá světlehnědý prášek.

K čištění práškovaného antibiotika G-6302 se užije například chromatografie na sloupci přípravku DEAE-Sephadex (Pharmacia, Švédsko]. Postup se provádí tak, že se sloupec s obsahem přípravku DEAE-Sephadex A-25 promyje 0,01 M fosfátovým pufrem · o pH 6,6 a pak se nechá sloupcem projít vodný roztok antibiotika, čímž dojde k adsorpci antibiotika.

Sloupec se pak promývá tímtéž pufrem a pak se vymývá pufrem s obsahem 0,5 % (hmotnostní/objemová ·%) chloridu sodného. Účinné frakce se slijí, pH se upraví na hodnotu 3,0 a roztok se znovu nechá projít sloupcem aktivovaného uhlí. Sloupec se promyje vodou a pak vodným roztokem methanolu o koncentraci 20 objemových °/o. Pak se sloupec vymývá směsí vody a acetonu. Účinné frakce se slijí a koncentrují za sníženého tlaku. Ke koncentrátu se přidá aceton, čímž se vysráží antibiotikum G-6302. Antibiotikum G-6302 tvoří soli s kovy a amonné soli. Z kovových solí je možno uvést sodné soli, draselné soli, lithné soli a podobně.

Fyzikálně chemické vlastnosti antibiotika G-6302, získaného způsobem podle příkladu 1, jsou tyto:

1) Teplota tání: 120 °C (vytváří se sintr), 130 °C (za rozkladu].

2) Vzhled: bílý prášek.

3) Elementární analýza (po usušení za sníženého tlaku nad kysličníkem fosforečným při teplotě 40 °C po dobu 6 hodin v %):

C: 34,83 35,45 (34,99+0,5)

H: 5,41 5,24 (5,58+0,5)

N: 13,22 13,73 (13,60+0,5)

S: 7,65 7,75 (7,70+0,5)

O: (38,13+0,5)

4) Molekulární hmotnost: Titrometricky: 400+20

Empirický vzorec (založený na svrchu uvedených ' údajích:

C12H20N4SO9. H2O

Vypočteno:

C 34,78 «/o, H 5,35 %, N 13,52 %, S 7,74 %.

5) Absorpční spektrum v ultrafialovém světle: Dochází pouze ke koncové absorpci, není možno pozorovat charakteristické absorpcí pruhy v oblasti nad 210 nm.

6) Spektrum v infračerveném světle v

KBr je znázorněno na obr. 1. Toto absorpční spektrum má následující vrcholy: (cm~1):

3440(s), 2920(m), 2850(m), 2600^),

177Q(s), 1650(s), 153O(s), 1458(mJ,

1390(w), 134O(w), 1280(sh), 1240(8),

1210(sh) 1180(m), 1118(w), 1043(s), 792(w), 632(s) (s = silná absorpce, m = středně silná absorpce, w = slabá absorpce, sh = hrb).

7) Specifická otáčivost: [αι]ο25 + 94^o+10° (c = 0,35, H2O).

8) Spektrum při nukleární magnetické resonanci v dimethylsulfoxidu při 100 MHz 3,31 ppm, chemický posun je možno· připsat skupině O-CH3).

9) Rozpustnost v různých rozpouštědlech: Antibiotikum · je nerozpustné v petroletheru, hexanu, diethyletheru, benzenu, ethylacetátu a chloroformu. Je slabě rozpustné v ethanolu, pyridinu a acetonu, dobře rozpustné v methanolu a dimethylsulfoxidu a velmi dobře rozpustné ve vodě.

10) Barevné reakce: Kladné jsou ninhydrinová reakce a reakce s manganistanem draselným, negativní je reakce se směsí chloridu železitého a kyanidu železitého, Sakaguchiho reakce a Molischova reakce. Neprůkazné pozitivní je Ehrllchova reakce.

11) Stálost: Antibiotikum je stálé ve vodném roztoku při pH v rozmezí 3 až 7 při · teplotě 60 °C po dobu 10 minut, při pH vyšším než 8,5 je nestálé.

