SU1212328A3

SU1212328A3 - Способ получени антибиотика М 139603

Info

Publication number: SU1212328A3
Application number: SU792798603A
Authority: SU
Inventors: Хью Дэвис Дэвид; Лайтфут Флайд Норрис Джоффри
Original assignee: Империал Кемикал Индастриз Лимитед (Фирма)
Priority date: 1978-08-03
Filing date: 1979-08-02
Publication date: 1986-02-15
Also published as: CH649780A5; HU179207B; HK26185A; CA1142107A; IE48204B1; AU4919479A; DE2954593C2; NO792537L; SE447910B; AU530316B2; AT367450B; IE791403L; PL217506A1; KE3433A; CS221514B2; IT1162363B; FR2433578A1; DE2931082A1; SE447910C; DE2931082C2

Description

Изобретение относитс к способу получени нового ко1 1ового антибиотика М 139603, повышающего количество протионовой кислоты в желудочно соке рубца за счет снижени доли метана и (или уксусной кислоты) обладающего антимикробной акпшностью относительно грамполажительных микроорганизмов и возбудител кокцидиоза . Антибиотик М 139603 может быть использован в качестве стимул тора роста жвачных животных, а также домашней пти1да и свиней.

Способ получени антибиотика М 139603 в литературе не описан.

Антибиотик Ml39603 получают Путем культивировани штамма Strep- tomyces longisporoflavus NCI В 11426 в.водиой питательной среде, .содержащей источник ассимшшруемого углерода в услови х аэробного встр хивани при 25гЗО С, экстрагировани , продукта из смеси дл ферментации этидацетатом, последукщей очистки и выделени целевого продукта в форме сво0{ дной кислоты или ее металлической соли.

Штамм Str. longisporoflavus NCIB хранитс в Государственной коллекции промышленных бактерий министерство сельского хоз йства, рыбной и пищевой промышленности, Торри Ризерг Стэйшн, 135 Эбби Роуд, Абердин АВ98Р, Шотланди , а также в Centraal bureauvoor Schimmelcultu res PC BOJf273, Oosterstraat 1, 3740 AG BAArn, Нидерланды, под номером CBS 312,79.

Штамм Str.longisporoflavus NICE 11426 культивируетс на средах, полученных в соответствии с рекомендаци ми дл Международного проекта по Streptpmyces (ИСП) при 25°С на свету.

ЙСП 1. Дрожжи Триптон (но с агаром ).

5 дней - тонкий, слева влажный, бархатистый, желтовато-коричневый; об| атна сторона неокрашенна .

3 дней - тонкий, бархатистый, слегка гранулированный, светло-ко- ричневый; обратна сторона неокрашенна .

(агароИСП 2. Дрожжевой экстракт вый солодовый экстракт).

5 дней - тонкий, бархатистый, светло-серый; обратна сторона очень бледна желтовато-коричнева .

13 дней - значительный, рельефный, бархатистый, светло-желтый (коричневый ), серый; обратна сторона коричневата .

ИС11 3. Агар овс ной муки.

5 дней - редкий до тонкого, бархатистый , светло-желтый (серый); обратна сторона не видна.

13 дней - тонкий, слегка рельефный , бархатистый, светло-серый; обратна сторона не видна.

ИСП 4. Неорганические соли - исходный агар.

5 дней - тонкий, светлоткоричне- вый, слегка гранулированный; обратна , сторона неокрашена.

13 дней - тонкий, слегка влажный коричневьШ; обратна сторона более или менее бесцветна.

ИСП 5. Глицерин - аспарагиновый агар.

5 дней - тонкий, слегка гранулированный , светло-коричневый; обратна сторона неокрашена.

13 дней - тонкий, бархатистый, .. светло-серый; обратна сторона не окрашена.о

ИСП 7. Тирозиновый агар.

5 дней - редкий до тонкогоj слегка гранулированный, бархатистый, светловато-коричневый (серый); обратна сторона не окрашена.

