SU1003761A3 - Способ получени антибиотика G-6302 - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  способа получени  антибиотика G-6302. Цель изобретени  - создание способа получени  антибиотика G-6302. Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  анти биотика формулы uHi uKj f н f н 7-, HOit-t-CHj-tHi-t-1J-U-t-l J H OHO® штамм Pseudomonas acedophila G-6302 ATCC-31363 культивируют в аэробных услови х в питательной среде, содер жащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и выделением целевого продукта. При этом, с целью повмшени  выхо да целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, содержащей дополнительно метионин, ци теин, цистин, сульфат натри  или ти сульфат натри . Используемый дл  осуиествлени  способа штамм Pseudomonas G-63D2 вы G-6302 делен из проб почвы, собранных в районе Ашигара Чимон-Гун, префектура Канагава , Япони , депонирован в институте Ферментации, Осака (1ГО) под номером I ГО 13774 и характеризуетс  следун цими признаками. вультурапьно-морфологические признаки . По истечении 2-х дней на питательном скошенном агаре при 28 С клетки приобретают форму стержней диаметром 0,7-1,0 мк и длиной 0,7-3,5 мк. Подвижна  с пол рно расположенной жгутиковой зооспорой или пол рно расположенным жгутиком, неполиморфна. Неспорулирующа : без накоплени  полибета-оксимасл ной кислоты в качестве внутриклеточного углеродного запаса. Грам-отрицательна , кислотонеустойчива . При выращивании при 28 С в течение 1-14 дней про вл ет следующие свойства. На питательном агаре образует круглые колонии диаметром 1-3 мм с полным оформлением кромок по истечении 3-х дней; однородные: непрозрачные/ белые, растворимый пигмент отсутствует.

Питательный скошенный агар. Рост умеренный, нитевидной формы, непрозрачный , кремовой окраски.

Жидка  питательна  среда. Мутное новообразование, практически без седиментации. По истечении 14 дней культивировани  образует тонкую пле ку.

Питательный желатиновый столбик. Поверхностный рост, без разжижени .

Физиолого-биохимические свойства

Лакмусовое молоко не измен ет. Нитраты в нитриты не восстанавливает . Денитрификаци  отрицательна . Проба, на метиловый красный отрицательна . Проба Воджес-Прокауэра отр цательна . Сероводород образует (сл бо положительна  реакци ), Крахмал не гидролизует. Нитрат кали  усваивает слабо, сульфат аммони  усваив ет. Пигмент не образует, У.реаза положительна , оксидаза отрицательна  каталаза положительна .

Растет при рН 4-8, оптимум рН 4,5-6,о; температуре от 2 До 31°С, оптимум роста при 25-30°С.

Аэроб. Окислительно-ферментативна  проба - оксилительна .

На средах с сахарами слабо образует кислоту, газ не образует.

Ассимил ци  источников углерода; хорошо усваивает арабинозу, D-ксилоЗУ , О-глюкозу D-маннозу, D-фруктозу , мальтозу, сахарозу, трегалозу, 0-сорбит, О-маннит, инозит, глицерин , альфа-метил-D-глюкозид, адонит раффинозу, цис-аконитат, цитрат, изоцитрат, глюконат, ацетат, фумара малат, тартрат, п-оксибензонат, о(.-аланин, бета-аланин, L-изолейцин сукцинат, 2-кетоглюконат.

Не усваивает лактозу, крахмал, мелибиозу, дульцит, L-валин.

Малонат не использует.

Фенилаланин не деаминирует.

Декарбоксилазна  активность; аргинин - отрицательна , лизин - отрицательна , орнитин - отрицательна  реакци .

Эскулин гидролизует.

Содержание гуанин-цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте 59,5 мол.%.

Способ осуществл ют следующим образом.