12) Alkalita nebo kyselost: Antibiotikum má kyselou povahu. ‘

Fyzikálně chemické vlastnosti sodné soli antibiotika ' G-6302, získané způsobem podle příkladu 3, jsou tyto:

1) Teplota tání: Sůl nemá zřetelnou teplotu tání, hnědne při teplotě 170 °C.

2) Vzhled: bílý prášek.

3) Elementární analýza po sušení za sníženého tlaku nad kysličníkem fosforečným při teplotě 40 °C po dobu 6 · hodin v procentech:

C: 33,0833,32

H: 5,074,97

N: 12,7313,27

S: 7,337,43

Na: 5,195,31

4) Modulární hmotnost: 438+5 za předpokladu, že každá molekula obsahuje 1 mol sodíku.

Empirický vzorec, založený na svrchu . uvedených údajích:

еюШэМ^ОдНа. H2O

Vypočteno:

С 33,03 θ/ο, Η 4,85 %, N 12,84 %,

S 7,35 %, Na 5,27 θ/ο.

5) Absorpční spektrum v ultrafialovém světle má pouze koncovou absorpci.

6) Absopční spektrum v infračerveném světle v KBr je znázorněno na obr. 2.

Toto spektrum má následující vrcholy v cm'¹:

3430^!(s), 3250(sh), 3000(m), 1770(s), 1640(s), 1530(s), 1450(w), 14O5(w), 1343(w), 1280(sh), 1245(s), 1180(w), 1118(w), 1050(s), 820[w), 785(wJ, 632(s).

(s = velmi silný, m = středně silný, w = slabý absorpční pruh, sh = hrb).

7) Specifická otáčivost.

[a]_D32 ₊ 85^o+10° (c=0,37, H₂O).

8) Rozpustnost v různých rozpouštědlech: Antibiotikum je nerozpustné v petroletheru, hexanu, diethyletheru, benzenu, ethylacetátu, chloroformu a acetonu. Je slabě rozpustné v methanolu, ethanolu a pyridinu, rozpustné v dimethylsulfoxidu, velmi dobře rozpustné ve vodě.

9j Barevné reakce: Pozitivní je ninhydrihová reakce s manganistanem draselným. Negativní je reakce se směsí chloridu železitého a ferrikyanidu draselného, Sakaguchiho a Molischova reakce. Neprůkazné pozitivní je Ehrlichova reakce.

10) Stálost: Sodná sůl je stálá ve vodném roztoku při pH 3 až 7 a při teplotě 60 °C po dobu 10 minut. Při pH vyšším než 8,5 je nestálá.

Antibiotikum G-6302 je možno převést na sůl, například na sodnou sůl, tak, že se к vodnému roztoku volného antibiotika přidá molární ekvivalent hydroxidu sodného a takto získaný vodný roztok se lyofiližuje.

V případě, že je zapotřebí převést sůl antibiotika G-6302 na volnou formu, je možno postupovat například tak, že se к vodnému roztoku sodné soli antibiotika přidá 1 N roztok kyseliny chlorovodíkové až do pH 3,0 načež se roztok zbaví solí, například aktivovaným uhlím.

Antimikrobiální spektrum antibiotika G-6302 a jeho sodné soli proti různým mikroorganismům je uvedeno v tabulce 3. Stanovení bylo prováděno zreďovací metodou na agarových plotnách.

Z tabulky 3 je zřejmé, že antibiotikum G-6302 je účinné převážně proti gramnegativním bakteriím, ale také proti některým grampozitivním bakteriím.

Akutní toxicita sodné soli antibiotika G-6302 je nízká, v případě že bylo myším podáno 500 mg/kg této soli nitrožilním způsobem, nebylo možno pozorovat žádné uhynutí.

Antibiotikum G-6302 chrání myši vystavené experimentální infekci Escherichia coli nebo Klebsiella pneumoniae v případě, že je aplikováno podkožně v dávce 10 mg/kg nebo perorálně v dávce 100 mg/kg.