13 дней - тонкий, бархатистьй, слегка рельефный, светловато- корич- невый; обратна сторона светловато- коричнева (сера ).

При старении ИСП 7 Культура становитс обычно более розовато-корич- :невой, но имеет области с более iгустой окраской, что св зано с более интенсивной спорул цией.

ИСП ВОценка

Углеродпоглощшощий агар

15 дней - углерода нет - очень редкий, погруженный Глюкоза - тонкий (плотный), бархатис-, тый, светловато- коричневый + Арабиноза - редкий ± Фруктоза - тонкий, бархатистый, ев етлов ато-коричневый+ Инозитол - очень редкий

Маннитол - тонкий,

бархатистый

Раффиноза - очень

редкий

Рамноза - редкий

Ксилоза - редкий

Общие черты.

Не образуютс меланины, обратны пигменты, а также растворимые пигменты .

Споры зарождаютс в открытых и плотных спирал х, часто отделенных от основных осей .более пр мой несущей гифой или цепочкой спор. Сами по себе споры трудно увидеть в обычный микроскоп, так как они расположены очень близко друг к другу. Споровые стенки (Е.М. на 4% уранил ацетатном составе) гладкие .

Пример 1.Streptomyces lon gisporoflavus штамм NCI В IIA26 вырастили в 500-миллнлитровой колбе Эрленмейера на триптон-дрож- жевом агаре, содержащем: Триптон (Оксоид L42) 0,5% в/о; Дрожжевой экстракт (Оксоид L 21) 0,3% в/о, которую предварительно простерилизо вали в автоклаве в течение 20 мин при нормальном давлении, рН средь примерно 7,0. Колбу в.стр хивали при 25 с в течение 120 ч на ротационном шзйкере.

Затем содержимое колбы использовали дл инокул ции еще 10 аналогичных колб, кажда из которых содержала 200 мл следующей питателной среды, % в/о:

Сироп

глюкозы3,0

Карбонат

кальци 0,25

Хлорид натри 0,3

Сульфат магни ,

гептагидрат 0,05

Концентрат

мйкрозлементов 0,1

Бактериологический

пептон

(Оксоид L37) 0,1

Порошок м сного

экстракта

(Оксоид L28,

Лаб Лемко) 0,5

Деионизированна

вода До 100

рН довели до- 7,2 и среду предва рительио стерилизовали в автоклаве

2123284

при в течение 20 мин. Инокули- рованные колбы встр хивали при в течение 120 ч на ротационном шэй- кере, а затем содержимое колб объ5 единили и рН довели до 3, осторожно добавл 0,1н. сол ную кислоту. Среду проэкстрагировали этилаЦета- том (2 -600 мл), экстракты объединили и осушили над сульфатом натри , раст10 воритель упарили и масл нистый остаток (290 мг).

Этилацетатный экстракт очистили с помощью препаративной прослойной хроматографии на двух пластинах

t5 (Мерк Кейселгел 60-254, 20«О см, толщина 2 мм), использу в качестве элюента этилацетат. Полосу при Р 0,39 (приблизительно) сн ли с пластины и проэкстрагировали этилаце20 татом, растворитель упарили и получили в зкую смолу (21 мг), котора в опытах in vitro про вила антибактериальное действие против S.aureus. Активную фракцию далее очислили с

25 помощью препаративной послойной хроматографии на пластине с силика- гелем (Кейселгел 60F-254, см толщина 0,25 мм), использу смесь . диэтилового эфира, метанола и муравь30 иной кислоты в отношении 95:4:1 (по объему) соответственно. Полосу при RP 0,66 (приблизительно) сн ли с пластины и проэкстрагировали этилацетатом, в результате чего после упаривани растворител получили в зкую смолу (9 мг) . Смолу превратили в.натриевую соль встр - .хива хлороформенный раствор с раствором гидроксида натри (0,1 М), Хлороформенный слой отделили и высушили над сульфатом натри , раство-- ритель вьтарили и получили М 139603 в виде белого твердого остатка (8мг), Т.пл.129-132 С,ИК-спектр показал следующие полосы поглощени .

