DK141783B

DK141783B - Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk stof kaldet mimosamycin eller et syreadditionssalt deraf.

Info

Publication number: DK141783B
Application number: DK421676AA
Authority: DK
Inventors: Tadashi Arai
Original assignee: Tadashi Arai
Priority date: 1975-09-19
Filing date: 1976-09-17
Publication date: 1980-06-16
Also published as: DK141783C; NL7610443A; JPS5753075B2; FR2324310A1; DE2641908A1; FR2324310B1; JPS5238094A; ATA697376A; AT349629B; GB1508949A; DK421676A; CH622823A5

Description

I 1 \Ra/ (11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1 ^4 1 7 8 3 DANMARK (51) lnt C|3 C 12 P 1/06 UMmviMmv c 07 B 11/00 §(21) Ansøgning nr. 42I6/76 (22) Indleveret den 17· sep. 1976 (23) Løbedag 17· S ep. 197δ (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 1 6. jun. 1 98Ο

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (»> Prioritet begæret fra døn

19· sep. 1975, 115289/75, JP

(71) TADASHI AR AI, Kojimachi Sanbancho Kondo 401, 5-2, Sanbancho, Chiyoda-ku, Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Samme.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk stof kaldet mimosa= mycin eller et syreadditionssalt deraf.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af det hidtil ukendte antibiotiske stof mimosamycin eller et syreadditionssalt deraf, hvorved en stamme af arten Streptomyces lavendulae dyrkes i et næringsmedium.

Det hidtil ukendte antibiotieum kaldet mimosamycin har antibak-teriel aktivitet overfor Gram-positive bakterier, især syrefaste bakterier.

Hidtil er isoleringen af omkring 2000 forskellige typer antibio- 141783 2 tiske stoffer blevet rapporteret, og det bliver efterhånden vanskeligere at finde nye antibiotiske stoffer. Imidlertid er der et stigende behov for nye antibiotiske stoffer på grund af forekomsten af mikroorganismer, som er resistente overfor konventionelle antibiotica såvel som fremkomsten af hidtil ukendte infektionssygdomme forårsaget af en udbredt anvendelse af antibiotica med et bredt antibakterielt spektrum, steroidhormoner, antitumormidler eller antiimmunstoffer.

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at Streptomyces lavendulae, som producerer et kendt antibioticum, streptothricin, også kan producere et hidtil ukendt og nyttigt antibiotisk stof kaldet mi-mosamycin, og især at en hidtil ukendt stamme af Streptomyces lavendulae kan producere særlig store mængder af dette hidtil ukendte antibiotiske stof.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.

Den stamme af Streptomyces lavendulae, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er mest foretrukken Streptomyces lavendulae stamme NRRL 11002.

Streptomyces lavendulae stamme NRRL 11002 blev isoleret fra en jordprøve opsamlet ved Kyoto og fandtes at tilhøre slægten Streptomyces. Denne stamme er blevet deponeret under accessionsnummeret 3218 i the Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan og også som anført under deponeringsnummeret NRRL 11002 i the Northern Regional Research •s

Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A., hvorfra den kan skaffes.

Iagttagelse af luftmycelium og sporer af Streptomyces lavendulae stamme NRRL 11002 blev foretaget ved dyrkning af stammen på medier ifølge anbefalingerne fra the International Streptomyces Project (ISP) (Shirling, E.B. & D. Gottlieb; International J. Systematic Bacteriol. 16, 313-340, 1966); nemlig ved dyrkning på agarplader 3 141783 af gær-stivelse-agarmedium, uorganiske-salte-stivelse-agarmedium og maltoseholdigt basalmedium for carbonkildeudnyttelsesmønster (Pridham-Gottlieb's agarmedium) ved 27°C i X-2 uger. Ligeledes blev farverne af myceliet med modne sporer, det vegetative mycelium og andet bestemt ifølge farvemærkenummeret som angivet i "Descriptive Colour Name Dictionary", Container's Corporation of America, 1950 og "Colour Harmony Manual", Container's Corporation of America, 1958·

Stammen NRRL 11002 udvikler et bølgeformet, foldet luftmycelium, som er langforgrenet og med ep diameter på omkring 0,6-l,0^um med mange cylindriske sporer. Sporernes størrelse er 0,5-l,0yum x 0,8-2,Oyum.