Tabulka 3

Antimikrobiální spektra antibiotika G-6302 a jeho sodné soli

Minimální inhibiční koncentrace (^ug/rnl)

G-6302 G-6302 . Na

Mikroorganismus

Escherichia Coli NIHJ	25		25
Escherichia coli T-7	25		25
Salmonella typhosa Boxhill 58	12,5		12,5
Shigella flexneri EW-10	25		25
Klebsiella pneumoniae DT	12,5		12,5
Próteus vulgaris IFO 3988	100		100
Próteus morganii IFO 3168	100		100
Próteus mirabilis IFO 3849	25		25
Seřratia marcescens IFO 12648	100		100
Pseudomonas aeruglnosa U-31	> 100	>	100
Staphylococcus aureus FDA 209P	> 100	>	100
Streptococcus pyogenes E-14	> 100	>	100
Bacillus subtilis PCI 219	100		100
Corynebacterium diphtheriae Toronto	12,5		12,5
Candida albicans IFO 0583	> 100 *	>	100 *
Sacharomyces cerevisiae IFO 0209	> 100 *	>	100 *
Aspergillus nige IFO 4066	> 100 *	>	100 *
Penicillium chrysogenum IFO 4626	> 100 *	>	100 *

Poznámka:

Prostředím pro stanovení minimální inhibiční koncentrace byl agar se sójou a tryptikázou.

* = živný agar s obsahem 1 % glukózy.

20-87 6 8

Jak je zřejmé ze svrchu uvedeného antimikrobiálního spektra, inhibuje antibiotikum G-6302 růst gramnegativních a grampozitivních bakterií. Z tohoto důvodu je možno· toto antibiotikum užít při léčbě infekcí, které jsou způsobeny svrchu uvedenými bakteriemi u savců, · například myší, krys, psů a člověka, a u · domácí drůbeže, například slepic a kachen.

Antibiotikum G-6302 · je vhodné zejména proti infekcím způsobeným Escherichia coli, a to například ve formě roztoku ve fyziologickém roztoku při parenterá-lním podání, například podkožním nebo· nitrosvalovém podání, v dávce 5 až 30 mg/kg denně. Pro perorální podání se antibiotikum G-6302 mísí například s latózou, načež se směs ukládá do kapslí a podává v dávce 20· až 200 mg/kg denně.

Antibiotikum G-6302 je· možno užít také jako germicid nebo desinfekční činidla. Postupuje se například tak, že se rozpustí antibiotikum G-6302 v destilované vodě na roztok, který obsahuje 0,1 až 1,0· % (hmotnostní/objemová %) tohoto antibiotika nebo se vytvoří mazání nebo mast smísením s vazelínou nebo lanolinem, tato mast obsahuje 5 až 20 mg antibiotika v 1 g a je· možno ji nanášet jako desinfekční činidlo na končetiny, oči, uši nebo jiné části těla.

Antibiotikum G-6302 je velmi cennou sloučeninou také vzhledem k tomu, že je možno toto antibiotikum užít jako meziprodukt pro výrobu dalších nových sloučenin.

V případě, že se antibiotikum G-6302 srovnává se známými antibiotiky, je možno· pozorovat několik rozdílů. Z antibiotik rozpustných ve vodě s kyselou · povahou a s obsahem síry je možno uvést peniciliny a cefalosporiny. Antibiotikum G-6302 se · však od těchto antibiotik liší tím, že neabsorbuje v ullrafialovém světle. Mimoto je možno v NMR-spektru pozorovat chemický posun, který je nutno připsat k protonům v O-methylové skupině. Mimoto při kyselé hydrolýze dává toto antibiotikum vznik kyselině glutamové, čímž je · možno prokázat, že antibiotikum je odlišné od jakýchkoli přírodně se vyskytujících penicilinů a cefalosporinů.