.3300, 1725, 1645, 1565 и 915 см . Найдено, %: С 67,5; Н 8,8. CjylljjOgUa

Вычислено, % С 67,3; Н 8,5. Масс-спектр: М 624,361, рас50 читанный дл 624,364, RI 0,39, тонкослойна хроматографи на Мерк 60F-254, 0,25 мм, пластины , про витель этилацетат, наблюдаетс в виде коричневого п тна пос55 ле опрыскивани Зн. серной кислотой и нагревани при 100 С.

Пример 2. Streptomyces Ion- . gisporoflavus NCI В 11426 вьфащивали

40

как культуру на скошенном агаре ИСП ,(45 МП/, в течение 7 дней прн . Три таких посева по отдельно ти собраны в три колбы с 100 мл стерильной воды, и полученные таким образом суспензии использованы дл инокул ции трех 2-литровых колб, кажда из которых содержала 1л среды следукщего состава, % в/о:

Глицерин3,0

Бактериологический

пептон (Оксоид

137)2,0

,024

MgS04-7H20 0,02 .

Концентрат

микроэлементов 0,1

Мел0,1

Деионизированна

водаДо 1 л,

которую предварительно стерилизовали в автоклаве при нб1 1альном давлении в течение 1/2 ч, рН приблизительно 6,7.

Подготовленные таким образ 4 три 2-литровые кoлi5ы встр хивали в те- чение 3 дней при 30°С на ротационном шэйкере. Затем содержимое трех колб объединили и использовали дн инокулировани ферментера из нержа- векщей стали, содержащего 30 л стерилизованной среды следуницего состава, % в/ог

Глицерин

Соева мука В Р 70

Мел

3,0. 1,0 0,25 3,0

Церелоза

Хлористый

натрий0 5,

MgS04 7H20 0,05

Коиг ентрат . ,

микроэлементов 0,1

Дистиллированна

водаДо 30 л

Содержимое ферментера перемещали в течение 70,ч при ЗО с, использу дл зтих целей мешалку с 4 плос кйми лопаст ми, вращающуюс со скоростью 350 об/мин, и аэрацию со скоростью 15 л/мин. Перед загрузкоЁ автоклава в смесь добавили силиконовый пёногаситель 30 мл (Силкон-. лапе) , рН культуры 7,9, образующу юс ферментационную смесь (22 л) смешали с равным объемом этилацетат Через 30 мин смесь центрифугировали и этилацетатный экстракт (приблизительно 18 л) осушили над безводным сульфатом натри и профильтровали. Фильтрат упарили при пониженном авлении и получили масл нистый остаток (. г) .

М 139603 получили из описанного концентрата следующим образом.

Масл нисть остаток (10,7 г) растворили в минимальном объеме зтилаце- тата и приготовленный раствор поместили в верхнюю часть колонки с нейтральной двуокисью алюмини (Воелм N, 200 г 18 см-4 см), приготовленный

в виде суспензии в зтилацетате. Сначала колонку элюировали зтилацетатом, затем 50% в/о смесью этилацетат и етанола и окончательно метанолом. После выхода из колонки фронта растворител были собраны следующие фракции .

Фракци

Объем, мл Элюент,% в/о

3 4

5

6

7

8

9

10 п

150 150 150 150 150 150

150 150 200 200 200

Этилацетат

Метанол и-

- 14Метанол

Как показали результаты тонкослой. ной хроматографии на сипикагеле при про влении 20% в/о раствором ацетона

в петролейном эфире (т.ип. 60-80 С), фрак1Ц1и 7-11 включительно содержат М 13У603 (Rp 0,22). Поэтому их объединили и выпарили, в результате чего получили в зкую смолу (840 мг)

которую дополнительно очистили с помощью препаративной послойной хроматографии на силикагеле (Кейсел- гель 60 250 ф.Мерк, 40 см л