Ifølge standarden i ISP siges stammen med de ovennævnte morpho-logiske egenskaber at tilhøre sektionen Rectiflexibiles. Imidlertid er lufthyferne med løkker eller ufuldstændige eller aflange spiraler, som er i vindinger på 1-2 omdrejninger. Derfor er stammen morphologisk bestemt til at tilhøre sektionen Retinaculiaperti. Når sporeoverfladen på disse medier iagttages under et elektronmikroskop findes stammens sporer at have en glat overflade. Stammens hovedkarakteristika er, at lufthyferne morphologisk tilhører' sektionen Retinaculiaperti, lufthyfernes farve med modne sporer er roaa til lavendel på forskellige medier, det vegetative myceliums farve somme tider er blå eller blåligt brun på et syntetisk medium, og produktionen af melanin-pigment er positiv. Ud fra en betragtning af de stammer af slægten Streptomyces, som er beskrevet i "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Vol. 2, 1959 og "Bergey's Determinative Bacteriology", 8th Ed,, 1974, antages det, at stammen har en nær lighed med Streptomyces lavendulae.

Stammen podes i et konventionelt medium til produktion af et antibiotisk stof, og der gennemføres en rystekultur ved 27eC i en dyrkningsperiode på 18-72 timer til frembringelse af et kulturfiltrat, som har en høj aktivitet over for coliforme baciller. Det således opnåede filtrat behandles med aktivkul under alkaliske betingelser og elueres med syrnet acetone eller adsor-beres på en svag kationbytterharpiks, f.eks. "Amberlite® IRC-50" (forhandlet af Rohm & Haas Co., U.S.A.) og underkastes desorption med 0,1 N saltsyre til opnåelse af et antibakterielt stof, som er 4 141783 aktivt overfor coliforme baciller. Derpå renses det således opnåede stof ved chromatografi over f.eks. "Amberlite ^ CG-50" (forhandlet af Rohm & Haas Co.) og krystalliseres i form af et Reinecke-salt eller picrat, hvorpå dette stof identificeres som streptothricin.

Endvidere foretoges en sammenligning af kulturmæssige og fysiolo-fiske egenskaber med Streptomyces lavendulae IFM 1031, som er en streptothricin-producerende stamme, Streptomyces racemochromo-genes IFM 1081, som antages at være identisk med Streptomyces lavendulae og i stand til at producere streptothricin, og den foreliggende stamme til endelig identifikation. Resultaterne er sammenfattet i tabel 1, -2 og 3· Nærmere betegnet er stammen NRRL 11002 øjensynligt identisk med Streptomyces lavendulae IFM 1031 med hensyn til enhver karakteristisk egenskab, som i øjeblikket anvendes til identifikation af stammen inden for slægten Streptomyces, selv om der iagttages mindre forskelle i nogle henseender, f.eks. udnyttelse af L-arabinose og lignende, og således er stammen blevet identificeret som en stamme af Streptomyces lavendulae. Selv om Streptomyces racemochromogenes IFM 1081 kan produce streptothricin, er denne stamme øjensynligt forskellig fra stammen NRRL 11002.

5 141783 /—s I ^ L — +2 ft 3 O β

a 'O -P P CM

ET Φ «© β \

o) a ©w β bo »Φ g β ρ φ bo β -p η β p Φ Η β-ρ © ·Η § ^ n

bo h <d°co φ -p © ^ h S

o Ρ Η β β°© Ρ © >β Η β β a ^ η ho ftH ® η taco S ® φ Ο ΡΗ Φ Ρ ΟΡΟ β© , > © > a Cj γ} η ,—ι β β p Η Η Η 1 R §Η-Ώβ *Η ft *β Η Η Η § ο Η β Η -Ρ-Ρβ Ρ Η Ρ Φ -ΡΟ Ρ Φ Ο Ρ Ο 00 PH hQ Ρ Μ-ΡΟ .!?& jj jj -u cq S Ο — Η·'"^ -Η Η Ή ©"-" -Ρ -Ρ β __ -Ρ (DH Ρ HOP Η Ρ1^ ΗγΙ Φ ©Λ ® 5Ρ Φ Ο bO β Φϋ Μ © β © _, Μ Ρ β © Ρ cos cd 3 bo Cd bo 3 bOP β S o >

Tj β ft !> β H CM |> Η β Η © ΙΑ Η B S 03 β H © Ρ β^ © βΡ β Qw φ · +j

M CQ H

φ 3 ^ hr i Ρ β i Φ o βΗ I β IH Ρ β ©p ©Η β , © j. 3

Al pjj Ρ φ ρ Ρ PHP Ρ Ρ ΝΛ O Φ p !> Φ bO © Ρ Η β bC © β P CMw 0 βΡ-HcdbO© β HP© ©βΦ hOw Η © ft© !> β H t> ft ί>®!> !> ft ί> β -Ρ Η © BISP ίο mo © ρ β © ©Η Η Η β Ρ Ρ w* Ρ Η Φ Η © »φ β Ρ