Дл  культивировани  штамма G-630 могут быть использованы такие источники углерода, как глюкоза, сахароза , .мгшьтоза, отработанна  меласса, глицерин, масла и жиры, органические кислоты. В качестве источника азота - органические и неорганические азотсодержашие соединени , например соева  мука, мука хлопковых сем н, кукурузный экстракт, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, м сной экстракт, мочевина, сульфат аммони 

нитрат аммони , хлорид аммони , фосфат аммони . Неорганические соли хлорид натри , хлористый калий, карбонат кальци , сульфат магни , первичный кислый фосфат кали , вторич-ный кислый фосфат натри . Выход антибиотика можно повысить путем добавлени  соединений серы - сульфат натри , тиосульфаты, серосодержащие аминокислоты - цистеин, цистин, мегионин . Концентрации соединений серы поддерживают в питательной среде на уровне 0,01-1,0% (вес.об.), предпочтительно 0,02-0,5% (вес.об.). В питательную среду можно вводить соли т желых металлов, в частности сульфат двухвалентного железа, сульфат меди, а также витамин В , биотин. Культивирование в жидкой среде провод т в стационарных услови х при перемешивании, встр хивании в аэробных услови х. Температура культивировани  от 15 до , рН питательной среды 4-8. Культивирование провод т в течение 8-168-4, предпочтительно от 24 до 144 ч.

Антибиотик может быть выделен обьачными способами, используемыми при выделении антибиотиков, а именно отделением клеток центрифугированием с последующей очисткой целевого продукта растворением в растворителе или осаждением из раствора, ионообменной хроматографией и др.

Пример. Клетки микроорганизма Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P 4344, I ГО 13774 ,:7 ТСС-31363) выращенные на питательном скошенном агаре, используют дл  ионокулировани  двух .ч. колб Сакагучи, содержавших по 500 об.ч. среды, котора  включает в себ  1% глюкозы, 0,5% продукта полицептон, 0,5% м с-ного экстракта, 0,5% хлористого натри , величина рН 7,0, после чего каждую колбу инкубируют на возвратнопоступательном встр хивателе при 28°С в течение 48 ч. Конечную культуру используют в качестве посевной культуры.