Na druhé straně je možno antibiotikum G-6302 srovnat s antibiotiky produkovanými kmeny Pseudomonas. Z těchto antibiotik však žádné není rozpustné ve vodě, nemá kyselou povahu a obsah síry. Mimoto se toto antibiotikum odlišuje od antibiotik produkovaných dalšími mikroorganismy svými fyzikálně chemickými a biologickými vlastnostmi. Je proto možno mít za to, že antibiotikum G-6302 je nová sloučenia.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

V těchto příkladech jde vždy o hmotnostní díly, není-li uvedeno jinak, a vztah mezi . hmotnostními a objemovými díly odpovídá vztahu mezi gramy a ml. Procenta jsou vždy hmotnostní/objemová %, není-li uvedeno jinak.

Přikladl

Buňky Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P č. 4344, · IFO· 13774, A.TCC-31363), pěstované na živném šikmém agaru,· byly užity k naočkování 2 X10³ objemových dílů Sakaguchiho· baněk, z nichž každá obsahovala 500 objemových dílů prostředí,· obsahujícího· 1 % glukózy, 0,5 % poiypeptonu (Daigo · Nutritive Chemicals Co. Japonsko}, 0,5 procenta extraktu z masa, 0,5· ·% chloridu sodného při pH 7,0, každá baňka pak byla inkubována na třepacím zařízení při teplotě 28 °C po· dobu 48 hodin. Výsledná kultura byla užita jako očkovací materiál.

Fermen.tační tank z· nerezavé· oceli o objemu 20-0X103 objemových dílů byl naplněn množstvím 120 X10³ objemových dílů prostředí, obsahujícího 3 % glycerolu, 0,1 % glukózy, 0,5 · % polypeptonu, 0,5 % extraktu z masa a 0,5 °/o chloridu sodného, a po úpravě pH na hodnotu 7,0 30% vodným roztokem hydroxidu sodného se prostředí sterilizuje párou při teplotě· 120 °C po dobu 20 minut. Sterilizované prostředí ve fermentačním tanku se pak očkuje svrchu uvedeným očkovacím materiálem a inkubuje· při teplotě 28 stupňů Celsia za stálého provzdušňování rychlostí 120 · X10³ objemových . . dílů za minutu při míchání 180' otáčkami za minutu po dobu 78 hodin.

Výsledné živné prostředí se odstředí (Sharples centrifugal separátor J k odstranění buněk, zůstává 110' X10³ objemových dílů supernatantu. Tato· kapalina se upraví na pH

4,2 a nechá se projít sloupcem s obsahem 15 X10³· objemových dílů aktivovaného· uhlí (Shirasagi, Takeda Chemical Industries, Ltd., Japonsko}', čímž dochází k · adsorpci účinné látky. Sloupec se pak promyje 45X10³ objemových dílů vody a· pak se vymývá 45· X10³objemových dílů směsi vody a acetonu v poměru 1:1, přičemž · eluát se odebírá ve formě frakcí o objemu 10X10³ objemových dílů, jednotlivé frakce se podrobí zkouškám proti Próteus mirabilis IFO 3849. Frakce · 2 a 3 se slijí, přidá se 20X10³ objemových dílů vody a směs se nechá projít sloupcem s obsahem 10X10³ objemových dílů pryskyřice Dowex 1 v chloridové formě (Dow and Chemical Industries, USA). Sloupec se promyje 25X10³ objemovými díly vody a pak se vymývá 50X10³ objemovými díly vody s 5% chloridu sodného. Účinné frakce se slijí, pH se upraví na hodnotu 4,0 a frakce se znovu nanesou na vrchol sloupce aktivovaného uhlí v množství 8X103 objemových dílů. Sloupec se promyje 24X10³ objemovými díly vody a pak se vymývá 20% vodným methanolem. Účinné frakce se slijí a zahustí na 50 objemových dílů za sníženého tlaku. Pak se přidá 200 objemových dílů acetonu a· výsledná sraženina se oddělí filtrací, promyje se 50 objemovými díly acetonu a 10 objemovými díly diethyletheru, načež se suší za sníženého tlaku. Svrchu uvedeným způsobem se získá 12 dílů surového produktu.