j 3 «Φ 3 "β © ^ μ© “ Φ bOH »O β b U R

ry; fin ρ>ορ©ΒβϊϊΟ Ρ Η'-' Ρ βΡ Η Ρ ft ·* Μ > 3 S β ίρ bO β ρ bOH æ Η bOP β bO Φ Φ IP Ρ Μ£! Ρ ΜΗ β 2 ΦΟ Η © Η H'“sJ3 Η bO ft Η β gw Η β OJ ©Η IS Ρ >Η ΗΉΡ ΗΦΡ®·ίΡ Η Η Η© Ρ Η §\ β Η © Φ 3 φ bO Φ Ρ β©ΗΟΦ©Ρβ©©ΘΗΦΡ Ρ Η θ Hg bO ·> © bOH Η Η 3 b0°© Η hQ "© ίΒ Ρ bO i? B ft ΗΦ>ΗΗΡ|ΦΗβ Η β*-» Η bO β β Η ΦΗ Ο βΗ >> Η © · Η ΡΡ© βΡ'-'ΡΡΡ β bO β O bO Ο Η βΡ>— θΡΡ Η Φ Ρ Μ ,.

Ρ © +2

© S

^ Φ lr_l i -Ρ nc1 Ο βΗ β © Ρ Ρβ >. φ Ρ Ρ Φ >5 Μ © © a Ρ Φ Ρ PH HP Μ ΡΡ ^ Φ ο J Φ ρ a bo Φ-'-νΗ© b£ Φ Ρ © <Η

ρ S β Ρ © βΗΦ«©0ιη©β bp«H

ο, Η ft Η·'"'' ί> ftH Η β w ί> ft © ΡΡ ø g ©β > ρ bO © ©Ρ bO—' © © > CMw U φ Ρ Ρ β Η <N Οβ P ©w

jj Φ ·> b> ® H *>P'V«. ·> © ® H ·* © P

CO © P Hl! P CM J2 -4" Η ρ © Η Ρ Ρ H t5® *+2 *© H bOH^> bQw © p bO S hOlP© P bOH Ρ«© β

Η 3 HO©H Η HHH Hv Η Φ © β bO

cO p Η Η Η β Η Η Ρ Η Φ^' H HbOP H!> βΜί>Ρ β Φ© Φ Φ Φ Ρ Φ ©> φ Ρ φ Η Φ Φβ Φ bOH Φ bf φ bO !>>CM bOP Ρ Ρ ΜββΜΦΡ Ρ bO © Ρ Η IS Ρ β >C\1 ΗΗΧ Η β β © βΡ Η©ΦΗββ©β Η *Ν ΟΗ©β Η ©Ο βΗβ©Φ bOH β β «H > β Φ Φ , Η β θ β Η β ΗΟ ·> Ηκ* Ρ Η ©>Η bC · Η g Φ Η gH©^nP^β S © Η gi^©H ft g© ^μΗ ft Η CO Η ρ-pw Η OH—ΌΡ !>ΡΟΡΗΗΡθ |>Ρ ρρρΟ γΗ 1 1.

i 1 Λ © ρ © Β co © β © β © ρ< ρ ft g β © I β I I β Η ©

φ β Φ © Ο bO

a © © ©bo β © 3 Ο bO ο© ΦΙ ft Ηβ© Ο I οβ C0 Ρ Ο Ρ β >>* Η Φ 3 Η Η Η bO w

g CO C5 bO O

6 141783

-P

rti S m (!>✓—s Φ Φ -g . - § — d © dd

rH ,_j i n ri +50 S<D SO

5 s - i) o s P. ® OH

ri .rT -P H d OfO 13 «Η

O OJ Η &0 O S CM OH OS

tj o s . - £t S'-' s o

6 S s~ ø øp o S « P ra O o P

g © s > o »O h S

^-¾ V“ d ' 44* g~ H S 44* & ;|n' 2 toø bQ>- P &0rQ S o H W) ** s- *, 4.· ° di? P d§H^+.

OS OP O O HIA O &0 44 OH S S, 5 2 _S" 5f

hO S b0°O P WHO—' P o s U0"O P &ØH S P O

•Η O H S S HH S f> § HH S T^Hg % > S M S &0 H S P Η 0 S S P H S &044 P 0

P

cd -'-n § o ® 2 2

HH S H H'd'S'S

ddi +1 S pø S SO

O &o “ s s s o ® h HHCMHOr-N+J H d H S τ3

O-H^ HO Μ &0 O S OØ O

SP OS H 0 S P > > £ £ O. 4-3 & SU t> ft β $U Ή ft ft W*P β U^&<t «I W-P Φ CtiH W MOJj

s d O .3 S >ΗΟ P H

•>dS »ΜΒΗΉ ·» d Η “O ro p S P P Η Η Η P S'~' Η ΛΡ P S P ’O ^ bopø &0C— O P P bOP s o p SH> ^?^5C· kpS'-'

•Γ-ϊ ο, ·Η Η H bn P4 O O S H 60 O H O

dpØ H SOP H^ P P S tO ft Η Η Η P H KJ H P P

ØbOSOPObOO ødmo &p o _ OH o ® S B .2 S

bO O S &0°Ο ί> P bO'O'-r P O Η H OJ bOH ΝΛ P bpH S P d

H |> O H S O in S H H S . > O H'-' H d— S H H O S S

Sh CQ CQ i-j bOH''—' Ή $U & Ή W S *P Sh bO ·Η β bO^n Ή rQ

- - _p.