Ферментер из нержавеющей стали емкостью 200 X 10 об. ч. заполн ют 120 X 10 об.ч. среды, котора  включает в себ  3% глицерина, 0,1% глюкозы , 0,5% полипептона, 0,5% м сного экстракта и 0,5% хлорида натри , и после доведени  величиры рН до 7,0 добавлением 30%-го водного раствора гидрата окиси натри  ее ртерилизуют вод ным паром при 120с в течение 20 мин. Затем среду стерилизованного сосуда инокулируют указанной посевной культурой и инкубируют при 28 С с аэрацией при скорости подачи 120 х X 10 об.ч./мин скорости вращени  мешалки 180 об/мин в течение 78 ч. .Конечный бульон подвергают центрифугированию с помошью сепараторной центрифуги с плавным рабочим режимо дл  отделени  клеточной массы, в ре зультате получают 110 X 10 об.ч. . верхнего сло  жидкости. Величину рН этой жидкости довод т до .4,2 и пропускают , через колонку с 15 х 10 об активированного древесного угл . Ко лонку промывают 45 X 10 об.ч. 50%-го водного раствора ацетона, эл ат собирают в виде 10 х 10 об.ч. фракций. Отбирают фракции 2 и 3, пр  вл ющие активность в отношении Pro teus mirabilis, добавл ют 20 х 10 об . воды и смесь пропускают,через колой ку, заполненную 10 х. 10 об.ч. смолы Даукс (хлорионна  форма). Колонку промывают 25-10об.ч. воды и элюиру ют 50 J 10 об.ч. 5%-го водного раств ра хлористого натри . Отбирают акти ные фракции, довод т рН до 4,О и вновь пропускают через колонку с ак тивирЬванным древесным углем (8 .ч.) . Колонку промывают 2410 об.ч. воды и элюируют 20%-ным водным раствором метанола (объем/ /объем). Отбирают активные фракции и.концентрируют до 50 об.ч. при пониженном давлении. Затем добавл ют 200 об.ч. ацетона, осадок отфильтровывают , промывают 50 об.ч. ацетона и 100 об.ч. диэтилового эфира и высушивают при пониженном давлении. Получают 12 частей сырого продукта. В500 об.ч. 0,01 М фосфатного буфера (рН 6,6) раствор ют сырой продукт и раствор пропускают через колонку с 200 об.ч. продукта ДЕВЕ-сефадекс А-25, предварительно обработанного буфером. Колонку промывают 400 об. ч. того же буфера, а затем элюируют тем же буфером, в который предварительно добавл ют 0,5% хлорис того натри . Отбирают активные фракции , довод т рН до 3,21 н. НС1 и пропускают через колонку с 60 об,ч, активированного древесного угл . Колонку промывают 200 об.ч. воды и 100 об.ч. 20%-го (объем/объем) водного раствора метанола с последуквдим элюированием 50%-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают активные фракции, концентрируют при пониженном давлении и раствор ют в 5 об.ч. метанола. Добавл ют 100 об.ч ацетона, смесь выдерживают на холоде Образовавшийс  осадок отдел ют фильтрованием , промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давл нии пентоксидом фосфора при 40 С в течение 6 ч. Получают 3,8 частей порошка. Антибиотик обладает следующими Физико-химическими свойствами. Температура плавлени  120°с (спекание ), 1. (с разложением). Белый порс иок. Молекул рный вес 400 + 20 (титрометри ). Найдено, %: С 34,83-35,45, Н 5,41- 5,24; N 13,22-13,73-, S 7,65-7,75, О 38,13+0,5. С Н N . S О- Н. О -(i 2.0 4- 9 2Спектрограмма ультра-фиолетового поглощени : только конечные частоты поглощени  (никаких.характеристических поглощений при длине волны свыше 210 нм). Спектрограмма инфра-красного поглощени , доминантные пики (бромид кали ), см : 3440 (си), 2920 (ср), 2850 (ср), 2600 (сл 1770 (си), 1650 (си) ,;i530 (си) ,.1458 (ср) , 1390 (ел) 1340 (ел), 1280 (пл), 1240 (си), 1210 (пл), 1180 (ср), 1118 (ел), 1043 (си), 792 (ел), 632 (ей), где си - сильное, ср - среднее, ел - слабое поглощение, пл - плечо. Удельное вращение (плоскости Ттол ризаи .ии) W 1 3+94°+10 (С-0,35, водр .). Спектрограмма  дерно-магнитного резонанеа (в диметилеульфокеиде, 100 мГц)5 3,31 ррт (S - определенный химический едвиг в направлении 0-СН,,) . Нераетворим в петролейном эфире, гексане, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате и хлороформе J умеренно растворим в этаноле, пиридине и ацетоне , растворим в метаноле и диметил сульфоксиде легко растворим в воде. Цветные реакции. Положительные с нингидрином и перманганатом кали , отрицательные - с хлоридом трехвалентного железа - феррицианидом кали , Сакагучи и Молиша) неопределенно положительные - реакци  Эрлиха. Стоек в водном растворе в интервале величин рН 3-7 при 60с в течение 10 мин, нестоек при рН выше 8,5. Кисла  реакци . Пример 2. В ферментационный сосуд из нержавеющей етал; емкостью об.ч. загружают 35 10об.ч. среды, котора  содержит 3% глицерина , 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% м сного экстракта, 0,5% хлористого натри , затем величину рН этой среды довод т до 7,0 добавлением 30%го водного раствора гидрата окиси натри  и стерилизуют вод ным паром при в течение 20 1ин. Затем среду инокулируют продуцентом. Инкубируют при температуре 2В°С с аэрацией при екороети подачи 3510 об. ч,/мин и екороети вращени  мешалки 180 об/мин в течение 48 ч., получа  вторичную поеевную культуру. Ферментационный еоеуд из нержавеющей стали емкоетью 2001П об.ч. заполн ют 120010 об.