V 500 objemových dílech 0,01 M fosfátového pufru o pH 6,6 se rozpustí 10 dílů svrchu uvedeného surového produktu a roztok se nechá projít sloupcem obsahujícím 200 objemových dílů pryskyřice DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia, Švédsko] v tomtéž pufru jako svrchu. Sloupec se promyje 400 objemovými díly téhož pufru a pak se vymývá tímtéž pufrem s přísadou 0,5 % chloridu sodného. Účinné frakce se slijí, upraví na pH 3,0 přidáním 1 N kyseliny chlorovodíkové, načež se nechají projít sloupcem s obsahem 60 objemových dílů aktivovaného uhlí. Sloupec se promývá 200 objemovými díly vody a 100 objemovými díly 20% vodného methanolu s následnou elucí 50% vodným acetonem. Účinné frakce se slijí, koncentrují za sníženého tlaku a rozpustí v 5 objemových dílech methanolu. Přidá se 100 objemových dílů acetonu a roztok se nechá stát v chladnu. Výsledná sraženina se oddělí filtrací, promyje se diethyletherem a suší za sníženého tlaku nad kysličníkem fosforečným při teplotě 40 °C po dobu 6 hodin. Tímto způsobem se získá 3,8 dílů prášku, jehož absorpční spektrum v infračerveném světle je znázorněno na obr. 1.

Elementární analýza (hmot. %)

C 34,83, H 5,41, N 13,22, S 7,65 %.

Příklad 2

Fermentor z nerezové oceli o obsahu 50 X X10³ objemových dílů se naplní 35X10³ objemovými díly prostředí, které obsahuje 3 % glycerolu, 0,1 % glukózy, 0,5 % polypeptonu, 0,5 % extraktu z masa a 0,5 % chloridu sodného. Prostředí se upraví na pH 7,0 přidáním 30% vodného roztoku hydroxidu sodného, načež se sterilizuje párou při teplotě 120 °C po dobu 20 minut. Sterilizované živné prostředí se očkuje tímtéž materiálem jako prostředí v příkladu 1 a inkubuje se při teplotě 28 °C za stálého provzdušňování rychlostí 35X 10³ objemových dílů za minutu při míchání 180 otáčkami za minutu po dobu 48 hodin, čímž se získá sekundární očkovací materiál.

Do fermentoru z nerezové oceli o obsahu 2000 X10³ objemových dílů se vloží 1200 X10³objemových dílů prostředí, které obsahuje 3 % glycerolu, 0,1 % glukózy, 0,5 % polypeptonu, 0,5 % extraktu z masa, 0,5 % chloridu sodného a 0,1 % thiosíranu sodného, pH se upraví na hodnotu 7,0 přidáním 30% vodného roztoku hydroxidu sodného, načež se prostředí sterilizuje párou při teplotě 120 °C po dobu 20 minut. Sterilizované živné prostředí se očkuje sekundární očkovací kulturou, získanou svrchu uvedeným způsobem.

Naočkované živné prostředí se inkubuje při teplotě 28 °C za stálého provzdušňování rychlostí 1200 X10³ objemovými díly za minutu při 180 otáčkách za minutu po dobu 90 hodin, čímž se získá 1150 X10³ objemových dílů fermentačního prostředí. К tomuto prostředí se přidá 40X10³ dílů přípravku Hyflo-Super-Cel [Johanes-Manville, USA) a směs se zfiltruje za současného lisování. Filtrát se upraví na pH 4,2 přidáním 4 N roztoku kyseliny sírové a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 120 X10³ objemových dílů aktivovaného uhlí.