·* I β ^ β φ β ρ 2 ^ " •dø ^ TjH-Pifn ω a>ø S ta 1 p ds-dopp 'd

øbo o HbO raS SO

H H^ HH ^ P HHH «> b0^ P O O OH

0 -Η Η H O bO bO O H'-' P^iSObO H TJ ^ s p s ό s h o 2 2 2 2 fe p, ss> P4 S S P S ί> > ^ Ji 2 top cm s^æ-4- ra rapø>ibooro\ta S P4 dw 0^ S κ“ P H w O to ra o--s

«p »bOtQH H » dH P Ø Η Η P O

P S S P HH -Η P SH ·> bO S O H -»O ,r^'H

bQP p {¢0- 0 P P bOP OPOOSP " P^t

•H S -HwH H O S S O P &Q bCk—' bO S fO

PPPH SOP HPPSOOPP O HbOO H O^— 0 bO ra 0 p 0 bO O O b044 Øi>caHO S HH HP Hjj -P -¾ bOO ft b0°O > P bO O S HH OP O OH ø OtiH Φ ϋ •H > 0 H S O ITv S ·Η>® Od &Q44 S Ό y>H ΝΛ P bOH O P d SØS smhw.-h søs SftOtO H o -^1 .fe % 2 2 cl. 2 S _ 44 „

S 5 & P >. s g S SS SS

f P

r—I

H S 0 S

s 00 0 O s o ρω ω 2-

bO H O 0 O aO

0 >>l JsJ I O

1 flP 0 O r-N I

s so ·η ta ftø H dS SH ω w CQ *tr{ *H (0 Φ Η β

O O O bO > w *H

u h o a

>> od 'op M

e-i o 0 d t a s 7 141783 -ρ S . Η Ρ ρ bo -Η ϋ g ^ ^

β © ** in -p -Ρ Η -P

ft * 5^8 S »ft s SP !? w 03 > -P<f c S o p> o ta ©^ h ί> 0 P rH f, rrj ω ,Γω SB Η Η © Η © “ S ,3 -ρ·^ -ρ <Η © -Ρ cd

ft IjW bo Cd cd Η H

2 SPnft L Η© © φ β b0 β

Η *©«© Ρ «ΰ TJ tn -P bO O fi O

0 ft B, Ih β ©β η β © ^ ω s ,ρ g h s o ρ o

-P

·% I) © -p © g c« © bO © p | ©

Std-PØ cd η φ S

©ί>Μ ® f, bo -Pd S) 2ω dC1 C; CT -p -p S'-' ·η © © η h © © pJjbQ H bQH H-P P,

Sd »© © H p, > Sm-H »cd ©o -ρβ ca-p hotnæ-ct· <fr .pn" o©·©- 5q ^οβ -ρ ρ ω - ,-) tap β© -β ft Η ft® mSd!p © »m -φη η ©°in Η©·"" © -pL sll^ sps^ * sia s

Η©-ΡΗββ©Ρ l £ji—Iffl -P *τ) φ .p -p +> O H

S, F” S Si m S M *2 φ -p © bO © © © β © b0^4<f P,

Si ©S ©© -P PH β ft © Ow O

ft 2 2 22^2^ m ΟΗΟ©ιη β Ρ, Ο Ρ β !> Λ

PPA PHH^ © g,Q g ·,-) MtHP Ή BIO

Ph o » I -P §

doLxsS -Ρ © ! H

βΡΡ-PS MS © ©

ft©,, dCT Q CT H bO-N ^ © © H >> © Η O bO bOH H ft £

P »bO »©© Hp, >> Η © Η ©Ο -Ρβ -P

PrP ? ^ P P 0©p a , β Η “πω 2 ©ping<J- Οβ ftp β «η® ~3H © bow| -ΡΟΗ -Ρ -Ρ Η Η -Ρ „ λ+3ΗΗ Η -d- p-S ·· © ΜΗ Η W>ft©-P β .μ 4^© Φ-Ρ β β © S © djj^dS^ojL © ©s·© ©-p η^-ν 3 ο Η·Ρ Η η fi J Η c. taSLidØ-P TjØPPPOH Ο