20 см, толщина 2 мм, использу в качестве элюента смесь 20% в/о ацетона в петролейноМ эфире (т.кип.60- 80°С). Уф-видимую полосу при ,22 приблизительно) вьоделили из двух пластин.и проэкстрагировали этилацетатрм, экстракт выйарили досуха получили в зкую смолу (240 мг), котора закристаллизовалась при добавлении петролейного эфира (т.кип. 60-80 С).Этот материал перекристаллизовалн из петролейного эфира (:т.кип.60-80 с) и получили Ml 39603 в виде бесцветных кристаллов , которые отфильтровали и высушили (210 мг), т.пл. 176-178 с. Уф-спектр в эталоне имел полосы поглощени при 234 им ( 12900) и 272 нм (е 10800). ИК-и ЯМР- спектры аналогичны полученным дл продукта примера 1.

П р и м е р 3. М139603 (40 мг) растворили в смеси ацетона (10 мл) и воды ( мл), добавили 1 мл 2н. сол ной кислоты и смесь интенсивно перемешивали в течение 5 мин. Добавили дистиллированную воду (20 мл), смесь проэкстрагировали дихлорме- таном (2 МО мл). Органический слой отделили и промыли 2н. сол ной кислотой , а затем дистиллированной водой. После этого дихлорметановьй слой упарили и получили в зкую смолу (ЗЗ мг) свободной кислоты, соответствующей М 139603.

Найдено, %: С 69,5; Н 9,1

8

Вычислено, %: С 69,8; Н 9,0

ИК-спектр, рн тый на таблетке из KB, имеет характеристические полосы поглощени при 3500,1765,1650, .1575 см- .

Пример 4. Свободную кислоту , соответствующую М 139603 (ЗО мг) растворили в смеси тетрагидрофурана (7 мл) и воды (1 мл). К водной тетрагйдрофурановой смеси добавили гидроксид щелочного металла, ХОГ (2Н, 2 мл) и смесь затем интенсивно перемешивали в течение 10 мин. Добавили воду (10 мл) , и раствор проэкстрагировали серным эфиром (2-15 мл). Эфирные экстракты объединили и вьшарили, в результате че:го получили соли щелочных металлов, соответствующие натриевой соли, М 139603..

Когда X - калий, то образуетс калиева соль, т.пл. 146-150 0

молекул рна формула , как показано масс-спектрометрией, котора дает молекул рный ион М массой 640, 335, рассчитано дл CiyHjjOgK 640,338.

Найдено, %: С 65,7%; Н 8,5%.

CjljrHjjOgK ,,.

;Вычислено, С 65,6, Н 8,3 Когда X - рубидий, то образуетс рубидиева соль, Т.пл. 95-12б с, молекул рной формулы установленной масс-спектрометрией, котора дает молекул рный ион К массой 686,279, рассчитанный дл

686,286.

Пример 5. Способность М 139603 ингибировать образование метана в рубце жвачных животных и уве- личивать количество протионата за счет} сокращени доли ацетата (Ас/Рг)в летучих жирных кислотах (ЛЖК), прошииост- рирована следующим образом.

С,уН„08

Собрали желудочный сок рубца от двух бычков-катратов, которых кормили одинаковым кормом,состо вшим из сена и концентратов. Врем вз ти ПрйЬб по возможности максимально стандартизировали, желудочный сок двух животных собирали в соотношении 50/50. Большие твердые включени отфильтровьшали через четырех- слойную муслиновую ткань. Затем фильтрат разбавл ли в соотношении один объем фильтрата к трем объемам искусственного желудочного сока рубца (приготовленного по методике Г.Л.Бейлза , но без использовани уксусной кислоты. рН смеси довели до 6,9-7,0 с помощью насыщенного водного раствора карбоната натри . Аликвотные количества (50 мл) этой смеси распределили в 100 мл конические колбы, содержащие высушенное измельченное сено (0,5 г) , и каждую колбу использовали дл оценки испытуемого соединени при данной концентрации.