Sloupec se promyje 300 X10³ objemovými díly vody a pak se vymývá 50% vodným acetonem. Účinné frakce se slijí a zahustí za sníženého tlaku к odstranění acetonu. Takto získaný vodný koncentrát se zředí vodou na objem 200 X10³ objemových dílů a nechá se projít sloupcem s náplní 50X10³ objemových dílů pryskyřice Diaion SA-21A v chloridové formě (Hitsubishi Chemical Industries, Japonsko). Sloupec se promyje 150 X10³ objemovými díly vody a pak se vymývá 1% vodným roztokem chloridu sodného. Účinné frakce se slijí a zahustí za sníženého tlaku na 100 objemových dílů, přidá se 2X10³ objemových dílů methanolu a vysrážený chlorid sodný se oddělí filtrací. Filtrát se znovu zahustí za sníženého tlaku na 200 objemových dílů, přidá se 2X10³ objemových dílů acetonu, vzniklá sraženina se oddělí filtrací a usuší. Svrchu uvedeným způsobem se získá 757 dílů surového produktu. 500 dílů tohoto produktu se rozpustí v 5X10³ objemových dílů vody, pH se upraví a 4,0 a roztok se nechá projít sloupcem s obsahem 5X10³ objemových dílů aktivovaného uhlí. Účinná složka se vymývá gradientovou eluční metodou při použití 10X10³ objemových dílů vody a 10X10³ objemových dílů 70% vodného methanolu a eluát se odebírá po frakcích o objemu 1X10³ objemového dílu. Účinné frakce se slijí, zahustí za sníženého tlaku к odstranění methanolu a doplní na objem 6X10³objemových dílů přidáním 0,01 M fosfátového pufru o pH 6,0. Tento roztok se adsorbuje na sloupec obsahující ЗХ10³ objemových dílů pryskyřice DEAE-Sephadex A-25, upravené způsobem podle příkladu 1. Sloupec se promyje 6X10³ objemovými díly téhož pufru a pak se vymývá tímtéž pufrem s přísadou 0,5 % chloridu sodného, přičemž se odebírá eluát po frakcích o 500 objemových dílech. Účinné frakce se slijí, pH se upraví na hodnotu 3 přidáním 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové a roztok se nechá projít sloupcem s obsahem 0,5 X10³ objemových dílů aktivovaného uhlí. Sloupec se vymývá 2X10³objemovými díly vody а 2X10³ objemovými díly 20% vodného methanolu, pak se eluce provádí 50% vodným acetonem, eluát se odebírá po frakcích o objemu 200 objemových dílů. Účinné frakce se slijí, zahustí za sníženého tlaku a rozpustí přidáním 300 objemových dílů methanolu. Přidá se 3X10³ objemových dílů acetonu а 4X10³ objemových dílů diethyletheru, načež se roztok nechá stát v chladnu a vysrážené antibiotikum G-6302 se oddělí filtrací, promyje se diethyletherem a suší za sníženého tlaku nad kysličníkem fosforečným. Výtěžek je 72 dílů.

0.8 7 6 8

Elementární analýza (hmot. %):

C 35,45, H 5,24, N 13,73, S 7,75 %.

P ř í k 1 a d 3

V 90 objemových dílech vody se rozpustí 4,0 díly volné formy antibiotika G-6302, získaného způsobem, podle příkladu 1 a 2, a za sníženého stálého chlazení se přidá 9,0 objemových dílů 1 N vodného roztoku hydroxidu sodného. Pak se přidá ještě 1 N roztok hydroxidu sodného, čímž se pH roztoku upraví na hodnotu 6,5. Roztok se pak lyofilizuje, čímž se získá 4,2 dílu monosodné soli antibiotika G-6302 ve formě bílého prášku. Absorpční spektrum tohoto materiálu v infračerveném světle po sušení za sníženého tlaku při teplotě 40 °C po dobu 6 hodin je znázorněno na obr. 2.

Elementární analýza (hmot. %):

C 33,08, H 5,07, N 12,73, S 7,33, Na 5,19 °/o.