Si Slid SiroS^m © © © o bo © ©©β© bOPsi P, g

bOtoQtQbOW^ d) irj ih [Q ^ jj £.,-^^43^0 3 H

dS2 m ° oi>,©Ln β ρ,ο Ρ β ^,β-ί Η © Ρ s Η Ρ Η Η^ © g SHrl^ Η CQ Η Ρ Η © Η β fer* te Γ, © β S3 Sgg S 5 SS S, å.

a >, -Ρ β ρ 2 § i © 2 μ 1 -P % © ©

pi © -P W

β © J. a s U ~ 1 -i - o £S % fe Έ > ^

Sh^ h> H| 2 o æ©bp ^© ee > % o s © h 8 141783 TABEL 2

Sammenligning af fysiologiske egenskaber af Streptomyces lavendulae stamme nr. NRRL 11002 og kendte stammer S. lavendulae S. lavendulae S. racemo-Fysiologisk egenskab NRRL 11002 IFM 1031 chromogenes IFM 1081

Nitratreduktion (14 dage) + + +

Smeltning af gelatine (18°C, 21 dage) + + +

Opløseligt pigment brunt brunt brunt

Hydrolyse af cellulose (21 dage) - - -

Lakmus mælk :

Koagulering ++ ++ ++

Peptonisering ++ ++ ++ pH 8,0 7,8 7,8

Melanindannelse + + + 9 141783 TABEL 3

Sammenligning af carbonkilde-udnyttelsesmønster for Streptomyces lavendulae stamme nr. NRRL 11002 og kendte stammer S. lavendulae S. lavendulae S. racemochromogenes Carbonkilde NRRL 11002 IFM 1031 IFM 1081 D-xylose35^ - y ) L-arabinose ' + X ) L-rhamnose -

yQ

D-glucose + + + D-fructosex^ - - y) sucrose 7 + + + lactose - + maltose + + + x) raffinose - mannitol ' χ] i-inositol ' - - - natriumacetat + + + natriumcitrat + + + natriumsuccinat + + +

Kontrol -

' carbonkilde beskrevet i ISP

x) 10 141783

Mimosamycin, som produceres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, har ikke tidligere været isoleret fra en dyrkningsvæske af de førnævnte velkendte mikroorganismer af slægten Streptomyces, især S. lavendulae.

Dyrkningen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan alment udføres ifølge konventionelle dyrkningsprocedurer for mikroorganismer, men det er sædvanligvis fordelagtigt at gennemføre suhmers dyrkning i et flydende medium. Som medium ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes alle medier indeholdende næringsstoffer, som stammen NRRL 11002 af slægten Streptomyces kan udnytte; Nærmere betegnet kan der anvendes syntetiske, havlsyntetiske eller naturlige medier, og som eksempler på mediumkomponenter kan nævnes en carbon-kilde, såsom glucose, maltose, fructose, xylose, stivelse og glycerol; en nitrogenkilde, såsom kødekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrøolie, sojabønnemel, najsstøbevand, tørgær, gærekstrakt, ammoniumsulfat, ammoniumchlorid, urinstof og andre organiske eller uorganiske nitrogenkilder. Carbonater, phosphater eller andre salte af metaller kan yderligere inkorporeres i mediet. I tilfælde, hvor der observeres overdreven skumning under dyrkningen, er det hensigtsmæssigt at tilsætte mediet et antiskummemiddel, såsom en vegetabilsk olie, f.eks. sojabønneolie, en siliconeolie, midler af polyoxyalkylentypen, mineralolier og lignende.

Dyrkningstemperaturen er sædvanligvis inden for området fra omkring 27 til omkring 30°C. Efterhånden som mediets volumen forøges, er det hensigtsmæssigt at gennemføre en podekultur og derpå indpode podekulturen i et medium. Dyrkningstiden er sædvanligvis fra omkring 18 til omkring 24 timer.

De førnævnte dyrkningsbetingelser kan udvælges med henblik på optimalt udbytte, afhængigt af den mikroorganisme, som anvendes til fremstillingen af de omhandlede antibiotica.

De antibiotiske stoffer, som således er opsamlet i en dyrkningsvæske, er sædvanligvis inkluderet i mycelie og dyrkningsvæske og ekstraheres fra det opsamlede mycelium ved centrifugering eller filtrering, og filtratet opsamles. Nærmere betegnet kan de antibiotiske stoffer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen isoleres, ±1 141783 udvindes og renses ved konventionelle procedurer, som sædvanligvis anvendes til fremstilling af et naturprodukt, f.eks. ved udnyttelse af opløselighed og opløselighedsforskelle i egnede opløsningsmidler, udfældningsevne og forskel i udfældningshastighed fra en opløsning, forskel i adsorption og affinitet på forskellige adsorbenser, forskel i fordeling mellem to væskefaser og lignende. Disse procedurer kan efter ønske anvendes alene eller i vilkårlig kombination, enkeltvis eller gentaget. En repræsentativ procedure skal forklares i det følgende.