Испытуемое соединение вводили в коническу :; колбу в виде спиртового

раствора (этанольного), колбу продували углекислым газом, закрьшали пробкой (резиновой) и термостатиро- вали при .в течение 15-16 ч. Через 1 ч узкую полую иглу вставл ли через резиновую пробку дл сн ти давлени газа и иглу вынимали за 30 мин до конца термостатирова- ни . Затем процесс ферментации останавливапи , помеща колбу на лед, и после 15-минутного охлаждени анализировали газ, наход щийс над жидкостью, на содержание в нем метана с помощыЬ газовой хроматогра- фии. Затем содержимое колб фильтрова ли через предварительно высушенный стекл нный t fOJibtp. Три образца фильт рата анализировали методом газовой хроматографии на содержание ЛЖК и, сравнива это количество t предварительно определенным количеством ЛЖК до термостатированй , определ ли точное количество ЛЖК ацетата и пропионата), образующихс в процессе термостатироваии .

Были получены следун цие результаты , выраженные в процентах от контрольных величин, полученных в отсутствие исследуемых соединений (табл.1). Моме зин, известный промотор роста, в н мций на функцию ца, включен в виде контрольного соединени .

Таблиц а 1

П р и м е р 6. Способ.ность . М 139603 увеличивать долю пропионата за счет сокращени доли ацета1та в желудочном соке рубца овец прошило- стрировали следующим образом.

Двадцать три овцы содержали отдельно на одинаковом рационе,состо щем из 1 кг брикетов сена на одного животного в день. Брикеты делили пополам и давали в день. Овец произвольно разде.аш1И

на 13 отрицательных контрольных и 5 положительных контрольных, которым давали монензин, известный регул тор рубца, а 5 животным давали определенную дозу М 139603. Подопыт- тм животньм давали момензин или М 139603 орально в количестве 0,5 мг/кг в течение четырех дней подр д, и пробы желудочного сока рубца собирали с помощью желудочного зонда через 6 ч после введени исследуемых соединений на четвертый день. Затем образцы желудочного сока рубца анализировали на содержание в нем ацетата и пропионата, как.описано в примере 2. Были, получены следующие результаты (см. табл.2). .

-.Таблица 2

20

Отрицательна контрольна 69,9

Положительные контрольные - монензин 0,5 мг/кг 57,1

М 139603 0 ,5 мг/кг 54,2

19,8

32,3 39,9

Сннвкение доли ацетата в случае использовани М 139603 значительно при Р 0,02 по сравнению с положительной контрольной группой, которой вводили монензин. Увеличение доли пропионата в случае использовани Н 139603 значительно при р 0,001 по сравнению с положительной контрольной группой, которой вводили монензии.

Пример 7. Антибиотик М 139603 обладает также,антикокци- ДИОЗИ1М действием. Это показано пробой тканевой культуры в клетках почек цьтл т, заразкенных спорозои- тами Eimeria tenella. В этом опыте М 139603 предотвращает рост споро- зоитов при концентрации jfO,001 части на миллион и обладает токсичным действием на клетки хоз ина только прн концентрации 0,ЗЭ части на миллион.

11121232812

Соединение М 139603 также облада- Corynefiacteriiun acne при концентра- ет грамположителЬным антибактериаль- ции .10 мг на мп и поэтойу может ным действием и предотвращает рост быть использовано как промотор роста Staphyllococcus aureus. Streptococcus нежвачных животны: С, например домай faecalis, Clostridium velchii, 5 ней птицы и свиней.

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА М 139603 путем культивирования штамма Streptomyces longisporoflavus № Cl Bl 1426 в водной питательной среде, содержащей источник ассимилируемого углерода в условиях аэроб- . ного встряхивания при 25-30 С, экстрагирования продукта из смеси ферментации этилацетагом, последующей очистки и выделения целевого продукта в форме свободной кислоты или ее металлической соли.