Příklad 4

Buňky Pseudomonas acidophila G-6302

Sloučenina síry (FERM-P č. 4344, IFO Í3774, ATCC-31363), pěstované na šikmém živném agaru, se užijí k naočkování prostředí v kónické láhvi o objemu 200 objemových dílů. Láhev obsahuje 400 objemových dílů živného- prostředí s obsahem 1 % glukózy, 0,5 % polypeptonu, 0,5 procent extraktu z masa a 0,5 % chloridu sodného při pH 7,0, naočkované živné prostředí se pak inkubuje na - rotační třepačce při teplotě 28 °C po dobu 48 hodin, čímž se získá očkovací materiál.

Pak se do každé kónické láhve o 200 objemových dílech vloží 40 objemových dílů živného prostředí, které obsahuje 3 % glycerolu, 1 % - glukózy, 0,5 % polypeptonu (Daigo Nutritive Chemicals], 0,5 % extraktu z masa a 0,5 - % chloridu sodného při pH 7,0 a 0,02 až 0,5 % různých sloučenin síry. Každá láhev se pak naočkuje 1 objemovým dílem svrchu uvedeného očkovacího materiálu a inkubuje 96 hodin na rotační třepačce při teplotě 28 °C. Jak je zřejmé z následující tabulky, produkce antibiotika se zvýší - přidáním sloučenin síry.

Koncentrace Produkce (%) (^g/ml J methionin cystein cystin síran sodný thiosíran sodný

—	15
0,02	20
0,5	43
0,02	55
0,1	65
0,02	30
0,5	65
0,02	70
0,1	48
0,02	55
0,1	80

Příklad 5

V 7,5 objemového dílu studené vody se rozpustí 1 díl volné formy antibiotika G-6302, získaného způsobem podle příkladu 1 nebo 2, a ke směsi se přidá 17,5 objemového dílu chladného methanolu.

Takto získaná směs se nechá stát v - chladnu 24 hodin, čímž se získá antibiotikum G-6302 ve formě bezbarvých krystalků. Krystalky se oddělí filtrací, promyjí se malým množstvím 80 % chladného vodného methanolu, chladným methanolem a etherem a vysuší se kysličníkem fosforečným za sníženého - tlaku při teplotě 60 °C po dobu 6 hodin, čímž se získá 0,930 dílu krystalků antibiotika G-6302. Fyzikálně chemické vlastnosti takto získaných krystalků jsou tyto:

1) Teplota tání 168 až 170 °C.

2] Elementární analýza pro

C12H20N4SO9 . CHaOH . 1/2H2O (hmotnostní %}:

Nalezeno:

C 35,51, 35,56

H 5,61, 5,61

N 12,93, 12,98

S 7,45, 7,59

Vypočteno:

C 35,69

H 5,76

N 12,81

S 7,33

3) Specifická otáčivost [a]D²3 + 82^o+5° (c = l,0, VH2OJ

4) Absorpční spektrum v - infračerveném světle v KBr -je znázorněno na obr. 3. Hlav208768 ní vrcholy jsou při následujících vlnočtech (cm-1): 3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625.

5] NMR-spektrum bylo provedeno v dimethylsulfoxidu při 100 MHz s následujícími výsledky:

ό 3,31 ppm (s, 3H) (chemický posun je možno připsat skupině О-СНз antibiotika G-6302) δ 3,20 ppm (s, 3H) (chemický posun je možno připsat skupině О-СНз methanolu, který je obsažen v krystalech).

Další fyzikálně chemické vlastnosti, to jest absorpční spektrum v ultrafialovém světle, rozpustnost v rozpouštědle, barevné reakce, stálost a stupeň kyselosti jsou stejné jako vlastnosti produktu získaného způsobem podle příkladu 1.

Claims

PŘEDMĚT

Způsob výroby antibiotika G-6302, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Pseudomonas acidophila G-6302, IFO 13774, schopný produkce antibiotika G-6302, v živném prostředí s obsahem využitelného zdroVYNÁLEZU je uhlíku a využitelného zdroje dusíku za aerobních podmínek při pH 4 až 8 a při teplotě 15 až 35 °C do nahromadění antibiotika s následnou izolací antibiotika G-6302 ze živného prostředí.