Efter fuldførelse af dyrkningen filtreres dyrkningsvæsken til adskillelse af myceliet fra et filtrat. Filtratet indstilles til pH 8,0 med 10 N natriumhydroxidopløsning. Filtratet kan i forvejen koncentreres til 1/2 - l/3 volumen til opnåelse af bedre ekstraktionseffektivitet med et opløsningsmiddel. Ved opløsningsmiddelekstraktion efterlades som nævnt ovenfor basiske vandopløselige an-tibiotica, f.eks. streptothricin, som ogs$ produceres af stammen NRRL 11002, i filtratet, medens andre produkter, herunder mimosa-mycin, ekstraheres i opløsningsmiddelfasen. Opløsningsmiddelfasen koncentreres til tørhed under formindsket tryk, koncentratet opløses i en lille mængde ethylacetat, opløsningen rystes successivt med vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, vandig natriumcarbonatop-løsning og vandig natriumhydroxidopløsning og skilles fra, hvorpå sure stoffer er overført i den vandige fase. Opløsningsmiddelfasen ekstraheres med 1 N saltsyre, og den sure ekstrakt indstilles til pH 9 - 10 med ammoniakvand og ekstraheres med chloroform. Dette trin gentages flere gange, og opløsningsmiddelfasen koncentreres til tørhed under formindsket tryk til opnåelse af en rå grundkomponent indeholdende mimosamycin. Grundkomponenten søjlechromatograferes på silica-gel med en blanding af benzen og ethylacetat og udvikles med ethylacetat til opnåelse af en fraktion, som overvejende indeholder mimosamycin. Denne fraktion renses yderligere flere gange ved silicagel-chromatografi til opnåelse af mimosamycin som gule krystaller.

12 141783

Mimosamycin

Ethylacetatlaget efter ekstraktion med 1 M saltsyre kan koncentreres til tørhed, og remanensen opløses i en passende mængde methanol.

Til den resulterende opløsning sættes vand i tilstrækkelig mængde til at give et vandindhold på 10 volumenprocent. Den vandige opløsning ekstraheres med n-hexan til fjernelse af urenheder med lav polaritet. Den vandige methanolekstrakt koncentreres derpå til tørhed, og remanensen opløses i ethylacetat. Den således opnåede opløsning vaskes successivt med 1 N saltsyre og 1 N natriumhydroxidopløsning og koncentreres derefter til tørhed, hvorved der opnås en remanens bestående af de rå neutrale komponenter. Mimosamycin kan derpå isoleres og renses fra komponenterne på samme måde som ovenfor.

Råt mimosamycin omkrystalliseres fra en blanding af ethylacetat og ethylether til opnåelse af de rene gule krystaller.

[A] Fysisk-kemiske egenskaber af mimosamycin (1) Farve og tilstand: Gule prismer

(2) Smeltepunkt: 227 - 231°C

(3) Element analyse: C 61,51% - H 4,79% - N 5,87% (4) Molekylvægt (massespektrum): 233 (5) Empirisk formel: C12H11N04 (6) Ultraviolet absorptionsspektrum (som vist i figur 1 på tegningen)

UvA^hano1 nm (log£): 230 (skulder) (4,16) 317 (4,14), 396 (3,56) ; UV Λ minhan01 m 277 (3,78), 370 (3,53).

13 141783 (7) Infrarødt absorptionsspektrum (som vist i figur 2 på tegningen) IRVS£ cm"1: 1685, 1655, 1655, 1585 (8) NMR spektrum (CDCl^) (som vist i figur 3 på tegningen) g: 2,10 (3H, g), 5,69 (3H, s), 4,20 (3H, μ), 7,12 (IH, s), 8,28 (IH, s).

(9) Rotationsspektrum (C = 4,57 x 10“^, MeOH) [jzl]20 (nm): -I6OI (500), -I373 (490, -1373 (480), -1144 (470), -1144 (460), -1144 (450 - 390), -1373 (380), -1144 (370 - 350), -1373 (340, -1831 (330), -2288 (320), -2288 (310), -1831 (300), -1601 (290), -2059 (280), -2517 (270), -3661 (260), -5492 (250) (10) Opløselighed

Letopløseligt i: Methanol, ethanol, phloroform, estere, acetone

Tungtopløseligt i: Diethylether, n-hexan.

Uopløseligt i: Vand (11) Parvereaktioner

Ehrlich-reaktion: positiv (orange)

Ninhydrin- og Dragendorff-reaktioner: negativ.

Dette stof har den biologiske egenskab at være aktivt over for Grampositive bakterier i en vis grad, men ueffektivt over for Gramnegative bakterier og svampe i en koncentration på 50 pg/ml.