ч. среды, котора  включает 3% глицерина, 0,1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% м сного экстракта, 0,5% хлористого натри  и ОД% тиосульфата натри , а после доведени  рН до 7,0 добавлением 30%-го раствора гидрата окиси нат ри  среду стерилизуют вод ным паром при в течение 20 мин„ Затем среду инокулируют вторичной посевной культурой Инокулированную среду инкубируютпри 28°С при аэрации со скоростью подачи 1200,10 и скорости вращени  мешалки 180 об/мин в те чение 90 Чр в результате получают 115010 обоЧ. культуральной жидкос ти.,, В нее добавл ют 40-10 ч. продук та Хифло-Супр-Сел и фильтруют с помошью Лилот-пресса, Величину фильтр та довод т до 4 ,,2 добавлением 4н, м ггропускают через колонку с 120-10 оК,ч. активированного древес ного угл . Колонку промывают 30010 об,ч. воды, элюируют 50%-ным (объем/объем) водным раствором ацетона . Отбирают активные фракции и концентрируют при пониженном давлении дл  удалени  ацетона. Полученны водный концентрат разбавл ют 200 10 об,ч. воды и пропускают через .колонку, заполненную 5010 об.ч. продукта Дианон (хлорионна  форма). Колонку про1 4ывают 1%-ным водным раствором хлористого натри . Собирают активные фракции и концент рируют при пониженном давлении до конечного объема 100 об.ч., после чего добавл ют 210- об,ч. метанола и выпавший в осадок хлористый натри отфильтровывают. После этого фил ьтрат концентрируют при пониженном давлении до объема 200 об.ч., а затем добавл ют 2-10 об,ч, ацетона, выпавший Б осадок отдел ют фильтрованием и высушивают Получают 757 ч сырого продг кта, 500 ч., сырого продукта раствор ют в .ч воды, довод т величин - оН до 4,0 и адсорбируют в колонке на активиро ванном древесном угле (510 -.об.ч. ) Активный компонент элюируют по мето ду градиентного элюировани  с испол зеванием Ю-10 об.ч,, воды и 10- 10 об,ч. водного раствора метанола (объем/объем) и элюат собирают l-io обоЧ. фракций. Активные фракции отбирают концентрируют при пониженном давлении дл  удалени  метанола и довод т объем до бlO об.ч, добавлением 0,01 М фосфатного буфера (рН б|,0). Пробный раствор ,Г1л  адсорбции пропускают через колонку с 3-10 об.ч. продукта ДЕАБ-С фадекс , приготовлен ный согласно примеру 1, затем колон ку про м1ывают бЮ об,ч, того же бу , фера, причем элюирование производ т .тем самым буфером, в который добавл ют 0,5% хлористого натри , элюат собирают в виде 500 об.ч. фракций. Активную фракцию отбирают, довод т рН до 3 1н, НС1 и пропускают через колонку с 0,5-10 об.ч. активированного древесного угл . Колонку промывают 2-10 об.ч. воды и 210 об.ч, 20%-го водного раствора метанола (объем/объем), а затем элюируют 50%-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают 200 об.ч. фракций. Активные фракции концентрируют при пониженном давлении и раствор ют в 300 об.ч. метанола. Добавл  ют 3 -10 об.ч. ацетона и 4 «Ю об.ч, диэтилового эфира и оставл ют на холоде , выпавший осадок антибиотика отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении над п тиокисью Фосфора. Выход 72 г. Данные элементарного анализа , %: С 35,45, Н 5,24, N 13,73, S 7,75 (вес/вес). Пример 3. В 90 об.ч. воды раствор ют 4,0 ч. антибиотика G-6302 в свободной форме (по примерам 1 и 2} на холоде и добавл ют в раствор приблизительно 9,0 об.ч. 1н. водного раствора NaOH. Затем добавл ют дополнительное количество 1н. раствора NaOH до достижени  величины-рН 6,5. Раствор высушивают вымораживанием, получают 4,2 мононатриевой соли G-6302 в виде белого порошка. Физико-химические свойства. Отсут .ствует определенна  температура плавлени  (приобретает коричневую окрас- ку при 170С) . Белый порсшок. Молекул рный вес 438±5. Найдено, %: С 33,08, Н 5,07, N 12,73, S 7,33, Na 5,18. о Вычислено, %: С,33,03, Н 4,85, N 12,84, S 7,35, Na 5,27. Спектр ультрафиолетового поглощени : только конечные поглощени . Спектрограмма инфра-красного поглощени , доминантные пики (бромистый калий), см : 3430 (си), 3250 (пл), 3000 (ср), 1770 (си), 1640 (си), 1530 (си), 1450 (ел), 1405 (ел), 1343 (ел), ), 1245 (си), 1180 (ел), 1118 (ел), 1050 (ей), 820 (ел), 782 (ел), 632 (ей). Удельное вращение: Icil + 85° + t Ю(С-0,37, вода). Нерастворим в петролейном эфире, гекеане, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате, хлороформе и ацетоне; слабо раетворим в метаноле, этаноле и пиридинеJ раетворим в диметилсульфоксиде, легко растворим в воде. Цветные реакции. Положительные с нингидрином и перманганзтом кали , отрицательные - е хлоридом трехвалентного железа - феррицианидом кали , Сакагучи и Молиша-, неопределенно положительные - реакци  Эрлиха. Стоек в водном растворе в интервале величин рН 3-7 при в течение 10 минутного нагревани ; нестоек при величинах рН выше-8,5. Пример 4. Клетки микроорганизма G-6302, выращенного на питательном скх  енном агаре, используют дл  инокулировани  питательной среды (40 об.ч.), содержащей 1% глюкозы, .0,5% полипептона, 0,5% м сного экстракта и 0,5% хлористого натри  (рН 7,0), затем колбу .с инокулированной средой инкубируют на роторном встр хивателе при 28°С в течение 48 ч и получают посевную культуру. Конические колбы емкостью по 200 об.ч. заполн ют 40 об.ч. среды, содержащей 3% глицерина, 1% глюкозы, 0,5% полипептона, 0,5% м сного экстракта и 0,5% хлористого натри  (рН 7,0), добавл ют в каждую колбу 0,020 ,5% различных соединений серы с nq следующим инкубированием на роторном встр хивателе при 28с в течение 96 4 Дополнительное введение соединений серы позвол ет повысить выход антибиотика (от 15 мкг/мл на обычной среде до 20-80 мкг/мп при добавлении эазличмых серосодержащих соединений) Пр и ме р 5. В 7,5 об.ч. холод ной водвл раствор ют 1 ч. антибиотика в свободной форме, затем в смесь добавл ют 17,5 об.ч. холодного метанола . Смесь оставл ют на холоде на 28 ч Получают порошок, кристаллизованный в виде бесцветных кристаллов. КрисАнтимикробный спектр G-6302 и его натриевой соли