14 141783

Især er stoffet aktivt over for syrefaste bakterier og effektivt over for høj-streptomycin-resistente stammer af menneske-tuberkelbaciller ligesom over for normale stammer af tuberkeibaciller. Mini-· male inhiberende koncentrationer over for Mycobacterium tuberculosis er bestemt efter 4 ugers inkubation på 37°C på Sauton*s medium og sammenfattet i tabel 4.

TABEL 4

Antimikrobiel aktivitet af mimosamycin over for tuberkelbaciller

Prøveorganisme MIC (pg/ml)

Mycobacterium tuberculosis H37 Ry 1,56

Mycobacterium bovis No. 10 6,25

Mycobacterium tuberculosis SMR 1,56

Mycobacterium smegmatis ATCC607 25,0

Bemærkninger: Næringsagar, 37°C, 48 timer for M. smegmatis.

Sauton* s væskemedium, 37°C, 4 uger for de andre 3 stammer. Stammerne SMR og Matsudo er resistente over for streptomycin ved 1000 pg/ml eller højere.

Mus (18-20 g) tolererede en intravenøs injektion på 50 mg/kg mimosamycin.

Det er bevist ud fra de ovenstående fysisk-kemiske og biologiske egenskaber, at dette stof er et hidtil ukendt antibiotisk stof, som er specielt effektivt over for tuberkelbaciller.

Mimosamycin kan anvendes til terapeutisk formål som antimikrobielt eller antituberculøst middel i forskellige farmaceutiske præparatformer, såsom tabletter, pulvere, orale suspensioner eller sirupper-, kapsler, opløsninger eller suspensioner til injektion osv. Disse former kan let fremstilles ved anvendelse af antibioticumet på konventionel måde. Antibioticumet kan indgives ad oral eller paren- 15 141783 teral vej, typisk i en intramuscular eller intravenøs injektion.

Den dosering, som indgives, kan variere efter de givne betingelser, men vil i almindelighed afhænge af sygdommens alvor og patientens alder og legemsvægt. Sædvanligvis vil en daglig dosis ligge inden for området fra omkring 200 mg til omkring 2 g for voksne og kan gives i enkelte eller opdelte doser.

De følgende eksempler tjener til nærmere at belyse fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Rystekolbekultur A. Podekultur

Der fremstilledes en suspension af et frysetørret præparat af Strep-tomyces lavendulae stamme NRRL 11002 i fysiologisk saltopløsning, og den blev podet på agar-skråsubstrater med følgende sammensætning:

Glucose 10 g L-asparagin 5 g KH2P04 5 g

Agar 15 g

Ledningsvand 1000 ml pH 6,8 - 7,0

Dyrkningen foregik ved 27°C i 1 uge, hvorved der blev opnået en podekultur med rigelig vækst og mange sporer.

B. Kultur 100 rystekolber, hver med et volumen på 500 ml og indeholdende 100 ml af det nedenfor angivne dyrkningsmedium, blev aseptisk podet med sporerne opsamlet fra den ovennævnte podekultur med to øjefulde pr. kolbe.

16 141783

Glucose 1,0 g

Stivelse 10,0 g

Polypepton (forhandlet af 10,0 g ¥ako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) Kødekstrakt ( " ) 5,0 g

NaCl 3,0 g

Silicone KM 72 10 ml (Shin-Etsu Chemical Co.,

Ltd., Japan)

Ledningsvand 1000 ml pH 7,0

Dyrkningen gennemførtes ved 27°C i 40 timer ved hjælp af et frem-og tilbagegående rysteapparat (125 slag pr. minut, udsving 8 cm).

Efter fuldførelse af dyrkningen blev kolbernes indhold kombineret, og myceliet fjernet ved hjælp af en kontinuert centrifuge. Den således opnåede overvæske (10 liter) blev indstillet til pH 8,0 og derpå ekstraheret tre gange med 1/3 volumen chloroform.

Ekstrakterne blev kombineret, filtreret gennem et filterpapir og derpå koncentreret til tørhed under formindsket tryk, hvorved der blev opnået 2,8 g af et mørkebrunt fast stof. En opløsning af stoffet i 50 ml ethylacetat blev rystet successivt med 5 % vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, 1 N natriumcårbonatop-løsning og 1 N natriumhydroxidopløsning i 25 ml portioner for at fjerne sure stoffer. Det organiske lag blev ekstraheret fem gange med 25 ml IN saltsyre. Ekstrakterne blev kombineret med det vandige lag, og blandingen blev indstillet il pH 9 - 10 med ammoniakvand og ekstraheret fem gange med et lige så stort volumen chloroform. Chloroformekstrakterne blev kombineret og koncentreret til tørhed. Remanensen opløstes i 50 ml af en 10 % vandig opløsning af eddikesyre og blev indstillet til pH 9 - 10 med ammoniakvand og ekstraheret fem gange med et lige så stort volumen chloroform. Ekstrakterne blev koncentreret under formindsket tryk, hvorved der blev opnået 200 mg af en rå ekstrakt indeholdende mimosamycin.

141783

Den således opnåede rå ekstrakt blev fyldt 1 en glaskolonne (diameter 1,0 cm og længde 50 cm) pakket med silicagel (partikelstørrelse 0,06 - 0,210 mm, forhandlet af Merck & Co., U.S.A.). Søjlen blev udviklet med blandinger af benzen og ethylacetat (2:1),(1:1) og (1:2) til opnåelse af fraktioner, som overvejende indeholdt mimosa-mycin. Hver fraktion blev yderligere chromatograferet på en silicagel-søjle (0,062 mm, forhandlet af Merck & Co.), hvorved der blev opnået 2,8 mg mimosamycin som gule krystaller.

EKSEMPEL 2

Dyrkning i gæringskar A. Der fremstilledes en podekultur på samme måde som i eksempel 1, undtagen at dyrkningen gennemførtes i 24 timer.

B. Fire gæringskar, hvert med et volumen på 20 liter og indeholdende 15 liter af det nedenfor angivne dyrkningsmedium, blev steriliseret under tryk på konventionel måde.

Glucose 5,0 g

Stivelse 5,0 g

Polypepton (forhandlet af Wako Pure Chemical Industries,

Ltd., Japan) 10,0 g Kødekstrakt ( " ) 5,0 g

NaCl 3,0 g

Ledningsvand 1000 ml PH 7,0 - 7,2

Dyrkningen gennemførtes i 18 timer under de følgende betingelser:

Podekultur 1%

Dyrkningstemperatur 27°C

Omrøring 550 omdr./min.

Strømningshastighed 1 volumen medium pr. min.

af aseptisk luft

Antiskumningsmiddel tilsattes om nødvendigt (silicone KM 72) 1A17 8 3 18

Efter det ovennævnte tidsrum var den maksimale titer af produceret mimosamycin blevet opnået, og derefter faldt titeren hurtigt. Dyrkningsvæskens pH-værdi faldt til under 6,0 og steg derefter igen - - til omkring 6,8*. Mycelievolumenet forøgedes hurtigt, og glucosen var næsten forbrugt ved dette tidspunkt. Den maksimale produktion af streptothricin blev opnået på omkring 30 timer. Pra den samlede dyrkningsvæske (omkring 60 liter) fra gæringskarrene blev myceliet fjernet ved hjælp af en kontinuert centrifuge, og dyrkningsvæsken, blev koncentreret til en tredjedel volumen.

Koncentratet blev indstillet til pH 8,0 med 1 N natriumhydroxidopløsning og ekstraheret tre gange med lige store volumener chloroform. Ekstrakterne blev kombineret og koncentreret under formindsket tryk til opnåelse af 16,4 g af en blanding af råt mimosamycin. Blandingen opløstes i 100 ml ethylacetat, og opløsningen blev vasket med 50 ml 5% vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og 1 N natrium-carbonatopløsning og derpå fire gange med 1 N natriumhydroxidopløsning under omrøring. Natriumhydroxidlaget fandtes at indeholde sure inaktive komponenter, især stearinsyre. Ethylacetatlaget blev rystet fem gange med 60 ml 1 N saltsyre, hvorved basiske stoffer blev ekstraheret i syren. De sure ekstrakter blev kombineret, indstillet til pH 9-10 med ammoniakvand, ekstraheret fem gange med lige store volumener chloroform, og derpå blev det organiske lag skilt fra og koncentreret under formindsket tryk til opnåelse af rå basiske stoffer. Stofferne opløstes i 60 ml af en 10 pct. vandig opløsning af eddikesyre, og opløsningen blev igen indstillet til pH 9-10 med ammoniakvand og ekstraheret fem gange med lige store volumener chloroform. Ekstrakterne blev kombineret og koncentreret tinder formindsket tryk til opnåelse af omkring 0,98 g råprodukt indeholdende mimosamycin.

Den totale mængde råprodukt fra fire gæringskar var fra omkring 0,2 til omkring 1,5 g.

Dyrkningen blev gentaget 140 gange under anvendelse af fire gæringskar og en.totalmængde dyrkningsvæske på 840 liter til opnåelse af 8,67 g af det rå produkt.

Det rå produkt opløst i en lille mængde benzen blev fyldt i en glaskolonne med en diameter på 5 cm, som var pakket med benzen-gennemvædet silicagel (partikelstørrelse 0,062 - 0,210 mm, Merck. & Co.). Søjlen