Микроорганизм

Esche г i ch i а coli N IHJ Escherichia coli T-7 Salmonella typhosa Boxhi11 58 Shigella flexnerl EW-10 Klebsiella pneunoniae DT Proteus vulgaris I FO 3988 Proteus morganic IFO 3168 Proteus mirabilis IFO 3849 Serratia marcescens tFO 12648 Pseudomonas aeruginosa U-31

Минимальна  ингибирующа 

22ЙЦ§ 1ЕЩи х 5 /5 0

G-6302 и G-6302 а

25 25

25 25

12,5

12,5 25 12,5 25

12,5 100 100 100 100 25 25 100 100 выше 100 Свыше 100 таллы отдел ют, промывают небольшим количеством 80%-го (объем/объем) холодного водного раствора метанола, затем последовательно холодным метанолом и диэтиловым эфиром высушивают над-п тиокисью фосфора при пониженном давлении и температуре 60°С в течение б ч и добавл ют 0,930 ч. кристаллов, полученного антибиотика . Полученные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства.Температура плавлени  от 168 до 170с. Найдено, %: С 35,51-35,56, Н 5,615 ,61, N 12,93-12,93, S 7,45-7,59. N,50, СН,,ОН 0,5 , It с35,69; П 5,76; N 12,81, S 7,33. 23 Удельное вращение: , + 82 + + (C 1,0, в воде) . Инфра-красный спектр поглощени , доминантные пики (бромистый калий), 3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625. Спектрограмма  дерно-магнитного резонанса (в диметилсульфоксиде, 100 МГц); 3,31 ррт (SiBS) (определенный химический сдвиг в сторону 0-СН G-6302). tf 3,320 ppm (.)(определенный химический сдвиг в сторону -o-CHj метанола, который содержитс  в крис-. таллах).. Антибиотик G-6302 и его натриева  соль активны в отношении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (см. таблицу) .

Продолжение таблицы

Предлагаемый способ позвол ет получить антибиотик, используемый дл  лечени  заболеваний, вызванных перечисленными микроорганизмами, а также в качестве гермицида или дезинфицирующего средства.

Claims (2)

1. Способ получени  антибиотика формулы

г JH, 1

BOjt-U-(iHi-CHi-(i-N- i- i-S«-n,

fl 8 Л о

Заключающийс  в том, что штамм Pseudononas acedophila G-6302 ATCC-3136 культивируют в аэробных услови х в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и вьщелением целевого продукта.

2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, чтоf с целью повышени  выхода целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде , содержащей дополнительно метионин , цистеин, цистин. сулыЬат натри  или тиосульфат натри .